CN115161210A

CN115161210A - 一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用

Info

Publication number: CN115161210A
Application number: CN202210924184.5A
Authority: CN
Inventors: 康丽华; 鲍锴; 程斯达; 张静静; 刘文瑶; 葛菁华
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2022-08-03
Filing date: 2022-08-03
Publication date: 2022-10-11

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。申请人首先构建得到重组表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株；然后通过紫外诱变的方法筛选获得海藻酸裂解酶产量得到显著提高的突变菌。所述突变菌为毕赤酵母ALG7B‑16（Pichia pastoris ALG7B‑16），已于2022年7月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221123。该突变菌可以作为海藻酸裂解酶的生产菌株，能大大降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。

Description

一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。

背景技术

褐藻是世界上最为丰富的海洋资源之一，它包括250属，1500余种，有经济价值的种类就有100多种。我国拥有漫长的海岸线，海藻产量居世界前列。海藻中富含海藻酸盐，据报道马尾藻的海藻酸盐含量可达30%～35%，海带干物质海藻酸盐含量为24%。

海藻酸又称褐藻胶，是一种是广泛存在于各种褐藻中的一类多糖物质，由α-L-古罗糖醛酸（G）和β-D-甘露糖醛酸（M）通过1-4糖苷键无序连接的线性多糖，可以形成多聚甘露糖醛酸片段、多聚古罗糖醛酸片段和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸混合片段。不同藻类来源的褐藻胶M与G的比值不同，其成胶性、离子结合能力、流动性等理化性质也各不相同。

褐藻胶水溶液黏度高，常被用作增稠剂、稳定剂、赋形剂等应用到食品行业中。然而，褐藻胶分子量大，导致其水溶性差和生物利用度低，严重限制了其应用范围。褐藻寡糖，是一种聚合度在2～25的分子，由褐藻胶分解而成，具有调节人体免疫、抗氧化、抗肿瘤、抑菌、保护神经系统、促进植物生长等多种功能。由于褐藻寡糖具有良好的水溶性、较强的稳定性、高生物利用度和安全无毒等特点，因此广受国内外研究学者的关注。褐藻寡糖的生产主要包括化学分解法、物理分解法和生物酶法。但物理化学方法，耗能大、副产物复杂，因此，更加环保温和的高效降解方法成为人们关注的焦点，海藻酸裂解酶(alginate lyase)就是这样一种高效生物催化剂。

海藻酸裂解酶通过β-（1,4）消去反应降解褐藻胶，并在非还原端形成一个235nm处有特征吸收峰的不饱和糖醛酸残基。褐藻胶裂解酶有多种分类方式，以不同底物偏好性可分为聚甘露糖醛酸（polyM）特异性酶、聚古罗糖醛酸（polyG）特异性酶和双功能酶；以反应方式可分为内切酶和外切酶；以分子量大小可分为小型（25 kDa～30 kDa）、中型（约 40kDa）和大型裂解酶（>60 kDa）。海藻酸裂解酶主要来源于某些微生物和一些海洋动植物。

现在海藻酸裂解酶已被广泛应用于食品、饲料、医药等工业以及科研工作中，例如，该酶能高效催化以海藻为原料的动物饲料中海藻多糖的降解，提高饲料利用率，并能生成有益寡糖，促进肠道益生环境的形成，抑制有害菌生长，起到替代多种抗生素作用。因此对海藻酸裂解酶的深入研究对海藻资源的开发具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。申请人首先构建得到重组表达海藻酸裂解酶的毕赤酵母工程菌株；然后通过紫外诱变的方法筛选获得海藻酸裂解酶产量得到显著提高的突变菌，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。

本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组质粒。

所述海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQID NO：2。

本发明另一方面涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

所述突变菌株为毕赤酵母ALG7B-16（Pichia pastoris ALG7B-16），已于2022年7月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221123。

本发明还涉及一种海藻酸裂解酶的生产方法，是以上述毕赤酵母突变菌为发酵菌株。

本发明提供的毕赤酵母突变菌株能大幅度提高海藻酸裂解酶的产量，摇瓶发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高达3846U/ml，比出发菌提高了82.7%，取得了意料不到的技术效果。

所述突变菌株可广泛应用于海藻酸裂解酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的推广与应用。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

主要试剂：海藻酸钠购自sigma-aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，各种限制性内切酶、DNA聚合酶等购自日本宝生物工程有限公司（大连），质粒提取纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。其余试剂均为国产分析纯，引物序列合成、核酸测序均由华大基因完成。

菌株与载体：大肠杆菌DH5α购自日本宝生物工程有限公司（大连），毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、抗生素G418、Amp购自Invitrogen公司。

氨苄青霉素（Amp）：储存浓度为100mg/ml，工作浓度为100mg/l；用ddH2O溶解，0.22μm滤器过滤后，-20℃保存。

遗传霉素（G418）：用ddH2O制备30ml 100mg/ml的储存液，过滤除菌，-20℃保存。

本发明实施例中所述海藻酸裂解酶酶活检测方法如下：

1、酶活定义

在40℃、pH7.5的条件下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和键，在235nm下，吸光度每增加0.1，为一个酶活单位U。

2、检测试剂

磷酸缓冲液（0.05M，pH7.5）

1）配制0.05M磷酸二氢钠溶液

称取3.9g二水合磷酸二氢钠，去离子水溶解后，定容至500ml。

2）配制0.05m磷酸氢二钠溶液

称取17.91g十二水合磷酸氢二钠，去离子水溶解后，定容至1000ml。

3）混合配制0.05M磷酸缓冲液

将2中的磷酸氢二钠溶液放置于2L烧杯中，用1中的磷酸二氢钠溶液调节其pH至7.5。

底物：0.3%海藻酸钠溶液

取100ml小烧杯，加入约80ml磷酸缓冲液；称取0.3g海藻酸钠，磁力搅拌条件下均匀加入到小烧杯中，搅拌至溶解；用磷酸缓冲液定容至100ml，配制当天使用。

终止液：0.06mol/L的磷酸终止液。根据不同的磷酸浓度进行计算。

（3）海藻酸裂解酶酶活测定步骤

取三支15mm×150mm试管，加入1.8ml底物，40℃水浴预热5min，加入准备好的酶液0.2ml，准确计时，涡旋振荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2ml磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

空白：取15mm×150mm试管，加入1.8ml底物，40℃水浴预热5min，加入0.2ml缓冲液，准确计时，涡旋振荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2ml磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

比色：每个样品的空白和酶反应终止后，立即在235nm比色，并记录吸光值A₀和A_样。

计算：X=（A₀-A_样）×2×N/（t×0.1）。

X——酶活力，U/ml或U/g；

2——加入2ml磷酸终止液的体积系数；

t（min）——酶促反应时间（在酶反应的线性范围内）；

0.1——体系系数，即将吸光值增长单位换算为0.1；

N——稀释倍速。

经简化：酶活力（U/ml）=吸光值差值×2×N。

下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。

实施例1 基因克隆

申请人以海藻酸裂解酶基因（GenBank号为WP_011469024.1）的氨基酸序列为基础，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏好性对其进行密码子优化，由华大基因进行合成。申请人将该海藻酸裂解酶基因命名为ALG7B。

然后以华大基因提供的ALG7B质粒为模板，利用引物1(F)和引物1(R)扩增ALG7B基因片段（ALG7B基因全长1773bp）。

PCR引物、反应体系和PCR条件如下：

引物1(F)：GCGCGAATTCGCTACTTTTGTTTTGGAAAAAGTTA（下划线处为EcoR I的酶切位点）；

引物1(R)：TAAAGCGGCCGCTTAATCATGAGTATGAGTCAAAGAA（下划线处为Not I的酶切位点）。

PCR 反应体系如下：

5×PS Buffer： 10μL；

ALG7B质粒： 0.1μL；

引物1(F)： 1μL；

引物1(R)： 1μL；

dNTP： 4μL；

Prime Star： 0.5μL；

ddH₂O补足50μL。

PCR 反应条件：94℃预变性 4min；然后98℃ 10s，56℃ 15s，72℃ 2min，35个循环后；72℃延伸10min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带，用Omega公司的Gel ExtractionKit纯化试剂盒进行纯化，纯化方法参照操作手册。

实施例2 毕赤酵母工程菌的构建

1、重组质粒的构建

将克隆得到的海藻酸裂解酶基因ALG7B与表达载体pPIC9K，分别用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，得到含粘性末端的片段。100 μl酶切体系如下：

质粒/PCR产物: 40 μl；

10×QuickCut Buffer: 10 μl；

EcoR I: 1.5 μl；

Not I: 1.5 μl；

ddH₂O 47 μl。

37℃酶切1.5 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经EcoR I和Not I双酶切的ALG7B片段与连接，构建表达载体pPIC9K-ALG7B。连接体系如下：

线性质粒pPIC9K： 1.7μl；

目的基因ALG7B： 6.8μl；

10×T₄ ligase buffer： 1 μl；

T₄ ligase： 0.5 μl。

22℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR（反应体系：模板为挑取的单克隆，rTaq DNA聚合酶 0.5ul，10×Buffer 2.0μL，dNTPs(2.5mM) 2.0μL，5’AOX引物（10μM）：0.5μL，3’AOX引物（10μM）：0.5μL，ddH₂O 14.5μL，反应程序：94℃预变性5min，30个循环： 94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃2min；72℃ 10min）琼脂糖凝胶电泳检测得到的阳性克隆子，送由华大基因进行测序验证。

测序结果显示，扩增得到的海藻酸裂解酶基因ALG7B的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

测序正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0）中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-ALG7B。

2、转化与筛选

将重组酵母表达质粒pPIC9K-ALG7B用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电转化法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板（1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油、2%琼脂糖）。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后在不同浓度遗传霉素的YPD平板（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，遗传霉素（0.5mg/mL-8mg/mL））上筛选多拷贝的转化子。

3、摇瓶发酵验证

将获得的多拷贝转化子分别接入BMGY培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油）中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇）中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行海藻酸裂解酶酶活力测定。

结果显示，在摇瓶条件下，上述构建得到的毕赤酵母工程菌发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活最高达到2105U/ml。将酶活水平最高的转化子命名为毕赤酵母ALG7B（Pichia pastoris ALG7B）。

实施例3 海藻酸裂解酶高产菌株的诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以毕赤酵母ALG7B为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其海藻酸裂解酶的产量。

将毕赤酵母ALG7B接种于YPD平板，30℃培养2-3天，使用无菌水洗涤菌体两次后，将打散的细胞制成悬浮液，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL，紫外灯（40W）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板，30℃培养48h。

第一轮紫外诱变共获得了约50个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有600ul BMGY液体培养基的48孔板，30℃、250rpm振荡培养1天后，离心去掉上层培养基，再加入600ul BMMY培养基，30℃、250rpm振荡培养2天，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2天后，离心去除菌体，得到含海藻酸裂解酶的上清液，测定海藻酸裂解酶的活力，以出发菌为对照，筛选出酶活力得到显著提高的突变菌株。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了12轮诱变筛选，最终获得1株海藻酸裂解酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为毕赤酵母ALG7B-16（Pichia pastoris ALG7B-16）。

所述突变菌株毕赤酵母ALG7B-16在摇瓶发酵条件下其发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活力高达3846U/ml，比出发菌提高了82.7%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2022年7月15日将毕赤酵母ALG7B-16（Pichia pastoris ALG7B-16）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221123。

本发明提供的毕赤酵母突变菌可用于海藻酸裂解酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1773

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctacttttg ttttggaaaa agttaatact ggtttttctg ttgatggtgg taatggtgct 60

gttgaagcta gacaagttta tttgtgggaa actaatacta ataatgttaa tcaaaattgg 120

gttcaaattt ctcatggtgg tggttattat tcttataaaa aacaaaatac taatttgtgt 180

ttggatggtg gttctggtgg tgctagattg caaccagtta ctttggaagt ttgtgattct 240

tctaattatg atcaacattg gaataaagtt aaagtttata ctggtactga aatttataga 300

atggaaaaaa gaaatgctcc aggtttttct attgatggta atggtggtgc tgctgctaga 360

caagctattt atttgtggaa ttctaattct aataatgtta atcaacaatg ggaatttatt 420

agaactgatg aagatactgg tgatggtaaa ttggctattg ctactgcttt tgatgatggt 480

tcttctcatt cttcttatcc agcttctaaa gctattgatg gtaatactgc ttgggcttct 540

agatgggctg cttctggttc tccagttaat ttgactattc aattggaaca aacttctaga 600

gttactgaag ttggtattgc ttggggtcaa ggtggttcta gagcttatac ttttgaaatt 660

tatgctagac caggtacttc tggttcttgg actaaagttt ttgatgatgt ttcttctggt 720

tctactgctg gtattgaagt ttttgatatt actgatattg atgctcaaca aattagagtt 780

aaaacttttg aaaatactgc tggtactact tggactaata ttactgaagt tgaaatttat 840

ggtgctgatg gtggttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttctacttc ttctacttct 900

tctacttctt ctacttcttc ttcttctggt ggttttaatt tgaatccaaa tgctccacca 960

tcttctaatt ttaatttgtc tcaatggtat ttgtctgttc caactgatac tgatggttct 1020

ggtactgctg attctattaa agaaggtgaa ttgaattctg gttatgaaaa taattcttat 1080

ttttatactg gttctgatgg tggtatggtt tttaaatgtc caatttctgg ttataaaact 1140

tctactggta cttcttatac tagaactgaa ttgagagaaa tgttgagagc tggtaatact 1200

tctattgcta cttctggtgt taataaaaat aattgggttt ttggttctgc tccatcttct 1260

gctcaagctg ctgctggtgg tgttgatggt aatatgaaag ctactttggc tgttaattat 1320

gttactacta ctggtgattc ttctcaagtt ggtagagtta ttattggtca aattcatgct 1380

gaaaaaaatg aaccaattag attgtattat agaaaattgc caggtaattc taaaggtggt 1440

atttattatg ctcatgaaga tgctgatggt ggtgaagttt gggttgatat gattggttct 1500

agatcttctt ctgcttctaa tccatctgat ggtattgctt tgaatgaagt tttttcttat 1560

gaaattgatg ttactaataa tatgttgact gttaaaattt atagagatgg taaatctact 1620

gttacttctc aatataatat ggttaattct ggttatgatg attctgatga ttggatgtat 1680

tttaaagctg gtgtttataa tcaaaataat actggtaatg gttctgatta tgttcaagct 1740

actttttatt ctttgactca tactcatgat taa 1773

<210> 2

<211> 590

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Thr Phe Val Leu Glu Lys Val Asn Thr Gly Phe Ser Val Asp Gly

1 5 10 15

Gly Asn Gly Ala Val Glu Ala Arg Gln Val Tyr Leu Trp Glu Thr Asn

20 25 30

Thr Asn Asn Val Asn Gln Asn Trp Val Gln Ile Ser His Gly Gly Gly

35 40 45

Tyr Tyr Ser Tyr Lys Lys Gln Asn Thr Asn Leu Cys Leu Asp Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Ala Arg Leu Gln Pro Val Thr Leu Glu Val Cys Asp Ser

65 70 75 80

Ser Asn Tyr Asp Gln His Trp Asn Lys Val Lys Val Tyr Thr Gly Thr

85 90 95

Glu Ile Tyr Arg Met Glu Lys Arg Asn Ala Pro Gly Phe Ser Ile Asp

100 105 110

Gly Asn Gly Gly Ala Ala Ala Arg Gln Ala Ile Tyr Leu Trp Asn Ser

115 120 125

Asn Ser Asn Asn Val Asn Gln Gln Trp Glu Phe Ile Arg Thr Asp Glu

130 135 140

Asp Thr Gly Asp Gly Lys Leu Ala Ile Ala Thr Ala Phe Asp Asp Gly

145 150 155 160

Ser Ser His Ser Ser Tyr Pro Ala Ser Lys Ala Ile Asp Gly Asn Thr

165 170 175

Ala Trp Ala Ser Arg Trp Ala Ala Ser Gly Ser Pro Val Asn Leu Thr

180 185 190

Ile Gln Leu Glu Gln Thr Ser Arg Val Thr Glu Val Gly Ile Ala Trp

195 200 205

Gly Gln Gly Gly Ser Arg Ala Tyr Thr Phe Glu Ile Tyr Ala Arg Pro

210 215 220

Gly Thr Ser Gly Ser Trp Thr Lys Val Phe Asp Asp Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Ser Thr Ala Gly Ile Glu Val Phe Asp Ile Thr Asp Ile Asp Ala Gln

245 250 255

Gln Ile Arg Val Lys Thr Phe Glu Asn Thr Ala Gly Thr Thr Trp Thr

260 265 270

Asn Ile Thr Glu Val Glu Ile Tyr Gly Ala Asp Gly Gly Ser Ser Ser

275 280 285

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Thr Ser Ser Thr Ser Ser

290 295 300

Thr Ser Ser Ser Ser Gly Gly Phe Asn Leu Asn Pro Asn Ala Pro Pro

305 310 315 320

Ser Ser Asn Phe Asn Leu Ser Gln Trp Tyr Leu Ser Val Pro Thr Asp

325 330 335

Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Asp Ser Ile Lys Glu Gly Glu Leu Asn

340 345 350

Ser Gly Tyr Glu Asn Asn Ser Tyr Phe Tyr Thr Gly Ser Asp Gly Gly

355 360 365

Met Val Phe Lys Cys Pro Ile Ser Gly Tyr Lys Thr Ser Thr Gly Thr

370 375 380

Ser Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Leu Arg Ala Gly Asn Thr

385 390 395 400

Ser Ile Ala Thr Ser Gly Val Asn Lys Asn Asn Trp Val Phe Gly Ser

405 410 415

Ala Pro Ser Ser Ala Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Asp Gly Asn Met

420 425 430

Lys Ala Thr Leu Ala Val Asn Tyr Val Thr Thr Thr Gly Asp Ser Ser

435 440 445

Gln Val Gly Arg Val Ile Ile Gly Gln Ile His Ala Glu Lys Asn Glu

450 455 460

Pro Ile Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Gly Asn Ser Lys Gly Gly

465 470 475 480

Ile Tyr Tyr Ala His Glu Asp Ala Asp Gly Gly Glu Val Trp Val Asp

485 490 495

Met Ile Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ala Ser Asn Pro Ser Asp Gly Ile

500 505 510

Ala Leu Asn Glu Val Phe Ser Tyr Glu Ile Asp Val Thr Asn Asn Met

515 520 525

Leu Thr Val Lys Ile Tyr Arg Asp Gly Lys Ser Thr Val Thr Ser Gln

530 535 540

Tyr Asn Met Val Asn Ser Gly Tyr Asp Asp Ser Asp Asp Trp Met Tyr

545 550 555 560

Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn Asn Thr Gly Asn Gly Ser Asp

565 570 575

Tyr Val Gln Ala Thr Phe Tyr Ser Leu Thr His Thr His Asp

580 585 590

Claims

1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组质粒。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的突变菌是以权利要求2所述的毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

4.如权利要求3所述的毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述突变菌为毕赤酵母ALG7B-16（Pichia pastoris ALG7B-16），已于2022年7月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221123。

5.一种海藻酸裂解酶的生产方法，其特征在于，所述方法是以权利要求4所述的毕赤酵母突变菌为发酵菌株。