CN111471669A - 一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法 - Google Patents
一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供的肝素裂解酶III有更高的催化效率和热稳定性，突变体S264F/Y490K/D321N的催化效率比原始菌株提高了1.68倍，更有利于低分子量肝素的制备。本发明还对来自变形拟杆菌来源的肝素裂解酶III进行了异源重组表达，胞内酶活可以达到4000U/L以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
肝素是一种异质性多分散的硫酸化多糖，是一种抗凝血药物。广泛用于内科和防止手术后血栓的形成。由于它的非均一性，肝素可显示出不同的生物活性：非分级肝素的在治疗过程中会带来一些副作用，如骨质疏松症、出血等；分子量低于6000D的小(低)分子肝素可降低这些副作用。
低分子量肝素的制备方法主要有化学解聚法、物理制备法、生物解聚法和合成制备法。肝素酶是一类能够特定切割肝素或硫酸乙酰肝素中α-1,4糖苷键并将其裂解成有活性寡糖片段的酶。肝素酶最初从肝素黄杆菌中分离得到，后来，在许多微生物中也发现了肝素酶，比如粪便拟杆菌、鞘胺醇杆菌、枯草芽孢杆菌。由于天然肝素酶的表达量低并且纯化操作繁琐且费用较高，因而肝素酶的异源重组表达是替代天然肝素酶的重要途径。现有的重组肝素酶普遍存在催化效率低，热稳定性低的问题，限制了其在制备肝素寡糖方面的应用。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是：提高肝素裂解酶III的热稳定性及催化效率。
[技术方案]
本发明提供了一种肝素裂解酶III突变体，是将变形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)来源的肝素裂解酶III进行突变后得到的。变形拟杆菌来源的编码肝素裂解酶III的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述肝素裂解酶III突变体是从变形拟杆菌中获得肝素裂解酶III的原始DNA序列，并对原始DNA序列进行分析，然后，对特定位点进行突变后得到的突变体。所述肝素裂解酶III突变体的热稳定性得到了提高。
所述肝素裂解酶III突变体是在变形拟杆菌来源的肝素裂解酶III的基础上，
将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)；
或者，将第321位的天冬氨酸(D)突变为谷氨酰胺(Q)；
或者，将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；
或者，将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为谷氨酰胺(Q)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)并将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)、将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；
分别得到突变体S264F、S264T、D321Q、D321N、Y490K、S264F/D321Q、S264F/D321N、S264T/Y490K、S264F/Y490K/D321N；
变形拟杆菌来源的编码肝素裂解酶III的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种异源重组表达所述肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体的方法，是将编码肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体的基因与载体连接，然后，将重组载体转入宿主中得到转化体，对转化体株进行培养并从培养物中分离得到肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体。
在本发明的一种实施方式中，将肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体与纯化标签融合，得到融合蛋白，将融合蛋白在宿主中进行表达。
在本发明的一种实施方式中，从Bacteroidesthetaiotaomicron中获得肝素裂解酶III的DNA序列，对其进行扩增，并和载体进行重组构建，得到重组载体；将所述重组载体转化至大肠杆菌进行表达，获得重组菌株；培养所述转化体，并将培养物进行物理破碎处理，得到所述肝素裂解酶III。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主是大肠杆菌，所述转化体的培养方法是：采用LB培养基在30℃培养所述转化体1～3h，加入终浓度为0.2～1mM的IPTG诱导，然后再27℃培养18～30h。
[有益效果]
(1)本发明对变形拟杆菌来源的肝素裂解酶III进行了异源重组表达，胞内酶活可以达到4000U/L以上。
(2)本发明提供的肝素裂解酶III有更高的催化效率和热稳定性，突变体S264F/Y490K/D321N的催化效率比原始菌株提高了1.68倍，更有利于低分子量肝素的制备。
附图说明
图1所示为实施例2中的重组大肠杆菌摇瓶发酵蛋白表达随时间变化图。泳道1：空质粒生长8h的大肠杆菌；泳道2：4h破壁后上清；泳道3：8h破壁后上清；泳道4：12h破壁后上清；泳道5：20h破壁后上清；泳道6：4h破壁沉淀；泳道7：8h破壁沉淀；泳道8：12h破壁沉淀；泳道9：20h破壁沉淀。
图2所示为实施例2中重组大肠杆菌摇瓶发酵的生长曲线和酶活随时间变化的曲线。
图3所示为实施例2中重组菌株发酵生产得到的肝素裂解酶III的纯蛋白的电泳图。
图4所示为肝素裂解酶III突变体与野生型酶热稳定差异。
具体实施方式
实施例涉及的核苷酸序列信息：
SEQ ID NO.1序列信息为来源于Bacteroidesthetaiotaomicron的编码肝素裂解酶III的基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO.2是编码突变体S264F/Y490K/D321N的基因的核苷酸序列。
酶活测定方法：以肝素钠为底物，底物浓度为20g/L，用Tris-HCl缓冲液(pH7.4)溶解底物。酶活测定的反应体系为1mL，含40μL酶液和960μL肝素钠底物溶液。30℃反应1min，通过分光光度计测定在232nm处的吸光值变化。酶活定义单位：每分钟转化1μmol底物所需要的酶量为1U。
实施例1重组大肠杆菌的构建
以Bacteroidesthetaiotaomicron基因组为模版，设计引物，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取序列SEQ ID NO.1所示的编码肝素裂解酶III的基因。将所得基因连接到pET-28a质粒XhoI和NdeI酶切位点上，获得重组质粒，将重组质粒导入EscherichiacoliBL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌菌株。
实施例2重组大肠杆菌的摇瓶培养
将上述实施例1中构建的重组大肠杆菌或对照菌接种于LB培养基，对照菌为将pET-28a空质粒直接导入Escherichia coliBL21(DE3)中得到的。37℃过夜培养后，将重组大肠杆菌、对照菌分别转接于装有LB培养基的250mL三角摇瓶中，30℃培养1h，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导后，置于27℃培养48h。将发酵液于4℃下，6800rpm，离心10min，弃掉上清，用20mM Tris-HCl重悬菌体2-3次，用超声细胞破碎仪破碎后12000rpm高速离心20min，获得胞内粗酶。粗酶过膜后用100mM咪唑洗脱获得纯酶。
结果：
如图1所示，相比于对照菌，重组菌明显表达了肝素裂解酶III，且在20h的培养时间下表达量达到最高。
如图2所示，在28h的培养时间下，重组菌的生长量和肝素裂解酶III的酶活都达到最高。
如图3所示为重组酶经镍柱纯化后的条带。
实施例3热稳定性提高突变体的获得
为了提高肝素裂解酶III热稳定性，对S264，D321，Y490位点进行饱和突变。以实施例1构建的携带编码未经突变的肝素裂解酶III的基因的重组质粒为模版，用标准的PCR程序进行扩增，所用引物如表1所示。将PCR扩增产物导入大肠感觉的感受态细胞中，置于冰上30min，42℃热击90s后加入LB培养基在37℃下培养50min，涂布于卡纳平板上，于37℃静置培养10-12h，挑选合适的单菌落测序验证得到正确的转化子。转化子的培养方法以及获得突变体纯酶的方法如实施例2所示。将所得到的突变体纯酶置于50mM磷酸盐缓冲液中，在55℃下处理0.5h、1h、2h、3h、4h后，置于冰上冷却20min，测定其酶活，筛选到热稳定性明显提高的突变体S264F/Y490K/D321N。
具体如图4所示，突变体S264F/Y490K/D321N在50℃下的稳定性比原始菌株提高了12％。如表2所示，突变体S264F/Y490K/D321N的催化效率比原始菌株提高了1.68倍。
表1
表2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
美药星（南京）制药有限公司
南京汉欣医药科技有限公司
<120> 一种肝素裂解酶突变体及其重组表达的方法
<130> BAA190515A
<160> 62
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2109
<212> DNA
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Claims (10)
1.一种肝素裂解酶III突变体，其特征在于，所述肝素裂解酶III突变体是在变形拟杆菌来源的肝素裂解酶III的基础上，
将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)；
或者，将第321位的天冬氨酸(D)突变为谷氨酰胺(Q)；
或者，将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；
或者，将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为谷氨酰胺(Q)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)并将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)；
或者，将第264位的丝氨酸(S)突变为苯丙氨酸(F)、将第490位的酪氨酸(Y)突变为赖氨酸(K)并将第321位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.携带权利要求2所述基因的重组细胞。
5.一种异源重组表达所述肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体的方法，其特征在于，是将编码肝素裂解酶III或权利要求1所述肝素裂解酶III突变体的基因与载体连接，然后，将重组载体转入宿主中得到转化体，对转化体株进行培养并从培养物中分离得到肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体。
6.根据权利要求5所述的一种异源重组表达所述肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体的方法，其特征在于，将肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体与纯化标签融合，得到融合蛋白，将融合蛋白在宿主中进行表达。
7.根据权利要求5所述的一种异源重组表达所述肝素裂解酶III或肝素裂解酶III突变体的方法，其特征在于，从Bacteroidesthetaiotaomicron中获得肝素裂解酶III的DNA序列，对其进行扩增，并和载体进行重组构建，得到重组载体；将所述重组载体转化至大肠杆菌进行表达，获得重组菌株；培养所述转化体，并将培养物进行物理破碎处理，得到所述肝素裂解酶III。
8.权利要求1所述肝素裂解酶III突变体在切割肝素或硫酸乙酰肝素中α-1,4糖苷键中的应用。
9.权利要求1所述肝素裂解酶III突变体在裂解肝素中的应用。
10.权利要求1所述肝素裂解酶III突变体在制备抗凝血药物中的应用。
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