CN113355305B

CN113355305B - 一种可降解菊粉果聚糖的外切菊粉酶Inu-2及其应用

Info

Publication number: CN113355305B
Application number: CN202110607724.2A
Authority: CN
Inventors: 梁明祥; 连丹; 郑世成; 赵耕毛
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-06-01
Filing date: 2021-06-01
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2041-06-01
Also published as: CN113355305A

Abstract

本发明公开了一种可降解菊粉果聚糖的外切菊粉酶Inu‑2及其应用。外切菊粉酶Inu‑2，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码本发明所述的外切菊粉酶Inu‑2的基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。将Inu‑2基因转化至毕赤酵母中，经过甲醇诱导表达出重组菊粉酶Inu‑2。Inu‑2的酶活性在培养36小时后可达6.15U/mL。纯化的重组菊粉酶Inu‑2能水解利云型果聚糖和菊粉。在pH为6，45℃的条件下水解菊粉的能力最高，纯化的重组菊粉酶Inu‑2经优化酶活可达到46.3U/mg，可用于果糖的工业化生产。

Description

一种可降解菊粉果聚糖的外切菊粉酶Inu-2及其应用

技术领域

本发明为一种可降解菊粉果聚糖的Glutamicibacter mishrai NJAU-1菌株中的外切菊粉酶Inu-2基因的表达及其应用。

背景技术

菊芋(Helianthus tuberosus.L)最早起源于北美，于17世纪被引入欧亚大陆，而在20世纪早期已经成为了一种较为常见的农作物。菊芋是一种适应性特别广的植物，生存能力特别强，能够在盐碱地和海岸滩涂这些盐浓度较高，绝大部分植物所不能生长的地方进行大范围种植。菊芋发达的根系使得它伸展的区域范围更广，并且即使是在风沙危害较大的沙地不采取任何的措施下种植菊芋，在45天干旱无雨的恶劣条件下它依然能够正常的生长。除了能够抵抗盐胁迫、抗风沙外，菊芋对高温环境也具有较好的适应性，是一种繁殖能力特别强的植物。这些特征使得它被引入我国之后，被广泛地种植于一些较为贫瘠的地区。其较好的耐盐性，也让它成为了可供选择的具有较好开发前景的盐土植物之一，在江苏沿海滩涂盐碱地可以进行大面积种植。

菊粉(Inulin，又称菊糖)，主要存在于菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和朝鲜蓟等植物体的根部或茎部，是一种来源丰富的可再生资源。通过菊粉酶的催化作用，以菊粉为原料，可以生产高果糖浆、低聚果糖、乳酸、柠檬酸、乙醇、单细胞蛋白、单细胞油脂和丁醇等精细化学品。利用酶法生产果糖和低聚果糖，条件温和，工艺简单，成本低廉，安全性高，无污染。因此，利用酶法生产果糖和低聚果糖更适用于工业化生产。

菊粉酶是一种天然的果聚糖水解酶，外切型菊粉酶是唯一的一步法生产高果糖浆的重要酶种，内切型菊粉酶是生产低聚果糖的重要酶种。利用菊粉酶水解菊粉生产果糖和低聚果糖，具有工艺简单，转化率高，成本低，无污染等优点。菊粉酶还可用于发酵生产生物乙醇。因此，菊粉酶的开发利用对开发新的食品工业原料，解决粮食危机，能源危机等具有重要的意义。

微生物产菊粉酶具有繁殖快、发酵成本低、易于大量培养且普遍酶活较高等优点，因此，现阶段主要研究以微生物为来源的菊粉酶以用于工业生产。然而野生菌株的产酶量普遍较低，可以从微生物中克隆菊粉酶基因在其他极具潜力的工业菌株细胞中进行表达，用于提高菊粉酶产量或进行菊粉的一步发酵生产生化物质和生化能源。在酵母和细菌系统中进行异源表达以高效生产菊粉酶一直以来都是一个重要的研究课题。本研究所使用的毕赤酵母是菊粉酶异源表达的常用宿主。相对真菌、酵母菌而言，关于细菌菊粉酶的相关研究尚缺乏，对细菌菊粉酶基因的克隆和重组表达的研究也并不充分。

在先前研究筛选出的Glutamicibacter mishrai NJAU-1菌株表现为外切菊粉酶的活性。本研究的主要目的是从该菌株中克隆外切菊粉酶基因，转化至毕赤酵母进行诱导表达，得到重组外切菊粉酶，将其进行纯化后研究其酶学性质，提高菊粉酶酶活，从而对果糖的工业化生产提供一些参考。果糖被认为是比蔗糖更安全的甜味剂，果糖有许多优良特性，如高甜度、高溶解度以及良好的口感，果糖可以与铁形成铁-果糖螯合物，增强儿童对铁的吸收。此外，果糖是一种易于发酵的原料糖，可以生物转化为HMF、塔格糖等增值产品。因此，果糖在食品和制药工业等方面具有很高的应用潜力。

发明内容

本发明的目的在于针对工业化大规模果糖生产问题，通过将Glutamicibactermishrai NJAU-1菌株中的外切菊粉酶基因转化至毕赤酵母中进行诱导表达，获得更高产量的可降解菊粉果聚糖的外切菊粉酶Inu-2，该外切菊粉酶具有较高的外切菊粉酶酶活(46.3U/mg),可用于果糖的生产。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

外切菊粉酶Inu-2，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码本发明所述的外切菊粉酶Inu-2的基因。

作为本发明的一种优选，该基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

含有本发明所述的编码外切菊粉酶Inu-2的基因的表达载体。

作为本发明的一种优选，以pPICZαC作为出发载体，将编码外切菊粉酶Inu-2的基因插入EcoR I和Xba I作为两个酶切位点间所得。

本发明所述的基因在制备重组外切菊粉酶Inu-2中的应用。

本发明所述的表达载体在制备重组外切菊粉酶Inu-2中的应用。

本发明所述的外切菊粉酶Inu-2在制备果糖中的应用。

有益效果：

本发明从Glutamicibacter mishrai NJAU-1菌株中成功克隆出Inu-2外切菊粉酶基因：Inu-2基因序列中有一个2616bp的开放阅读框，编码872个氨基酸。将Inu-2基因转化至毕赤酵母中，经过甲醇诱导表达出重组菊粉酶Inu-2。Inu-2的酶活性在培养36小时后可达6.15U/mL。对重组菊粉酶进行了SDS-PAGE分析，纯化的Inu-2分子量约为100kDa，均与其预测分子量相符，这也验证了重组蛋白Inu-2的成功表达。纯化的重组菊粉酶Inu-2能水解利云型果聚糖和菊粉。在pH为6，45℃的条件下水解菊粉的能力最高，添加1mM LiCl对Inu-2酶活的促进作用最大，其活性与未添加金属离子的对照相比增加近20％，Fe²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Fe³⁺对Inu-2酶活起抑制作用。纯化的重组菊粉酶Inu-2经优化酶活可达到46.3U/mg，可用于果糖的工业化生产。

附图说明

图1菌落PCR验证阳性克隆

1：Inu1-X33阳性转化子，2：转入pPICZαC空载体的阳性转化子，3：Inu2-X33阳性转化子，M：DL5,000DNA Marker

图2重组子的Inu-2酶活的发酵曲线

图3重组外切菊粉酶Inu-1、Inu-2的SDS-PAGE分析。1-5：分别使用40,80,120,160和200mM咪唑缓冲液洗脱后的重组蛋白Inu-1,6-10：分别使用40,80,120,160和200mM咪唑缓冲液洗脱后的重组蛋白Inu-2；M：Marker。

图4、重组子Inu-2-X33酶学性质

具体实施方式

实施例1外切菊粉酶基因Inu-2的PCR扩增及产物测序

设计并筛选了一对引物(表1，Inu2F和Inu2R)，以扩增Glutamicibacter mishraiNJAU-1菌株(保藏编号为CGMCC No.19750，在CN111849809A中公开)的Inu-2基因的CDS全长序列。将扩增产物连接到pEASY-Blunt载体，送至测序公司使用引物(表1，M13F和M13R)进行测序验证。成功获得外切菊粉酶基因Inu-2，其全长2616bp，CDS序列如SEQ ID NO.1所示，编码872个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2外切菊粉酶基因Inu-2表达载体的构建

本研究选择pPICZαC作为表达载体，根据外切菊粉酶Inu-2的酶切位点分析结果，选择EcoR I(G|AATTC)和Xba I(T|CTAGA)作为两个酶切位点，将pPICZαC空载体进行双酶切。利用测序正确的Inu-2菊粉酶基因作为DNA模板，去除信号肽序列设计带有同源序列的特异性引物pic-inu2F、pic-inu2R(详见表1)进行高保真PCR扩增，得到带有同源序列的插入目的基因片段。将扩增得到的PCR产物分别与线性化的pPICZαC表达载体按比例混合，在ExnaseⅡ的催化下，37℃反应2h完成重组反应。将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)Trans1-T1感受态细胞，接种至含有Zeocin^TM(25μg/mL)的低盐LB固体培养基的平板上，37℃过夜培养，挑选出阳性转化子，送至测序公司使用M13F、M13R进行测序验证(引物详见表1)。

实施例3外切菊粉酶基因Inu-2转化毕赤酵母及诱导表达

(1)外切菊粉酶基因Inu-1/2转化毕赤酵母

使用内切酶PmeI将pPICZαC-inu2表达载体线性化，从而使线性化的质粒DNA与毕赤酵母的基因组DNA可以进行同源重组整合。反应体系如下：

37℃酶切过夜，使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测其线性化程度，使用核酸回收试剂盒(Takara，大连)回收产物。将回收产物转化至巴斯德毕赤酵母X-33(具体实验步骤参考EasySelect.Pichia Expression Kit说明)。将电转后的菌液涂布于YPDS+Zeocin^TM(100μg/mL)的抗性平板上37℃，培养3-5天，筛选出阳性转化子。使用酵母DNA提取试剂盒提取阳性转化子DNA作为模板，使用引物Y1F和Y1R进行菌液PCR检测(引物详见表1)，Inu2-X33得到约2500bp的条带，pPICZαC-X33为200bp的条带，与目的条带大小一致(图1)。随后将通过菌落PCR验证的PCR产物送至测序公司测序，测序结果与目的条带完全一致，证明Inu-2成功转入毕赤酵母中P.pastoris X-33的基因组DNA中。

(2)外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的诱导表达

每隔12h收集发酵液上清与底物反应，使用HPLC测定产物生成量并计算其菊粉酶酶活，重组菊粉酶酶活的测定方法为：

取100μL粗酶液，加入900μL 1.0％的菊粉溶液(50mM，pH6醋酸缓冲液配制)，45℃水浴反应12h，95℃，5min灭活终止反应。在相同的实验条件下使用95℃，5分钟灭活的粗酶液作为对照，每组实验重复3次作为平行实验。使用安捷伦1200高效液相色谱(HPLC,Agilent Technologies,PaloAlto,CA,USA)连接糖柱PrevailTMCarbohydrate ES(Alltech,column-W250*4.6mm 5um)通过蒸发光检测器ELSD 3300(Alltech)来测定反应产物中各糖分的含量(Xu et al.2015)。根据峰面积来计算产生的果糖量，从而计算出重组蛋白的酶活。每1个单位的菊粉酶酶活定义为每分钟转化成1μmol果糖所需的酶量。

结果如图2所示，结果表明，重组蛋白Inu-2可水解菊粉，Inu-2的酶活性在培养36小时后达到峰值，然后在稳定前略有下降(6.15U/mL)。因此，Inu-2在培养36小时后获得最高活性，并用于后续实验。

实施例4重组蛋白的纯化及SDS-PAGE分析

将Inu-2诱导36h后的上清液使用硫酸铵沉淀法实现蛋白浓缩并进行透析纯化，将得到的透析液通过Ni柱，使其中的重组蛋白吸附在Ni柱上，再分别使用含有40mM,80mM,120mM,160mM和200mM的咪唑平衡缓冲液洗脱重组蛋白，分别收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析，结果见图3。在SDS-PAGE分析中，Inu-2重组蛋白的预测分子量约为93.5kDa，与SDS-PAGE分析中得到的清晰条带分子量相匹配(约100kDa)，这也证明了重组蛋白Inu-2的成功纯化。

实施例5外切菊粉酶Inu-2酶学性质分析

(1)反应温度对重组菊粉酶酶活的影响

在其他实验条件不变的情况下将重组菊粉酶分别置于不同的温度下(30℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃)进行水解反应，每个实验组设置3个平行，测定重组菊粉酶酶活力，从而确定重组菊粉酶的最佳反应温度。将被测变量的最高酶活性设置为100％，并计算相对酶活性。外切菊粉酶Inu-2在45℃下进行酶解反应的菊粉酶酶活最高，并在40-50℃的温度范围内可保持超过其最大菊粉酶活性60％的酶活(图4A)。

(2)反应pH对重组菊粉酶酶活的影响

在其他实验条件不变的情况下将重组菊粉酶分别置于不同的pH下(4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，8.0)进行水解反应，每个实验组设置3个平行，测定重组菊粉酶酶活力，从而确定重组菊粉酶的最佳反应pH值。将被测变量的最高酶活性设置为100％，并计算相对酶活性。外切菊粉酶Inu-2在pH为6的条件下达到最大菊粉酶酶活，且具有较高的pH稳定性，在pH5.0-6.5的范围内均表现出超过其最大菊粉酶活性50％的酶活(图4B)。

(3)金属离子对重组菊粉酶酶活的影响

在其他实验条件不变的情况下，将纯化后的重组菊粉酶分别与MgSO₄·5H₂O，ZnSO₄，CuSO₄·5H₂O，FeCl₃，FeCl₂，CaCl₂，LiCl，KCl，MnCl₂，NaCl和CoCl₂(1.0mM)混合于0℃放置60min，再将混合物加入含1％的菊粉底物进行酶解反应，每个实验组设置3个平行，测定菊粉酶活性变化。将加入同等体积去离子水的重组菊粉酶的酶活力设置为100％，并计算相对酶活性，从而确定金属离子对重组菊粉酶酶活性的影响。几种金属离子对Inu-2酶活的促进作用由强到弱依次为Li⁺>Na⁺>Co²⁺>Ca²⁺>K⁺>Mg²⁺>Mn²⁺，其中Li⁺对于Inu-2酶活的促进作用最大，其活性与未添加金属离子的对照相比增加20％，Fe²⁺,Zn²⁺,Cu²⁺和Fe³⁺对Inu-2酶活起抑制作用，酶活与未加金属离子的对照相比分别降低了20％,19％,85％和86％。(图4C)

(4)重组菊粉酶的底物特异性分析

分别用1％的菊粉Inulin、利云型果聚糖Levan、蔗糖、蔗果三糖(1-kestose)、蔗果四糖(nystose)、蔗果五糖(1^F-fructofuranosylnystose)(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd)作为底物，在同等实验条件下进行酶解反应，每个实验组设置3个平行，分别测定重组菊粉酶Inu-2活性，将被测变量的最高酶活性设置为100％，并计算相对酶活性。从而确定重组菊粉酶Inu-2的底物特异性。外切菊粉酶Inu-2显示出很高的水解菊粉能力，将其设置为100％，外切菊粉酶Inu-2对蔗果五糖、蔗果三糖、利云型果聚糖、蔗糖的水解能力分别为菊粉水解水平的99％、96％、94％和72％，而水解蔗果三糖的能力最低，仅为菊粉水解水平的68％。(图4D)

表1.本研究中所使用的引物

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种可降解菊粉果聚糖的外切菊粉酶Inu-2及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2616

<212> DNA

<213> 菊芋(Helianthus tuberosus.L)

<400> 1

atgcctcaat gtactgctcg aactaagcaa tcgatctcgc ttgtcaccgc cgccagcctg 60

tgcttgggcg cggggctaat cagcgctatg ccagctgccg ccgcagaact gggtgatgaa 120

ccctaccgtc ccgggatcca cttcagccca gaaaagaact ggatgaacga ccccaacggc 180

atggtttatt acaagggcgt ctaccacctg tacttccagc acaatcccaa aggcaatgtc 240

tggggaaata tgtcctgggg gcacgccacc tccaaggacc tggtgcactg ggaacaacag 300

cccctggcca ttgcgggcga tgcagaagaa gacgtattct cgggcagcgt tgtcgtagac 360

gccaataaca cctcagggct tggcaccgcc aagaatccgc cactgattgc cgtctacacc 420

agcgcataca aggcaggatc cgaacatgcc ggactgcaag cgcaatccct ggcctacagc 480

ctggatgacg ggcagacctg gaccaaatac aagaacaacc cagtgctcaa ccgcaactcg 540

gccaacttcc gcgaccccaa agtcttctgg tacaccggca aagacggcca gggctactgg 600

gtgatgacgg cggtggaagc caccgatcac aaggccgtgc tctacaagtc caagaacctc 660

aaggactgga ccaagctcag cgaattcggc ccggccaacg ccaccggcgg cgtctgggaa 720

tgcccggatc tgttcccact ggcagtcgat ggcgacccga acaacgtcaa atgggtcatg 780

gtcgtcaaca tgaacccggg cggcgtctcc ggcggttccg ccggccaata cttcgtcggc 840

gacttcgacg gcaccacctt cacctcggaa accaccaagc cagcgcccac catgccggaa 900

ggcgaactgc tggccgggtt caatgacggc acctatgacg gctggagcgt caccaacgat 960

ccgaacagcg accaggcagg gcccttcgga accaagccag tggccggaac cgttccgggg 1020

caacaagaag tcaccggcta ccagggcgca ggactggtga attccttcct tggctttgac 1080

cagccaacag gcaccatgct ctccgacccg ttcaccgtag accacgacta cctgaacttc 1140

ctggtcggcg gcggcaagca tgcacgcgtc agcgacaagc gggataacaa ggctccggtg 1200

ggcgacttgc tcttcgacgg attcgaagtc ccagaaggct ccgacctgtc agaattcggc 1260

tggagtggaa ccggctcgct ggttccagag aacctgccct tcgccggcgg cggcaacatg 1320

gccatcggaa gccatgtcat caacacctgg gaagccggcg gtggcggcga tgacctgatg 1380

ggcaccgcaa cgtcaccgga attcaccatc accaagcagc ggatcggcat gctgatcggc 1440

ggcggacacc ggcgcaacga tccaagccaa aaacttgaag tccagctgat ggtcaacggc 1500

gacgtggtcc agtccctggc cggtgacaac gctggtgcga tgaactggaa gtccttcgac 1560

accgccagct atgcagggca gaaagcccgg atccgggtcg tggaccaggc caccggcggc 1620

tggggccacc tcaccctgga tcacctcgtg caaaccgatg aagaagtcgt tccgcgctcc 1680

gatgaaacca ccgtcaacct ggtggtggat gacaagacgg tgcgtacggc cacgggtacg 1740

gacagcgaga gcctggactt tgcctcatgg aacgtgaagg aattcgccgg caagcaggcc 1800

caaatcgaaa ttgtcgataa caacaaggaa ggctggggcc acatcctggc cgacgaattc 1860

acccagtcca ataccgcggc caagtcatcc ctggagaact atgactggct ggactacggg 1920

cgcgactact atgcgaccgt gtccttcggc aacatgccgc aggacaagcg catcatgctg 1980

ggatggatga acaactggga ctacgccaac gacatcccaa cctcgccatg gcgcagcgcc 2040

atgacgctgc cgcgcaaggt gggcctgact caaaccgctg aaggtccccg cctgacccag 2100

gcgccagtgg aacaggtcag caagctcggc ggcaagccga agtacctgga aaccaacaag 2160

accatcaccg agggaacccg cacgctgcca cagcaagcag ctggatccat cgcgcaagtc 2220

gacgtggtcc ttgatcccgg caccgccaag acctcgggca tcaccgttca tggcgatgcc 2280

aacagctcca cggtgatcgg ctacgacgcg gacagcaaaa aggtctatgt ggaccgcagc 2340

aactcaggca atgtcggatt ccatcctgcc tttgcctcgg ttgaagagat gccggtcaag 2400

ctgaacagca acggggaagt gaccctgcgg gtttacctcg accgttcctc ggtggaagtc 2460

ttcgcccaga agggccagcg aaccctgacc gaccaggtct tccctaatgc gggggccgac 2520

cagcttggcg tcttcgccaa cggtggcacc gcgaagctga agtcgctgaa ggtgaccgag 2580

ctgcagccgt cgatgttcac ctcggcaacg aagtag 2616

<210> 2

<211> 871

<212> PRT

<213> 菊芋(Helianthus tuberosus.L)

<400> 2

Met Pro Gln Cys Thr Ala Arg Thr Lys Gln Ser Ile Ser Leu Val Thr

1 5 10 15

Ala Ala Ser Leu Cys Leu Gly Ala Gly Leu Ile Ser Ala Met Pro Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Glu Leu Gly Asp Glu Pro Tyr Arg Pro Gly Ile His Phe

35 40 45

Ser Pro Glu Lys Asn Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Met Val Tyr Tyr

50 55 60

Lys Gly Val Tyr His Leu Tyr Phe Gln His Asn Pro Lys Gly Asn Val

65 70 75 80

Trp Gly Asn Met Ser Trp Gly His Ala Thr Ser Lys Asp Leu Val His

85 90 95

Trp Glu Gln Gln Pro Leu Ala Ile Ala Gly Asp Ala Glu Glu Asp Val

100 105 110

Phe Ser Gly Ser Val Val Val Asp Ala Asn Asn Thr Ser Gly Leu Gly

115 120 125

Thr Ala Lys Asn Pro Pro Leu Ile Ala Val Tyr Thr Ser Ala Tyr Lys

130 135 140

Ala Gly Ser Glu His Ala Gly Leu Gln Ala Gln Ser Leu Ala Tyr Ser

145 150 155 160

Leu Asp Asp Gly Gln Thr Trp Thr Lys Tyr Lys Asn Asn Pro Val Leu

165 170 175

Asn Arg Asn Ser Ala Asn Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Thr

180 185 190

Gly Lys Asp Gly Gln Gly Tyr Trp Val Met Thr Ala Val Glu Ala Thr

195 200 205

Asp His Lys Ala Val Leu Tyr Lys Ser Lys Asn Leu Lys Asp Trp Thr

210 215 220

Lys Leu Ser Glu Phe Gly Pro Ala Asn Ala Thr Gly Gly Val Trp Glu

225 230 235 240

Cys Pro Asp Leu Phe Pro Leu Ala Val Asp Gly Asp Pro Asn Asn Val

245 250 255

Lys Trp Val Met Val Val Asn Met Asn Pro Gly Gly Val Ser Gly Gly

260 265 270

Ser Ala Gly Gln Tyr Phe Val Gly Asp Phe Asp Gly Thr Thr Phe Thr

275 280 285

Ser Glu Thr Thr Lys Pro Ala Pro Thr Met Pro Glu Gly Glu Leu Leu

290 295 300

Ala Gly Phe Asn Asp Gly Thr Tyr Asp Gly Trp Ser Val Thr Asn Asp

305 310 315 320

Pro Asn Ser Asp Gln Ala Gly Pro Phe Gly Thr Lys Pro Val Ala Gly

325 330 335

Thr Val Pro Gly Gln Gln Glu Val Thr Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Leu

340 345 350

Val Asn Ser Phe Leu Gly Phe Asp Gln Pro Thr Gly Thr Met Leu Ser

355 360 365

Asp Pro Phe Thr Val Asp His Asp Tyr Leu Asn Phe Leu Val Gly Gly

370 375 380

Gly Lys His Ala Arg Val Ser Asp Lys Arg Asp Asn Lys Ala Pro Val

385 390 395 400

Gly Asp Leu Leu Phe Asp Gly Phe Glu Val Pro Glu Gly Ser Asp Leu

405 410 415

Ser Glu Phe Gly Trp Ser Gly Thr Gly Ser Leu Val Pro Glu Asn Leu

420 425 430

Pro Phe Ala Gly Gly Gly Asn Met Ala Ile Gly Ser His Val Ile Asn

435 440 445

Thr Trp Glu Ala Gly Gly Gly Gly Asp Asp Leu Met Gly Thr Ala Thr

450 455 460

Ser Pro Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gln Arg Ile Gly Met Leu Ile Gly

465 470 475 480

Gly Gly His Arg Arg Asn Asp Pro Ser Gln Lys Leu Glu Val Gln Leu

485 490 495

Met Val Asn Gly Asp Val Val Gln Ser Leu Ala Gly Asp Asn Ala Gly

500 505 510

Ala Met Asn Trp Lys Ser Phe Asp Thr Ala Ser Tyr Ala Gly Gln Lys

515 520 525

Ala Arg Ile Arg Val Val Asp Gln Ala Thr Gly Gly Trp Gly His Leu

530 535 540

Thr Leu Asp His Leu Val Gln Thr Asp Glu Glu Val Val Pro Arg Ser

545 550 555 560

Asp Glu Thr Thr Val Asn Leu Val Val Asp Asp Lys Thr Val Arg Thr

565 570 575

Ala Thr Gly Thr Asp Ser Glu Ser Leu Asp Phe Ala Ser Trp Asn Val

580 585 590

Lys Glu Phe Ala Gly Lys Gln Ala Gln Ile Glu Ile Val Asp Asn Asn

595 600 605

Lys Glu Gly Trp Gly His Ile Leu Ala Asp Glu Phe Thr Gln Ser Asn

610 615 620

Thr Ala Ala Lys Ser Ser Leu Glu Asn Tyr Asp Trp Leu Asp Tyr Gly

625 630 635 640

Arg Asp Tyr Tyr Ala Thr Val Ser Phe Gly Asn Met Pro Gln Asp Lys

645 650 655

Arg Ile Met Leu Gly Trp Met Asn Asn Trp Asp Tyr Ala Asn Asp Ile

660 665 670

Pro Thr Ser Pro Trp Arg Ser Ala Met Thr Leu Pro Arg Lys Val Gly

675 680 685

Leu Thr Gln Thr Ala Glu Gly Pro Arg Leu Thr Gln Ala Pro Val Glu

690 695 700

Gln Val Ser Lys Leu Gly Gly Lys Pro Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Lys

705 710 715 720

Thr Ile Thr Glu Gly Thr Arg Thr Leu Pro Gln Gln Ala Ala Gly Ser

725 730 735

Ile Ala Gln Val Asp Val Val Leu Asp Pro Gly Thr Ala Lys Thr Ser

740 745 750

Gly Ile Thr Val His Gly Asp Ala Asn Ser Ser Thr Val Ile Gly Tyr

755 760 765

Asp Ala Asp Ser Lys Lys Val Tyr Val Asp Arg Ser Asn Ser Gly Asn

770 775 780

Val Gly Phe His Pro Ala Phe Ala Ser Val Glu Glu Met Pro Val Lys

785 790 795 800

Leu Asn Ser Asn Gly Glu Val Thr Leu Arg Val Tyr Leu Asp Arg Ser

805 810 815

Ser Val Glu Val Phe Ala Gln Lys Gly Gln Arg Thr Leu Thr Asp Gln

820 825 830

Val Phe Pro Asn Ala Gly Ala Asp Gln Leu Gly Val Phe Ala Asn Gly

835 840 845

Gly Thr Ala Lys Leu Lys Ser Leu Lys Val Thr Glu Leu Gln Pro Ser

850 855 860

Met Phe Thr Ser Ala Thr Lys

865 870

Claims

1.外切菊粉酶Inu-2，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的外切菊粉酶Inu-2的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于该基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

4.含有权利要求2或3所述的编码外切菊粉酶Inu-2的基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于以pPICZαC作为出发载体，将编码外切菊粉酶Inu-2的基因插入EcoR I和Xba I作为两个酶切位点间所得。

6.权利要求2或3所述的基因在制备重组外切菊粉酶Inu-2中的应用。

7.权利要求4或5所述的表达载体在制备重组外切菊粉酶Inu-2中的应用。

8.权利要求1所述的外切菊粉酶Inu-2在制备果糖中的应用。