CN112980821B - 一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体及其应用 - Google Patents

一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酶工程技术领域，具体的说是一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体及其应用。突变体为褐藻胶裂解酶AlgAT5第146位天冬氨酸、第149位蛋氨酸、第151精氨酸中任意一个位点突变。本发明不同突变体可降解不同底物的功能本发明将根据底物类型的不同，定制化设计出具有不同底物特异性的褐藻胶裂解酶、及pH适用范围的褐藻胶裂解酶。为加速该酶的产业化进程，实现褐藻寡糖的绿色生物制造，提供技术支持。

Description

一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体的说是一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体及其应用。
背景技术
目前全球大型藻类总产量是2500万吨/年，中国占其中的53.97％，是世界上最大的生产国。其中褐藻和红藻是大型养殖藻类中最主要的两类。褐藻中的主要多糖成分包括褐藻胶、甘露醇和少部分的海带多糖，基本前两种物质能占褐藻生物量的70％左右[Zhu B,Yin H.Alginate lyase:Review of major sources and classification,properties,structure-function analysis and applications[J].Bioengineered Bugs,2015,6(3):125-131.]。褐藻胶作为褐藻中最主要的多糖成分之一，含量最多的时候占到了干重的40-50％。其降解产物褐藻寡糖在工业、农业、医药、保健品等行业具有重要的应用价值。
从结构上分析，褐藻胶是一种线性多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(M)、α-L-古罗糖醛酸(G)通过1，4糖苷键连接而成，排列方式分为聚甘露糖醛酸(Poly-mannuromte,简称PolyM)、聚古罗糖醛酸片段(Poly-guluronate,简称PolyG)和甘露糖酸酸-古罗糖醛酸杂合片段(MG blocks简称PolyMG)三种形式。不同排列方式在聚合的空间结构差别很大。也由此导致了褐藻胶裂解酶的底物特异性不同，分为PolyM、PolyG、PolyMG三种类型的褐藻胶裂解酶。目前已知的褐藻胶裂解酶只能特异性的对其中一种底物类型进行降解，无法实现对褐藻胶的完全降解。
使用传统酸法和碱法生产褐藻寡糖不仅会造成严重污染，而且降解产物无法形成不饱和的碳碳双键，因而不具备生物学活性，在实际生产应用过程中效果并不理想。与传统酸法、碱法制备生产寡糖相比，用褐藻胶裂解酶为工具酶来生产褐藻寡糖具有诸多优点，比如环保，高效，产物具有优良的生物活性，反应过程可控。但是目前已知的褐藻胶酶，底物特异性范围窄，只能针对褐藻胶中的一种类型底物进行降解，不能完全实现褐藻胶的全底物降解，因此也不适合大规模的工业化应用。传统方法是扩大筛选范围，特别是从高温、高压等特殊生境中寻找新型的褐藻胶裂解酶。然而该方法有多种不足，例如耗时久，盲目性高，周期长等。
因此，如何利用结构分析、理性设计、分子对接模拟等手段，对已有的褐藻胶裂解酶进行精准的改造来获得具有多种底物特异性的褐藻胶裂解酶来配合使用成为了一条新的路径。
发明内容
本发明目的在于提供一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体，突变体为褐藻胶裂解酶AlgAT5第146位天冬氨酸、第149位蛋氨酸、第151精氨酸中任意一个位点突变。
所述突变点可相同或不同的突变为谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。
所述突变体为突变体D146E是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸突变成谷氨酸E，氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示；
或，所述突变体为突变体D146K是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸突变成赖氨酸K，氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示；
或，所述突变体为突变体D146P是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸突变成脯氨酸P，氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示；
或，所述突变体为突变体D146A是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸突变成丙氨酸A，氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示；
或，所述突变体为突变体D146P/M149R是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，同时将149位的蛋氨酸M突变为精氨酸R，氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示；
或，突变体为突变体D146P/M149K是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，同时将149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，氨基酸序列为SEQID NO:6所示；
或，突变体为突变体D146E/M149K/R151Y是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成谷氨酸E，将149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，同时第151位精氨酸R突变为酪氨酸Y，氨基酸如下SEQ ID NO:13所示；
或，突变体为突变体D146K/M149R/R151Q是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成赖氨酸K，将149位的蛋氨酸M突变为精氨酸R，同时第151位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q，氨基酸如下SEQ ID NO:14所示。
所述突变体D146E、D146K、D146P或D146A特异性识别褐藻胶PolyG；
所述突变体D146P/M149K特异性识别褐藻胶PolyMG；
所述突变体D146P/M149R特异性识别褐藻胶PolyM；
所述突变体D146E/M149K/R151Y特异性识别褐藻胶PolyM和/或褐藻胶PolyG；
所述突变体D146K/M149R/R151Q特异性识别褐藻胶PolyG和/或褐藻胶PolyMG。
一种表达载体：表达载体含所述突变体。
一种基因工程菌，基因工程菌含所述的表达载体。
一种突变体的应用，所述突变体特异性识别褐藻胶PolyMG、褐藻胶PolyM、褐藻胶PolyG中的一种或几种在催化制备褐藻寡糖中的应用。
一种突变体的应用，所述突变体D146E、D146K、D146P或D146A特异性识别褐藻胶PolyG；
所述突变体D146P/M149K特异性识别褐藻胶PolyMG；
所述突变体D146P/M149R特异性识别褐藻胶PolyM；
所述突变体D146E/M149K/R151Y特异性识别褐藻胶PolyM和/或褐藻胶PolyG；
所述突变体D146K/M149R/R151Q特异性识别褐藻胶PolyG和/或褐藻胶PolyMG。
一种特异性催化褐藻胶制备褐藻寡糖的方法，将所述突变体加入至褐藻胶PolyMG、褐藻胶PolyM、褐藻胶PolyG中的一种或几种中，在pH为5.8的0.2M的NaAC-HAC缓冲液，0.2M NaCl，1mM CaCl2，温度70℃条件下制备褐藻寡糖。
本发明所具有的优点：
本发明以海洋嗜热菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1褐藻胶裂解酶AlgAT5为来源结果表明146位的氨基酸为脯氨酸，149位的则为赖氨酸的突变体底物特异性变为了PolyMG，146位的氨基酸为脯氨酸，149位的则为精氨酸，底物特异性为PolyM。结果表明146位的氨基酸为谷氨酸，149位的则为赖氨酸，151位的氨基酸为酪氨酸时，底物特异性变为了PolyG和PolyM的双功能酶；146位的氨基酸为赖氨酸，149位的则为精氨酸时，151位的氨基酸为谷氨酰胺时，底物特异性为PolyG和PolyMG的双功能酶。本发明定制化设计出具有不同底物特异性的褐藻胶裂解酶、及pH适用范围的褐藻胶裂解酶。为加速该酶的产业化进程，实现褐藻寡糖的绿色生物制造，提供技术支持。
附图说明
图1为计算1UAI，2CWS，1VAV，3ZPY，4OZX和4BE3表面原子的静电势。
图2为本发明实施例提供的AlgAT5(5ZQI)与1UAI，2CWS，1VAV，3ZPY，4OZX和4BE3的总体结构比较。
图3为本发明实施例提供的晶体结构的7个序列，基于结构的多序列比对结果。
图4为本发明实施例提供的PL7家族中不同底物特异性的酶表面静电荷分布图。
图5为本发明实施例提供的Pl7家族中不同底物特异性的酶催化孔道内的关键氨基酸残基分析图；其中，A.叠加了PL7家族中的AlgAT5(PolyG)，alyPG(PolyG)来自Corynebacterium sp.ALY-1、AlyA5(PolyMG)来自Zobellia galactanivorans DsijT，NitAly(PolyM)来自于Nitratiruptor sp.SB155-2。主要区别位于A6和A7片层。B.为alyPG与AlgAT5在关键氨基D149和M149位的比较。C.为AlyA5与AlgAT5在关键氨基D149和M149位的比较。D.为NitAly与AlgAT5在关键氨基D149和M149位的比较。
图6为本发明实施例提供的AlgAT5对不同底物的氨基酸结合位点分析图,其中黄色为Poly M,浅蓝色为Poly G；其中，A为PolgG与AlgAT5的对接结果、B为PolgM与AlgAT5的对接结果、C为G的结构模式图、D为M的结构模式图、E为AlgAT5中关键氨基酸与polyM的作用、F为AlgAT5中关键氨基酸与polyG的作用、G为Asp146对两种不同地物的选择性的决定因素。
图7为本发明实施例提供的Asp146点单突变体的底物特异性分析图。
图8为本发明实施例提供的不同特异性的酶催化孔道内关键氨基酸分析图。
图9为本发明实施例提供的双突变体D146P/M149R、D146P/M149K的底物特异性分析图。
图10为本发明实施例提供的Asp146、Arg151点单突变体的底物特异性分析图。
图11为本发明实施例提供的突变体D146E/M149K/R151Y、D146K/M149R/R151Q的底物特异性分析图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征做进一步的描述，所列举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。另外，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明以海洋嗜热菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1褐藻胶裂解酶AlgAT5为来源，通过结构分析、理性设计、定点突变等方法获得了底物谱广泛，pH适用范围广，利用分子对接的结果为我们理性改造AlgAT5提供了理论指导。
实施例1、AlgAT5的晶体结构解析及关键氨基酸位点分析
为了深入理解褐藻胶裂解酶AlgAT5结构中与底物识别相关的氨基酸分布情况，利用X射线晶体衍射的方式对AlgAT5的结构进行了解析，具体来说是
1.1重组蛋白AlgAT5在大肠杆菌中的异源表达及纯化
从-80℃取出感受态细胞BL21(DE3)，置于冰上解冻，待感受态细胞刚刚化冻时立刻向100μL感受态细胞中加入10μL含有目标酶AlgAT5的质粒pET30a-AlgAT5[中国科学院青岛生物能源与过程研究所，李福利，苏航，冀世奇，吕明.褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用：中国，201810862414.3[P].2018-08-01.]；冰浴30min；42℃热击30s；冰浴2min；加入800μL LB培养基，置于37℃摇床200rpm孵育1h，让细胞进行恢复；取出50uL菌液涂布于LB加卡那霉素的固体培养基平板，37℃恒温培养箱中过夜培养。目的基因在大肠杆菌中的诱导表达是从37℃恒温培养箱中过夜培养的平板上挑一个单克隆，在5mL的LB加卡那霉素液体培养基中200rpm，37℃过夜培养作为种子。次日将经过活化的细胞转接至500mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm，37℃培养至OD600为0.5-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，置于22-25℃恒温摇床中200rpm震荡培养16-18h，诱导蛋白的表达。
重组目的蛋白的纯化及浓缩：
(1)重组目的蛋白的纯化
将上述获得种子分别接种于装有250mL的LB液体培养基的500mL三角瓶中，于37℃，220rpm摇床中培养3-5h待OD600nm达到0.8-1.2之间时，加入使用终浓度为1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行工程菌的诱导表达，22℃，220rpm下诱导18h。在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用Buffer 0(50mM NaH2PO4，500mM NaCl，pH 8.0)重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎30-40min，破5s停5s，30％功率。在60℃水浴锅中处理10min，让大部分杂蛋白变性沉淀。在10,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集上清组分，破碎完成后在低温下以10000rpm离心20min，所得上清经0.22μm滤器过滤后即得到粗酶液。
用Ni-NTA Resin(购自TransGen Biotech公司)对褐藻胶裂解酶AlgAT5进行纯化。
Ni-NTA-Sefinose柱中的乙醇流出后，加入总体积为10mL的无菌水，每次加入2mL。加入总体积10mL的Buffer 0(50mM NaH2PO4,500mM NaCl,pH8.0)，每次加入2mL。加入粗酶液，并穿透3次。加入磷酸缓冲液(50mM NaH2PO4,500mM NaCl,pH8.0)，直至流出液中无蛋白。然后依次加入咪唑浓度逐渐升高的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，咪唑浓度分别为25mM、50mM、100mM、250mM，pH 8.0)各5mL，并收集蛋白组分，每次收集1mL。
完成纯化后，用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组褐藻胶裂解酶AlgAT5的纯化情况。将聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测蛋白纯度达到98％以上的重组褐藻胶裂解酶AlgAT5样品装入最小分子截留量为10kD的超滤管，在4000rpm，4℃下对AlgAT5进行浓缩，并将缓冲液置换为100mM的Tris-HCl pH8.0。制得重组褐藻胶裂解酶AlgAT5酶液。
(2)重组目的蛋白的浓缩
根据目的蛋白分子量的大小选择10KDa的超滤管，对纯化后的蛋白进行浓缩，并且用新的缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 8.0)对蛋白样品进行缓冲液置换，除去咪唑。将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE，以确定目的蛋白的纯度。
1.2重组目的蛋白浓度分析
使用BCA蛋白浓度检测试剂盒，对蛋白浓度进行测定，参照BCA蛋白定量试剂盒说明书中操作步骤，进行蛋白浓度定量，经过测定纯化后的蛋白浓度为100mg/mL。
1.3蛋白晶体生长及收据收集
首先使用96孔板，对重组蛋白AlgAT5采用坐滴蒸汽扩散法进行结晶。进行晶体初筛。初筛所用试剂来自Hampton公司的蛋白结晶试剂盒。重组蛋白AlgAT5的蛋白浓度为118.5mg/mL,筛选温度为18℃。每隔3至5天后，对晶体筛选的各个条件进行显微观察。如果长出晶体记录该条件。使用检测器ADSC Quantum 315r，在上海同步辐射装置的BL17U1束线上收集AlgAT5的X射线衍射数据。初始衍射数据集由MOSFLM处理。通过使用来自棒状杆菌的ALY-1的alyPG(PDB ID：1UAI)作为初始模型，利用分子置换方法解析三维结构。使用CCP4i软件包中的程序ARP/wARP和REFMAC5来优化启动阶段。使用获得COOT和phenix的程序进行结构的细化。使用PROCHECK评估最终模型，并将AlgAT5晶体的结构和前体晶体(AlgAT5)中的催化结构域精制至高质量。
利用Pymol蛋白结构显示软件可以对上述获得晶体预测蛋白表面的静电力，根据总体蛋白表面的静电力的预测可以看出，这些β-折叠片层形成一个带正电的底物催化腔,蓝色显示的潜在静电表面正电荷区域,红色为负电荷和白色表示是中性区。催化氨基酸位点附近为白色，说明糖苷键断裂区域为电中性区。底物结合的位置用黑色虚线框表示。两个酶的lid loops位于结构的中间，与催化氨基酸一起共同组成了形成了AlgAT5的催化活性中心(参见使用PyMOL1.7.4.5生成的图1和图2)。根据以往的研究可知，PL7家族的两个lidloops主要作用是帮助底物进入催化中心和产物的释放。特别地，与AlyA1(PDB ID:3ZPY)相比。模型AlgAT5的静电表面电位与PL7亚家族3的alyPG(PDB ID:1UAI)、AlyA1(PDB ID:3ZPY)和A1-II'(PDB ID:2CWS)类似。AlgAT5的总体结构是类似于其他成员的PL7、PL14、PL18家族的β-jelly roll类型。与PL7家族的已经解出结构的6个alyPG(PDB ID:1UAI),AlyA1(PDB ID:3ZPY),AlyA(PDB ID:4OZX)(41,42),AlyA5(PDB ID:4BE3),PA1167(PDB ID:1VAV)and A1-II'(PDB ID:2CWS)的蛋白表面的静电力的结果类似，如图1所示。
而后，进一步根据已经解析结构的6个褐藻胶裂解酶的底物特异性，分析了PL7家族中底物结合区域附近的氨基酸，参见图3。并进一步由图5可知，通过叠加不同地物特异性的四个PL7家族褐藻胶裂解酶AlgAT5(PolyG)、alyPG(PolyG)、PA1167(PolyMG)、FIAly(PolyM)，重点关注伸向底物一侧有可能起到底物识别作用的氨基酸。比对后发现在A2-A8片层上有可能与底物结合的区域中，在+1、+2、+3位上，从A2-A5上朝向催化凹槽内侧的氨基酸基本都非常保守，所有类型的酶都保持了一致。最主要的区别是位于A6这个片层上，初步推测这个-1位是主要的底物识别位点。
此外对比PL7家族中的表面电荷分布情况，参见图4和图5催化孔道里的+1、+2、+3位的电荷分布主要是蓝色，表明主要分布的是带正点的氨基酸。区别主要是在-1、-2位，PolyG特异性的酶电荷分布主要是蓝色，表明主要是带负电的氨基酸，而PolyM特异性的酶电荷分布主要是红色，主要是带正电的氨基酸。
实施例2、突变体D146P、D146A的构建及底物特异性分析
点突变所使用的模板以质粒模板pET30a-AlgAT5。点突变的PCR反应体系如下：
正向引物(10pM) 1μL
反向引物(10pM) 1μL
模板DNA 1μL
2×KAPA PCR SuperMix 50μL
H<sub>2</sub>O 43μL
PCR扩增条件如下：预变性，变性，退火，延伸，循环33次，延伸。
1 94℃ 10min
2 94℃ 30sec
3 67℃ 30sec
4 72℃ 6min
5 72℃ 10min
突变体构建所需引物如下所示：
D146P
Forward:5'-CAGATGATCCTGTTATAATGATTCGTTTAGAAGGAAATC-3'
Reverse:5'-AACAGGATCATCTGAATCATGAATTTGTCCC-3'
D146A
Forward:5'-CAGATGATGCTGTTATAATGATTCGTTTAGAAGGAAAT-3'
Reverse:5'-TAACAGCATCATCTGAATCATGAATTTGTCC-3'
PCR完成后进行琼脂糖凝胶电泳验证，为消除模板质粒的对后续转化的影响，加入Dpn I消化模板，37℃过夜处理。将突变体质粒转化到Trans1T1(全式金)待其长出单克隆后，再送样至青岛擎科测序公司使用T7的正向和反向引物进行测序验证，测序正确的菌株提取质粒转化表达菌株BL21(DE3，全式金)。突变体蛋白的表达纯化方式与野生型相同。
按照上述过程即获得不同突变体为：
突变体D146P是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，氨基酸如下SEQ ID NO:3所示。
突变体D146A是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，氨基酸如下SEQ ID NO:4所示。
所述的褐藻胶裂解酶AlgAT5的原始基因序列如SEQ ID NO.1所示。
ATGAAGGGAAGATTAAAAAAATGGTGTAGTGGCTTTCTAATTGCTATGTTAGTATCTACACCAACAGGAATGGTTAATGCAGCAAGTTTGCTTCCATCAGACATTTTAGATTTGACTAATTGGAAACTTACATTACCTATTAATGATGCAGAAGAAATTACGCAACCAGAATTAGATAGTTATGAACATAGTGAGTACTTTCATGTAAATGATGATGGAGATGCAGTCGTATTTAAAGCACACTGTGGAGGAGATACTACAGAGGGTTCTTCGTATCCAAGATGTGAACTTAGAGAAATGACAAATGATGGACAAGATAAGGCTAGTTGGTCTACTACATCTGGAACACATACTATGATAATTGATCAAAAAATCACACATCTTCCCGAAGTAAAAGACCATGTTGTTGTGGGACAAATTCATGATTCAGATGATGATGTTATAATGATTCGTTTAGAAGGAAATCATTTATTTGTAGAAGGGGATGGAGAGGAACTTGCAGATTTAGATACAGATTATGAATTAGGAACAAGATTTACTGTAAAGATAGTGGCATCCGGAGGTAAAATTAAAGTATATTATAATGGAGATTTAAAATTAACTTATAATAAGAGTGTTTCAGGATGTTATTTTAAAGCAGGTATGTATACTCAATCTAACACCAGCAAAGGTGATAGTGAGGATGCATATGGGGAAAATGAAATTTATAATCTAGTAGTAACCCATAGT
(a)序列特征：
·长度：729
·类型：基因序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
褐藻胶裂解酶AlgAT5的原始氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示
SEQ ID NO.2:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDDVIMIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
突变体D146P是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，氨基酸如下SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO.3:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDPVIMIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
突变体D146A是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，氨基酸如下SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO.4:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDAVIMIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
而后将野生型蛋白AlgAT5及上述获得两个突变体蛋白分别进行对底物特异性分析，方法为，将上述纯化后获得褐藻胶裂解酶AlgAT5蛋白及其突变体，分别取浓度为2μg/mL的酶50μl，加入到含有2g/L不同底物(Sodium Alginate，PolyM，PolyG，PolyMG)的在一定的pH下，在一定的温度下反应1min，在有水浴锅循环加热的紫外分光光度计下测定其OD235nm的变化值。一个酶活单位定义为每分钟OD235nm的值变化0.1数值。比酶活力定义：酶活与对应蛋白量的比值。其中不同组分海藻酸钠寡糖的制作方法为PolyM，PolyG和PolyMG。50g/L的海藻酸钠溶解在0.3M HCl中，100℃水解20min，7000×g离心30min，取出上清中和，蒸发浓缩为组分A。在剩余的沉淀中重新加入0.3M HCl，100℃继续水解20h之后7000×g离心30min，弃去上清，沉淀用0.3M NaOH溶液溶解，然后用HCl调pH到2.85，7000×g离心30min，所得上清为组分B，沉淀为组分C，将组分B和C中和之后，蒸发浓缩。最后用80％的乙醇脱盐三次，纯乙醇清洗一次，冷冻干燥。组分A为PMG，组分B为PM，组分C为PG。
实验结果表明，D146P或D146A的底物特异性仍然是PolyG类型的褐藻胶裂解酶，对PolyM和PolyMG这两种底物的催化活力均明显低于PolyG类型的褐藻胶裂解酶。这一结果表明，虽然Asp146这一位点的氨基酸对底物识别十分重要，然而这一单位点的突变并不能够形成很好地特异性改变，仍然需要进一步对其他重要的氨基酸位点进行突变研究，结果参见图7。实施例3、双突变体D146P/M149R、D146P/M149K的构建及底物特异性分析
按照上述实施例记载突变过程，以D146P为模板，依次用下列引物进行PCR，获得不同突变体：
所需引物为：
M149K
Forward:5'-GATGTTATAAAGATTCGTTTAGAAGGAAATCATTTATTTG-3'
Reverse:5'-CGAATCTTTATAACATCATCATCTGAATCATGAATTTG-3'
M149R
Forward:5'-GTTATAAGGATTCGTTTAGAAGGAAATCATTTATTTGT-3'
Reverse:5'-AACGAATCCTTATAACATCATCATCTGAATCATGAATT-3'
获得不同突变体为：
突变体D146P/M149R是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，同时将149位的蛋氨酸M突变为精氨酸R，氨基酸如下SEQ ID NO:5所示。
突变体D146P/M149K是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，同时将149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，氨基酸如下SEQ ID NO:6所示。
突变体D146P/M149R是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，同时将149位的蛋氨酸M突变为精氨酸R，氨基酸如下SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO.5:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDPVIRIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
突变体D146P/M149K是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，同时将149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，氨基酸如下SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO.6:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDPVIKIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
对上述获得不同的突变体，以及野生型蛋白AlgAT5进行底物特异性分析，具体为将上述纯化后获得褐藻胶裂解酶AlgAT5及其不同突变体蛋白，分别取一定量，加入到含有2g/L不同底物(PolyM，PolyG，PolyMG)的乙酸-乙酸钠缓冲液(200mM乙酸-乙酸钠盐缓冲液，pH 5.8)中，70℃反应1min，在有水浴锅循环加热的紫外分光光度计下测定其酶活(参见图9)。
结果表明146位的氨基酸为脯氨酸，149位的则为赖氨酸底物特异性变为了PolyMG特异性的酶；同时，146位的氨基酸为脯氨酸，149位则为精氨酸时，底物特异性为PolyM特异性酶，并进一步用AutoDock4.238和AutoDock Vina通过柔性和共价对接的混合方法，将底物聚甘露糖醛酸(PolyM)和聚古洛糖醛酸(PolyG)分别与AlgAT5结构进行了分子对接。用Chimera制备IsPETase的配体分子，并在进行对接之前，使用AutoDockTools将非极性H原子合并到配体和靶标上。PolyM的网格框的中心分别位于x：10.658，y：30.946和z：18.576，尺寸分别为28、32和
Figure BDA0002957662680000111
PolyG的网格框的中心分别位于x：10.658，y：30.946和z：18.576，尺寸分别为28、32和
Figure BDA0002957662680000112
在共价对接之前，使用AutoDock Vina进行了非共价对接计算，并生成了9个输出位姿，并根据其自身的评分功能计算了其结合自由能。选择具有最佳对接模型，并将模型的构型用作以下计算的评估标准。
基于分子对接模拟进一步分析了-1、-2位的氨基酸后发现，主要的区别在于146位这个氨基酸残基上，当位于-1位上的Asp146与PolyM和PolyG两种不同的底物结合时，在C2位的羧基上相同的点为，都是被Ser91侧链的羟基结合形成氢键，稳定了结构。区别主要体现在C5位的羟基上，由于M和G单体的区别体现在C5位的差向异构，因此这个羟基在PolyM和PolyG中正好是在糖环平面的两侧，一个朝上，一个朝下。经过氨基酸之间的距离测量我们发现Asp146上羧基与PolyG上面的羧基之间的距离为
Figure BDA0002957662680000113
足以形成氢键来稳定酶底物复合物的结构。然而Asp146上羧基与PolyM上面的羧基之间的距离为
Figure BDA0002957662680000114
远大于形成氢键的距离，不足以抓住该类型的底物，无法形成稳定的结合。故而发生催化反应的能力不足，无法很好地降解PolyM类型的底物。结果参见图6。
同时进一步对结构分析后发现Met149距离糖环的C2位上的羟基位置与方向都比较合适，但是Met149距离这个羟基的距离是
Figure BDA0002957662680000121
不足以形成氢键，无法形成稳定的酶底物复合物，参见图8。因此将Met149这个氨基酸的侧链进一步加长，同时改为带正电荷的氨基酸残基增加与底物的相互作用；进而使得双突变体成功获得了可以降解所有底物的褐藻胶裂解酶，极大地扩展了其应用场景。结果参见图6。
实施例4、突变体D146E、D146K、R151Q、R151Y的构建及底物特异性分析为了进一步扩大底物适用范围，我们设计了突变体D146E、D146K、R151Q、R151Y来扩展其特异性底物的适用范围。
所需引物为：
D146E
Forward:5'-CAGATGATGAAGTTATAATGATTCGTTTAGAAGGAAATC-3'
Reverse:5'-TATAACTTCATCATCTGAATCATGAATTTGTCC-3'
D146K
Forward:5'-CAGATGATAAGGTTATAATGATTCGTTTAGAAGGAAATC-3'
Reverse:5'-TATAACCTTATCATCTGAATCATGAATTTGTCCC-3'
R151Q
Forward:5'-GATTCAGTTAGAAGGAAATCATTTATTTGTAGAAGGGG-3'
Reverse:5'-CCTTCTAACTGAATCATTATAACATCATCATCTGAATCA-3'
R151Y
Forward:5'-GTTATAATGATTTATTTAGAAGGAAATCATTTATTTGTAGAAGGGG-3'
Reverse:5'-TTCTAAATAAATCATTATAACATCATCATCTGAATCATG-3'
突变体D146E是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成谷氨酸E，氨基酸如下SEQ ID NO:7所示。
SEQ ID NO.7:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDEVIMIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
突变体D146K是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成赖氨酸K，氨基酸如下SEQ ID NO:8所示。
SEQ ID NO.8:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDKVIMIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
突变体R151Q是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的精氨酸R突变成谷氨酰胺Q，氨基酸如下SEQ ID NO:9所示。
SEQ ID NO.9:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDDVIMIQLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
突变体R151Y是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的精氨酸R突变成谷氨酰胺Q，氨基酸如下SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO.10:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDDVIMIYLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
对上述获得不同的突变体，具体为将上述纯化后获得褐藻胶裂解不同突变体蛋白，分别取一定量，加入到含有2g/L不同底物(PolyM，PolyG，PolyMG)的乙酸-乙酸钠缓冲液(200mM乙酸-乙酸钠盐缓冲液，pH 5.8)中，70℃反应1min，在有水浴锅循环加热的紫外分光光度计下测定其酶活。
实验结果表明，D146E、D146K的底物特异性仍然是PolyG类型的褐藻胶裂解酶，对PolyM和PolyMG这两种底物的催化活力均明显低于PolyG类型的褐藻胶裂解酶。这一结果表明，虽然Asp146这一位点的氨基酸对底物识别十分重要，然而这一单位点的突变并不能够形成很好地特异性改变，仍然需要进一步对其他重要的氨基酸位点进行组合突变研究。如图10所示。
实施例5、双功能底物特异性突变体的构建
组合突变体D146E/M149K/R151Y、D146K/M149R/R151Q的构建及底物特异性分析
按照上述实施例记载突变过程，分别以D146E和D146K为模板，依次用下列引物进行PCR，获得不同突变体D146E/M149K和D146K/M149R：
所需引物为：
M149K为
Forward:5'-GATGTTATAAAGATTCGTTTAGAAGGAAATCATTTATTTG-3'
Reverse:5'-CGAATCTTTATAACATCATCATCTGAATCATGAATTTG-3'
M149R为
Forward:5'-GTTATAAGGATTCGTTTAGAAGGAAATCATTTATTTGT-3'
Reverse:5'-AACGAATCCTTATAACATCATCATCTGAATCATGAATT-3'
获得不同突变体为：
突变体D146E/M149K是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成谷氨酸E，同时将149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，氨基酸如下SEQ ID NO:11所示。
SEQ ID NO.11:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDEVIKIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
突变体D146K/M149R是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成赖氨酸K，同时将149位的蛋氨酸M突变为精氨酸R，氨基酸如下SEQ ID NO:12所示。
SEQ ID NO.12:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDKVIRIRLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
再分别以D146E/M149K和D146K/M149R为模板，依次用下列引物进行PCR，获得不同突变体D146E/M149K/R151Y和D146K/M149R/R151Q
R151Q
Forward:5'-GATTCAGTTAGAAGGAAATCATTTATTTGTAGAAGGGG-3'
Reverse:5'-CCTTCTAACTGAATCATTATAACATCATCATCTGAATCA-3'
R151Y
Forward:5'-TTATAATGATTTATTTAGAAGGAAATCATTTATTTGTAGAAGGGG-3'
Reverse:5'-TTCTAAATAAATCATTATAACATCATCATCTGAATCATG-3'
获得组合突变体为：
组合突变体D146E/M149K/R151Y是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成谷氨酸E，149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，同时将151位的精氨酸R突变成酪氨酸Y，氨基酸如下SEQ ID NO:13所示。
SEQ ID NO.13:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDEVIKIYLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
组合突变体D146E/M149K/R151Q是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成谷氨酸E，149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，同时将151位的精氨酸R突变成谷氨酰胺Q，氨基酸如下SEQ ID NO:14所示。
SEQ ID NO.14:
MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQPELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWSTTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDEVIKIQLEGNHLFVEGDGEELADLDTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDSEDAYGENEIYNLVVTHS
(a)序列特征：
·长度：243
·类型：氨基酸序列
·链型：单链
·拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1
对上述获得不同的突变体，具体为将上述纯化后获得褐藻胶裂解不同突变体蛋白，分别取一定量，加入到含有2g/L不同底物(PolyM，PolyG，PolyMG)的乙酸-乙酸钠缓冲液(200mM乙酸-乙酸钠盐缓冲液，pH 5.8)中，70℃反应1min，在有水浴锅循环加热的紫外分光光度计下测定其酶活。
结果表明146位的氨基酸为谷氨酸，149位的则为赖氨酸，151位的氨基酸为酪氨酸时，底物特异性变为了PolyG和PolyM的双功能酶；146位的氨基酸为赖氨酸，149位则为精氨酸时，151位的氨基酸为谷氨酰胺时，底物特异性为PolyG和PolyMG的双功能酶，可见不同组合突变体成功获得了一个酶即可降解两种不同底物的功能，如图11所示。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagggaa gattaaaaaa atggtgtagt ggctttctaa ttgctatgtt agtatctaca 60
ccaacaggaa tggttaatgc agcaagtttg cttccatcag acattttaga tttgactaat 120
tggaaactta cattacctat taatgatgca gaagaaatta cgcaaccaga attagatagt 180
tatgaacata gtgagtactt tcatgtaaat gatgatggag atgcagtcgt atttaaagca 240
cactgtggag gagatactac agagggttct tcgtatccaa gatgtgaact tagagaaatg 300
acaaatgatg gacaagataa ggctagttgg tctactacat ctggaacaca tactatgata 360
attgatcaaa aaatcacaca tcttcccgaa gtaaaagacc atgttgttgt gggacaaatt 420
catgattcag atgatgatgt tataatgatt cgtttagaag gaaatcattt atttgtagaa 480
ggggatggag aggaacttgc agatttagat acagattatg aattaggaac aagatttact 540
gtaaagatag tggcatccgg aggtaaaatt aaagtatatt ataatggaga tttaaaatta 600
acttataata agagtgtttc aggatgttat tttaaagcag gtatgtatac tcaatctaac 660
accagcaaag gtgatagtga ggatgcatat ggggaaaatg aaatttataa tctagtagta 720
acccatagt 729
<210> 2
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Gly Arg Leu Lys Lys Trp Cys Ser Gly Phe Leu Ile Ala Met
1 5 10 15
Leu Val Ser Thr Pro Thr Gly Met Val Asn Ala Ala Ser Leu Leu Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Leu Asp Leu Thr Asn Trp Lys Leu Thr Leu Pro Ile Asn
35 40 45
Asp Ala Glu Glu Ile Thr Gln Pro Glu Leu Asp Ser Tyr Glu His Ser
50 55 60
Glu Tyr Phe His Val Asn Asp Asp Gly Asp Ala Val Val Phe Lys Ala
65 70 75 80
His Cys Gly Gly Asp Thr Thr Glu Gly Ser Ser Tyr Pro Arg Cys Glu
85 90 95
Leu Arg Glu Met Thr Asn Asp Gly Gln Asp Lys Ala Ser Trp Ser Thr
100 105 110
Thr Ser Gly Thr His Thr Met Ile Ile Asp Gln Lys Ile Thr His Leu
115 120 125
Pro Glu Val Lys Asp His Val Val Val Gly Gln Ile His Asp Ser Asp
130 135 140
Asp Asp Val Ile Met Ile Arg Leu Glu Gly Asn His Leu Phe Val Glu
145 150 155 160
Gly Asp Gly Glu Glu Leu Ala Asp Leu Asp Thr Asp Tyr Glu Leu Gly
165 170 175
Thr Arg Phe Thr Val Lys Ile Val Ala Ser Gly Gly Lys Ile Lys Val
180 185 190
Tyr Tyr Asn Gly Asp Leu Lys Leu Thr Tyr Asn Lys Ser Val Ser Gly
195 200 205
Cys Tyr Phe Lys Ala Gly Met Tyr Thr Gln Ser Asn Thr Ser Lys Gly
210 215 220
Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Gly Glu Asn Glu Ile Tyr Asn Leu Val Val
225 230 235 240
Thr His Ser
<210> 3
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Gly Arg Leu Lys Lys Trp Cys Ser Gly Phe Leu Ile Ala Met
1 5 10 15
Leu Val Ser Thr Pro Thr Gly Met Val Asn Ala Ala Ser Leu Leu Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Leu Asp Leu Thr Asn Trp Lys Leu Thr Leu Pro Ile Asn
35 40 45
Asp Ala Glu Glu Ile Thr Gln Pro Glu Leu Asp Ser Tyr Glu His Ser
50 55 60
Glu Tyr Phe His Val Asn Asp Asp Gly Asp Ala Val Val Phe Lys Ala
65 70 75 80
His Cys Gly Gly Asp Thr Thr Glu Gly Ser Ser Tyr Pro Arg Cys Glu
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Thr Ser Gly Thr His Thr Met Ile Ile Asp Gln Lys Ile Thr His Leu
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Thr Arg Phe Thr Val Lys Ile Val Ala Ser Gly Gly Lys Ile Lys Val
180 185 190
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Thr His Ser
<210> 4
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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165 170 175
Thr Arg Phe Thr Val Lys Ile Val Ala Ser Gly Gly Lys Ile Lys Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Gly Glu Asn Glu Ile Tyr Asn Leu Val Val
225 230 235 240
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65 70 75 80
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65 70 75 80
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85 90 95
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
Pro Glu Val Lys Asp His Val Val Val Gly Gln Ile His Asp Ser Asp
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Asp Glu Val Ile Lys Ile Arg Leu Glu Gly Asn His Leu Phe Val Glu
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165 170 175
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180 185 190
Tyr Tyr Asn Gly Asp Leu Lys Leu Thr Tyr Asn Lys Ser Val Ser Gly
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Lys Gly Arg Leu Lys Lys Trp Cys Ser Gly Phe Leu Ile Ala Met
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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165 170 175
Thr Arg Phe Thr Val Lys Ile Val Ala Ser Gly Gly Lys Ile Lys Val
180 185 190
Tyr Tyr Asn Gly Asp Leu Lys Leu Thr Tyr Asn Lys Ser Val Ser Gly
195 200 205
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Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Gly Glu Asn Glu Ile Tyr Asn Leu Val Val
225 230 235 240
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<210> 13
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Lys Gly Arg Leu Lys Lys Trp Cys Ser Gly Phe Leu Ile Ala Met
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35 40 45
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Gly Glu Asn Glu Ile Tyr Asn Leu Val Val
225 230 235 240
Thr His Ser
<210> 14
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Lys Gly Arg Leu Lys Lys Trp Cys Ser Gly Phe Leu Ile Ala Met
1 5 10 15
Leu Val Ser Thr Pro Thr Gly Met Val Asn Ala Ala Ser Leu Leu Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Leu Asp Leu Thr Asn Trp Lys Leu Thr Leu Pro Ile Asn
35 40 45
Asp Ala Glu Glu Ile Thr Gln Pro Glu Leu Asp Ser Tyr Glu His Ser
50 55 60
Glu Tyr Phe His Val Asn Asp Asp Gly Asp Ala Val Val Phe Lys Ala
65 70 75 80
His Cys Gly Gly Asp Thr Thr Glu Gly Ser Ser Tyr Pro Arg Cys Glu
85 90 95
Leu Arg Glu Met Thr Asn Asp Gly Gln Asp Lys Ala Ser Trp Ser Thr
100 105 110
Thr Ser Gly Thr His Thr Met Ile Ile Asp Gln Lys Ile Thr His Leu
115 120 125
Pro Glu Val Lys Asp His Val Val Val Gly Gln Ile His Asp Ser Asp
130 135 140
Asp Glu Val Ile Lys Ile Gln Leu Glu Gly Asn His Leu Phe Val Glu
145 150 155 160
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180 185 190
Tyr Tyr Asn Gly Asp Leu Lys Leu Thr Tyr Asn Lys Ser Val Ser Gly
195 200 205
Cys Tyr Phe Lys Ala Gly Met Tyr Thr Gln Ser Asn Thr Ser Lys Gly
210 215 220
Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Gly Glu Asn Glu Ile Tyr Asn Leu Val Val
225 230 235 240
Thr His Ser

Claims (7)

1.一种特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于：
所述突变体为突变体D146E是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸突变成谷氨酸E，氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示；
或，所述突变体为突变体D146K是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸突变成赖氨酸K，氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示；
或，所述突变体为突变体D146P/M149R是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，同时将149位的蛋氨酸M突变为精氨酸R，氨基酸序列为SEQID NO:5所示；
或，突变体为突变体D146P/M149K是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成脯氨酸P，同时将149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，氨基酸序列为SEQ IDNO:6所示；
或，突变体为突变体D146E/M149K/R151Y是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成谷氨酸E，将149位的蛋氨酸M突变为赖氨酸K，同时第151位精氨酸R突变为酪氨酸Y，氨基酸如下SEQ ID NO: 13所示；
或，突变体为突变体D146K/M149R/R151Q是将褐藻胶裂解酶AlgAT5氨基酸序列第146位点上的天冬氨酸D突变成赖氨酸K，将149位的蛋氨酸M突变为精氨酸R，同时第151位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q，氨基酸如下SEQ ID NO: 14所示。
2.按权利要求1所述的特异性识别底物的褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于：所述突变体D146E或D146K特异性识别褐藻胶PolyG；
所述突变体D146P/M149K特异性识别褐藻胶PolyMG；
所述突变体D146P/M149R特异性识别褐藻胶PolyM；
所述突变体D146E/M149K/R151Y特异性识别褐藻胶PolyM和/或褐藻胶PolyG；
所述突变体D146K/M149R/R151Q特异性识别褐藻胶PolyG和/或褐藻胶PolyMG。
3.一种表达载体，其特征在于：表达载体含权利要求1所述突变体。
4.一种基因工程菌，其特征在于：基因工程菌含有权利要求3所述的表达载体。
5.一种权利要求1所述的突变体的应用，其特征在于：权利要求1所述突变体以褐藻胶PolyMG、褐藻胶PolyM、褐藻胶PolyG中的一种或几种为底物在催化制备褐藻寡糖中的应用。
6.一种权利要求5所述的突变体的应用，其特征在于：所述突变体D146E或D146K特异性识别褐藻胶PolyG；
所述突变体D146P/M149K特异性识别褐藻胶PolyMG；
所述突变体D146P/M149R特异性识别褐藻胶PolyM；
所述突变体D146E/M149K/R151Y特异性识别褐藻胶PolyM和/或褐藻胶PolyG；
所述突变体D146K/M149R/R151Q特异性识别褐藻胶PolyG和/或褐藻胶PolyMG。
7.一种特异性催化褐藻胶制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：将所述权利要求1所述突变体加入至褐藻胶PolyMG、褐藻胶PolyM、褐藻胶PolyG中的一种或几种中，在pH为5-8，0.1-0.3M的NaAC-HAC缓冲液，0.1-0.3 M NaCl，0.05-5mM CaCl2，温度50-80℃，条件下制备褐藻寡糖。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108929878A (zh) * 2018-08-01 2018-12-04 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用
CN111269907A (zh) * 2020-04-03 2020-06-12 江南大学 一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用
CN111424027A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 江南大学 一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108929878A (zh) * 2018-08-01 2018-12-04 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用
CN111424027A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 江南大学 一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用
CN111269907A (zh) * 2020-04-03 2020-06-12 江南大学 一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of AlgMsp, an Alginate Lyase from Microbulbifer sp. 6532A;Steven M. Swift等;《PLOS ONE》;20141130;第9卷(第11期);第1-11页 *
Structural and molecular basis for the substrate positioning mechanism of a new PL7 subfamily alginate lyase from the arctic;Fei Xu 等;《ASBMB》;20200923;第48卷;第16380-16392页 *
主要海藻多糖降解酶活性架构及其降解模式分析;张恒曦;《中国优秀硕士论文库 基础科技辑》;20170930;第1-128页 *
海藻工具酶――褐藻胶裂解酶研究进展;李丽妍等;《生物工程学报》;20110625(第06期);第838-845页 *
褐藻胶裂解酶分泌菌株的分离鉴定及Tamlana holothuriorum s12T 中褐藻胶裂解酶的研究;周燕霞;《中国博士论文库 基础科学辑》;20161031;第1-145页 *
褐藻胶裂解酶在制备海洋寡糖中的应用;刘翼翔等;《食品工业科技》;20070625(第06期);第220-222页 *
褐藻胶裂解酶的结构及催化机制研究进展;李谦 等;《生物加工过程》;20200930;第18卷(第5期);第1-7页 *

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