CN114908076B

CN114908076B - 一种定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶及其应用

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Publication number: CN114908076B
Application number: CN202111658154.6A
Authority: CN
Inventors: 杨志强; 李福利; 苏航; 公衍军
Original assignee: Weifang Macaaji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Weifang Macaaji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114908076A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶及其应用。褐藻胶裂解酶的碱基序列如SEQ ID NO.1中碱基序列所示。所述褐藻胶裂解酶在定向降解褐藻获得褐藻寡糖三糖中的应用。本发明利用来源于海洋嗜热菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1的褐藻胶裂解酶AL1761，通过生物酶解法降解获得的褐藻寡糖聚合度小于5，即褐藻寡糖三糖，进而在最大程度的保留了褐藻寡糖主要活性成分的同时，并将褐藻胶中的大分子转化为能被机体直接吸收的小分子，是环保、高效的加工工艺；本发明采用特定的酶定向获得褐藻寡糖三糖产物，本发明所述的褐藻胶裂解酶具有产物单一、酶活高、降解效率高的优点，具备良好的工业应用前景。

Description

一种定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是一种定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶及其应用。

背景技术

褐藻中的重要多糖成分重要包括褐藻酸、甘露醇和少部分的海带多糖，基本前两种物质能占70%左右。我国海带产地，北起辽宁(大连)、南至广东(南澳)，其中山东、福建是我国的海带主产地，占全国总产量的90%以上。

褐藻胶的分子量非常大,一般为20～250 kDa。褐藻胶具有较强的凝胶性,不容易通过机体所设置的屏障和细胞膜,很难被机体吸收,导致褐藻胶在活性应用方面受到了很大的限制。褐藻寡糖是将褐藻胶降解得到的一种低分子聚合物,褐藻寡糖有许多的生物活性功能,属于功能性寡糖。褐藻寡糖是海洋性寡糖的代表,它的结构较简单与内源性糖链中的结构有许多相似之处，作为基础的活性物质己经为大家所认知。褐藻胶降解为褐藻寡糖后,褐藻寡糖水溶性增强,从而易被机体吸收,同时还增强其生物活性,褐藻寡糖较褐藻胶生物活性更为突出,如促进植物生长、缓解植物胁迫、抗炎、抑菌、抗肿瘤及抗氧化等方面,应用前景广阔，由于褐藻寡糖具有很好的市场发展前景和广阔的应用空间,近年来褐藻寡糖的研究成为热门话题,日益受到各国科学家的关注和探究。

褐藻胶分子量较大,因此制备较小分子量的褐藻寡糖成为科学家关注的热点,物理降解法是最为简单经济的方法。化学降解的寡糖是饱和糖醛酸寡糖,而酶降解法降解出的寡糖是不饱和糖醛酸寡糖。

褐藻寡糖的物理降解法降解有辐射法、热溶法、高温高压法、超声法等，物理降解褐藻寡糖具有易操作、快捷、经济实惠和无环境污染等优点,比较适合工业化生产,但是在物理降解方法中降解效率比较低,反应机理不明确,仍需进一步进行实验研究讨论,从而降解出更高活性的褐藻寡糖。

化学降解法主要包括酸降解、碱降解和氧化降解等。化学降解法是指利用化学试剂,将多糖中的糖苷键断裂,从而形成低分子量的寡糖。化学降解法操作简便,技术成熟,反应机制明确,但是反应剧烈,降解产物少等缺点。酸降解是指样品在盐酸、浓硫酸、甲酸、硝酸和草酸等酸性溶液中发生糖苷键断裂的反应,酸降解可以获得特定结构特征的寡糖,并且在一次降解中就可以获得一系列聚合度的寡糖。

随着褐藻寡糖在分子生物学中备受关注,褐藻寡糖的分离纯化方法也取得了巨大的进步。褐藻寡糖虽然结构相对简单,但是在微观上寡糖的不均一性导致寡糖的复杂性,褐藻寡糖上的糖苷键连接方式不同，褐藻寡糖上的糖苷键连接方式不同,导致褐藻寡糖的生物功能不同,因此将褐藻寡糖分离成不同的组分成为降解寡糖后很关键的一步。褐藻寡糖的分离目前有许多种,主要包括沉降分离法、凝胶色谱法和离子交换树脂法等。

褐藻寡糖是褐藻胶降解的一种低分子聚合物,不同降解条件得到的褐藻寡糖的糖苷键连接方式不同,导致褐藻寡糖生物活性的多样性,如具有抗氧化、抑菌、抗炎以及促生长等生物活性。在黄瓜受水分胁迫的各种不同时间加入聚合度为8～12的褐藻酸寡糖,结果表明褐藻寡糖能够显著增加黄瓜幼苗叶片的超氧化物歧化物酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性以及脯氨酸含量。同时也发现聚合度小于5的褐藻寡糖对植物根系生长及耐盐效果更显著[Tang J , Zhou Q , Chu H , et al. Characterization of alginase andelicitor-active oligosaccharides from Gracilibacillus A7 in alleviating saltstress for Brassica campestris L.[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59(14):7896-7901.]。

然而目前已知的褐藻胶裂解酶产物谱通常比较广，通常不止有一种产物，酶解产物的聚合度分布从2-8不等[CN112725319A]，2-6糖[CN108753642B],少量外切酶主要产生的是单糖[CN110951716A]，无法产生有活性的寡糖结构。因此如何获得特定聚合度的褐藻寡糖成为了人们关注的热点，这不仅可以降低分离的难度，更可以减少后期分离纯化的成本，进一步促进褐藻寡糖的广泛应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶，褐藻胶裂解酶的碱基序列如SEQ ID NO.1中碱基序列所示。

所述定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2中所示。

一种定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶的应用，所述褐藻胶裂解酶在定向降解褐藻获得褐藻寡糖三糖中的应用。

所述褐藻为海带、马尾藻、泡叶藻、昆布、巨藻、鼠尾藻中的一种或几种。

一种重组表达载体，含有所述的定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶的编码基因。

一种重组宿主细胞，含有所述的定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶。

所述重组宿主细胞为大肠杆菌菌株BL21。

一种定向酶解获得褐藻寡糖三糖的方法，以海藻酸钠为底物，添加含定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶，在pH 3-9，温度40-80 ℃下酶解获得褐藻寡糖三糖。

所述酶为定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶或含定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶的复合酶；其中，酶为定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶时添加量为底物质量的0.5%-2%，优选为0.5%-1%；酶为混合酶时添加量为底物质量的2%-5%，优选为2%-3%。

所述混合酶为按2:2:1比例的定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶、蛋白酶和果胶酶。

本发明所具有的优点：

本发明利用来源于海洋嗜热菌 Defluviitalea phaphyphilasp. Alg1的褐藻胶裂解酶AL1761，通过生物酶解法降解获得的褐藻寡糖聚合度小于5，即褐藻寡糖三糖，进而在最大程度的保留了褐藻寡糖主要活性成分的同时，并将褐藻胶中的大分子转化为能被机体直接吸收的小分子，是环保、高效的加工工艺；本发明采用特定的酶定向获得褐藻寡糖三糖产物，本发明所述的褐藻胶裂解酶具有产物单一、酶活高、降解效率高的优点，具备良好的工业应用前景。

序列表

<110> 潍坊麦卡阿吉生物科技有限公司

<120> 一种定向获得褐藻寡糖三糖产物的褐藻胶裂解酶及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1887

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaatatt ttgatttaga tttattaaaa gaaaatattg aaaaaaatga aaaatataaa 60

aatatgattg aaacaatgaa ggtagaagtg gaagacttca tgaaagattt tcatgatgac 120

ccttccaaaa catctagatg gggacatcat tacttttgtt ctaaagatgg aggattactt 180

atttataata ggaaaacacc aaacattcat gtttgtgaaa tttgtgggca tgagtataaa 240

gacaatgaac tacttaatgg tgtttgggtt tatatgtatc gtaatgaagc tattttaaca 300

gcatggaaat caggagtttt atatagagta acagaagata ataaatattt aagatatatt 360

gagaaaattg ttggatatta tgctgaccat tatacagaat ttgtacttca caataaagaa 420

ggcaatgaat ttgaaagtat agaggaaatg gaatggggtt gtggcagaat tatgccacaa 480

ggacttaatg aatctattgt attaattaga atagttaatt cacttgaatt agtaaaagat 540

tttatatcaa aagattttct tgaaaaagtt catgataaac tatttagaga agcttttaaa 600

ttattaaaac cccaggttaa taaaatacat aacataccat tttggcttaa taatggtata 660

ggtgtaatgg gattattttc aaatgataaa gaaatgatag attttgcatt tgaaggagaa 720

tataatgtta gaaaacaatt acaacaaggg gttactaaag atggtttttg gtatgaagga 780

tcaattcact ataacttctt tactttagaa ggagctacta atttattatt atttagtgaa 840

ttatacgatt ttgattttgg aaaagagaaa gaaattatta aaaagatgtt tatttctgca 900

tataaatatg cctttgataa tcaacaactt ccaaatccta atgatggttg gccaaattta 960

aatctaaaat catattcata tatttatagt gtagctacaa aaatttttgg aatagaaagt 1020

gaagtaggga atctacttaa aaatatttta aaatctgatt acgaaagggg acaattccca 1080

ttatctaggc catattatta taaaaatgat atatcccttg aacaacttat attaatacca 1140

gaaattgacc ctagtacagc aaaacctgtt gaacaagttt caataaattt cgaaacttcc 1200

aattgtggaa ttataaaaca aaatggaatt aatgtatttt ataaatatgg acataatgga 1260

ccttctcatg cccatccaga taaaatgaat atagaagtag taattggaaa atattcctta 1320

agtagagatt tatccaattc tggatatggt aataagttat gtaatgagtg gcatagaatg 1380

actccatctc acaatacagt agttataaac ggagaaaatc atgtgtctgt agaaccagga 1440

gaatgtttag aatttaaacc aaatatttta gatgcaaaag tagtagatgt gtatccaggt 1500

gtagatttta gaagaagaat agagttatca aatactggat ttatggataa gttttatgtt 1560

tattcaaaat cagagaatat tagtgattat ttcttccatg tggaagctaa tttaataact 1620

gatcttgtaa ctgaatcagc tgatttagtg ttcaataaaa atggttatca gcatattagt 1680

gaagtaaaga aagtaataaa tgataaacct agtattaaat tagactggaa attaggagac 1740

atggtaatta caagtgatat atctttagaa aataaagagt tatttattgc aaaatctcct 1800

gataatccaa ttaccggttc aagaactact ctaattatta gagaaaaagc ttcagaaata 1860

ttatatgaat taaaatggag tataaaa 1887

<210> 2

<211> 629

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Tyr Phe Asp Leu Asp Leu Leu Lys Glu Asn Ile Glu Lys Asn

1 5 10 15

Glu Lys Tyr Lys Asn Met Ile Glu Thr Met Lys Val Glu Val Glu Asp

20 25 30

Phe Met Lys Asp Phe His Asp Asp Pro Ser Lys Thr Ser Arg Trp Gly

35 40 45

His His Tyr Phe Cys Ser Lys Asp Gly Gly Leu Leu Ile Tyr Asn Arg

50 55 60

Lys Thr Pro Asn Ile His Val Cys Glu Ile Cys Gly His Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asp Asn Glu Leu Leu Asn Gly Val Trp Val Tyr Met Tyr Arg Asn Glu

85 90 95

Ala Ile Leu Thr Ala Trp Lys Ser Gly Val Leu Tyr Arg Val Thr Glu

100 105 110

Asp Asn Lys Tyr Leu Arg Tyr Ile Glu Lys Ile Val Gly Tyr Tyr Ala

115 120 125

Asp His Tyr Thr Glu Phe Val Leu His Asn Lys Glu Gly Asn Glu Phe

130 135 140

Glu Ser Ile Glu Glu Met Glu Trp Gly Cys Gly Arg Ile Met Pro Gln

145 150 155 160

Gly Leu Asn Glu Ser Ile Val Leu Ile Arg Ile Val Asn Ser Leu Glu

165 170 175

Leu Val Lys Asp Phe Ile Ser Lys Asp Phe Leu Glu Lys Val His Asp

180 185 190

Lys Leu Phe Arg Glu Ala Phe Lys Leu Leu Lys Pro Gln Val Asn Lys

195 200 205

Ile His Asn Ile Pro Phe Trp Leu Asn Asn Gly Ile Gly Val Met Gly

210 215 220

Leu Phe Ser Asn Asp Lys Glu Met Ile Asp Phe Ala Phe Glu Gly Glu

225 230 235 240

Tyr Asn Val Arg Lys Gln Leu Gln Gln Gly Val Thr Lys Asp Gly Phe

245 250 255

Trp Tyr Glu Gly Ser Ile His Tyr Asn Phe Phe Thr Leu Glu Gly Ala

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Leu Phe Ser Glu Leu Tyr Asp Phe Asp Phe Gly Lys

275 280 285

Glu Lys Glu Ile Ile Lys Lys Met Phe Ile Ser Ala Tyr Lys Tyr Ala

290 295 300

Phe Asp Asn Gln Gln Leu Pro Asn Pro Asn Asp Gly Trp Pro Asn Leu

305 310 315 320

Asn Leu Lys Ser Tyr Ser Tyr Ile Tyr Ser Val Ala Thr Lys Ile Phe

325 330 335

Gly Ile Glu Ser Glu Val Gly Asn Leu Leu Lys Asn Ile Leu Lys Ser

340 345 350

Asp Tyr Glu Arg Gly Gln Phe Pro Leu Ser Arg Pro Tyr Tyr Tyr Lys

355 360 365

Asn Asp Ile Ser Leu Glu Gln Leu Ile Leu Ile Pro Glu Ile Asp Pro

370 375 380

Ser Thr Ala Lys Pro Val Glu Gln Val Ser Ile Asn Phe Glu Thr Ser

385 390 395 400

Asn Cys Gly Ile Ile Lys Gln Asn Gly Ile Asn Val Phe Tyr Lys Tyr

405 410 415

Gly His Asn Gly Pro Ser His Ala His Pro Asp Lys Met Asn Ile Glu

420 425 430

Val Val Ile Gly Lys Tyr Ser Leu Ser Arg Asp Leu Ser Asn Ser Gly

435 440 445

Tyr Gly Asn Lys Leu Cys Asn Glu Trp His Arg Met Thr Pro Ser His

450 455 460

Asn Thr Val Val Ile Asn Gly Glu Asn His Val Ser Val Glu Pro Gly

465 470 475 480

Glu Cys Leu Glu Phe Lys Pro Asn Ile Leu Asp Ala Lys Val Val Asp

485 490 495

Val Tyr Pro Gly Val Asp Phe Arg Arg Arg Ile Glu Leu Ser Asn Thr

500 505 510

Gly Phe Met Asp Lys Phe Tyr Val Tyr Ser Lys Ser Glu Asn Ile Ser

515 520 525

Asp Tyr Phe Phe His Val Glu Ala Asn Leu Ile Thr Asp Leu Val Thr

530 535 540

Glu Ser Ala Asp Leu Val Phe Asn Lys Asn Gly Tyr Gln His Ile Ser

545 550 555 560

Glu Val Lys Lys Val Ile Asn Asp Lys Pro Ser Ile Lys Leu Asp Trp

565 570 575

Lys Leu Gly Asp Met Val Ile Thr Ser Asp Ile Ser Leu Glu Asn Lys

580 585 590

Glu Leu Phe Ile Ala Lys Ser Pro Asp Asn Pro Ile Thr Gly Ser Arg

595 600 605

Thr Thr Leu Ile Ile Arg Glu Lys Ala Ser Glu Ile Leu Tyr Glu Leu

610 615 620

Lys Trp Ser Ile Lys

625

附图说明

图1为本发明实施例提供的褐藻胶裂解酶AL1761的基因功能预测；

图2为本发明实施例提供的重组质粒pEASY-BluntE1-AL1761质粒图谱；

图3为本发明实施例提供的菌落PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，其中M为核酸Marker，17号永道为最终确认好的pEASY-BluntE1-AL1761；

图4为本发明实施例提供的SDS-PAGE分析褐藻胶裂解酶AL1761蛋白表达纯化情况，其中M为Marker，1号泳道为细胞破碎液，2号泳道为穿透液，1号泳道为纯化后的AL1761；

图5为本发明实施例提供的褐藻胶裂解酶AL1761的最适温度；

图6为本发明实施例提供的降解产物分析；

图7为本发明实施例提供的海带降解率；

图8为本发明实施例提供的咔唑-硫酸法测试海藻酸含量标准曲线。

实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1、根据海洋嗜热菌 D. phaphyphilasp. Alg1菌株基因组DNA中AL1761基因序列，进行分析。

将海洋嗜热菌 Defluviitalea phaphyphilasp. Alg1菌株（Ji S Q ,Wang B ,LuM ,et al . Defluviitalea phaphyphila sp .nov .,a novel thermophilic bacteriumthat degrades brown algae[J] .Applied and environmental microbiology ,2016 ,82(3): 868-877.）用NCBI( http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)网站的Basic LocalAlignment Search Tool (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，对al1761 进行保守结构与的预测。al1761由orf1761编码，基因全长1890 bp，具有一个预测结构域，Heper_II_III superfamily (氨基酸顺序416-518) ，将该酶命名为AL1761。

褐藻胶裂解酶AL1761的原始基因序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

ATGGAATATTTTGATTTAGATTTATTAAAAGAAAATATTGAAAAAAATGAAAAATATAAAAATATGATTGAAACAATGAAGGTAGAAGTGGAAGACTTCATGAAAGATTTTCATGATGACCCTTCCAAAACATCTAGATGGGGACATCATTACTTTTGTTCTAAAGATGGAGGATTACTTATTTATAATAGGAAAACACCAAACATTCATGTTTGTGAAATTTGTGGGCATGAGTATAAAGACAATGAACTACTTAATGGTGTTTGGGTTTATATGTATCGTAATGAAGCTATTTTAACAGCATGGAAATCAGGAGTTTTATATAGAGTAACAGAAGATAATAAATATTTAAGATATATTGAGAAAATTGTTGGATATTATGCTGACCATTATACAGAATTTGTACTTCACAATAAAGAAGGCAATGAATTTGAAAGTATAGAGGAAATGGAATGGGGTTGTGGCAGAATTATGCCACAAGGACTTAATGAATCTATTGTATTAATTAGAATAGTTAATTCACTTGAATTAGTAAAAGATTTTATATCAAAAGATTTTCTTGAAAAAGTTCATGATAAACTATTTAGAGAAGCTTTTAAATTATTAAAACCCCAGGTTAATAAAATACATAACATACCATTTTGGCTTAATAATGGTATAGGTGTAATGGGATTATTTTCAAATGATAAAGAAATGATAGATTTTGCATTTGAAGGAGAATATAATGTTAGAAAACAATTACAACAAGGGGTTACTAAAGATGGTTTTTGGTATGAAGGATCAATTCACTATAACTTCTTTACTTTAGAAGGAGCTACTAATTTATTATTATTTAGTGAATTATACGATTTTGATTTTGGAAAAGAGAAAGAAATTATTAAAAAGATGTTTATTTCTGCATATAAATATGCCTTTGATAATCAACAACTTCCAAATCCTAATGATGGTTGGCCAAATTTAAATCTAAAATCATATTCATATATTTATAGTGTAGCTACAAAAATTTTTGGAATAGAAAGTGAAGTAGGGAATCTACTTAAAAATATTTTAAAATCTGATTACGAAAGGGGACAATTCCCATTATCTAGGCCATATTATTATAAAAATGATATATCCCTTGAACAACTTATATTAATACCAGAAATTGACCCTAGTACAGCAAAACCTGTTGAACAAGTTTCAATAAATTTCGAAACTTCCAATTGTGGAATTATAAAACAAAATGGAATTAATGTATTTTATAAATATGGACATAATGGACCTTCTCATGCCCATCCAGATAAAATGAATATAGAAGTAGTAATTGGAAAATATTCCTTAAGTAGAGATTTATCCAATTCTGGATATGGTAATAAGTTATGTAATGAGTGGCATAGAATGACTCCATCTCACAATACAGTAGTTATAAACGGAGAAAATCATGTGTCTGTAGAACCAGGAGAATGTTTAGAATTTAAACCAAATATTTTAGATGCAAAAGTAGTAGATGTGTATCCAGGTGTAGATTTTAGAAGAAGAATAGAGTTATCAAATACTGGATTTATGGATAAGTTTTATGTTTATTCAAAATCAGAGAATATTAGTGATTATTTCTTCCATGTGGAAGCTAATTTAATAACTGATCTTGTAACTGAATCAGCTGATTTAGTGTTCAATAAAAATGGTTATCAGCATATTAGTGAAGTAAAGAAAGTAATAAATGATAAACCTAGTATTAAATTAGACTGGAAATTAGGAGACATGGTAATTACAAGTGATATATCTTTAGAAAATAAAGAGTTATTTATTGCAAAATCTCCTGATAATCCAATTACCGGTTCAAGAACTACTCTAATTATTAGAGAAAAAGCTTCAGAAATATTATATGAATTAAAATGGAGTATAAAA

（a）序列特征：

●长度：1887

●类型：基因序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：DNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源： Defluviitalea phaphyphilasp. Alg1

褐藻胶裂解酶AL1761的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

MEYFDLDLLKENIEKNEKYKNMIETMKVEVEDFMKDFHDDPSKTSRWGHHYFCSKDGGLLIYNRKTPNIHVCEICGHEYKDNELLNGVWVYMYRNEAILTAWKSGVLYRVTEDNKYLRYIEKIVGYYADHYTEFVLHNKEGNEFESIEEMEWGCGRIMPQGLNESIVLIRIVNSLELVKDFISKDFLEKVHDKLFREAFKLLKPQVNKIHNIPFWLNNGIGVMGLFSNDKEMIDFAFEGEYNVRKQLQQGVTKDGFWYEGSIHYNFFTLEGATNLLLFSELYDFDFGKEKEIIKKMFISAYKYAFDNQQLPNPNDGWPNLNLKSYSYIYSVATKIFGIESEVGNLLKNILKSDYERGQFPLSRPYYYKNDISLEQLILIPEIDPSTAKPVEQVSINFETSNCGIIKQNGINVFYKYGHNGPSHAHPDKMNIEVVIGKYSLSRDLSNSGYGNKLCNEWHRMTPSHNTVVINGENHVSVEPGECLEFKPNILDAKVVDVYPGVDFRRRIELSNTGFMDKFYVYSKSENISDYFFHVEANLITDLVTESADLVFNKNGYQHISEVKKVINDKPSIKLDWKLGDMVITSDISLENKELFIAKSPDNPITGSRTTLIIREKASEILYELKWSIK

（a）序列特征：

●长度：629

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源： Defluviitalea phaphyphilasp. Alg1。

实施例2、大肠杆菌表达载体pEASY-BluntE1-AL1761构建。

根据AL1761的基因序列和大肠杆菌表达质粒pEASY-BluntE1（全式金生物）的质粒图谱设计引物，而后以 Defluviitalea phaphyphilasp. Alg1的基因组DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，经电泳验证AL1761的分子量大小为1887 bp左右，表明扩增成功（参见图3）。

引物如下：

AL1761：

正向引物F：5’-ATGGAATATTTTGATTTAGATTTATT-3’；

反向引物R：5’-CTATTTTATACTCCATTTTAATTC-3’；

PCR反应体系如下：

之后使用Omega PCR纯化试剂盒进行PCR产物纯化，测定浓度，按照大片段：小片段的摩尔比为1：3的比例使用T4 DNA连接酶进行连接，16°C连接12h，连接体系如下：

将上述获得连接产物转化于50 μL Trans1-T1感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴30min。冰浴结束后42℃热激30秒，然后立即置于冰上2分钟。加0.6 ml LB无抗培养基，200 转，37℃孵育1小时。菌液6000rpm离心1min后，取50-100 μL全部用来涂添加了氨苄的LB平板，培养过夜，挑取17-20个单克隆进行菌落PCR验证，获得重组质粒pEASY-BluntE1-AL1761。

PCR方法分析阳性重组子

1．挑选克隆至500 μL LB液体培养基中，37℃培养5-6h。

2. 25 μL 反应体系中取1 μL 菌液用作PCR 反应的模板，用AL1761正向引物和反向引物鉴定重组子。

3. PCR 反应条件，循环数33个：

结果得到大小为1887 bp左右的的扩增条带，如图3所示。初步验证正确后，再挑选正确的质粒，送样到青岛擎科梓熙公司进行测序，进一步证明构建的重组质粒pEASY-BluntE1-AL1761正确。质粒图谱如图2所示。

实施例3、AL1761 在大肠杆菌中的表达

将上述获得重组质粒pEASY-BluntE1-AL1761于LB液体培养基过夜培养，提取质粒后转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自TransGen Biotech公司)，得到表达pEASY-BluntE1-AL1761的工程菌。涂布于100μg/ml氨苄的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养18h后，挑取单克隆作为种子培养过夜。

之后分别接种于装有250ml的LB液体培养基的500ml三角瓶中，于37℃，220rpm摇床中培养3-5小时待OD600nm达到0.8-1.2之间时，加入使用终浓度为1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行工程菌的诱导表达，22℃，220rpm下诱导18小时。在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用Buffer 0（50mM NaH2PO4，500mMNaCl， pH8.0）重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎30-40min，破5s停5s，30%功率。在60℃水浴锅中处理10min，让大部分杂蛋白变性沉淀。在10,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集上清组分，破碎完成后在低温下以10000rpm离心20min，所得上清经0.22µm滤器过滤后即得到粗酶液，并用Ni-NTA对褐藻胶裂解酶AL1761进行纯化。用含有咪唑浓度为10、50、100、250、500mM的Buffer 0进行梯度洗脱，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组褐藻胶裂解AL1761的纯化情况。将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE，以确定目的蛋白的AL1761纯化结果如图4所示。

实施例4、褐藻胶裂解酶AL1761的最适温度分析

以2g/L的海藻酸钠为底物测定蛋白酶活时使用分光光度法在OD235nm测定不饱和褐藻寡糖生成量。取浓度为海藻酸钠质量1%的褐藻胶裂解酶溶液，加入到2g/L的海藻酸钠的乙酸-乙酸钠缓冲液（200 mM乙酸-乙酸钠盐缓冲液，pH5.8）中，70°C反应3min，在有水浴锅循环加热的紫外分光光度计下测定其OD235nm的变化值。

一个酶活单位定义为每分钟OD235nm的值变化0.1数值。比酶活力定义为酶活与对应蛋白量的比值。褐藻胶裂解酶的最适反应pH值、最适反应温度及在最适反应条件下半衰期的确定，在其pH7.0值条件下测其在不同温度范围（30、40、50、60、65、70、75、80、85、90 °C）的酶活，确定其最适反应温度为65 °C。见图5所示。

实施例5、褐藻胶裂解酶AL1761的产物分析

利用上述实施例3纯化得到重组褐藻胶裂解酶AL1761，对海藻酸钠进行降解处理：

具体是，以10 g/L海藻酸钠为底物，用上述实施例3纯化得到褐藻胶裂解酶进行酶解处理；进一步的说是：

取AL1761蛋白溶于pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠钠缓冲液体系中，终浓度2 0µg/ml，而后加入至取浓度为海藻酸钠质量1%的褐藻胶裂解酶溶液的海藻酸钠（pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液）溶液中，酶解温度为65°C，酶解时间分别为12 h。利用薄层层析法检测在AL1761的酶解产物组成，结果如图6所示。在0h时，还未加入褐藻胶裂解酶AL1761，由于褐藻胶是超大分子量的物质无法在TLC板子上移动，只在底部形成一个黑点。酶解12h后，取样进行TLC薄层色谱分析，与不同聚合度的Marker进行比对后表明其95%以上为三糖，12h后，AL1761的酶解产物组成主要是三糖。

实施例6、褐藻胶裂解酶AL1761单独、以及与果胶酶、蛋白酶协同降解海带

海带细胞壁的成分40%左右的是褐藻胶，其余主要成分为蛋白质、海带多糖、岩藻多糖等物质，这些物质相互缠绕形成致密的结构。目前的方法主要是使用某一种酶来对海带进行处理，使得单一酶法无法很好的发挥作用。

采用上述纯化后褐藻胶裂解酶AL1761与果胶酶、蛋白酶（购自宁夏夏盛实业集团有限公司，酶活60000 u/g）三个复合酶以及单一的上述纯化后褐藻胶裂解酶AL1761对海带进行降解；具体为：

以15%质量浓度的海带粉水溶液作为底物，放置于50°C恒温摇床、200rpm溶胀2h，待底物变为胶状固体，无团状干海带粉，表明溶胀完全。此时按照海带粉质量的2.5%的混合酶。继续放入65°C恒温摇床、200rpm开始酶解；其中，混合酶为质量比为2:2:1的褐藻胶裂解酶AL1761、果胶酶和蛋白酶；

同时，向溶胀后海带粉底物中加入底物质量1%的褐藻胶裂解酶AL1761按照上述记载条件进行酶解。

以海带降解率为指标干重法测定降解效率，取2ml的离心管置于60°C烘箱烘干至恒重，将上述不同条件下获得海带粉酶解后的酶解液摇匀后等体积取样2次,每次1ml, 离心收集残余海带粉，吸取上清，用水洗两遍残渣，离心，倒掉水后进行烘干至恒重，测定干重。

结果表明单独使用AL1761降解效率高达93%，进一步和果胶酶可以和蛋白酶一起配合配合降解12h后，降解效率达到了98%。结果见图7所示。

实施例7、海带酶解液中海藻酸含量的测定

为进一步明确海带酶解液中主要营养成分的含量，在pH7.0 ，温度65℃，200rpm转速使用复合酶酶解海带粉12h后，对酶解液中的海藻酸含量测定。海藻酸含量测定采用硫酸-卡唑法，标准曲线使用海藻酸钠进行测定。

海藻酸在强酸条件下水解为糖醛酸，糖醛酸可与咔唑形成稳定的紫红色化合物，在520 nm波长下用分光光度汁测定其吸光度。根据其吸光度数值，可计算藻液中海藻酸的质量分数。所需试剂如下：

6.1 硫酸。

6.2 无水乙醇。

6.3 海藻酸钠贮备液[(C6H7NaO6)n］储备液：10 mg/mL。称取10. 00 g海藻酸钠，溶解于去离子水中，定容至1000 mL。

6.4 海藻酸钠标准液：l mg/mL。吸取10.00 mL海藻酸饷储备液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

6.5 咔唑乙醇溶液：2 g/L。称取0.2g咔唑，用无水乙醇溶解并定容至100 mL。

首先是做好海藻酸含量的标准曲线根据海藻酸肥料国家行业标准，《海藻酸类肥料-HG_T 5050-2016》和《含海藻酸尿素-HG_T 5049-2016》关于海藻酸含量的测定方法如下：

配制海藻酸钠标准溶液1mg/mL，分别移取海藻酸钠标准溶液0.00mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 ml，至50mL比色管中，分别加入3.00 mL、2.80mL、2.60 mL、2.40 ml、2.20 mL、2.00 mL、1. 80 mL水，使体积为3.00mL移入冰水浴中，边振荡边缓缓加入10.00 mL硫酸．开始约每秒1滴，待加入一半酸后增加至约每秒2滴，加完后放入沸水浴中，加热20min。取出，冷却至80℃，加入0.30 mL咔唑乙醇溶液，摇匀．室温下放置45min，在520nm波长下用1cm吸收池进行比色．以试剂空白为参比，测定吸光度。以总显色体积的标准比色液中所含海藻酸钠的质量（mg）为横坐标、以试样测得的吸光度为纵坐标绘制标准曲线或求线性回归方程。结果如图8所示。线性方程为y = 0.6401x - 0.119（R² =0.9963）线性化程度真实可信。

海藻酸含量的测定方法为称取1 g～2 g （准确至0. 000 2 g）酶解海藻液于烧杯中．加入25 mL去离子水溶解．转移至50 mL容量瓶中，定容摇匀。准确移取3. 00 mL试样溶液50 mL比色管中，以下与标准曲线绘制的操作步骤相同。

从标准曲线查出所测吸光度对应的海藻酸的质量或由回归方程求出海藻酸钠的质量。经检测酶解液中海藻酸含量为5.16%。

Claims

1.一种褐藻胶裂解酶在定向降解褐藻获得褐藻寡糖三糖中的应用,其特征在于：褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在定向降解褐藻获得褐藻寡糖三糖中的应用，其特征在于：褐藻胶裂解酶的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在定向降解褐藻获得褐藻寡糖三糖中的应用，其特征在于：所述褐藻为海带、马尾藻、泡叶藻、巨藻中的一种或几种。

4.一种定向酶解获得褐藻寡糖三糖的方法，其特征在于：以海藻酸钠为底物，添加褐藻胶裂解酶，在pH3-9，温度65℃下酶解获得褐藻寡糖三糖；其中，褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求4所述的定向酶解获得褐藻寡糖三糖的方法，其特征在于：所述酶为褐藻胶裂解酶或含褐藻胶裂解酶的复合酶；其中，酶为褐藻胶裂解酶时添加量为底物质量的0.5%-2%；酶为混合酶时混合酶的添加量为底物质量的2%-5%。

6.根据权利要求5所述的定向酶解获得褐藻寡糖三糖的方法，其特征在于：所述混合酶为按2:2:1比例的褐藻胶裂解酶、蛋白酶和果胶酶。