CN113862248B - 肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用 - Google Patents

肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用，属于生物工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌为宿主异源表达Bacteroides thetaiotaomicron来源的肝素裂解酶I，通过N端融合寡肽序列，优化启动子及5'UTR序列，并于BhepI基因C端用GGGGS短肽连接肝素裂解酶III的基因FhepIII，构建融合酶BhepI‑FhepIII，通过两者对肝素钠裂解能力的比较，发现融合酶得到的肝素分子量可低至1300Da以下，且其抗凝血活性更强，为肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的工业化生产及低分子量肝素制备奠定了基础。

Description

肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用
技术领域
本发明涉及肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
肝素，是一种复杂、分散、高度磺酸化的线性糖胺聚糖，广泛存在于细胞表面和胞外基质中，糖链由N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸通过1-4糖苷键连接而成的二糖单元组成。肝素在机体内作为细胞识别、信号传递和抗凝血等的生物活性分子，在临床上长期被用作抗凝血药物，广泛用于内科和防止手术后血栓的形成，但对人体有一定的副作用，如影响血小板的稳定导致手术后大出血等。相比于未分级肝素，低分子量肝素(3000-8000Da)不仅抗凝血活性强、易被机体吸收利用、副作用低，还具有更高的药理活性可预测性和更高的生物利用率。因此，制备低分子量肝素是非常有必要的。
低分子量肝素的制备方法主要有化学降解法(亚硝酸降解法、过氧化氢降解法等)、物理制备法(超滤法、凝胶层析法等)、化学合成法、生物解聚法等。其中，通过生物酶法使用肝素裂解酶在温和的反应条件下专一性制备特定低分子量的肝素越来越受到关注，是目前最常用的降解肝素的方法。肝素裂解酶是一类能够将肝素或硫酸乙酰肝素裂解成不饱和二糖及寡糖的一类糖胺聚糖裂解酶，目前国内外学者已经鉴定并表征了黄杆菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属、鞘氨醇杆菌属及铜绿假单胞菌等微生物来源的肝素裂解酶。
其中，肝素裂解酶I(BhepI)偏好底物磺酸化程度高的肝素结构，可特异性催化肝素结构中连接含有2-3个硫酸基团的二糖单元的1,4糖苷键；肝素裂解酶III(FhepIII)偏好底物磺酸化程度低的硫酸乙酰肝素结构；两者皆可将肝素裂解为低分子量肝素。目前现有肝素裂解酶的表达量都较低，限制了其在制备肝素寡糖方面的应用。
发明内容
[技术问题]
对肝素裂解酶进行异源的表达优化及融合表达是提高酶活与表达量，改善肝素裂解能力的重要途径，并由此获得更高抗凝血活性的低分子量肝素。
[技术方案]
本发明提供了一种融合表达肝素裂解酶的方法，所述方法是将来源于Bacteroides thetaiotaomicron的肝素裂解酶I和肝素裂解酶III利用连接肽融合并在枯草芽孢杆菌中表达。
在一种实施方式中，所述肝素裂解酶I的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述肝素裂解酶III的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，将肝素裂解酶III融合于肝素裂解酶I的N端。
在一种实施方式中，所述连接肽包括但不限于GGGGS、GGGSGGSG、GGGGGGGG、GGSGGSGGSGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGSGGGGSGGGGS。
优选的，所述连接肽为GGGGS。
在一种实施方式中，在肝素裂解酶I的N端插入序列，所述序列包括bltD、cspB、C4、yxjG、ydbD、valS、tufA、ybdD、yvyD或glnA，所述序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～14所示。
优选的，所述序列为yvyD、lnA、ydbD或tufA。
在一种实施方式中，以pSTOP1622质粒为骨架，利用启动子PxylA、PspovG、PlytR或P43启动肝素裂解酶的表达。
优选的，所述启动子为PspovG。
在一种实施方式中，将启动子的5'UTR替换为核苷酸序列如SEQ ID NO.15～18所示。
优选的，所述5'UTR序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.18所示。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis WB600。
本发明提供了所述方法制备得到的融合肝素裂解酶。
本发明提供了一种制备所述肝素裂解酶的方法，是将构建的重组基因工程菌接种到含有20μg·mL-1四环素的新鲜TB液体培养基中，在35～37℃、200～220rpm培养8-10h至对数中期，将菌液转接到发酵罐中进行发酵培养，初始转速500～600rpm，发酵温度22～25℃，培养30～36h。转速与溶氧偶联，控制发酵过程中培养基中的溶氧量不低于通气搅拌开始后、接种前的培养基中的饱和溶氧量的30％；整个过程通气量为1.5vvm，维持发酵液的pH为7.0。
在一种实施方式中，所述发酵培养基为TB培养基。
在一种实施方式中，发酵液的pH利用2M NaOH调节。
本发明提供了一种制备低分子量肝素的方法，其特征在于，以肝素钠为底物，加入所述融合肝素裂解酶，反应后得到低分子量肝素。
在一种实施方式中，所述融合肝素裂解酶的添加量为不少于1200U/g底物。
在一种实施方式中，将融合肝素裂解酶与底物过夜彻底反应。
在一种实施方式中，反应体系中含有pH7.4±0.2的PBS缓冲液。
本发明提供了所述融合肝素裂解酶在制备低分子量肝素中的应用。
[有益效果]
本发明提供了一种Bacteroides thetaiotaomicron来源的肝素裂解酶I在枯草芽孢杆菌中构建与异源重组表达优化的方法，最终胞内酶活可以达到5.46×104U/L；并且提供了一种融合表达肝素裂解酶BhepI-FhepIII的方法，裂解结果表明融合酶更有利于低分子量肝素的制备，当添加的融合酶量达到1200U/g底物时，分子量就可低于1300Da，适于制备低分子量的肝素，且获得的肝素康凝血活性更强，能够获得更高的抗凝血活性。
附图说明
图1所示为实施例1中诱导后不同培养时间的酶活。
图2所示为实施例1中添加不同终浓度木糖诱导剂的酶活。
图3所示为实施例2中替换不同组成型启动子后在不同时间点的酶活。
图4所示为实施例3中N端融合寡肽序列后的酶活。
图5所示为实施例4中5'UTR序列的位置及替换示意图。
图6所示为实施例4中替换5'UTR序列后胞内酶活的变化情况。
图7所示为实施例5中替换不同连接肽后的胞内酶活变化情况。
图8所示为实施例6中重组菌BSBH/PspovG 5'UTR4-yvyD、突变体S264F/Y490K/D321N、重组菌BSBH/FhepIII在3-L发酵罐中不同时间点的酶活变化。
图9所示为实施例7中不同重组酶裂解肝素钠的分子量变化情况。
具体实施方式
实施例涉及的相关核苷酸序列信息：
SEQ ID NO.1序列信息是来源于Bacteroides thetaiotaomicron的编码肝素裂解酶I的基因BhepI的核苷酸序列。
肝素裂解酶的酶活测定方法：
以肝素钠为底物，底物浓度为20g/L，用50mM PB缓冲液(pH 8.0)溶解底物。酶活测定的反应体系为1mL，含40μL酶液和预热的960μL肝素钠底物溶液。30℃反应1min，通过分光光度计测定232nm波长下的吸光值变化。酶活定义单位：在30℃条件下，每分钟产生1μmol4,5-不饱和糖醛酸所需要的酶量为1U。
实施例1：BhepI在枯草芽孢杆菌中的诱导型表达
采用标准的PCR扩增体系和程序，所用引物如表1所示。以质粒pET28a-BhepI为模版，设计引物STOP-BhepI-F和STOP-BhepI-R，扩增获取含有编码肝素裂解酶I基因BhepI的DNA片段。通过Gibson组装将所得基因插入到质粒pSTOP1622的PxylA木糖诱导型启动子的下游，得到诱导型重组质粒pSTOP-BhepI，并化转到B.subtilis WB600细胞中，获得重组菌株BSBH，对重组菌的培养时间和诱导剂添加量进行优化。将所得重组菌株接种于3mL含有20μg/mL四环素的新鲜LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8-10h至对数中期，然后按1％(v/v)接种量转接到装有50mL含四环素的新鲜TB液体培养基的250mL三角摇瓶中，30℃、220rpm培养3h，加入不同终浓度的木糖诱导后，置于25℃、220rpm条件下继续培养。
结果如图1所示，诱导后培养24h，重组菌株胞内BhepI酶活达到8.48×103U/L。
如图2所示，当加入15g/L木糖诱导时，重组菌株胞内BhepI酶活达到最高，为1.09×104U/L。
表1引物的核苷酸序列
实施例2：替换组成型启动子提高BhepI的组成型表达水平
选择B.subtilis内源三种启动子PspovG、PlytR和P43，将上述实施例1中构建的重组质粒pSTOP-BhepI的PxylA启动子分别替换成PspovG、PlytR和P43启动子。设计引物P43-F和P43-R，所用引物如表1所示，从质粒P43NMK中扩增出P43启动子的基因序列，通过Gibson组装替换pSTOP-BhepI质粒的PxylA启动子，获得重组质粒P43-BhepI，以同样的方法获得重组质粒PspovG-BhepI和PlytR-BhepI。并分别化转到B.subtilis WB600细胞中，获得重组菌株BSBH/PspovG、BSBH/PlytR和BSBH/P43。将所得重组菌株接种于3mL含有20μg/mL四环素的新鲜LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8-10h至对数中期，然后按1％(v/v)接种量转接到装有50mL含四环素的新鲜TB液体培养基的250mL三角摇瓶中，置于25℃、220rpm条件下继续培养。
结果如图3所示，培养30h时，重组菌株BSBH/PspovG胞内BhepI酶活最高，达到1.41×104U/L，表明选择使用组成型启动子PspovG调控的BSBH/PspovG具有更高的肝素裂解酶I表达强度。
实施例3：优化N端序列提高BhepI的表达水平
在上述实施例2中构建的重组质粒的基础上，在BhepI基因的N端插入十种寡肽序列，N端序列如表2所示。使用引物ybdD-F和ybdD-R以质粒PspovG-BhepI为模板进行全质粒扩增，获得重组质粒PspovG-ybdD-BhepI，依此类推，所用引物如表1所示。将构建的重组质粒分别化转到B.subtilis WB600细胞中，获得10株重组菌株BSBH/PspovG-bltD、BSBH/PspovG-cspB、BSBH/PspovG-C4、BSBH/PspovG-yxjG、BSBH/PspovG-ydbD、BSBH/PspovG-valS、BSBH/PspovG-tufA、BSBH/PspovG-ybdD、BSBH/PspovG-yvyD和BSBH/PspovG-glnA。将所得重组菌株接种于3mL含有20μg/mL四环素的新鲜LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8-10h至对数中期，然后按1％(v/v)接种量转接到装有50mL含四环素的新鲜TB液体培养基的250mL三角摇瓶中，置于25℃、220rpm条件下继续培养。
结果如图4所示，培养30h，重组菌株BSBH/PspovG-yvyD的胞内BhepI酶活达到1.97×104U/L，比出发菌株BSBH/PspovG(1.41×104U/L)提高了41.7％。
结果表明插入适当的N端序列能够提高肝素裂解酶I的表达水平。
表2 N端序列
N端序列 序列
bltD ATGAGTATAAACATAAAAGCAGTAACTGATGATAATCGTGCTGCA SEQ ID NO.5
cspB ATGCAAAACGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTGAAAAAGGTTTC SEQ ID NO.6
C4 ATGAAAAAAATCAAAAACAACCAACAAAAAAATGAACTGATTCAA SEQ ID NO.7
yxjG ATGTCACAACAAACAACACCCGCAGAACAAAAATCACTTCAAAGA SEQ ID NO.8
ydbD ATGTTTAAGCACACAAAAATGCTGCAGCATCCTGCTAAACCAGAT SEQ ID NO.9
valS ATGGAAACGAATGAACAAACAATGCCGACGAAATATGATCCGGCA SEQ ID NO.10
tufA ATGGCTAAAGAAAAATTCGACCGTTCCAAATCACATGCCAATATT SEQ ID NO.11
ybdD ATGAAGCATATTTATGAGAAAGGAACATCTGACAACGTACTTTTG SEQ ID NO.12
yvyD ATGAACAAAAACATCAAAAAAGAAAATATTGAAGTGACACCCAAA SEQ ID NO.13
glnA ATGAAAAAAAACACTGAAGAAAACATCGAAAAAAAAGTAAAAGAA SEQ ID NO.14
实施例4：优化5'UTR序列提高BhepI的表达水平
在实施例3的基础上，选择了四条5'UTR序列，具体示意如图5所示。5'UTR序列如表3所示，分别替换重组质粒PspovG-yvyD-BhepI上的PspovG启动子的原始5'UTR序列。使用引物5'UTR1-F和5'UTR1-R以质粒PspovG-yvyD-BhepI为模板进行全质粒扩增，获得重组质粒PspovG 5′UTR1-yvyD-BhepI，依此类推，所用引物如表1所示，最终获得4种构建的重组质粒。将其分别化转到B.subtilis WB600细胞中，获得4株重组菌株BSBH/PspovG 5'UTR1-yvyD、BSBH/PspovG 5'UTR2-yvyD、BSBH/PspovG 5'UTR3-yvyD、BSBH/PspovG 5'UTR4-yvyD。将所得重组菌株接种于3mL含有20μg/mL四环素的新鲜LB液体培养基中，37℃、220rpm培养8-10h至对数中期，然后按1％(v/v)接种量转接到装有50mL含四环素的新鲜TB液体培养基的250mL三角摇瓶中，置于25℃、220rpm条件下继续培养。
结果如图6所示，培养30h，重组菌株BSBH/PspovG 5'UTR4-yvyD的胞内BhepI酶活最高，达到了2.65×104U/L，相比于出发菌株BSBH/PspovG-yvyD(1.97×104U/L)提高了34.5％。
结果表明优化5'UTR序列能够提高肝素裂解酶I的表达水平。
表3 5'UTR序列
5'UTR 序列
5'UTR1 GTGATTAGAAAGGAGGAATGTACAC SEQ ID NO.15
5'UTR2 GTGATAGCGGTACATTAGAAAGGAGGAATGTATA SEQ ID NO.16
5'UTR3 GTACATTAGAAAGGAGGAATGTATA SEQ ID NO.17
5'UTR4 GTATATTAGAAAGGAGGAATATATA SEQ ID NO.18
实施例5：肝素裂解酶BhepI-FhepIII的融合表达
在实施例4的基础上，利用柔性连接肽将FhepIII基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)融合于BhepI基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的C端，即得到BhepI-FhepIII基因，从而两者蛋白结构域之间可相互作用，促进酶的表达，选择的连接肽包括GGGGS、GGGSGGSG、GGGGGGGG、GGSGGSGGSGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGSGGGGSGGGGS。
在得到BhepI-FhepIII融合基因后，替换重组质粒PspovG 5′UTR1-yvyD-BhepI中的BhepI基因，将得到的重组质粒化转至宿主B.subtilis WB600中，得到重组菌BSBH/FhepIII，并进行肝素裂解酶BhepI-FhepIII的融合表达。
结果如图7所示，在BhepI基因C端用GGGGS短肽连接FhepIII基因，胞内BhepI-FhepIII酶活最高，为6.55×103U/L。
在此基础上，同样的，利用GGGGS短肽在BhepI基因N端融合FhepIII基因，从而得到FhepIII-BhepI基因，随后替换重组质粒PspovG 5′UTR1-yvyD-BhepI中的BhepI基因，将得到的重组质粒化转至宿主B.subtilis WB600中，进行肝素裂解酶FhepIII-BhepI的融合表达，并与C端融合的结果进行比较。
结果如表4所示，融合酶BhepI-FhepIII的比酶活是融合酶FhepIII-BhepI的3.3倍，因此最终选择通过GGGGS短肽连接得到BhepI-FhepIII基因，并进行后续BhepI-FhepIII的融合表达。
表4不同重组酶的动力学参数和比酶活
vmax Km Kcat Kcat/Km 比酶活
BhepI 21.05 1.748 1473.5 843.0 18.75
FhepIII 14.45 18.5 1011.5 54.7 5.33
BhepI-FhepIII 21.44 2.406 1500.8 623.8 20.11
FhepIII-BhepI 16.3 21.7 1141.0 52.6 6.12
实施例6：BhepI、FhepIII及融合酶BhepI-FhepIII的发酵罐发酵培养
3-L发酵罐培养：将实施例4构建的重组基因工程菌株BSBH/PspovG 5′UTR4-yvyD、重组基因工程菌株突变体FhepIII-S264F/Y490K/D321N(公开于公开号为CN111471669A的专利文献中)及实施例5构建的重组基因工程菌株BSBH/FhepIII接种到含有20μg·mL-1四环素的新鲜TB液体培养基中，37℃、220rpm培养8-10h至对数中期，然后以1％(V/V)的接种量转接到3-L发酵罐中进行分批发酵培养，发酵罐的装液量为1L，发酵培养基为TB培养基，初始转速600rpm，发酵温度25℃，培养36h。发酵过程中，转速与溶氧偶联，控制发酵过程中培养基中的溶氧量是通气搅拌开始后、接种前的培养基中的饱和溶氧量的30％以上。整个过程通气量为1.5vvm，自动添加2M NaOH维持发酵液的pH为7.0。发酵结束后，4℃、6800rpm离心10min收集发酵上清液。
结果如图8A所示，培养32h，重组菌株BSBH/PspovG 5′UTR4-yvyD的胞内BhepI酶活最高，达到5.46×104U/L，相比摇瓶水平提高了106％；如图8B所示，重组菌株突变体FhepIII-S264F/Y490K/D321N的胞内FhepIII酶活也达到最高，为8.68×103U/L，同时如图8C所示，发酵32h时，重组菌株BSBH/FhepIII的胞内BhepI-FhepIII酶活最高，为1.51×104U/L。
实施例7：BhepI与融合酶BhepI-FhepIII制备低分子量肝素的应用
低分子量肝素的制备方法：使用50mM PBS缓冲液(pH 7.4)配制5g/L肝素钠溶液以作为底物，调节pH为7.4。在此之后，分别在反应体系中加入0、2000U/L、4000U/L、6000U/L、8000U/L、10000U/L的酶，包括单独添加BhepI、FhepIII、融合酶BhepI-FhepIII以及按照酶活比1:1的比例同时添加BhepI和FhepIII。具体的加酶量跟据实施例6得到样品的最高酶活除以体系所需要的梯度酶活算得，此后，置于30℃金属浴中过夜彻底反应后，将反应液在沸水中加热3min使酶失活，高速离心后用0.22μm的滤膜过滤得到样品，从而测定制得肝素钠的分子量。
低分子量肝素的测定方法：寡糖分子量的测定采用凝胶渗透色谱-液相色谱(GPC-HPLC)法。所用色谱柱为UltrahydrogelTM Linear column 7.8×300mm，流动相为NaNO3溶液(0.1mol·L-1)，0.9mL·min-1，柱温40℃，进样量40μL。测量每个样品的洗脱体积，根据葡聚糖标准样品的分子量和洗脱体积之间的标准曲线，用GPC软件计算出每个样品的重均分子量(MW)。
结果如图9所示，总体上，肝素的分子量随加酶量酶活的增加呈先下降后保持不变的趋势。用FhepIII单独作用时，当加入的酶活为8000U/L，分子量降至4500Da，当酶量再增加时，分子量不再大幅下降。用BhepI单独作用时，加酶量酶活为6000U/L时，分子量达到了2300Da，此后加酶量再增加，分子量基本保持不变。用FhepIII和BhepI同时作用时(酶活1:1)，加酶量酶活达到4000U/L时，分子量就达到了2100Da，随后酶活增加分子量并不下降。用融合酶BhepI-FhepIII裂解时，当加入的酶活达到6000U/L时，分子量就已下降至1300Da。相比于肝素裂解酶FhepIII、BhepI及两者同时作用，融合酶BhepI-FhepIII得到的肝素分子量更低、裂解效果更好。
实施例8：抗凝血活性的测定
为了评估实施例7中不同肝素裂解酶及其组合得到的几种低分子量肝素的应用价值，对其抗凝血活性进行了评估，分别测定了活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和血浆凝血酶时间(TT)，三者分别反应内源性凝血途径、外源性凝血途径和共同凝血途径。
采用试剂盒法测定肝素的APTT、PT及TT。以未降解的肝素钠标准品为阳性对照，生理盐水为阴性对照。APTT测定方法：取待测血浆50μL，加入50μL待测样品，再加入APTT试剂50μL混匀后在37℃下温浴3min，然后快速加入50μL氯化钙溶液，立即混匀启动计时，记录血液凝固时间，即为APTT。PT测定方法：取待测血浆50μL，加入50μL待测样品，37℃下温浴3min，再加入PT试剂100μL，立即混匀启动计时，记录血液凝固时间，即为PT。TT测定方法：取待测血浆100μL，加入100μL待测样品，37℃下温浴3min，再加入TT试剂100μL，立即混匀启动计时，记录血液凝固时间，即为TT。以上操作均由武汉景川诊断技术股份有限公司(http://www.ztbiotech.com/)进行。
结果如表5所示，相比于普通未分级肝素，用BhepI单独降解时得到的低分子量肝素APTT为22s，PT为59s，TT为21s，分别下降了81.7％、50.8％和82.5％，下降结果最为显著。用BhepI和FhepIII共同作用混合降解得到的低分子量肝素APTT下降了18.3％，为98s，PT没有降低，TT为34s，降低了71.7％。而用FhepIII和融合酶BhepI-FhepIII分别单独降解时，APTT和PT均未下降，TT分别为51s和44s，分别下降了57.5％和63.3％。
由此可知，FhepIII和融合酶BhepI-FhepIII单独降解时得到的低分子量肝素具有更好的抗凝血活性。根据实施例7所述，FhepIII无法将分子量为4500Da的肝素进一步裂解，因此，融合酶BhepI-FhepIII的应用价值最强，可以用于制备高抗凝血活性的低分子量肝素。
表5制得的不同低分子量肝素抗凝血活性的评估情况
BhepI FhepIII BhepI-FhepIII BhepI+FhepIII
APTT(s) 22±0.5s ＞120s ＞120s 98±0.5s
PT(s) 59±0.5s ＞120s ＞120s ＞120s
TT(s) 21±0.5s 51±0.5s 44±0.5s 34±0.5s
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 肝素裂解酶在枯草芽孢杆菌中的融合表达及其应用
<130> BAA211207A
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctgactg ctcagactaa aaatacgcaa acactgatgc cactcaccga acgggtaaac 60
gtacaggctg actctgcacg tatcaaccag attattgacg gttgctgggt agctgtcggg 120
acgaataaac ctcatgccat tcagcgtgat tttaccaacc tgtttgatgg caagccctcc 180
tatcgctttg aactcaaaac tgaagacaat acactggaag gttatgcgaa aggagaaacg 240
aaaggacgtg ccgagttttc atattgctat gcaacttccg acgatttcag gggattacct 300
gccgacgttt atcagaaagc acagatcaca aagacagttt atcatcacgg gaagggagct 360
tgtccgcaag gaagttcccg cgactatgag ttttcggttt atattccttc ttctttagac 420
agcaatgtct ccaccatctt tgcccaatgg cacggaatgc ccgaccggac gctggtccag 480
actcctcagg gcgaggtgaa gaaactgact gttgacgaat ttgtagaact ggaaaaaacg 540
accttcttca aaaagaatgt cggacacgaa aaagtggcca gactggataa acaaggtaat 600
ccggtgaaag ataaaaatgg aaaacctgta tataaggcag gaaaacccaa cggatggttg 660
gttgaacagg gaggataccc gccattggca ttcggatttt ccggaggact gttttatatc 720
aaagcaaact ccgaccgtaa atggctgaca gacaaagatg accgttgcaa tgcaaacccg 780
ggaaagacgc ccgttatgaa accgctgact tctgaataca aggcatccac cattgcctac 840
aaattacctt ttgccgattt cccgaaagac tgctggatta ctttccgtgt ccatatcgac 900
tggacggtct atggcaagga agcggaaacg attgtgaaac cgggcatgct ggatgtacgg 960
atggattatc aggagcaagg taagaaagtg agcaaacaca ttgtcgataa tgagaagatt 1020
ctgattggac gtaacgacga agacgggtat tactttaagt tcggaattta ccgcgtaggt 1080
gatagtaccg ttcccgtttg ctacaatctc gcaggatatt cggaaaga 1128
<210> 2
<211> 376
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Leu Thr Ala Gln Thr Lys Asn Thr Gln Thr Leu Met Pro Leu Thr
1 5 10 15
Glu Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Arg Ile Asn Gln Ile Ile
20 25 30
Asp Gly Cys Trp Val Ala Val Gly Thr Asn Lys Pro His Ala Ile Gln
35 40 45
Arg Asp Phe Thr Asn Leu Phe Asp Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu
50 55 60
Leu Lys Thr Glu Asp Asn Thr Leu Glu Gly Tyr Ala Lys Gly Glu Thr
65 70 75 80
Lys Gly Arg Ala Glu Phe Ser Tyr Cys Tyr Ala Thr Ser Asp Asp Phe
85 90 95
Arg Gly Leu Pro Ala Asp Val Tyr Gln Lys Ala Gln Ile Thr Lys Thr
100 105 110
Val Tyr His His Gly Lys Gly Ala Cys Pro Gln Gly Ser Ser Arg Asp
115 120 125
Tyr Glu Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Leu Asp Ser Asn Val Ser
130 135 140
Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Met Pro Asp Arg Thr Leu Val Gln
145 150 155 160
Thr Pro Gln Gly Glu Val Lys Lys Leu Thr Val Asp Glu Phe Val Glu
165 170 175
Leu Glu Lys Thr Thr Phe Phe Lys Lys Asn Val Gly His Glu Lys Val
180 185 190
Ala Arg Leu Asp Lys Gln Gly Asn Pro Val Lys Asp Lys Asn Gly Lys
195 200 205
Pro Val Tyr Lys Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Leu Val Glu Gln Gly
210 215 220
Gly Tyr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Phe Ser Gly Gly Leu Phe Tyr Ile
225 230 235 240
Lys Ala Asn Ser Asp Arg Lys Trp Leu Thr Asp Lys Asp Asp Arg Cys
245 250 255
Asn Ala Asn Pro Gly Lys Thr Pro Val Met Lys Pro Leu Thr Ser Glu
260 265 270
Tyr Lys Ala Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Leu Pro Phe Ala Asp Phe Pro
275 280 285
Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Arg Val His Ile Asp Trp Thr Val Tyr
290 295 300
Gly Lys Glu Ala Glu Thr Ile Val Lys Pro Gly Met Leu Asp Val Arg
305 310 315 320
Met Asp Tyr Gln Glu Gln Gly Lys Lys Val Ser Lys His Ile Val Asp
325 330 335
Asn Glu Lys Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Phe
340 345 350
Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asp Ser Thr Val Pro Val Cys Tyr
355 360 365
Asn Leu Ala Gly Tyr Ser Glu Arg
370 375
<210> 3
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaagaaca tcttctttat ttgcttttgt gcgctattcg catttagtgg atgcgcagac 60
gatgatgatg atctattaac cggagggaat gtagatatag atctgcttcc tgatgccaaa 120
ccaaacgatg ttgttgatcc tcaagtattc gaggctatca acctcaacta ccccggtctg 180
gaaaaagtta aagaattcta cgaggcaggc gaacattatt atgcagccaa tgctttattg 240
gaatactata gaacgagaac caatgttaca aatccgaact tatctttaat taatgtgacg 300
atctcagaag cagagcaggc aaaagctgat tatgcactgg tagattatcg ctttcatgtt 360
aacaacttct atgaagataa ggaaaccctg aaaccctatt cagtaaaaca agacggaggt 420
ataaactggg agtattcacc gaaagatgca tctgatgaat atcagaaaca acttcatcgc 480
catcagtggt tcatccccca agccaaagct taccgtgtaa gtggagatga gaaatacatt 540
caatcatgga ttgaggtata taagaattgg atagaaaaca atccgaagcc tacaacagga 600
cctaatacta cctcatggtg gcagttacag gtatctaccc gtatcggtga ccaagtacaa 660
ttgcttgaat acttcaagaa ctctgttaat tttactccgg aatggctttc tacattcttg 720
gtagaatttg cagaacaagc agactttctc gtagattatc cgtatgaatc aggaggtaac 780
atacttatat tccaagcgaa tgcattggct actgccggaa cgttaatgcc ggaatttaag 840
aatgcggaga aatggatgaa tacaggatat cagatactta gcgaagaagt acaaaatcaa 900
attatgagtg acggatggca caaggaaatg tcgctccact atcatatcgg tatcgttgcg 960
aacttctacg aggcaatgaa attagcagag gcaaaccaac tctccagtaa attgccgtca 1020
gattttacag aaccactgcg taaagcagca gaagtagtga tgtacttcac atatcctaat 1080
tactttatca agggttccga taatgtggtc ccaatgttca acgactcatg gagccggaca 1140
cgtaatgtcc ttaaaaatac gaactttaag caatatgtgg aaatgttccc ggatagtgaa 1200
gaattgaaat atatgcaaac tgccggaaat ggtggaacag cacagggacg tacccccaat 1260
aatgatatga agctattcga ccaggcagga tattatgtat tacgaaatgg ttggacaccg 1320
gcttctacag tcatgatttt aagcaataac aagagtaatg atgcttctaa ttcacttagt 1380
gcttatagtc ataaccagcc agataatgga actttcgaac tttaccataa cggacgaaat 1440
tttttccctg attcaggtgt gtgtactaaa tataccagcg gtggagacaa tgacttacgt 1500
tactggttcc gtggtatcga taaacacaat actttatcaa tcggaaaaca gaatatcaaa 1560
aaggcagcag gcaaactgtt gaaatcagag gaaggagcga ctgaattagt tgtatttgag 1620
aatcaaggat atgataactt aaagcaccgt cgtgcagtct tttacgtaaa caaaaaattc 1680
tttgtattag tagatgaagg tattggaaat gcagaaggta ctattaatct aagtttcaat 1740
ctttgcgaag gcactgccag cgaagttgtt atggatacag ataaaaatgg agtccataca 1800
gcattcagca ataataataa cattatagtc cgcacttttg ccaataaagc agtaacctgt 1860
tctccattca cggggcgtat agcctatctc gtagacgggg cttacaacac acgtcaatct 1920
tataccatcg atatgaataa gagtgctgat gaaaccgcac gttacattac agttattctt 1980
ccagtcaatg gaagtactga tacgtccagt atctcagcca aattcataga tagcggatat 2040
tccgaaaaca gcgcttctgt agaagtaagt gtgaatggag agacacatac attatcttat 2100
accttataa 2109
<210> 4
<211> 702
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Lys Asn Ile Phe Phe Ile Cys Phe Cys Ala Leu Phe Ala Phe Ser
1 5 10 15
Gly Cys Ala Asp Asp Asp Asp Asp Leu Leu Thr Gly Gly Asn Val Asp
20 25 30
Ile Asp Leu Leu Pro Asp Ala Lys Pro Asn Asp Val Val Asp Pro Gln
35 40 45
Val Phe Glu Ala Ile Asn Leu Asn Tyr Pro Gly Leu Glu Lys Val Lys
50 55 60
Glu Phe Tyr Glu Ala Gly Glu His Tyr Tyr Ala Ala Asn Ala Leu Leu
65 70 75 80
Glu Tyr Tyr Arg Thr Arg Thr Asn Val Thr Asn Pro Asn Leu Ser Leu
85 90 95
Ile Asn Val Thr Ile Ser Glu Ala Glu Gln Ala Lys Ala Asp Tyr Ala
100 105 110
Leu Val Asp Tyr Arg Phe His Val Asn Asn Phe Tyr Glu Asp Lys Glu
115 120 125
Thr Leu Lys Pro Tyr Ser Val Lys Gln Asp Gly Gly Ile Asn Trp Glu
130 135 140
Tyr Ser Pro Lys Asp Ala Ser Asp Glu Tyr Gln Lys Gln Leu His Arg
145 150 155 160
His Gln Trp Phe Ile Pro Gln Ala Lys Ala Tyr Arg Val Ser Gly Asp
165 170 175
Glu Lys Tyr Ile Gln Ser Trp Ile Glu Val Tyr Lys Asn Trp Ile Glu
180 185 190
Asn Asn Pro Lys Pro Thr Thr Gly Pro Asn Thr Thr Ser Trp Trp Gln
195 200 205
Leu Gln Val Ser Thr Arg Ile Gly Asp Gln Val Gln Leu Leu Glu Tyr
210 215 220
Phe Lys Asn Ser Val Asn Phe Thr Pro Glu Trp Leu Ser Thr Phe Leu
225 230 235 240
Val Glu Phe Ala Glu Gln Ala Asp Phe Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Asn Ile Leu Ile Phe Gln Ala Asn Ala Leu Ala Thr Ala
260 265 270
Gly Thr Leu Met Pro Glu Phe Lys Asn Ala Glu Lys Trp Met Asn Thr
275 280 285
Gly Tyr Gln Ile Leu Ser Glu Glu Val Gln Asn Gln Ile Met Ser Asp
290 295 300
Gly Trp His Lys Glu Met Ser Leu His Tyr His Ile Gly Ile Val Ala
305 310 315 320
Asn Phe Tyr Glu Ala Met Lys Leu Ala Glu Ala Asn Gln Leu Ser Ser
325 330 335
Lys Leu Pro Ser Asp Phe Thr Glu Pro Leu Arg Lys Ala Ala Glu Val
340 345 350
Val Met Tyr Phe Thr Tyr Pro Asn Tyr Phe Ile Lys Gly Ser Asp Asn
355 360 365
Val Val Pro Met Phe Asn Asp Ser Trp Ser Arg Thr Arg Asn Val Leu
370 375 380
Lys Asn Thr Asn Phe Lys Gln Tyr Val Glu Met Phe Pro Asp Ser Glu
385 390 395 400
Glu Leu Lys Tyr Met Gln Thr Ala Gly Asn Gly Gly Thr Ala Gln Gly
405 410 415
Arg Thr Pro Asn Asn Asp Met Lys Leu Phe Asp Gln Ala Gly Tyr Tyr
420 425 430
Val Leu Arg Asn Gly Trp Thr Pro Ala Ser Thr Val Met Ile Leu Ser
435 440 445
Asn Asn Lys Ser Asn Asp Ala Ser Asn Ser Leu Ser Ala Tyr Ser His
450 455 460
Asn Gln Pro Asp Asn Gly Thr Phe Glu Leu Tyr His Asn Gly Arg Asn
465 470 475 480
Phe Phe Pro Asp Ser Gly Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ser Gly Gly Asp
485 490 495
Asn Asp Leu Arg Tyr Trp Phe Arg Gly Ile Asp Lys His Asn Thr Leu
500 505 510
Ser Ile Gly Lys Gln Asn Ile Lys Lys Ala Ala Gly Lys Leu Leu Lys
515 520 525
Ser Glu Glu Gly Ala Thr Glu Leu Val Val Phe Glu Asn Gln Gly Tyr
530 535 540
Asp Asn Leu Lys His Arg Arg Ala Val Phe Tyr Val Asn Lys Lys Phe
545 550 555 560
Phe Val Leu Val Asp Glu Gly Ile Gly Asn Ala Glu Gly Thr Ile Asn
565 570 575
Leu Ser Phe Asn Leu Cys Glu Gly Thr Ala Ser Glu Val Val Met Asp
580 585 590
Thr Asp Lys Asn Gly Val His Thr Ala Phe Ser Asn Asn Asn Asn Ile
595 600 605
Ile Val Arg Thr Phe Ala Asn Lys Ala Val Thr Cys Ser Pro Phe Thr
610 615 620
Gly Arg Ile Ala Tyr Leu Val Asp Gly Ala Tyr Asn Thr Arg Gln Ser
625 630 635 640
Tyr Thr Ile Asp Met Asn Lys Ser Ala Asp Glu Thr Ala Arg Tyr Ile
645 650 655
Thr Val Ile Leu Pro Val Asn Gly Ser Thr Asp Thr Ser Ser Ile Ser
660 665 670
Ala Lys Phe Ile Asp Ser Gly Tyr Ser Glu Asn Ser Ala Ser Val Glu
675 680 685
Val Ser Val Asn Gly Glu Thr His Thr Leu Ser Tyr Thr Leu
690 695 700
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgagtataa acataaaagc agtaactgat gataatcgtg ctgca 45
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgcaaaacg gtaaagtaaa atggttcaac tctgaaaaag gtttc 45
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgaaaaaaa tcaaaaacaa ccaacaaaaa aatgaactga ttcaa 45
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgtcacaac aaacaacacc cgcagaacaa aaatcacttc aaaga 45
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgtttaagc acacaaaaat gctgcagcat cctgctaaac cagat 45
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggaaacga atgaacaaac aatgccgacg aaatatgatc cggca 45
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atggctaaag aaaaattcga ccgttccaaa tcacatgcca atatt 45
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgaagcata tttatgagaa aggaacatct gacaacgtac ttttg 45
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atgaacaaaa acatcaaaaa agaaaatatt gaagtgacac ccaaa 45
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atgaaaaaaa acactgaaga aaacatcgaa aaaaaagtaa aagaa 45
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gtgattagaa aggaggaatg tacac 25
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gtgatagcgg tacattagaa aggaggaatg tata 34
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gtacattaga aaggaggaat gtata 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gtatattaga aaggaggaat atata 25

Claims (8)

1. 一种融合表达肝素裂解酶的方法，其特征在于，将来源于Bacteroides thetaiotaomicron的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的肝素裂解酶I和氨基酸序列如SEQID NO.4所示的肝素裂解酶III利用连接肽融合并在枯草芽孢杆菌中表达，将肝素裂解酶III融合于肝素裂解酶I的C端；
利用启动子PspovG启动肝素裂解酶的表达，同时采用SEQ ID NO.15的5'UTR1序列替换PspovG启动子的原始5'UTR序列；在肝素裂解酶I的N端插入SEQ ID NO.13所示的yvyD序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接肽包括GGGGS、GGGSGGSG、GGGGGGGG、GGSGGSGGSGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GSGGGSGGGGSGGGGS。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以pSTOP1622质粒为骨架，利用启动子PspovG启动肝素裂解酶的表达。
4.权利要求1~3任一所述方法制备得到的融合肝素裂解酶。
5.一种制备低分子量肝素的方法，其特征在于，以肝素钠为底物，加入权利要求4所述融合肝素裂解酶，反应后得到低分子量肝素钠。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述融合肝素裂解酶的添加量不少于1200U/g底物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在pH为7.4±0.2的体系中进行反应。
8.权利要求4所述融合肝素裂解酶在制备低分子量肝素中的应用。
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