CN111269907B

CN111269907B - 一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN111269907B
Application number: CN202010260033.5A
Authority: CN
Inventors: 李恒; 史劲松; 李星霖; 吴雯; 龚劲松; 许正宏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111269907A

Abstract

本发明公开了一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明基于褐藻胶裂解酶的结构推测，采用结构序列分析方法，确定对催化域附近的loop区域进行改造，并通过定点突变和组合突变进行改造，得到对PolyG片段具有较高的降解能力的突变体；将亲本褐藻胶裂解酶氨基酸序列中位于催化域附近的loop区205位、210位突变为酪氨酸，将褐藻胶裂解酶对底物的偏好性由M转变为G，酶活6100U/mL，稳定性得以提高。

Description

一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

褐藻是三大藻类之一，主要成分为褐藻胶、甘露醇和海带多糖。其中，甘露醇和海带多糖的利用的相关研究较为成熟，因此，如何高效降解褐藻胶并实现工业化应用是目前研究的热点。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)构成的线性多糖，其降解产物褐藻寡糖具有重要的生理活性，如抗氧化、抗肿瘤、促进植物根细胞生长等，因此受到了广泛的关注。

目前，制备褐藻寡糖的方法主要是酸解等化学法，制备条件剧烈且容易造成环境污染，而相比之下，生物法降解褐藻多糖条件温和、易于控制并且绿色环保，因此开发高效、稳定性高且易于制备的褐藻胶裂解酶是十分必要的。

褐藻胶裂解酶(Aly)可以通过β-消除反应机制来降解褐藻胶，并且在降解产物的非还原端形成不饱和的碳碳双键，形成末端不饱和双键结构的降解片段。根据其酶切方式，可将其分为内切型(endo-type)和外切型(exo-type)褐藻胶裂解酶，内切型Aly降解褐藻胶的终产物为褐藻寡糖(AOs)，常见产物聚合度为2-6，而外切型Aly的产物单一，终产物主要为单糖。在应用上，内切型的褐藻胶裂解酶更具有研究和应用价值。根据Aly的底物特异性，可将其分为专一降解甘露糖醛酸片段(PolyM)的酶，专一降解古罗糖醛酸片段(PolyG)的酶以及两种片段都可裂解的双功能裂解酶。目前公开报道的褐藻胶裂解酶中，以能降解PolyM的酶以及双功能酶居多，高效降解PolyG片段的酶较少。但由于PolyG片段较大的刚性使得其来源藻类的难以充分降解，因此可高效降解PolyG片段的酶研究具有重要的研究意义。

目前的研究表明，基因工程是提高褐藻胶裂解酶酶活的主要手段。常规的提高重组蛋白表达水平的方法往往是基于一级氨基酸序列的改造，包括催化关键位点的突变、启动子更换、高分泌能力强的信号肽替换等。但这种改造方法往往存在效果不确定性，需要大量实验工作量。基于更高级的蛋白结构的改造方法更具有针对性和优势。

发明内容

为解决上述问题，本发明基于褐藻胶裂解酶的结构推测，采用结构序列分析方法，确定对催化域附近的loop区域进行改造，并通过定点突变和组合突变进行改造，得到对PolyG片段具有较高的降解能力的突变体。该突变体底物偏好性变化明显，同时其催化活性和稳定性也有一定程度的提高，为其进一步的应用奠定基础。

本发明的第一个目的是提供一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体，所述的突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶为亲本，将亲本褐藻胶裂解酶氨基酸序列201～211位loop区域进行定点突变。

进一步地，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的205位甘氨酸突变为酪氨酸。

进一步地，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的210位天冬酰胺突变为酪氨酸。

进一步地，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的205位甘氨酸突变为酪氨酸，以及210位天冬酰胺突变为酪氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的褐藻胶裂解酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的褐藻胶裂解酶突变体的重组菌。

进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。

本发明的第三个目的是提供所述褐藻胶裂解酶突变体在医药、农业、印染、化工、防治等行业中的应用。

进一步地，所述的应用是采用褐藻胶裂解酶突变体降解褐藻胶为褐藻寡糖。

本发明的有益效果：

本发明基于褐藻胶裂解酶的结构推测，采用结构序列分析方法，确定对催化域附近的loop区域进行改造，并通过定点突变和组合突变进行改造，得到对PolyG片段具有较高的降解能力的突变体；将亲本褐藻胶裂解酶氨基酸序列中位于催化域附近的loop区205位、210位突变为酪氨酸，将褐藻胶裂解酶对底物的偏好性由M转变为G，酶活6100U/mL，稳定性得以提高。

附图说明

图1为模拟的亲本褐藻胶裂解酶结构；

图2为突变改造前后褐藻胶裂解酶核酸凝胶电泳图；M，marker；1～4分别为：WT，Alg205Y，Alg210Y，Alg205-210Y；

图3为突变改造前后褐藻胶裂解酶酶活；

图4为组合突变后褐藻胶裂解酶热稳定性；

图5为亲本褐藻胶裂解酶热稳定性。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：发酵培养条件与酶活测定方法

将重组菌株在LB液体培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 5.0g/L。

褐藻胶裂解酶酶活力的测定：

在改良DNS法上稍作调整。0.1mL酶液加入0.9mL 1％海藻酸钠溶液中，混匀后于45℃下反应20min，然后向体系中加入1mL DNS，沸水浴3min终止反应，迅速定容至10mL，吸取200μL加入96孔板，于520nm处测定吸光值。对照组采用去离子水代替粗酶液。1酶活活力单位(U)定义：上述条件下，1mL的酶液每分钟产1μg还原糖所需的酶量。配制不同浓度的葡萄糖醛酸溶液，加入1mL DNS试剂后进行反应，并于520nm处测定不同浓度溶液的吸光值。根据标准曲线计算酶活。

实施例2：大肠杆菌来源褐藻胶裂解酶晶体结构模拟

以己报道的alginate lyase AlyA5褐藻胶裂解酶(PDB code：4BE3)为模板，构建序列为SEQ ID NO.1褐藻胶裂解酶的结构。第201位天冬氨酸至211位酪氨酸为本研究的褐藻胶裂解酶的催化域附近的loop区域。

实施例3：对亲本褐藻胶裂解酶205位定点突变

利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，设计引物205Y-F，205Y-R(如表1所示)，以已经构建的pET-28a(+)为模版进行PCR，将褐藻胶裂解酶第205位甘氨酸替换为酪氨酸，PCR反应条件为：98℃5min，34个循环(98℃30S、57.6℃60S、72℃1.5min)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，Prime Star(Premix)DNA 20μL，ddH2O 17μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。在Bam HI和Mlu I快切酶作用下进行酶切，尝试利用T4连接酶方法进行连接处理PCR回收产物，将其转化到感受态E.coilJM109，涂布氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，再转入大肠杆菌E.coli Rosetta，得到定点突变的重组菌株。

表1引物序列

实施例4：对亲本褐藻胶裂解酶210位定点突变

设计引物210Y-F，210Y-R(如表1所示)，构建方法如实施例3所述。

实施例5：亲本褐藻胶裂解酶205位与210位的组合突变

设计引物205Y-F，205Y-R，210Y-F，210Y-R(如表1所示)，构建方法如实施例3所述。

实施例6：褐藻胶裂解酶重组菌株的验证

挑选实施例3、4、5中转化子接种到装有LB液体培养基96孔板中，37℃，培养6h，转接到发酵培养基中，接种量为2％，培养30h。收集发酵上清，检测发酵上清酶活。挑选产量发生明显变化的菌株进行摇瓶发酵。检测褐藻胶裂解酶酶活，结果如图3所示。随后，利用Ni²⁺亲和柱进行纯化，获得高纯度蛋白。

实施例7：亲本与突变褐藻胶裂解酶的酶活与底物偏好性比较

分析酶学性质如下表2示，突变体对褐藻胶的酶解活力较亲本褐藻胶裂解酶略有升高，但对底物偏好性发生明显变化，由PM向PG转变。上述结果表明，loop区特定位点的突变能显著影响褐藻胶裂解酶的底物偏好性及催化效率。

表2突变体酶学性质

实施例8：亲本与突变褐藻胶裂解酶的温度稳定性比较

将稀释到一定浓度的酶液分别放置于不同温度的恒温水浴锅中，保温30min后迅速冷却，然后测定残余酶活。以最高酶活作为100％。另外，将酶液放于30、40、50℃恒温水浴锅中。每隔10min取样测定样品残余酶活，确定该酶在不同温度下的稳定性。比较组合突变体与亲本褐藻胶裂解酶的稳定性结果可以发现(图4和5)，突变改造后，酶的热稳定性增强，50℃保温80min仍有55％的活力。

实施例9：褐藻胶裂解酶的降粘应用

将海带液5000r/min离心5min，取上清液50mL加入褐藻胶裂解酶突变体，加酶量1500U，40℃酶解至还原糖浓度不再变化。将酶解液离心10min后装入喷瓶中喷洒于植物茎叶表面，具有促进植物根生长的作用。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 352

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Arg Asn Thr Arg Val His His Pro Leu Val Thr Ala Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ser Ala Val Ala Ile Ser Ala Pro Ala Leu Ala Asn Asp Thr

20 25 30

Pro Pro Gly Glu Thr Phe Asp Leu Asp Thr Trp Lys Leu Thr Leu Pro

35 40 45

Met Asp Ala Asp Gly Asn Gly Lys Val Asp Glu Ile Lys Val Ala Asp

50 55 60

Leu Gln Ser Tyr Arg His Ser Asp Tyr Phe Tyr Leu Asp Asp Asp Ser

65 70 75 80

His Met Val Phe Val Thr Pro Asn Lys Ala Phe Thr Thr Pro Asn Ser

85 90 95

Ser Asn Ala Arg Thr Glu Leu Arg Gln Met Leu Arg Gly Thr Asp Thr

100 105 110

Ser Ile Gly Thr His Asp Pro Lys Asn Asn Phe Ala Leu Ala Ser Asn

115 120 125

Gln His Ala Asp Glu Phe Ala Gln Ile Gly Gly Tyr Leu Ser Ala Thr

130 135 140

Leu Arg Val Glu His Val Ala Glu Arg Ser Lys Lys Pro Asp Arg Lys

145 150 155 160

Ser Ala Tyr Ser Val Val Val Gly Gln Ile His Ala Gly Lys Asp Gln

165 170 175

Ala Leu Met Glu Ala Asp Glu Gly Phe Gly His Gly Asn Glu Pro Leu

180 185 190

Lys Ile Phe Tyr Lys Lys Leu Pro Asp Asp Lys Thr Gly Ser Val Phe

195 200 205

Trp Asn Tyr Glu Lys Asn Leu Ala Lys Glu Asp Pro Lys Arg Thr Asp

210 215 220

Val Ser Tyr Ala Val Trp Gly Asn Asp Trp Ser Ser Asn Ala Asp Pro

225 230 235 240

Gly Lys Glu Gly Ile Ala Leu Gly Asp Thr Phe Ser Tyr Lys Val Glu

245 250 255

Val Lys Gly Asp Ile Met His Leu Thr Phe Asn Ala Asp Gly His Pro

260 265 270

Thr His Asn Phe Glu Ile Asn Leu Ala Asp Asn Val Asp Ala Asn Gly

275 280 285

Lys Val Asp Asn Asp Asp Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Gly Asp Trp Met

290 295 300

Tyr Phe Lys Ala Gly Ser Tyr Asn Gln Cys Asn Thr Lys Ala Ser Ser

305 310 315 320

Asn Ala Cys Glu Gly Thr Gly Val Trp Glu Thr Asp Lys Ala Asn Gly

325 330 335

Asp Tyr Ala Lys Val Val Phe Thr Lys Val Glu Ser Gly Glu Met Gln

340 345 350

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

ctggaactac tataagaatc tcgccaagga agatcc 36

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

tcttatagta gttccagaac accgagccag tg 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

tcccaaatat acggatgtca gctatgcggt at 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

catccgtata tttgggatct tccttggcga ga 32

Claims

1.一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于，所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的205位甘氨酸突变为酪氨酸；或所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的210位天冬酰胺突变为酪氨酸；或所述的褐藻胶裂解酶突变体是将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的褐藻胶裂解酶亲本的205位甘氨酸突变为酪氨酸，以及210位天冬酰胺突变为酪氨酸。

2.一种编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体的基因。

3.一种携带权利要求2所述的基因的表达载体。

4.一种表达权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体的重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌为宿主菌。

6.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体在医药、农业、印染、化工行业中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用褐藻胶裂解酶突变体降解褐藻胶为褐藻寡糖。