CN108929878B - 褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及褐藻胶裂解酶，具体的说是三种降解褐藻胶的褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用。褐藻胶裂解酶分别为褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5，所述褐藻胶裂解酶的编码基因碱基序列依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。本发明还利用基因工程的方法，将褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠杆菌和毕赤酵母中。将AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5克隆到毕赤酵母的表达载体上，经过发酵条件优化，发酵120h后，胞外蛋白分别为0.312g/L,1g/L,9.39g/L,酶活为分别为64666.67U/mL，126666.67U/mL和136025.6U/mL。获得可制备褐藻胶酶的大肠杆菌重组菌株及毕赤酵母菌株。重组酶的性质稳定，可用于褐藻胶的高附加值转化，且三个酶的酶活均远远高出目前为止已报道的数值，具有很好的工业应用潜质。

Description

褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及褐藻胶裂解酶，具体的说是三种降解褐藻胶的褐藻胶裂解酶的编码基因 及其应用。

背景技术

藻类作为第三代可持续生物能源的代表，不含木质素，因此利于单糖释放，繁殖快、 能耗低、不占用耕地和不消耗淡水,不产生粮食矛盾等许多优势，相比于的第一代生物能 源原料(谷物为代表)，第二代生物能源原料(秸秆等为代表的),具有广阔的应用前景。目前全球大型藻类总产量是2500万吨/年，中国占其中的53.97％，是世界上最大的生产国，其次是印度尼西亚、韩国、日本、马来西亚，这些亚洲国家的总产量占到了全部的96.27％。其中褐藻和红藻是大型藻类养殖最主要的两类。褐藻中的重要多糖成分重要包括褐藻胶、甘露醇和少部分的海带多糖，基本前两种物质能占70％左右[Zhu B,Yin H,Bioengineered,2015,6(3):125-131]。

褐藻胶主要存在于褐藻中,例如昆布(Laminaria hyperborean),大昆布(Macrocystis pyrifera),掌状海带(Lamimria digitata),泡叶藻(Ascophyllumnodosum),海带(Laminaria japonica),巨藻(Lessonia nigrescens),南极海藻(Durvillea antarctica),马尾藻 (Sargassum)等褐藻的细胞壁中,可以占海带干重30-40％[Wong TY,Preston L.Annual Review of Microbiology 2000,54:289-340.]。,除了藻类外，假单胞菌属(Pseudomonas) 和固氮菌属(Azotobacter)两个属的细菌也能够合成褐藻胶，这些细菌多为致病菌，例如 能引起囊性纤维化的铜绿假单胞菌通过形成含有褐藻胶的生物被膜(biofilm)来提高其 防御能力[G.A.Islan et al.International Journalof Pharmaceutics 496,2015,953–964； Rehm BHA,Nat Rev Microbiol,2010,.8:578–592]海洋褐藻胶的主要生物学功能与陆生植 物体内的纤维素的生理性质类似，是起到结构支撑的作用。

褐藻胶作为长链大分子，主要以褐藻酸盐的形式存在,例如褐藻酸钠和褐藻酸钙等。 由于褐藻酸盐具有良好的其亲水性、成凝胶、粘稠性以及生物相容性等独特的理化性质, 多年来已广泛应用于食品、医药和化工等各个领域具有凝胶特性,作为稳定剂、增调剂和 现化剂被广泛地应用于食品、纺织、印染、生物、医药等工业。例如作为膳食纤维的功能,起到控制血糖和血脂的功能、延缓衰老、抗肿瘤、增强机体免疫功能等多方面的生态 效应和保健功能；作为释放或包埋药物基质材料,起到药物缓释的作用；另外也可作为支 架材料,用于医学用途[Lopes M.Expert Opinion on Drug Delivery,2016:1-14；Fuenzalida J P.Food Hydrocolloids,2016,53:239-248.]。

褐藻胶作为褐藻中三种的多糖成分之一，随着季节的变化含量有所不同，其含量最 多的时候占到了干重的40％。褐藻胶是一种线性多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(M)、α-L-古罗糖醛酸(G)通过1，4糖苷键连接而成，排列方式分为(Poly-mannuromte,简称PM)、 聚古罗糖酸酸片段(Poly-guluronate,简称PG)和甘露糖酸酸-古罗糖醛酸杂合片段(MG blocks简称PMG)三种形式。不同排列方式在聚合的空间结构差别很大。[Grasdalen H,Carbohydrate Research,1983,118:255-260.]

与传统化学法降解褐藻胶相比，利用微生物代谢酶降解褐藻的反应条件易于控制、 底物特异性强、产率高、节能环保等诸多优势。但是目前已知的褐藻胶酶大多为中低温酶，而且热稳定性不好，不适合大规模的工业化应用，这也成为了限制褐藻胶的高附加 值转化化学品如燃料、褐藻寡糖、药物转化的主要因素。因此，如何寻找高效、热稳定 强的褐藻胶酶成为人们关注的热点。

褐藻寡糖因其特殊的化学特性和生物活性受到了极大关注，近年来的研究发现,褐藻 酸寡糖有很多种生物活性,例如抗肿瘤、促进植物生长、调节免疫力、调节血糖血脂等重要的研究和利用价值。与传统酸解制备生产寡糖相比，用褐藻酸裂解酶作为工具酶生 产褐藻寡糖具有诸多优点，比如环保，高效，反应过程可控。褐藻酸裂解酶是一类可以 通过裂解反应降解褐藻胶的酶类,由于褐藻在生态系统中的位置也很重要，该酶还参与 了海洋碳循环的过程，因此对褐藻胶酶的研究不仅具有极大地应用前景，还能为全球碳 汇研究，及人们对生态系统的了解，提供新思路。

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸两种糖单元通过1,4糖苷键聚合而成 的线性大分子。褐藻多糖及其降解产物褐藻低聚糖已广泛应用于制药、食品、化工等多个领域。褐藻胶裂解酶能通过β-消去反应裂解褐藻胶的1,4糖苷键，在非还原性末端 生成带有C4,5双键的不饱和糖醛酸。褐藻胶的高粘度和凝胶性能，被广泛用于食品行 业作为食品改性剂。褐藻胶裂解酶通过β消除反应，断裂褐藻胶的1,4糖苷键，在非还 原性末端生成带有C4,5双键的4-脱氧-L-erythro-hex-4-烯醇式吡喃糖醛酸。褐藻寡糖目 前已经被证明具有刺激人的内皮细胞生长，以及促进巨噬细胞分泌细胞因子等诸多应用 领域，已被广泛应用于制药、食品、化工等多个领域。褐藻胶被内切和外切褐藻胶酶转 化为不饱和单糖，因此褐藻胶酶作为生物催化剂可以被用于可再生的化学品、生物燃料 生产，海藻肥生产，食品添加剂等很多工业领域。

发明内容

本发明目的在于提供一种褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种褐藻胶裂解酶，褐藻胶裂解酶分别为褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5，所述褐藻胶裂解酶的编码基因碱基序列依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

所述褐藻胶裂解酶为与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示碱基序列具有至少95％同源性，且具有活性的编码基因。

所述褐藻胶裂解酶的编码基因碱基序列依次为SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8。

一种降解褐藻胶的质粒，包含上述任意所述的褐藻胶裂解酶。

所述质粒载体为pET-30a(+)或pEASY-Blunt E1Expression Vector。

一种降解褐藻胶的菌株，包含上述任意所述的褐藻胶裂解酶。

所述宿主菌株为大肠杆菌Trans1-T1或BL21(DE3)，毕赤酵母菌株(X33)

一种褐藻胶裂解酶的应用，所述褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶中的应用。

所述褐藻胶裂解酶AlgAT0在降解PolyMG中的应用；

所述褐藻胶裂解酶AlgAT1在降解PolyM和PolyG中的应用；

所述褐藻胶裂解酶AlgAT5在降解PolyM和PolyG中的应用。

所述褐藻胶裂解酶在55-75℃下、PH为5.5-6.5在降解褐藻胶中的应用。

褐藻胶裂解酶的应用，其特征在于：所述褐藻胶裂解酶AlgAT0在生产不饱和二糖中的应用；

所述褐藻胶裂解酶AlgAT1在生产不饱和四糖中的应用；

所述褐藻胶裂解酶AlgAT5在生产不饱和二糖、三糖和单糖中的应用。

本发明所具有的优点：

本发明所得褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5源于海洋嗜热菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1，具有催化效率高、热稳性强的特点，是符合产业化需求的新型褐 藻胶酶。其中，褐藻胶裂解酶AlgAT0对PolyMG表现出较强的酶活，主产物为不饱和 二糖，AlgAT1对PolyM和PolyG均表现出较强的酶活，主产物是不饱和四糖，AlgAT5对PolyM和PolyG均表现出较强的酶活，主产物包括不饱和二糖、三糖和单糖。三个酶 都具有热稳定性好、催化效率高的优点，为高效稳定工具酶的开发、推广和提升褐藻胶 酶的产业应用价值打下了基础，具备工业应用的潜质。

附图说明

图1为本发明实施例提供的褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的基因注释结果图；其中A、B、C依次为AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5；

图2为本发明实施例提供的三种重组褐藻胶裂解酶的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白marker，1为AlgAT1，2为AlgAT5，3为AlgAT0；

图3为本发明实施例提供的三种重组褐藻胶裂解酶的底物特异性效果图；其中A、B、 C依次为AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5；

图4为本发明实施例提供的三种重组褐藻胶裂解酶的最适温度效果图；其中A、B、C依次为AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5；

图5、本发明实施例提供的三种重组褐藻胶裂解酶的最适pH效果图；其中A、B、C 依次为AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5；

图6为本发明实施例提供的三种重组褐藻胶裂解酶的热稳定性效果图；其中A、B、C依次为AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5；

图7为本发明实施例提供的金属离子，有机溶剂及表面活性剂对褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT5的影响图，其中，A、B依次为AlgAT0，AlgAT5；

图8为本发明实施例提供的用重组褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5降解褐藻酸钠终产物的薄层层析TLC分析图；其中A、B、C依次为AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5；

图9为本发明实施例提供的Superdex Peptide 10/300GL分子凝胶色谱对褐藻胶裂 解酶AlgAT0，AlgAT5的终产物进行分离效果图，其中，A、B依次为AlgAT0，AlgAT5； 图中monomer、DP1、2、3、4分别代表不饱和单糖、二塘、三糖和四糖；

图10为本发明实施例提供的负离子高分辨质谱(MS)对褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT5的终产物进行分析图，其中，A、B依次为AlgAT0，AlgAT5，monomer、△DP、2、 3、4分别代表不饱和单糖、二塘、三糖和四糖；

图11为本发明实施例提供的三种重组褐藻胶裂解酶在毕赤酵母中经诱导表达96h后的SDS-PAGE分析图；其中A、B、C依次为AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5；

图12为本发明实施例提的DNS法测定葡萄糖醛酸标曲；

图13为本发明实施例提的重组褐藻胶裂解酶AlgAT5在毕赤酵母中发酵图，其中，A,5L发酵罐对褐藻胶裂解酶AlgAT5发酵过程的OD600nm随时间变化图；B,AlgAT5发 酵过程的胞外蛋白含量随时间变化图；C,OD235nm法测定发酵罐中AlgAT5胞外酶活随 时间变化图；D,DNS法测定5L发酵罐中胞外酶活随时间变化图.取样点分别为0,12, 24,34,40,52,62,72,84,96,108,120,132h；

图14为本发明实施例提的SDS-PAGE分析不同发酵时间的AlgAT5胞外蛋白图，其中M是蛋白marker，泳道1-13分别是0,12,24,34,40,52,62,72,84,96,108, 120,132h的胞外蛋白；

图15为本发明实施例提的重组褐藻胶裂解酶AlgAT0和AlgAT1在毕赤酵母中发酵图，其中A，5L发酵罐对褐藻胶裂解酶AlgAT0发酵过程的OD600nm随时间变化图；B， OD235nm法测定发酵罐中AlgAT0胞外酶活随时间变化图；C，5L发酵罐对褐藻胶裂解酶 AlgAT1发酵过程的OD600nm随时间变化图；D，OD235nm法测定发酵罐中AlgAT1胞外酶 活随时间变化图；

图16为本发明实施例提的褐藻胶裂解酶AlgAT5降解海带粉结果图；其中EP管1-7分别是加入了280U,560U,1120U,2800U,5600U,8400U,11200U的AlgAT5；

图17为本发明实施例提的三种重组褐藻胶裂解酶对海带粉降解结果图；其中，A,咔 唑-硫酸法测试海藻酸含量标准曲线；B,三种重组褐藻胶裂解酶对海带粉降解结果，以及其对海带粉降解的协同效应分析。

具体实施方式

下面结合符合和实施例对本发明作进一步的解释说明。

本发明所涉及的三种褐藻胶裂解酶来源于近海环境中的一株海洋嗜热新菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1(CGMCC 1.5199^T and JCM 30481^T)。编码所述褐 藻胶裂解酶的基因序列分别为SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3中所示， 碱基长度分别为1455bp，5475bp和729bp。氨基酸序列为SEQ ID NO：4，SEQ ID NO： 5，SEQ ID NO：6。分子量分别为54.14KD，204.10kD，23kD。AlgAT0，比酶活3592U/mg， 具PolyMG特异性酶活；AlgAT1比酶活2850U/mg，具双功能酶活性；AlgAT5，比酶活 700U/mg、具双功能酶活性。这三种酶最适温度超过60℃，热稳定性明显优于目前报道 其余褐藻胶裂解酶。本发明还利用基因工程的方法，将褐藻胶裂解酶的基因克隆到大肠 杆菌和毕赤酵母中。将AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5克隆到毕赤酵母的表达载体上，经过 发酵条件优化，发酵120h，后胞外蛋白分别为0.312g/L,1g/L,9.39g/L,酶活为分别为 64666.67U/mL，126666.67U/mL和136025.6U/mL。获得可制备褐藻胶酶的大肠杆菌重 组菌株及毕赤酵母菌株。重组酶的性质稳定，可用于褐藻胶的高附加值转化，且三个酶 的酶活均远远高出目前为止已报道的数值，具有很好的工业应用潜质。

实施例1、海洋嗜热菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1菌株基因组DNA的提取：

将海洋嗜热菌Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1[Ji S Q,Wang B,Lu M,etal. Defluviitalea phaphyphila sp.nov.,a novel thermophilic bacterium thatdegrades brown algae[J].Applied and environmental microbiology,2016,82(3):868-877.]接种至液体培养基 BMS中，在厌氧试管中，60℃培养2天；取培养菌液10mL，在12,000×g条件下离心 5min，收集菌体沉淀；用TE缓冲液洗两遍除去培养基残留，离心收集菌体，参照 TIANGEN细菌基因组提取试剂盒的方法，用细菌基因组DNA提取试剂盒提该菌的基因组。最后用60℃的无菌去离子水在溶解DNA样品，制得基因组DNA。

上述液体培养基BMS的组分如下：

磷酸氢二钾0.1g/L,磷酸二氢钾0.1g/L,碳酸氢钠1g/L,氯化铵2g/L,海盐30g/L,半胱氨酸0.5g/L,酵母提取物1g/L,维生素是在以下浓度下添加的(mg/L):吡多西胺盐酸盐，1；对氨基苯甲酸(PABA)，0.5；生物素，0.2；维生素B12，0.1；盐酸硫胺素，0.1； 叶酸，0.2；泛酸钙盐，0.5；烟碱酸，0.5；pyridoxine-HCl，0.1；硫辛酸，0.5；核黄素， 0.1。调节pH值为7.4。

根据基因组测序结果，获得三个褐藻胶裂解酶的基因序列[Ji S Q,Wang B,Lu M,et al.Defluviitalea phaphyphila sp.nov.,a novel thermophilic bacterium thatdegrades brown algae[J].Applied and environmental microbiology,2016,82(3):868-877.]，将获得基因序列， 采用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的CD-Search和EMBL-EBI的InterPro 进行这三个基因的保守结构域的分析，用上述生物学软件分析的结果显示，褐藻胶裂解 酶AlgAT0，AlgAT0由orf0084编码，基因全长1455bp，推测含有在多糖裂解酶6家族 (PL6)中保守的假定催化结构域，命名为AlgAT0,并且包含钙离子结合位点(如图1-A 所示)。用生物学软件DNAMAN进行分析，显示蛋白质AlgAT0的理论分子量约为54.14 kDa。用信号肽在线预测软件SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)在 线分析，该蛋白质N端有21个氨基酸的分泌型信号肽。

褐藻胶裂解酶AlgAT1，AlgAT1由orf0100编码，基因全长5475bp，采用NCBI 的CD-Search和EMBL-EBI的InterPro预测该基因的保守结构域(如图1-B所示)，褐 藻胶酶AlgAT1具有七个预测结构域包括Alginate Lyase(1)、HeparⅡ/Ⅲ(1)、FN3(3)、CBM6/35(1)和F5/8(1)七个结构域。理论分子量约为204.10kDa。用信号肽在线预 测软件SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析，该蛋白质N 端存在的26个氨基酸的分泌型信号肽。去除信号肽后，该酶由1799个氨基酸组成。

褐藻胶裂解酶AlgAT5，推测含有在褐藻胶裂解酶超级家族2中保守的假定催化结构域，命名为AlgAT5(如图1-C所示)。用生物学软件DNAMAN进行分析，显示蛋白 质AlgAT5的理论分子量约为23kD。用信号肽在线预测软件SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析，该蛋白质N端有28个氨基酸 的分泌型信号肽。

实施例2

褐藻胶裂解酶基因的克隆及其在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的表达、纯化：

1)根据三个褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的基因，设计如下引物：

AlgAT0：

正向引物F：5’-ATGAATGTTTACGCTACTTCTACTGAAAC-3’；

反向引物R：5’-ATTATCTATACCTACATCTGACGAAGTTAAAGG-3’；

AlgAT1：

正向引物F：5’-GCAAACTATGAAACTTATGATGGTTTTAAAGTT-3’；

反向引物R：5’-TTGTATTGGAAGTAATACTGGTCCTGCTGGATT-3’；

AlgAT5：

正向引物F：5’-CGGAATTCATGAAGGGAAGATTAAAAAAATGGT-3’(EcoR I)；

反向引物R：5’-CCGCTCGAGACTATGGGTTACTACTAGATTATAAATTTC-3’ (Xho I)；

上述正向引物中下划线标注的是限制性内切酶EcoR I位点，反向引物下划线标注的 是限制性内切酶Xho I位点。加粗显示的是保护碱基；

以实施例1制得的基因组DNA为模板，利用上述获得引物分别进行PCR扩增。体 系如下：

所用高保真DNA聚合酶KAPA HiFi Hot Start DNA Polymerase(KAPABiosystems) 所用PCR反应试剂按照产品说明进行操作。PCR扩增条件如下：94℃预变性10min， 94℃变性30sec，67℃退火30sec，72℃延伸60sec，循环30次，72℃延伸10min。 PCR完成后分别进行琼脂糖凝胶电泳验证分子量大小(参见图2)。

2)将上述获得褐藻胶酶AlgAT0和AlgAT1分别使用pEASY-Blunt E1 ExpressionVector(TransGen Biotech公司)表达载体进行表达

反应体系配置

轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。

3)转化感受态细胞Trans1-T1Competent Cells：将上述获得连接产物与加入至50μl Trans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴20-30 分钟。

42℃热激30秒，立即置于冰上2分钟。

而后向体系中加1ml平衡至室温的LB，200转，37℃孵育1小时。

孵育后菌液以6000rpm离心1min后，铺板，培养过夜(为得到较多克隆，4000rpm 离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过 夜)。

4)PCR方法分析阳性重组子

①挑选白色克隆至10μl无菌水中，涡旋混合。

②25μl PCR扩增反应体系中取1μl上述混合液菌液用作PCR反应的模板，用T7 正向引物和反向引物鉴定重组子。

T7引物：

正向引物F:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'

反向引物R:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'

③PCR反应条件：94℃预变性10分钟(裂解细胞，失活核酸酶)，94℃变性30秒， 55℃退火30秒，72℃延伸(根据片段的大小确定延伸时间)30个循环，72℃后延伸 10分钟。37℃培养18h后，挑取单克隆20个，确认包含重组子的克隆，即用T7的正 向和反向引物，菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增条带，初步验证正确，将验 证结果正确的克隆在在37℃，200rpm条件下过夜培养后，提取质粒；接着将该重组质 粒送样到擎科梓熙公司进行测序，结果表明，在pEasy-E1Cloning vector中分别插入SEQ IDNO.1，SEQ IDNO.2所示的基因AlgAT0和AlgAT1，且插入方向正确，所以进一步证 明构建的重组质粒正确。

5)褐藻胶酶AlgAT5使用pET-30a(+)进行表达，将PCR产物用限制性内切酶EcoR I和Xho I(FD)在37℃下进行双酶切1.5小时，在通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR 产物。将表达载体pET-30a(+)质粒DNA，同样用EcoR I和Xho I(FD)在37℃下进行双 酶切1.5小时，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。限制性内切酶EcoR I和 Xho I均购于Thermo Fisher Scientific公司，酶切所用到的酶与底物反应的体系、温度和 时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

6)将经过EcoR I和Xho I双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-30a(+)质粒载体，在DNA T₄连接酶的作用下进行16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell(TransGen Biotech公司)菌株，涂布 于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基固体平板上，37℃培养18h后，挑取单克隆20 个，用-T7正向引物和反向引物鉴定重组子。

T7引物：

正向引物F:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'

反向引物R:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'

进行菌落PCR验证，结果得到大小为700bp的扩增条带，初步验证正确，将验证 结果正确的克隆再扩大过夜培养后，提取质粒；接着将该重组质粒送样到擎科梓熙公司 进行测序，结果表明，在pET-30a(+)的EcoR I和Xho I酶切位点之间插入SEQ IDNO.3 所示的基因AlgAT5，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确。

将上述获得含有重组质粒的克隆菌株在37℃，200rpm条件下过夜培养，分别提取质粒pEasy-E1-AlgAT0，pEasy-E1-AlgAT1和pE30a(+)-AlgAT5，而后分别转化大肠杆 菌菌株BL21(DE3)(购自TransGen Biotech公司)，得到表达pEasy-E1-AlgAT0，pEasy-E1-AlgAT1和pE30a-AlgAT5的工程菌。

将上述pEasy-E1-AlgAT0，pEasy-E1-AlgAT1涂布于100μg/ml氨苄的LB培养基固体平板上，37℃培养18h后，挑取单克隆作为种子培养过夜。pE30a-AlgAT5涂布于含 有50μg/mL卡那霉素的LB培养基固体平板上，37℃培养18h后，挑取单克隆作为种子 培养过夜。

将上述获得种子分别接种于装有250ml的LB液体培养基的500ml三角瓶中，于 37℃，220rpm摇床中培养3-5小时待OD600nm达到0.8-1.2之间时，加入使用终浓度为 1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行工程菌的诱导表达，22℃，220rpm下诱导18小时。 在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用Buffer 0(50mM NaH₂PO4， 500mMNaCl，pH8.0)重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎30-40min，破5s停5s，30％ 功率。在60℃水浴锅中处理10min，让大部分杂蛋白变性沉淀。在10,000×g、4℃条件 下进一步离心30min，收集上清组分，破碎完成后在低温下以10000rpm离心20min，所 得上清经0.22μm滤器过滤后即得到粗酶液。

用Ni-NTA Resin(购自TransGen Biotech公司)对褐藻胶裂解酶粗酶液AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5进行纯化。

Ni-NTA-Sefinose柱中的乙醇流出后，加入总体积为10ml的无菌水，每次加入2ml。加入总体积10ml的Buffer 0(50mM NaH₂PO4,500mM NaCl,pH8.0)，每次加入2ml。 加入粗酶液，并穿透3次。加入磷酸缓冲液(50mM NaH₂PO4,500mM NaCl,pH8.0)，直 至流出液中无蛋白。然后依次加入咪唑浓度逐渐升高的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4， 300mM NaCl，咪唑浓度分别为25mM、50mM、100mM、250mM，pH 8.0)各5mL， 并收集蛋白组分，每次收集1mL。

完成纯化后，用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的纯化情况。将聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测蛋白纯度达到98％以上的重组褐 藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5样品分别装入最小分子截留量为30kD,100kD,10kD 的超滤管，在4000rpm，4℃下对AlgAT5进行浓缩，并将缓冲液置换为100mM的Tris-HCl pH8.0。制得重组褐藻胶裂解酶AlgAT5酶液。将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE，以确 定目的蛋白的纯度，然后用BCA的方法测定蛋白浓度，AlgAT5纯化过程如图2所示。

纯化结果如图2所示，所获得的褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的分子 量分别为54.14kDa,200kDa,23kDa。

利用大肠杆菌对上述获得AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5分别进行1L摇瓶发酵，37℃，200rpm下培养3-4h待OD600nm达到0.8-1.2左右后，加入终浓度为100mM的IPTG(购 自Solarbio Life Science公司)22℃，200rpm下培养18h，收集菌体，破碎细胞，纯化蛋 白的蛋白表达量分别为，10mg/L，10mg/L，20.15mg/L。AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5 的酶活分别为35.92U/mL、28.5U/mL、14.1U/mL

上述三种褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的基因序列如SEQ ID NO.1，SEQID NO.2，SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1：

ATGAGAAAATTTTATACTATTATTCTTATTTTATTTTTAACTCTAAGTACTTTTAATGA AAAAATGAATGTTTACGCTACTTCTACTGAAACAAATAATATATATGTATCTACAAAT GATGAATTAGAAGATGCGGTAAATAATGCTGTACCAGGTGATACAATTATTGTGGCA GATGGAAGTTATGAAGCTTTTAAAATTAAAAATAAAATTGGAACAGAAGATGCTCC TATTACAATAACTGCTGAAAATACATTAGGTGCAACCTTTGATGAAGGACAATTACA CTTTTATGAATGTGAATATATTGTTTTTAAAGGCTTTGGAATCTATACAGATTCAGAA ATTAAAATCGAGGGGTCCAATCATATACGTTTAACAAATAATCATATAAGATTAAATG AAGAAGATACGGATTCTTTAAAATGGATTAGAATTTATGGAGAAAACAGTGGTTAT AATCAAATAGATCATAATATATTTGATGAAAAAACAAAACTTGGAAATTTTATTACCATTGATGGAACAAATGAAGATGATCATGGTTCTTGTGTTTCTTCTCAATATGATGTTA TTGAATATAATTATTTCTATAACATTGGTCCACGGGCAGATAATGAAATGGAAGCTAT CCGGGTTGGTTGGAGTGAAATGTCTGAATCAAGTGGCTATACAACTATTCAATATAA TCTATTTGAAGAATGTGATGGTGACCCTGAAATTATATCTATTAAAACTTGCGATAAT ATAGTTAGATATAATACCTTTAGATCTTGTCAAGGAGTAGTAAGTTTAAGACACGGT AATCGCAATGAAGTATATGGGAATTTCTTCTTTGGAGAAGGTAAAGAAGGAACTGG TGGTATTCGTGTTTATGGTTCCGACCATAAAATATATAATAATTATATGGAAGGATTA ACTGGTAGTGGATACTCTGCACCTATAATCTTAGATGGTGGAGATGTTGACACTAGT GGAGCTTTAAATAAACATTTTAGAGTATACAGAGCTGAAGTTGTTAATAATACAATA GTAAACTGTGATTATGGTATAGAAATAGGTACAAATTATTCTTATGCTCCTTCTGATT GTATCATTGCTAATAATCTAATTGTAAATTCAGAAAATGAAGCCATTGCAGAGTATA ATGAACCAGTAAATATGACATATGAAGGAAATATAGTATCAGGTTCTGGAGATATTA TCACATTTTCTTCTATAACTGATGATGAAATTAAATTTGTAGAAGAAGTTGAATTAG AATTAAGTAATGATGGACTTTATAGATTAAAACAAGATAGTGTATCAATAGATTCCT CTGTTGGAAATTATTCATATGTCACAATAGATATGGATGGACAGTCAAGATCTTTAG CTGATGTAGGAGCCGATGAATTTTCTTCTGACGATATTGTTATATATCCTTTAACTTC GTCAGATGTAGGTATAGATAAT

(a)序列特征：

●长度：1455

●类型：基因序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

SEQ ID NO.2：

ATGAAAAAGTTTATAAGTCTTATGGTTTGCTTAAGTTTAGTAGTTTCTCTTTTCTTTA ATCAAAGTTATGTAATGGCAGCAAACTATGAAACTTATGATGGTTTTAAAGTTTCAG AAGAGCCAGTATTACCGGAAAAAGAAGTTCATCCATCTTTATGGTTTACAAAAAGT GATATTCAAAAAATTAAAGAAAAGAAAAATGAAGATTCATTTACAGCTGAATTATG GGAAGAAATTTCTAACAGTCCTTATTTGACTATGGAAATACCAACAGATATTCCTAG TGCTACTGATAGTGATACGGATATACATAAGTATTATGGGAATATGTCAAGAATAGCA AAATATAATGCTTTTATGTATTTGATGACAGGGAAAAGTGAATATAGATTAAGGGCT ACTGAAGCTTTAAAAAGAGCGTTTGATGGTCCTATATATGAAATGGACCCTACAGT TTCAGGAAGTGGAGTAGACGAAATTTATAGAGCTGTTTGGGCTCAAAATTTTGCAA CAGCTTATGACTGGATTCAACCATACTTATCAGATGAAGATGATGAAATTATTAGAG AACGTTTAGCAAAAGAAGCTCAAGTAGTATATGAAAATTTATACACTTGGGGTCCA AGACCACATAACCATTTATCTAAACCAGCTTGGGGATTAGGTACATTAGCACTTACA TTATCTGATCATCCAGATGCTTCAAAATGGTTAAATCGTGCCTTAGAAGCAGCAAAT ACCAATACTTTGTATTTCTTTAATAAAGATGGTCATTATAGAGAAGGTGCACATTATT ATGTTTATTCATTGGTAAATTTAATTCCATTTTTATATCATTATAAAAATGTGTCTGGT GTAAATTATTTCCCAGAATATAAAAATATTTTTGAATGGGCAGTTAAAATAAGAAAT GGAAGAGGATGGATGCCAAATGTAGAGGATTCATGGATAAAACCTGCTCCAACAC ATATGGTGGCATCTCAATATAAAGATACAGATACAGATTTACATTCTACTGCAAAATT GGCAAATATTTTACAATGGTCTTACTTTAATACAGATTTTAGACCTTGGGAACCAGA TGGCTCTTACACAGGAGCATCCTATGATGATACATGGGATATAGACCAATATTTAAC ATATGATAGTACTATTGAACAGATTAAGCCAGATGTTTCAGGAACAGTTTTTATGAA TAATAGTGGGCAAACAGTTTTTAGAAGTGATTGGAATTTTAATAATCCAAATTCTCG ATATTTGCTTTTCCAAGGGGTAGCTGAAGCAGATAATCACTATCATTATGATCATTTA AGTTTTATCATCCATGCAGAAAATCAAATGATGGCAAGTGATTCTGGATATTCTAGA AATAGTTATGGAGAAGGGATAAGAACTAGCTGGTATTTAACAGCTGAAGCACATAA TGTTATTACTGCTAATGGAGAGCATCCAAAAGATGTAAGCGAAAATACTACTCCTGT ATCACGTTATGATATGGATACTGATTTCTTTGATTTCCAAGAAAAAGAAGCAGTTTA TGATGGATTTACTTTCCCAGAAAAGAATTCTTATGATTTTAGTGGTAAACAAATTCG TGCTATTGGTTTCCCACGACAAGATTATTTTGTAGTAGCAGACCAGTTATTTAGTGA TAAAGAAGTGCAATATGATTTATATTTACATGGTGGTCGTGGAGAAATGTCTGGAGA AGGTAATTATCGTCTTTGGACTTATGAAGATGATAGATATGGTCAAGAAGCAAAAAT GGCAGCTTGGGTATTTCCTTCTAAAGAATCTATATTTATAGATAAAGAAGGAGAAGT AAACTATGAAGCAGGAGCATTTAATAGTTATGGATATTTAAATGCAAGACAAATAGC AAAAGATACTATGTTTATGCAAATTATAGTTCCTCTTTCTAAATATGCTGATATTCCA GAAGTAGTAGATTTAAGTACAGATGATGTAGTAGGTGGAACTGTAGTAAAAGATAA TGAAAAAGATACTTTTATGCAACAATTAAACAATGCTGAAAATTCTTTGGGAGATAT TACAACAGATGCTACTTTTGCATATACTAACGAAAATTCAAATAATGAGTTACAGCA TTTTTCAGTAAGACAAGGAACATCATTAGATTATAAAGGCGAAAATATTTTTGTATC AAATAAACCTATAACCTTTGCATTAGATATTAGTGATGAAACTCAATATAAAGGAAC AATTGCTGCTTTAAATGAAACTGTAGAATTAAGAGTTAAAAATCCAGTTGGAGTAC CAACAGAATCAGTGGTAGTTAATGGTGAAAATATTGAATTTAGTGTAGAAGATGGA TATACTGTTATTCAAGTAGCAGAAGGTGGAGATATAAATATTAATTTTGGAGAAGGA GTAGCTCCAGAAGTTCCAGAAGTAAATGTTAAAGTAAATGATAAGAAGGTTAAATT AACTTGGGAAGCAGTTCAAGCAGAAGAGTATGTAATTAAAAGAGGCACAGATGAA TCAAATTTAGAAGAAATTGAAATTGTTAAAGAAAATGAATATATTGACTTAGATGTT GAAAATGGAAAAACTTATTTCTATAGTGTAGAAGCAAAAAATGCTTATGGAACAAG TGGAGATTCTAAGATTATAAAAGCTACACCAGAAGCTACAAAAGCTCCACAACAA CCAACTAATGTAAAAATTACTTCAAGCCAAAATCAAGTAACTATTGAATGGGATGA AGTTGATAATGCTTATAAATATGAAGTAAGACAAGGTACAAATCCTTCCAACTTAAG TGTAGTAGCAACAGTTTCAGATACTAAGTATATAGCTAAAGACTTAAAAGCTGGAA CAACTTACTATTTTGTAGTAACTGCTATTAACTCTAAAGGAAGTGCAAAATCTGAAG TTATAGAAGTAAAACCAATTTTAGATGTATTATCTGCTCCTGAAAATGTACAATATTC TGTTGGAGACGGTAGCGTTGTTATAACATGGGATAAGGTATCTGGAGCGGAAGGTT ATACTATTAAGAGAAGTACAACAGGAAATAATTATGAAGTTATTGCTAAAAATATTA AATCTAATATTTTTACAGATTCATCCTTAGATAATGAAAAAACATATTATTATATAATA ACAGCAGAAAAAGAATTTGCCCAAGGAGAAGATTCATATATTTTAGCAATTAATGG AGATGTAAATGGAGGACATATTACACACTTAGTTGAAGATGATATAGCATATATTGA AGCAGAGTATGCAACATCAGTAAATGGATTTGTTAATGCATCACAAGCAGAAGCTT CTAATGGACAATATATTACTGCAGTAAATGATGATGCTATGGTTACTTATGAAATAAATGTGCCATCTAGTGGTCGTTATAATATTCTTCTAAGAACAAAAGGAACTCAAAATCT TAATGTAGCAATTAATAACGAAACACCTATTGCATTAAGTAGTTCTAATAATGGATTT AATTGGGGAAAAGTTATAAGTGGAATTTACTTAGAAGCAGGTAAAAACACAATAAT TATAAAAGCTTCTAAAGCTGCTAATATTGATAAGTTGGCAATTTCTAATGATTTAGAT TATATACCAACTGGAGAAGGTAGCTTAGCAGTTAAACCAGTTATGGGAATTGGTAA ACCACTTAACTTTACAGCTACTCGTGATGGAGATAAAGTTAATTTAGAATGGAATGC ATTAGAAGGTGTAGAAAGTTATAATATTAAGAGAAAAGGAATAGAAGATGATAACT ATAAAGTAATTGCTAGAAATGTAAAAGGCACAAGTTTTGAAGATACTAATGTATATA AGAGTTTAGGGTACTCTTATGTTGTAAGTGGTAATACAGAAATAGGAGAAACTCAA GATTCCTTAGAAGCAGTAGTTGAGCCTATGACTAATGATACTATCTTATATCCAACA GATGATACTTATGTTGAAAATAAATCTTCAACTGTAGATAGTAATTTTGCAACATCA AAACAATTGAAGTTTAAAGGAACTTCTAAAGGTAGTGACGATAGAATAGGATATTT AAAATTTGACATTAGTAATTTTAAAGGAGAGATAGATAAAGCTTATATAGAACTTGA AGGAAAAACTAGTAGTTCCTCTGAAGTATATCCACCAATTGATATATCTATACATGG TTTAACAGATGACACATGGTCAGAAACAGATTTAACATGGAATAATTCTCCAAACC ATGAACCAGGTTCTGCAAAAGTTGTAGGATTAGGAGAAACTGCTACATTCCTAGGA AAAGTTACTGTAAACTTTGGAGAATATCATAAAGTTGAACTAGATATTACAGATTAC ATTAAAAATCATTCTGATAATAAAGATGGAATAGTAGCTTTAATGATATCTGACCAA GATCAAAATAATGCTTATGGTTGGTTCCGTTCAACTCAAGAAACAAGTGAAGACAC ATATCCAAAATTAATTTTAGTAGGGAAAACTGAAGAAATTGTATTACCAGATACTCC TGCAAATATTCAAATAATATCTGCTAGTAAAACTCATACAATAACTTGGGATGCAGT AGAAGATGCAGAAGAGTACATTGTAAGAAGAAGTATTAATGGATATGATTTTGATG TTATAGCTAAGACTAAAGAAACTACTTATACAGATAATGATGTAATTAATGGAATAC CATATTATTATACTGTAAGTGCTGTAAGTAATGGATTAGAAAGTGATCCTACTTCAGT TATGATGGCTAAAACTAAAGTAACATTGAGTGATAAAAAAGTTTCAGATATTAAAG ATCTAGAAAGTGATTTAAACAGTGAAGGTTTAGTAATCAAATGGAACAATCCAGAA CAAGATATAGATGCAATATTAATTTACAGCGAAGGAGAATTAATTGATATATTAGATG GCAATGCAACAGGACATACAATACAAGGAGTTACTTATAATGATGATTATAAATTCG TCATCAAAACTGTAGATGTACAAGGAAATCAATCAGAGGGAGTAGTAGTTGAAAAAGAAATAGTAGAATCTGGAGGACCAGTACTATTAATTCCAGTAGCTGTAACAGACA GTGAAAATGACGGAAATGTTCCAGAAAATACATTAGACGGTGATCTATCAACAAGA TGGTCATCAGAAAGTCCATCAGAAACAACAGCACAATGGATTCAATACGACTTAG GAGAAGTAAAAGAGATTGGATATTTAGGTATAGCTCTTTCTAAAGGAGACGTGAGA AAAACAAAACTAGAAATTCTAGTATCAGAAGACGGTAATAATTGGGTTACTGTTTA CAGTGGTAAGAGCAGTGGAACTACTACAGATATGGAAGCTTATCTATTCTCACAAA TAGTAAAAGGTCGTTATGTAAGAATCAATGGTTATGGTTACTATAATTTATCTGATGG ATCTTATGGAAAAGGCTGGACTAGTATAACAGAAGTGCATATATATGCACCAAATCCAGCAGGACCAGTATTACTTCCAATACAA

(a)序列特征：

●长度：5475

●类型：基因序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

SEQ ID NO.3：

ATGAAGGGAAGATTAAAAAAATGGTGTAGTGGCTTTCTAATTGCTATGTTAGTATCT ACACCAACAGGAATGGTTAATGCAGCAAGTTTGCTTCCATCAGACATTTTAGATTT GACTAATTGGAAACTTACATTACCTATTAATGATGCAGAAGAAATTACGCAACCAG AATTAGATAGTTATGAACATAGTGAGTACTTTCATGTAAATGATGATGGAGATGCAG TCGTATTTAAAGCACACTGTGGAGGAGATACTACAGAGGGTTCTTCGTATCCAAGA TGTGAACTTAGAGAAATGACAAATGATGGACAAGATAAGGCTAGTTGGTCTACTAC ATCTGGAACACATACTATGATAATTGATCAAAAAATCACACATCTTCCCGAAGTAAA AGACCATGTTGTTGTGGGACAAATTCATGATTCAGATGATGATGTTATAATGATTCG TTTAGAAGGAAATCATTTATTTGTAGAAGGGGATGGAGAGGAACTTGCAGATTTAG ATACAGATTATGAATTAGGAACAAGATTTACTGTAAAGATAGTGGCATCCGGAGGT AAAATTAAAGTATATTATAATGGAGATTTAAAATTAACTTATAATAAGAGTGTTTCAG GATGTTATTTTAAAGCAGGTATGTATACTCAATCTAACACCAGCAAAGGTGATAGTG AGGATGCATATGGGGAAAATGAAATTTATAATCTAGTAGTAACCCATAGT

(a)序列特征：

●长度：729

●类型：基因序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

本发明的三种褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的氨基酸序列如SEQ IDNO.4， SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6所示

SEQ ID NO.4:

MRKFYTIILILFLTLSTFNEKMNVYATSTETNNIYVSTNDELEDAVNNAVPGDTIIVADG SYEAFKIKNKIGTEDAPITITAENTLGATFDEGQLHFYECEYIVFKGFGIYTDSEIKIEGS NHIRLTNNHIRLNEEDTDSLKWIRIYGENSGYNQIDHNIFDEKTKLGNFITIDGTNEDD HGSCVSSQYDVIEYNYFYNIGPRADNEMEAIRVGWSEMSESSGYTTIQYNLFEECDG DPEIISIKTCDNIVRYNTFRSCQGVVSLRHGNRNEVYGNFFFGEGKEGTGGIRVYGSDH KIYNNYMEGLTGSGYSAPIILDGGDVDTSGALNKHFRVYRAEVVNNTIVNCDYGIEIG TNYSYAPSDCIIANNLIVNSENEAIAEYNEPVNMTYEGNIVSGSGDIITFSSITDDEIKFV EEVELELSNDGLYRLKQDSVSIDSSVGNYSYVTIDMDGQSRSLADVGADEFSSDDIVI YPLTSSDVGIDN

(a)序列特征：

●长度：485

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

SEQ ID NO.5:

MKKFISLMVCLSLVVSLFFNQSYVMAANYETYDGFKVSEEPVLPEKEVHPSLWFTKS DIQKIKEKKNEDSFTAELWEEISNSPYLTMEIPTDIPSATDSDTDIHKYYGNMSRIAKYN AFMYLMTGKSEYRLRATEALKRAFDGPIYEMDPTVSGSGVDEIYRAVWAQNFATAYD WIQPYLSDEDDEIIRERLAKEAQVVYENLYTWGPRPHNHLSKPAWGLGTLALTLSDHP DASKWLNRALEAANTNTLYFFNKDGHYREGAHYYVYSLVNLIPFLYHYKNVSGVNY FPEYKNIFEWAVKIRNGRGWMPNVEDSWIKPAPTHMVASQYKDTDTDLHSTAKLANI LQWSYFNTDFRPWEPDGSYTGASYDDTWDIDQYLTYDSTIEQIKPDVSGTVFMNNSG QTVFRSDWNFNNPNSRYLLFQGVAEADNHYHYDHLSFIIHAENQMMASDSGYSRNS YGEGIRTSWYLTAEAHNVITANGEHPKDVSENTTPVSRYDMDTDFFDFQEKEAVYDGFTFPEKNSYDFSGKQIRAIGFPRQDYFVVADQLFSDKEVQYDLYLHGGRGEMSGEGN YRLWTYEDDRYGQEAKMAAWVFPSKESIFIDKEGEVNYEAGAFNSYGYLNARQIAK DTMFMQIIVPLSKYADIPEVVDLSTDDVVGGTVVKDNEKDTFMQQLNNAENSLGDIT TDATFAYTNENSNNELQHFSVRQGTSLDYKGENIFVSNKPITFALDISDETQYKGTIAA LNETVELRVKNPVGVPTESVVVNGENIEFSVEDGYTVIQVAEGGDININFGEGVAPEVP EVNVKVNDKKVKLTWEAVQAEEYVIKRGTDESNLEEIEIVKENEYIDLDVENGKTYF YSVEAKNAYGTSGDSKIIKATPEATKAPQQPTNVKITSSQNQVTIEWDEVDNAYKYEV RQGTNPSNLSVVATVSDTKYIAKDLKAGTTYYFVVTAINSKGSAKSEVIEVKPILDVLS APENVQYSVGDGSVVITWDKVSGAEGYTIKRSTTGNNYEVIAKNIKSNIFTDSSLDNE KTYYYIITAEKEFAQGEDSYILAINGDVNGGHITHLVEDDIAYIEAEYATSVNGFVNAS QAEASNGQYITAVNDDAMVTYEINVPSSGRYNILLRTKGTQNLNVAINNETPIALSSSN NGFNWGKVISGIYLEAGKNTIIIKASKAANIDKLAISNDLDYIPTGEGSLAVKPVMGIG KPLNFTATRDGDKVNLEWNALEGVESYNIKRKGIEDDNYKVIARNVKGTSFEDTNVY KSLGYSYVVSGNTEIGETQDSLEAVVEPMTNDTILYPTDDTYVENKSSTVDSNFATSK QLKFKGTSKGSDDRIGYLKFDISNFKGEIDKAYIELEGKTSSSSEVYPPIDISIHGLTDDT WSETDLTWNNSPNHEPGSAKVVGLGETATFLGKVTVNFGEYHKVELDITDYIKNHSD NKDGIVALMISDQDQNNAYGWFRSTQETSEDTYPKLILVGKTEEIVLPDTPANIQIISAS KTHTITWDAVEDAEEYIVRRSINGYDFDVIAKTKETTYTDNDVINGIPYYYTVSAVSNGLESDPTSVMMAKTKVTLSDKKVSDIKDLESDLNSEGLVIKWNNPEQDIDAILIYSEG ELIDILDGNATGHTIQGVTYNDDYKFVIKTVDVQGNQSEGVVVEKEIVESGGPVLLIPV AVTDSENDGNVPENTLDGDLSTRWSSESPSETTAQWIQYDLGEVKEIGYLGIALSKGD VRKTKLEILVSEDGNNWVTVYSGKSSGTTTDMEAYLFSQIVKGRYVRINGYGYYNLS DGSYGKGWTSITEVHIYAPNPAGPVLLPIQ

a)序列特征：

●长度：1825

●类型：基因序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

SEQ ID NO.6:

MKGRLKKWCSGFLIAMLVSTPTGMVNAASLLPSDILDLTNWKLTLPINDAEEITQ PELDSYEHSEYFHVNDDGDAVVFKAHCGGDTTEGSSYPRCELREMTNDGQDKASWS TTSGTHTMIIDQKITHLPEVKDHVVVGQIHDSDDDVIMIRLEGNHLFVEGDGEELADL DTDYELGTRFTVKIVASGGKIKVYYNGDLKLTYNKSVSGCYFKAGMYTQSNTSKGDS EDAYGENEIYNLVVTHS

(a)序列特征：

●长度：243

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

实施例3、褐藻胶裂解酶酶学特性分析：

a.褐藻胶裂解酶的底物特异性测定

将上述实施例纯化后获得褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5蛋白，分别取浓度为2μg/ml的酶50μl，加入到含有2g/L不同底物(PolyM，PolyG，PolyMG)的乙酸 -乙酸钠缓冲液(200mM乙酸-乙酸钠盐缓冲液，pH5.8)中，70℃反应3min，在有水 浴锅循环加热的紫外分光光度计下测定其OD235nm的变化值(参见图3)。一个酶活单 位定义为每分钟OD235nm的值变化0.1数值。比酶活力定义为酶活与对应蛋白量的比 值。

由图3结果显示：AlgAT0对海藻酸钠的比酶活3592U/mg，具PolyMG特异性酶活；AlgAT1对海藻酸钠的比酶活2850U/mg，具双功能酶活性(双功能酶活性为：PolyM和PolyG)；AlgAT1，比酶活对海藻酸钠的700U/mg、具双功能酶活性(双功能酶活性为：PolyG和PolyMG)；其中，AlgAT5以PolyG和海藻酸钠为底物时酶活较高，其它酶活 较低，如图3所示。

b.褐藻胶裂解酶的最适反应温度测定

在pH7.0的条件下测其在不同温度范围(30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、 75℃、80℃、85℃、90℃)的酶活，确定其最适反应温度(参见图4和表1)，由图4所 示褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的最适温度分别为60℃、65℃、70℃。

c.褐藻胶裂解酶的最适反应pH值测定

在60℃条件下测定蛋白在不同pH范围(pH4、5、5.2、5.6、5.8的200mM的乙酸 -乙酸钠缓冲液；pH6、6.4、7、7.4、8.0的200mM磷酸盐缓冲液的酶活；pH7.1、7.5、 8.1、8.5的200mMTris-HCl)最适反应pH值(参见图5和表1)，由图5所示褐藻胶裂解 酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的最适pH分别为6.4、5.8、5.8。

d褐藻胶裂解酶的半衰期的测定

将酶置于其最适反应条件下，每隔一段时间测定残余酶活，残余酶活为50％时的取 样时间即为此条件下的半衰期，结果如图6所示。三种褐藻胶酶的酶学特性总结如表1所示，褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的半衰期分别为60℃下1.5h、65℃下 3h、70℃下6h。

表1三种褐藻胶裂解酶AlgATO，AlgATl，AlgAT5的酶学性质检测

实施例4、金属离子，有机溶剂和表面活性剂对重组褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT5活性的影响

将上述获得的重组褐藻胶裂解酶液AlgAT0或AlgAT5中加入不同的金属离子、有机溶剂或表面活性剂等化学试剂，而后在各裂解酶的最适条件下反应3min，按前述的 分光光度法在OD235nm下测酶的活力。对照组为不加金属离子，有机溶剂和表面活性 剂时活性(设定为100％)(参见图7)。

其中，向反应体系(2g/L海藻酸钠，200mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH5.8或者6.4) 中添加金属离子时，离子终浓度为1mM；添加终浓度均为5％的有机溶剂和表面活性剂， 其中，有机溶剂为甲醇、乙醇、甘油、异丙醇、正丁醇、正丁醇或DMSO，表面活性剂 为吐温20、吐温80、Triton X-100、Span 80、SDS。

由图7-A所示金属离子和化学试剂对重组褐藻胶裂解酶AlgAT0结果，在1mM浓 度下：(1)金属螯合剂EDTA、EGTA、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺对AlgAT5的活性表现为抑制作 用，其中加入EDTA特别是钙离子螯合剂EGTA后该酶活性基本完全消失，表明该酶是 一个金属依赖性的酶。Mn²⁺对其活性有微弱降低，Mg²⁺、Co²⁺、Ni²⁺对AlgAT0的活性 有微弱增强。而Ca²⁺对其影响最大，可以使AlgAT0的比酶活增加为对照的两倍。表面 活性剂SDS和有机溶剂Tween20使其活性降低为对照的50％。

由图7-B所示金属离子和化学试剂对重组褐藻胶裂解酶AlgAT5结果，在1mM浓 度下：(1)金属螯合剂EDTA、Cu²⁺、Ba²⁺对AlgAT5的活性表现为抑制作用；(2)1mM的 Co²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺,等二价金属例子对酶活具有促进作用，而其余二价、三价金属 离子对酶活具有一定促进作用；(3)异丙醇及DMSO对AlgAT5的活性有促进作用， Triton-X100对AlgAT5的活性有抑制作用，其余有机溶剂及表面活性剂影响不大。

实施例5、重组褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的终产物谱分析

具体是，以海藻酸钠为底物，用上述纯化得到褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5 分别进行酶解处理；

取AlgAT0蛋白溶于pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠钠缓冲液体系中，终浓度2 0μg/ml，加入终浓度10g/L的海藻酸钠(pH7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液)溶液， 酶解温度为50℃，酶解时间分别为0、10min、20min、0.5h、1h、2h、6h、9h、20h、 24h。利用薄层层析法检测在不同酶解时间下，AlgAT0的酶解产物组成(参见图8-A)， 如图8-A所示AlgAT0蛋白酶解海藻酸钠，24小时后，酶解产物组成主要是二糖。

取AlgAT1蛋白溶于pH7.0的Tris-HCl缓冲液体系中，终浓度2 0μg/ml，加入终浓度10g/L的海藻酸钠(pH5.8的醋酸-醋酸钠缓冲液)溶液，酶解温度为60℃，酶解时 间分别为0、6h、7h和8h。利用薄层层析法检测在不同酶解时间下，AlgAT1的酶解产 物组成(参见图8-B)，如图8-B所示，AlgAT1蛋白酶解海藻酸钠8小时后，酶解产物 组成主要是四糖。

取AlgAT5蛋白溶于pH8.0的Tris-HCl缓冲液体系中，终浓度2 0μg/ml，加入终浓度10g/L的海藻酸钠(pH5.8醋酸-醋酸钠缓冲液)溶液，酶解温度为60℃，酶解时间 分别为0、2min、20min、6、11、72小时。利用薄层层析法检测在不同酶解时间下的酶 解产物组成(参见图8-C)，如图8-C所示，AlgAT5蛋白酶海藻酸钠，72小时可将底 物完全降解，酶解产物组成主要是二糖、三糖、及少量单糖。

进一步对AlgAT0和AlgAT5的终产物进行分离，将2ml浓度为10g/L的海藻酸钠 用重组褐藻胶裂解酶AlgAT0、AlgAT5酶解24h，处理后的样品在100℃沸水浴10min， 使蛋白变性。13000rpm离心10min，使变性的蛋白完全被除去。上清液用0.22μm的滤 膜过滤后使用蛋白质快速纯化系统

对产物进行分离纯化。样品的上样量为1mL、 使用SuperdexPeptide 10/300GL分子凝胶色谱柱(GE公司)进行分离，因为产物褐藻寡糖 含有双键，在235nm有最大吸收峰，因此可以作为特征信号使用紫外检测器进行检测， 并按照出峰时间分别收集出峰时间为主要的寡糖样品(参见图9)。

为进一步明确AlgAT0和AlgAT5的产物组成，AlgAT0的主要产物为单一峰， AlgAT5包括两个主要的产物峰。为进一步研究产物组成，将多次收集到的两个寡糖样 品分别集中后，用醇沉法脱盐后。用无菌去离子水溶解所得寡糖样品，进行负离子高分 辨质谱(MS)分析，确定各寡糖的相对分子量，AlgAT0的主要产物为二糖，然而AlgAT5 的主要产物为二糖，三糖和少量单糖(参见图10)。

实施例6、褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5基因的克隆及其在毕赤酵母菌 株X33中的表达、纯化

由于毕赤酵母属于真核生物，有其自身的密码子偏好性，首先需要对该细菌来源的 褐藻胶裂解酶进行密码子优化，使其能够适应毕赤酵母的表达。该基因优化是由无锡青兰生物完成，AlgAT5优化后的核酸序列如SEQ ID NO.7所示，AlgAT0优化后的核酸序 列如SEQ ID NO.8所示，AlgAT1使用原始序列。

SEQ ID NO.7:

ATGAAGGGCAGATTGAAGAAGTGGTGCTCTGGTTTTTTGATCGCCATGTTGGTTTC TACTCCAACTGGTATGGTTAACGCTGCTTCTTTGTTGCCATCTGATATCTTGGACTT GACTAACTGGAAGTTGACCTTGCCAATTAACGATGCCGAAGAGATTACTCAACCA GAGTTGGATTCCTACGAACACTCTGAATACTTCCATGTCAACGATGATGGTGATGC CGTTGTTTTTAAGGCTCATTGTGGTGGTGATACTACTGAAGGTTCTTCTTACCCAAG ATGTGAATTGAGAGAGATGACTAACGATGGTCAAGATAAGGCTTCTTGGTCTACTA CTTCTGGTACCCATACCATGATTATCGACCAGAAGATTACCCATTTGCCAGAGGTTA AGGATCATGTCGTCGTTGGTCAAATTCATGATTCTGACGACGACGTCATTATGATTA GATTGGAGGGCAACCACTTGTTTGTTGAAGGTGACGGTGAAGAATTGGCTGATTT GGATACCGATTACGAATTGGGTACTCGTTTCACTGTTAAGATTGTCGCTTCTGGTGG TAAGATTAAGGTTTACTACAACGGTGACTTGAAGTTGACTTACAACAAGTCCGTTT CCGGTTGTTACTTTAAGGCTGGTATGTACACTCAATCTAACACCTCTAAGGGTGATT CTGAAGATGCTTACGGTGAAAACGAAATCTACAACTTGGTCGTTACTCACTCT

a)序列特征：

●长度：729

●类型：基因序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

SEQ ID NO.8:

AACGAGAAGATGAACGTTTACGCTACTTCCACTGAGACTAACAACATTTATGTCTC TACCAACGATGAGTTGGAAGATGCTGTTAACAACGCTGTTCCAGGCGATACTATTA TTGTCGCTGACGGTTCTTACGAAGCCTTCAAGATCAAGAACAAGATCGGTACTGA GGATGCCCCAATTACTATTACTGCCGAGAACACTTTGGGTGCTACTTTTGATGAAG GTCAATTGCACTTCTACGAATGCGAATACATTGTCTTCAAGGGCTTCGGTATTTACA CTGACTCCGAGATTAAGATTGAGGGTTCCAACCACATTAGATTGACCAACAACCAC ATCCGTTTGAACGAAGAGGACACCGATTCTTTGAAGTGGATCCGTATTTACGGTGA GAACTCTGGTTACAACCAGATCGACCATAACATTTTCGACGAGAAGACCAAGTTG GGTAACTTCATCACTATTGACGGTACCAACGAAGATGATCATGGTTCCTGTGTTTCT TCTCAGTACGACGTTATTGAGTACAACTACTTCTACAACATCGGTCCAAGAGCTGA TAACGAAATGGAGGCTATTAGAGTTGGTTGGTCTGAAATGTCTGAATCCTCTGGTT ACACTACTATCCAGTACAACTTGTTCGAGGAGTGTGATGGTGATCCAGAGATCATT TCTATTAAGACCTGCGACAACATTGTTCGTTACAACACCTTTAGATCCTGTCAAGGC GTTGTTTCTTTGAGACACGGTAACAGAAACGAAGTCTACGGCAACTTCTTTTTCGG TGAAGGTAAGGAAGGTACTGGTGGTATTAGAGTTTACGGTTCCGACCATAAGATTT ACAACAACTACATGGAAGGTTTGACTGGTTCTGGTTACTCTGCTCCCATTATTTTGG ATGGTGGCGACGTTGATACTTCTGGTGCTTTGAACAAGCATTTCCGTGTTTACAGA GCTGAAGTTGTCAACAACACCATTGTTAACTGCGACTACGGTATTGAGATTGGTAC CAACTACTCTTACGCTCCATCCGATTGCATTATTGCCAACAACTTGATCGTTAACTC CGAGAACGAAGCTATTGCTGAATACAACGAGCCAGTTAACATGACTTACGAGGGC AACATTGTTTCTGGTTCCGGCGACATTATTACCTTCTCCTCTATCACCGACGATGAA ATCAAGTTTGTCGAAGAGGTTGAGTTGGAATTGTCTAACGATGGCTTGTACAGATT GAAGCAGGATTCCGTGTCTATTGATTCCTCTGTTGGTAACTACTCCTACGTCACCAT TGATATGGATGGTCAGTCTCGTTCTTTGGCTGATGTTGGTGCTGATGAATTCTCTTC CGACGATATCGTTATCTACCCATTGACCTCTTCTGATGTTGGTATCGACAAC

a)序列特征：

●长度：1401

●类型：基因序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Defluviitalea phaphyphila sp.Alg1

根据优化后的褐藻胶裂解酶的基因，设计如下引物：

AlgAT0

正向引物F：

5’-GGACTAGTAACGAGAAGATGAACGTTTACGC-3’(Spe I)；

反向引物R：

5’-CTAGTCTAGACTAAAAGTTAAATACTGGAGAAAGAGTTGGA -3’(Xba I)；

AlgAT5

正向引物F：

5’-GGACTAGTGTTAACGCTGCTTCTTTGTTGCCATCT-3’(Spe I)；

反向引物R：

5’-CTAGTCTAGAAGAGTGAGTAACGACCAAGTTGTAGATTTCGTT-3’(Xba I)；

AlgAT1未经密码子优化直接用原始序列进行引物设计如下：

AlgAT1

正向引物F：

5’-CGGGGTACCGCAAACTATGAAACTTATGATGGTTTTAAAGTT-3’(Kpn I)；

反向引物R：

5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTGTATTGGAAGTAATACTGGTCCTGCTGGATTT-3’( Not I)；

其中正向引物中和反向引物下划线标注的是限制性内切酶位点(括号里注明了内切 酶名称)；加粗显示的是保护碱基。

以实施例1获得基因组DNA为模板，以上述引物分别进行PCR扩增。体系如下：

所用高保真DNA聚合酶KAPA HiFi Hot Start DNA Polymerase(KAPABiosystems) 所用PCR反应试剂按照产品说明进行操作。PCR扩增条件如下：94℃预变性10min， 94℃变性30sec，67℃退火30sec，72℃延伸60sec，循环30次，72℃延伸10min。 将上述获得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证分子量大小。

将褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT5的PCR产物分别用限制性内切酶Spe I和Xba I(FD)在37℃下进行双酶切1.5小时，在通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。 将穿梭质粒pPICZα，同样用Spe I和Xba I(FD)在37℃下进行双酶切1.5小时，进行琼 脂糖凝胶电泳并切胶回收酶切后的产物片段。

褐藻胶裂解酶AlgAT1的PCR产物用限制性内切酶Kpn I和Not I(FD)在37℃下进行双酶切1.5小时，在通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。将穿梭质粒pPICZα， 同样用Kpn I和Not I(FD)在37℃下进行双酶切1.5小时，进行琼脂糖凝胶电泳并切胶 回收酶切后的产物片段。

限制性内切酶Spe I，Xba I,Kpn I和Not I(FD)均购于Thermo FisherScientific公司， 酶切所用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将上述经过双酶切的不同PCR产物，分别与同样经过双酶切的pPICZα质粒载体，在DNA T₄连接酶(Thermo Fisher Scientific)的作用下进行16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell(TransGen Biotech公司) 菌株，涂布于含有50μg/mL博莱霉素(Invitrogen)的LB培养基固体平板上，37℃培养18h后，挑取单克隆20个，用基因的引物进行菌落PCR验证，结果得到分子量大小分 别为1455bp，5475bp和729bp的扩增条带，初步验证正确，将验证结果正确的克隆再 扩大过夜培养后，提取质粒；接着将该重组质粒送样到擎科梓熙公司进行测序，结果表 明，在pPICZα的Spe I和Xba I酶切位点之间插入SEQ IDNO.8所示的基因AlgAT0， SEQ IDNO.7所示的基因AlgAT5，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正 确。

在pPICZα的Kpn I和Not I酶切位点之间插入SEQ IDNO.2所示的基因AlgAT1且 插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确。将含有重组质粒的克隆菌株过夜 培养，提取质粒后用Bgl II或Pme I(FD,Thermo Fisher Scientific)进行线性化处理，37℃反应1.5小时，作为转化备用。

毕赤酵母X33感受态细胞做法：无菌接种环从甘油保种管挑一环菌采用三步划线法涂布YPD固体平板；三天后挑取平板上大的单菌落接种到3mL YPD液体培养基， 30℃，220rpm过夜培养；过夜培养的菌液取100μL接种到100/500mL YPD三角瓶， 待OD₆₀₀到0.5-0.8；3500rpm室温离心5min，弃上清；加入9mL过滤除菌的无菌水 重悬，动作轻柔，冰上操作；30℃，100rpm培养30min；4℃、3500rpm，离心5min 去上清，用3mL无菌水重复洗3次，动作轻柔，冰上操作；4℃、3500rpm，离心5min 去上清，最后用无菌水重悬然后分装成100μL，液氮速冻，置于-80℃保存。

电击转化毕赤酵母X33步骤：电转条件电压1kV或1.2Kv；电容25μF；电阻200Ω。 电击时间为3-5msec

1.将0.5～3μg的线性化DNA溶解在5～10μl TE溶液中，与180μl的上述步骤6所得的菌 体混匀，转至0.2cm的电转化杯中；

2.用BIO-RAD电转化仪进行电击转化；

3.电击完毕后，加入无菌水将菌体混匀，该步骤越快越好，转至1.5ml的EP管中；

4.电转后的感受态细胞置于30℃培养箱静置培养30min，4000rpm离心1min，弃上清， 用1ml过滤除菌的饱和生理盐水混匀，动作轻柔，然后取200-600μL涂布在终浓度为50,100,150μg/mL博莱霉素的YPDS平板上，30℃培养3天，直至单个菌落出现。

YPDS+Zeocin培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：

不管是液体YPDS培养基，还是YPDS+Zeocin培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。固体培养基加入1.2-2％琼脂粉。

对毕赤酵母菌落进行PCR鉴定重组子，3天后待平板上长出单克隆挑取5-10个克隆，置于BMMY液体培养基中进行培养，每试管3mL，过夜培养后取1mL于1.5mL 离心管中1200rpm离心2min。再用TE缓冲液洗两遍菌体。由于酵母细胞壁较厚需要提 前预处理使DNA能释放出来，用液氮快速冷冻后置于沸水浴中煮15min，再用液氮冷 冻一次再次煮沸15min，1200rpm离心2min。对PCR管编号，进行PCR扩增，反应体 系如下：

PCR扩增条件如下：94℃预变性10min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延 伸60sec(根据各自分子量大小AlgAT0为90s，AlgAT1为2.5min)，循环30次，72℃ 延伸10min。

对PCR产物进行电泳检测，分子量大小分别为1455bp，5475bp和729bp的扩增条带，初步验证正确的为正确转化的菌株，挑选PCR结果正确的菌株进行保种，为下一 步发酵培养准备。

实施例7、重组毕赤菌株X33/pPICZα-AlgAT0，X33/pPICZα-AlgAT1，X33/pPICZα-AlgAT5摇瓶发酵培养

将重组毕赤菌株X33/pPICZα-AlgAT0，X33/pPICZα-AlgAT1，X33/pPICZα-AlgAT5挑取单菌落接种于3mL YPD试管种子培养基中，24h后1％接种量转接到250mL 装 液量25mL的BMGY培养基摇瓶中，36h后待OD600长到15-18左右时离心收集菌体 将培养基换成BMMY培养基，用甲醇替换甘油进入诱导表达的阶段。每隔12h补充 0.5％的甲醇，并且分别在12h、24h、48h和72h取样，在96h收菌，8000rpm离心 5min收集上清。

种子培养基BMGY为：1％yeast extract(W/V)，2％peptone(W/V)，1.34％YNB (W/V)，400μg/L Biotin(W/V)，1％glycerol(W/V)，100mM pH 6.0的磷酸钾缓冲液。 121℃灭菌20min

诱导培养基BMMY为1％yeast extract(W/V)，2％peptone(W/V)，1.34％YNB(W/V)，400μg/L Biotin(W/V)，1％methanol(W/V)，100mM pH 6.0的磷酸钾缓冲液。121℃ 灭菌20min，YNB,Biotin和磷酸盐都是先配好母液灭完待菌后再加入。

上清进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测重组褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5 的纯化情况，同时可以通过催化反应对粗酶液酶活进行测定。

将纯化后的重组褐藻胶裂解酶AlgAT0样品装入最小分子截留量为100kD的超滤管，AlgAT1样品装入最小分子截留量为30kD的超滤管，AlgAT5样品装入最小分子截 留量为10kD的超滤管，在4000rpm，4℃下对AlgAT5进行浓缩，并将AlgAT0的缓冲 液置换为pH8.0的100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，AlgAT0的缓冲液置换为100mM 的Tris-HCl pH7.0，AlgAT5的缓冲液置换为pH8.0的100mM的Tris-HCl。制得重组褐 藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5酶液。将收集的蛋白样品进行SDS-PAGE，以确 定目的蛋白的纯度，结果如图11中所示，根据SDS-PAGE胶图(图11)可以看出AlgAT0 分子量为53kDa，AlgAT1分子量为210kDa，AlgAT5分子量为27.5kDa，均符合各自的 理论分子量。然后用BCA的方法测定蛋白浓度。

实施例10、重组毕赤菌株X33/pPICZα-AlgAT0，X33/pPICZα-AlgAT1，X33/pPICZα-AlgAT5褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5在5L发酵罐上的高密度发酵，

为进一步提高其表达量我们利用5L发酵罐对褐藻胶裂解酶AlgAT5进行发酵放大，来提高其表达量。

发酵所需培养基为：

(1))YPD培养基：1％yeast extract(W/V)，2％peptone(W/V)，2％D-glucose(W/V)。

(2)种子培养基BMGY：1％yeast extract(W/V)，2％peptone(W/V)，1.34％YNB(W/V)， 400μg/LBiotin(W/V)，1％glycerol(W/V)，100mM pH 6.0的磷酸钾缓冲液。121℃灭 菌20min。

(23)发酵培养基BSM(L)：26.7ml 85％H₃PO₄，0.93g CaSO₄，18.2g K₂SO₄，14.9gMgSO₄·7H₂O，4.13g KOH，40g甘油和4.35ml PTM1(过滤除菌)。

(34)PTM1(L)：6.0g CuSO₄·5H₂O，0.08g NaI，3.0g MnSO₄·H₂O，0.2g NaMoO₄·2H₂O， 0.02g H₃BO₃，0.5g CoCl2，20.0g ZnCl₂，65.0g FeSO₄·7H₂O，0.2g biotin，5mlH₂SO₄。

将上述实施例获得AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5毕赤酵母表达菌株 X33/pPICZα-AlgAT0，X33/pPICZα-AlgAT1，X33/pPICZα-AlgAT5，分别在YPD平板上 进行划线培养30℃下，3天后挑选大的单克隆按3％接种量分别接种到3mL YPD培养 基，作为的一级试管种子液，30℃，250rpm，12h后3％接种量转接到500mL装液量 100mL的BMGY二级种子液中，30℃，220rpm，12h后OD₆₀₀到10，10％的接种量接 种到5L的发酵罐中，发酵罐初始装2.1L BSM培养基。初始发酵控制温度30℃，用浓 氨水(28％)控制pH为5.0，通过调节搅拌转速和通气量控制罐上溶氧在20％以上。等 BSM中甘油耗尽溶氧上升后，以18.15mL/h/L的速率流加含有12ml/L(V/V)PTM1 的50％(W/V)甘油，待OD₆₀₀到125时停止流加甘油，饥饿培养30min-2h，用10g/h/l 的速率流加含有12ml/L(V/V)PTM1的100％甲醇，并用浓氨水(28％)控制pH为5.6。发酵过程中通过调节通气量和转速将溶氧值控制在20-30％。

AlgAT5发酵结果如图13所示，在28h时菌体OD到达125，此时停止甘油流加,饥 饿培养1h后换为甲醇诱导时间，直至120h。根据图13-A发酵过程中OD600nm最大值 为120h时的347.2。根据图13-B发酵过程中OD600nm最大值为120h时的9.39g/L，与 大肠杆菌宿主中表达的AlgAT5相比，蛋白浓度提高了466倍。

AlgAT0，AlgAT1的发酵过程同AlgAT5，发酵结果如图13所示，根据图15-A发酵 过程中AlgAT0的OD600nm最大值为120h时的350，根据图15-B发酵过程中紫外分光 光度法OD235nm法测得的AlgAT0的细胞外酶活的最大值为120h时的1120U/mL。根 据图15-C发酵过程中AlgAT0的OD600nm最大值为108h时的406，根据图15-D发酵 过程中紫外分光光度法OD235nm法测得的细胞外酶活的最大值为120h时的2800U/mL。

SDS-PAGE胶鉴定蛋白表达情况可以参见图11，可以看出胞外蛋白蛋白表达纯度都比较高，蛋白含量用BCA法进行测定，最终得到AlgAT0的毕赤酵母胞外蛋白质含量为0.312g/L，是大肠杆菌表达蛋白含量的31.2倍，AlgAT1毕赤酵母胞外蛋白质含量为1.0g/L是大肠杆菌BL21中表达蛋白含量100倍。

利用5L发酵罐进行表达含有AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5重组毕赤酵母的酶活分别为1120U/mL,2800U/mL,5633.33U/mL。分别是利用大肠杆菌在1L摇瓶发酵过程的31.18 倍、98.24倍，399.52倍

由表8和表9可知紫外分光光度法OD235nm法测得的最大酶活为390U/mL，而AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5分别是其2.87，7.17，15.38倍，具有很好的工业化生产的 潜质。参见表8，9。

目前表征褐藻胶裂解酶的酶活方法主要有紫外分光光度法OD235nm法和DNS法为进一步与目前已经报道的褐藻胶酶进行酶活比较，再用DNS法对毕赤酵母表达的 AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5的酶活进行测定。

首先用葡萄糖醛酸作为产物用DNS制作标曲，方法如下

采用3，5-二硝基水杨酸法测定酶活力。每24h取甲醇诱导的产酶菌株酶液与1mL1％褐藻酸钠溶液(pH 7.0的HAC-NaAC缓冲液配制)于EP管中混匀，同时以 相同体积的蒸馏水替代酶液做空白对照试验。置于70℃金属浴反应4min，冷却，取出 100μL加入3，5二硝基水杨酸显色剂125μL，再沸水浴5min显色，冷却，加入蒸馏 水200μL，混匀，在550nm下测定吸光度(用空白调零)，OD值越高酶活力越高。酶 活力定义：在一定温度和pH值下，每分钟催化海藻酸钠水解生成1μg葡糖醛酸的 酶量定义为一个海藻酸裂解酶活力单位(U)。根据上述方法做出葡萄糖醛酸的标准曲线 为图13所示。线性方程为y＝2.0305x-0.0734(R²＝0.9949)。

根据DNS法测得的发酵过程为120h时，胞外酶活最大值的褐藻胶酶AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5得酶活分别为64666.67U/mL，126666.67U/mL和136025.6U/mL。由 表8和表9可知，用DNS测还原糖表征酶活的方法，目前已知的最高酶活31000U/mL， AlgAT0，AlgAT1和AlgAT5是其2.08倍，3.22倍，4.4倍，均远远高出目前为止已报道 的最高酶活，具有很好的工业应用潜质。参见表8，9。

实施例8、测试重组毕赤酵母所表达的褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5发 酵液对海带粉的降解能力

海藻酸含量的测定首先是做好海藻酸含量，标准曲线根据海藻酸肥料国家行业标准，《海藻酸类肥料-HG_T 5050-2016》和《含海藻酸尿素-HG_T 5049-2016》关于海藻 酸含量的测定方法如下：

配制海藻酸钠标准溶液1mg/mL，分别移取海藻酸钠标准溶液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20ml，至50mL比色管中，分别加入3.00mL、 2.80mL、2.60mL、2.40ml、2.20mL、2.00mL、1.80mL水，使体积为3.00mL移入冰 水浴中，边振荡边缓缓加入10.00mL硫酸.开始约每秒1滴，待加入一半酸后增加至 约每秒2滴，加完后放入沸水浴中，加热20min。取出，冷却至80℃，加入0.30mL 咔唑乙醇溶液，摇匀.室温下放置45min，在520nm波长下用1cm吸收池进行比色.以 试剂空白为参比，测定吸光度。以总显色体积的标准比色液中所含海藻酸钠的质量 (mg)为横坐标、以试样测得的吸光度为纵坐标绘制标准曲线或求线性回归方程(参 见12-A)。结果如图12-A所示。线性方程为y＝0.6401x-0.12(R²＝0.9963)

称取15g～20g(准确至0.000 2g)海带酶解液于烧杯中.加入25mL水清解.转 移至50mL容量瓶中，定容摇匀。从容量瓶中准确移取3.00mL待测海带酶解液于50mL 比色管中，以下与标准曲线绘制的操作步骤相同。海藻酸含量为海藻酸钠含量乘以0. 8839(海藻酸纳换算为海藻酸的系数)。

为检测褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5对海带粉的降解能力，进行如下实验。将提前晒干研磨好的海带粉放置于100℃烘箱中烘干24h以上，除去其中水分，使 其充分干燥直至恒重。称取10g海带粉置于250mL的三角瓶中，加入80mL的水，搅拌 均匀。放置于恒温摇床中，设置转速200rpm，温度50℃，充分溶胀3h后海带粉充分吸 水膨胀，粘度增大。此时加入1％质量浓度的纤维素酶，再分别加入不同酶活为的褐藻 胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5，

根据表5可以看出，加入1mL，120h的AlgAT0发酵液相当于加入11200U，质量 分数为海带粉的3.76‰，最终可得60.63％的降解率，浓度为63.36g/L。

根据表6可以看出，加入4mL，120h的AlgAT1发酵液相当于加入11200U，质量 分数为海带粉的3.76‰，最终可得76.75％的降解率，浓度为78.69g/L。

根据表7可以看出，加入120h的AlgAT5发酵液1mL相当于5600U，质量分数为 海带粉的1.88‰此时降解体系中的海藻酸含量为49.46％，浓度为61.82g/L，加入2mL 发酵液相当于加入11200U，质量分数为海带粉的3.76‰，最终可得79.73％的降解率， 浓度为74.67g/L。降解结果分别参见表5-7。

以AlgAT5为例，海带粉经不同AlgAT5降解后均匀取样2mL，12000rpm离心5min 后的效果图16所示，可以看出随着加入AlgAT5酶量的增加，离心管中沉淀的量在减少， 同时上清溶液中的颜色在加深，推测是由于海藻酸含量在增加。EP管1-7分别是加入了 280U,560U,1120U,2800U,5600U,8400U,11200U的AlgAT5。

由于AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5的底物特异性不同，可以研究其对于海带粉降解有没有协同效应。将提前晒干研磨好的海带粉放置于100℃烘箱中烘干24h以上，除去其 中水分，使其充分干燥直至恒重。称取10g海带粉置于250mL的三角瓶中，加入80mL 的水，搅拌均匀。放置于恒温摇床中，设置转速200rpm，温度50℃，充分溶胀3h后海 带粉充分吸水膨胀，粘度增大。此时加入1％质量浓度的纤维素酶，再分别加入酶活为 3000U的褐藻胶裂解酶AlgAT0，AlgAT1，AlgAT5，此外按照总酶活为3000U的酶量分 别设置如下实验：AlgAT0+AlgAT5,AlgAT0+AlgAT1,AlgAT1+AlgAT5, AlgAT0+AlgAT1+AlgAT5。在转速200rpm，温度50℃的条件下处理6h后，测定海藻酸 海藻酸含量对其降解效率进行评定。降解6h后用上述检测海藻酸含量的方法测定结果 如图17所示。在三个褐藻胶裂解酶中AlgAT5的海藻酸含量最高，同时三个酶互相配合 后AlgAT0+AlgAT1+AlgAT5海藻酸含量仅次于单独的AlgAT5有一定协同效应。

表5发酵后褐藻胶酶AlgAT0降解海带粉海藻酸含量

表6发酵后褐藻胶酶AlgAT1降解海带粉海藻酸含量

表7发酵后褐藻胶酶AlgAT5降解海带粉海藻酸含量

表8专利中关于褐藻胶裂解酶活力的报道

注：a测还原糖法(DNS)表征酶活；NA此项没有测

表9文献中关于褐藻胶裂解酶活力的报道

注：a测还原糖法(DNS)表征酶活；b测紫外吸收法(OD235nm)表征酶活；NA此项没有测

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> 褐藻胶裂解酶(AlgAT0)

<400> 1

atgagaaaat tttatactat tattcttatt ttatttttaa ctctaagtac ttttaatgaa 60

aaaatgaatg tttacgctac ttctactgaa acaaataata tatatgtatc tacaaatgat 120

gaattagaag atgcggtaaa taatgctgta ccaggtgata caattattgt ggcagatgga 180

agttatgaag cttttaaaat taaaaataaa attggaacag aagatgctcc tattacaata 240

actgctgaaa atacattagg tgcaaccttt gatgaaggac aattacactt ttatgaatgt 300

gaatatattg tttttaaagg ctttggaatc tatacagatt cagaaattaa aatcgagggg 360

tccaatcata tacgtttaac aaataatcat ataagattaa atgaagaaga tacggattct 420

ttaaaatgga ttagaattta tggagaaaac agtggttata atcaaataga tcataatata 480

tttgatgaaa aaacaaaact tggaaatttt attaccattg atggaacaaa tgaagatgat 540

catggttctt gtgtttcttc tcaatatgat gttattgaat ataattattt ctataacatt 600

ggtccacggg cagataatga aatggaagct atccgggttg gttggagtga aatgtctgaa 660

tcaagtggct atacaactat tcaatataat ctatttgaag aatgtgatgg tgaccctgaa 720

attatatcta ttaaaacttg cgataatata gttagatata atacctttag atcttgtcaa 780

ggagtagtaa gtttaagaca cggtaatcgc aatgaagtat atgggaattt cttctttgga 840

gaaggtaaag aaggaactgg tggtattcgt gtttatggtt ccgaccataa aatatataat 900

aattatatgg aaggattaac tggtagtgga tactctgcac ctataatctt agatggtgga 960

gatgttgaca ctagtggagc tttaaataaa cattttagag tatacagagc tgaagttgtt 1020

aataatacaa tagtaaactg tgattatggt atagaaatag gtacaaatta ttcttatgct 1080

ccttctgatt gtatcattgc taataatcta attgtaaatt cagaaaatga agccattgca 1140

gagtataatg aaccagtaaa tatgacatat gaaggaaata tagtatcagg ttctggagat 1200

attatcacat tttcttctat aactgatgat gaaattaaat ttgtagaaga agttgaatta 1260

gaattaagta atgatggact ttatagatta aaacaagata gtgtatcaat agattcctct 1320

gttggaaatt attcatatgt cacaatagat atggatggac agtcaagatc tttagctgat 1380

gtaggagccg atgaattttc ttctgacgat attgttatat atcctttaac ttcgtcagat 1440

gtaggtatag ataat 1455

<210> 2

<211> 5475

<212> DNA

<213> 褐藻胶裂解酶(AlgAT1)

<400> 2

atgaaaaagt ttataagtct tatggtttgc ttaagtttag tagtttctct tttctttaat 60

caaagttatg taatggcagc aaactatgaa acttatgatg gttttaaagt ttcagaagag 120

ccagtattac cggaaaaaga agttcatcca tctttatggt ttacaaaaag tgatattcaa 180

aaaattaaag aaaagaaaaa tgaagattca tttacagctg aattatggga agaaatttct 240

aacagtcctt atttgactat ggaaatacca acagatattc ctagtgctac tgatagtgat 300

acggatatac ataagtatta tgggaatatg tcaagaatag caaaatataa tgcttttatg 360

tatttgatga cagggaaaag tgaatataga ttaagggcta ctgaagcttt aaaaagagcg 420

tttgatggtc ctatatatga aatggaccct acagtttcag gaagtggagt agacgaaatt 480

tatagagctg tttgggctca aaattttgca acagcttatg actggattca accatactta 540

tcagatgaag atgatgaaat tattagagaa cgtttagcaa aagaagctca agtagtatat 600

gaaaatttat acacttgggg tccaagacca cataaccatt tatctaaacc agcttgggga 660

ttaggtacat tagcacttac attatctgat catccagatg cttcaaaatg gttaaatcgt 720

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gaaggtgcac attattatgt ttattcattg gtaaatttaa ttccattttt atatcattat 840

aaaaatgtgt ctggtgtaaa ttatttccca gaatataaaa atatttttga atgggcagtt 900

aaaataagaa atggaagagg atggatgcca aatgtagagg attcatggat aaaacctgct 960

ccaacacata tggtggcatc tcaatataaa gatacagata cagatttaca ttctactgca 1020

aaattggcaa atattttaca atggtcttac tttaatacag attttagacc ttgggaacca 1080

gatggctctt acacaggagc atcctatgat gatacatggg atatagacca atatttaaca 1140

tatgatagta ctattgaaca gattaagcca gatgtttcag gaacagtttt tatgaataat 1200

agtgggcaaa cagtttttag aagtgattgg aattttaata atccaaattc tcgatatttg 1260

cttttccaag gggtagctga agcagataat cactatcatt atgatcattt aagttttatc 1320

atccatgcag aaaatcaaat gatggcaagt gattctggat attctagaaa tagttatgga 1380

gaagggataa gaactagctg gtatttaaca gctgaagcac ataatgttat tactgctaat 1440

ggagagcatc caaaagatgt aagcgaaaat actactcctg tatcacgtta tgatatggat 1500

actgatttct ttgatttcca agaaaaagaa gcagtttatg atggatttac tttcccagaa 1560

aagaattctt atgattttag tggtaaacaa attcgtgcta ttggtttccc acgacaagat 1620

tattttgtag tagcagacca gttatttagt gataaagaag tgcaatatga tttatattta 1680

catggtggtc gtggagaaat gtctggagaa ggtaattatc gtctttggac ttatgaagat 1740

gatagatatg gtcaagaagc aaaaatggca gcttgggtat ttccttctaa agaatctata 1800

tttatagata aagaaggaga agtaaactat gaagcaggag catttaatag ttatggatat 1860

ttaaatgcaa gacaaatagc aaaagatact atgtttatgc aaattatagt tcctctttct 1920

aaatatgctg atattccaga agtagtagat ttaagtacag atgatgtagt aggtggaact 1980

gtagtaaaag ataatgaaaa agatactttt atgcaacaat taaacaatgc tgaaaattct 2040

ttgggagata ttacaacaga tgctactttt gcatatacta acgaaaattc aaataatgag 2100

ttacagcatt tttcagtaag acaaggaaca tcattagatt ataaaggcga aaatattttt 2160

gtatcaaata aacctataac ctttgcatta gatattagtg atgaaactca atataaagga 2220

acaattgctg ctttaaatga aactgtagaa ttaagagtta aaaatccagt tggagtacca 2280

acagaatcag tggtagttaa tggtgaaaat attgaattta gtgtagaaga tggatatact 2340

gttattcaag tagcagaagg tggagatata aatattaatt ttggagaagg agtagctcca 2400

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gaaattgtta aagaaaatga atatattgac ttagatgttg aaaatggaaa aacttatttc 2580

tatagtgtag aagcaaaaaa tgcttatgga acaagtggag attctaagat tataaaagct 2640

acaccagaag ctacaaaagc tccacaacaa ccaactaatg taaaaattac ttcaagccaa 2700

aatcaagtaa ctattgaatg ggatgaagtt gataatgctt ataaatatga agtaagacaa 2760

ggtacaaatc cttccaactt aagtgtagta gcaacagttt cagatactaa gtatatagct 2820

aaagacttaa aagctggaac aacttactat tttgtagtaa ctgctattaa ctctaaagga 2880

agtgcaaaat ctgaagttat agaagtaaaa ccaattttag atgtattatc tgctcctgaa 2940

aatgtacaat attctgttgg agacggtagc gttgttataa catgggataa ggtatctgga 3000

gcggaaggtt atactattaa gagaagtaca acaggaaata attatgaagt tattgctaaa 3060

aatattaaat ctaatatttt tacagattca tccttagata atgaaaaaac atattattat 3120

ataataacag cagaaaaaga atttgcccaa ggagaagatt catatatttt agcaattaat 3180

ggagatgtaa atggaggaca tattacacac ttagttgaag atgatatagc atatattgaa 3240

gcagagtatg caacatcagt aaatggattt gttaatgcat cacaagcaga agcttctaat 3300

ggacaatata ttactgcagt aaatgatgat gctatggtta cttatgaaat aaatgtgcca 3360

tctagtggtc gttataatat tcttctaaga acaaaaggaa ctcaaaatct taatgtagca 3420

attaataacg aaacacctat tgcattaagt agttctaata atggatttaa ttggggaaaa 3480

gttataagtg gaatttactt agaagcaggt aaaaacacaa taattataaa agcttctaaa 3540

gctgctaata ttgataagtt ggcaatttct aatgatttag attatatacc aactggagaa 3600

ggtagcttag cagttaaacc agttatggga attggtaaac cacttaactt tacagctact 3660

cgtgatggag ataaagttaa tttagaatgg aatgcattag aaggtgtaga aagttataat 3720

attaagagaa aaggaataga agatgataac tataaagtaa ttgctagaaa tgtaaaaggc 3780

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gatactatct tatatccaac agatgatact tatgttgaaa ataaatcttc aactgtagat 3960

agtaattttg caacatcaaa acaattgaag tttaaaggaa cttctaaagg tagtgacgat 4020

agaataggat atttaaaatt tgacattagt aattttaaag gagagataga taaagcttat 4080

atagaacttg aaggaaaaac tagtagttcc tctgaagtat atccaccaat tgatatatct 4140

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aaaacaaaac tagaaattct agtatcagaa gacggtaata attgggttac tgtttacagt 5280

ggtaagagca gtggaactac tacagatatg gaagcttatc tattctcaca aatagtaaaa 5340

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<400> 3

atgaagggaa gattaaaaaa atggtgtagt ggctttctaa ttgctatgtt agtatctaca 60

ccaacaggaa tggttaatgc agcaagtttg cttccatcag acattttaga tttgactaat 120

tggaaactta cattacctat taatgatgca gaagaaatta cgcaaccaga attagatagt 180

tatgaacata gtgagtactt tcatgtaaat gatgatggag atgcagtcgt atttaaagca 240

cactgtggag gagatactac agagggttct tcgtatccaa gatgtgaact tagagaaatg 300

acaaatgatg gacaagataa ggctagttgg tctactacat ctggaacaca tactatgata 360

attgatcaaa aaatcacaca tcttcccgaa gtaaaagacc atgttgttgt gggacaaatt 420

catgattcag atgatgatgt tataatgatt cgtttagaag gaaatcattt atttgtagaa 480

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gtaaagatag tggcatccgg aggtaaaatt aaagtatatt ataatggaga tttaaaatta 600

acttataata agagtgtttc aggatgttat tttaaagcag gtatgtatac tcaatctaac 660

accagcaaag gtgatagtga ggatgcatat ggggaaaatg aaatttataa tctagtagta 720

acccatagt 729

Claims (3)

1.一种褐藻胶裂解酶的编码基因，其特征在于：所述编码基因的碱基序列为SEQ IDNO.7所示。

2.一种降解褐藻胶的质粒，包含权利要求1所述的编码基因。

3.一种降解褐藻胶的菌株，包含权利要求1所述的编码基因。

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