CN108410903B - 一种耐低pH值的内切木聚糖酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了耐低pH值的内切木聚糖水解酶基因、含有该基因的工程菌及其应用。内切木聚糖水解酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。其所编码的内切木聚糖水解酶蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2。将该内切木聚糖水解酶基因构建重组质粒并导入Pichia pastoris X33即获得含有该基因的基因工程菌P.pastoris X33‑x10c。该耐低pH值的内切木聚糖水解酶能够高效降解作物秸秆中大量存在的木聚糖，在pH值2.0条件下能够稳定存在，能够满足微生物有机肥生产工艺中对耐低pH值秸秆降解酶的特殊需求；同时，其耐低pH值的特性能够有效避免动物胃酸对功能酶的失活作用，适合应用于动物饲料行业。

Description

一种耐低pH值的内切木聚糖酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种耐低pH值的内切木聚糖酶及其编码基因和应用。

背景技术

木聚糖是半纤维素的主要成分，自然界储量丰富，由木糖单体经β-1,4-糖苷键聚合而成。自然条件下，木聚糖中的木糖单元往往被甘露糖、葡糖糖、阿拉伯糖、麦芽糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等修饰而形成因物种和个体差异带来的木聚糖含量和结构上的不同。木聚糖的水解主要由β-1,4-D-内切木聚糖酶、木聚糖苷酶及支链水解酯酶完成，前者是微生物水解木聚糖最重要的酶，其水解产物包括各类寡糖以及木单糖。

微生物有机肥能够替代或部分替代化肥，具有促进植物生长、防控土传病害的功能，符合国家“减肥减药”政策。微生物有机肥的生产主要以作物秸秆为基质进行功能微生物的发酵。作为碳源和能源的唯一来源，作物秸秆的主要成分为木质纤维(90％以上)，是由纤维素、木聚糖等多聚物构成的复杂物质。功能微生物(例如哈茨木霉(Trichodermaharzianum))在发酵的过程中主要通过分泌大量胞外降解酶系(包括纤维素酶系、木聚糖酶系)对作物秸秆中的纤维素和木聚糖等成分进行有效降解，从而释放出可利用寡糖。然而，实际生产过程中需要面对外源微生物的污染问题，但通过添加动物源氨基酸能够有效解决，其主要原因在于营造一个低pH值环境，使得功能微生物(哈茨木霉)具有明显的生存优势，既节省灭菌成本，又便于发酵质量控制。然而酶学研究表明，丝状真菌分泌的大部分木质纤维降解酶(包括纤维素酶和木聚糖酶)在低pH值条件下(pH<3.0)会完全变性，丧失功能。寻找能够耐低pH(<2.0)的秸秆降解酶表达基因是一种有效的解决方案，具有潜在的在低pH值条件下提高功能微生物碳源摄入效率，增加其发酵产量的功能；此外，在动物饲料领域，耐低pH值木聚糖酶能够有效避免动物胃酸对其酸失活作用。

发明内容

本发明的目的是针对低pH值条件下(pH<3)木聚糖酶容易丧失活性、微生物有机肥和饲料行业对耐酸木聚糖酶的要求，提供一种耐低pH值的β-1,4-D-内切木聚糖酶基因。

本发明的另一目的是提供含有该基因的基因工程菌。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。利用该基因生产的酶制剂可用于微生物有机肥、动物饲料行业，能够满足低pH反应的需求，带来可观的经济效益。本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种耐低pH值的内切木聚糖水解酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因的全长(从起始密码子到终止密码子)为1080bp，G+C含量为56％，编码360个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2(N端含有17个氨基酸长度的信号肽序列)。

所述的耐低pH值的内切木聚糖水解酶基因核苷酸序列所编码的耐低pH值木聚糖水解酶蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

一种重组质粒，该重组质粒是含有所述的耐低pH值内切木聚糖水解酶基因的pPICZαA-x10c重组质粒。主要通过EcoRI和XbaI双酶切pPICZαA和x10c基因的cDNA序列后，经T4连接酶过夜酶连后热转化进入大肠杆菌，通过博来霉素(zeocin)抗生素筛选正确突变子并测序验证。

含有所述的耐低pH值的内切木聚糖水解酶基因的基因工程菌为Pichia pastorisX33-X10C。所述的基因工程菌P.pastoris X33-X10C的构建方法：所述的含有耐低pH值的木聚糖水解酶基因pPICZαA-x10c重组质粒电转化到表达宿主菌P.pastoris X33获得重组微生物P.pastoris X33-X10C，再将所获得的重组微生物Pichia pastoris X33-X10C转接到含有25mg/l博来霉素的YPD(2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)葡萄糖，1M山梨醇，pH 6.0)平板上，30℃培养48h后，挑取转化子，经测序验证和预发酵酶活测定无误后，保存。

所述的耐低pH值的内切木聚糖水解酶蛋白X10C生产方式如下：

1)将工程菌Pichia pastoris X33-X10C少量菌体接种到含100mg/l博来霉素的BMGY液体培养基(2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母粉，1.34％(w/v)YNB，4×10^-5％(w/v)生物素，1％(v/v)甘油)中，黑暗条件下28℃、250rpm培养24小时，8000rpm离心5分钟去除培养基，获得大量菌体。

2)将获得的菌体重新接种至含1％甲醇的BMMY液体培养基(2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母粉，1.34％(w/v)YNB，4×10^-5％(w/v)生物素，1％(v/v)甲醇)中，黑暗条件下28℃、250rpm培养，每24小时添加一次甲醇(按照培养基体积的1％的量添加)，72小时后8000rpm离心5分钟去除菌体，获得X10C蛋白发酵液。

3)取少量蛋白溶液用于SDS-PAGE蛋白电泳验证和DNS酶活测定验证，确认无误后采用分子筛技术纯化，将纯化后的蛋白溶解于100mM的磷酸钾溶液中(pH6.6)，BCA方法测定蛋白含量在1.0-2.0g/L，-80℃保存待用。

本发明的有益效果如下：

本发明提供一种耐低pH值的内切木聚糖水解酶基因及其工程菌，其表达蛋白X10C能够将微生物难降解的木聚糖水解成最终产物木二糖和木糖。X10C的最适反应温度为70℃，能够在pH1.0较稳定存在，pH2.0稳定存在。X10C对温度和pH值的耐受能力符合微生物有机肥(功能微生物为哈茨木霉)发酵生产过程中的低pH环境，其对秸秆的降解作用能够释放易吸收寡糖，加快哈茨木霉的发酵。此外，耐低pH值能力具有有效抵抗动物胃酸作用，保证该酶在动物饲料中正常发挥功能。

附图说明

图1耐低pH值内切木聚糖水解酶X10C的SDS-PAGE图。

图2耐低pH值内切木聚糖水解酶X10C的pH值稳定性测定。

A：X10C的pH稳定性，X10C在不同pH值缓冲液中4℃保存1h，接着用DNS法在最适温度和最适pH条件下测定剩余酶活；B：X10C在pH 2.0条件下相对酶活随时间变化的动态曲线，X10C在pH 2.0缓冲液中于4℃保存10min、30min、1h、2h、4h、6h后测定相对酶活；C：X10C在pH 1.0条件下相对酶活随时间变化的动态曲线，X10C在pH 1.0缓冲液中于4℃保存10min、30min、1h、2h、4h、6h后测定相对酶活。

生物材料保藏信息

NJZ5，烟曲霉Aspergillus fumigatus,已于2009年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.3309，基因组序列上传于美国国家生物技术信息中心(简称NCBI)，检索号为AZZA00000000。

具体实施方式

实施例1耐低pH值内切木聚糖水解酶的制备

1.耐低pH值内切木聚糖水解酶基因的克隆

菌株NJZ5在以1％(w/v)葡萄糖作为唯一碳源的无机盐培养基中培养48h后，将菌丝体转接到含有1％(w/v)木聚糖的无机盐培养基中继续培养12h，接着利用RNA提取试剂盒提取NJZ5在木聚糖诱导下的总RNA，经反转录后PCR扩增得到所述内切木聚糖水解酶基因cDNA序列。具体操作为从-80℃冰箱中取出预存的木聚糖诱导的NJZ5菌丝体，液氮研磨至粉末状。利用QIAGEN公司的Plant Mini Kit并结合该公司的RNase-Free DNase set一起使用成功提取NJZ5的总RNA。通过电泳的方法来检测所提取总RNA的完整性和纯度。使用TAKARA公司的PrimeScript RT-PCR Kit反转录试剂盒得到NJZ5木聚糖诱导的cDNA。

反转录体系：第一步

反应条件：65℃反应5分钟，4℃保存10分钟。

第二步：

反应条件：42℃反应30分钟，95℃反应5分钟，4℃保存10分钟。

根据内切木聚糖水解酶基因ORF序列，设计了一对引物，利用重叠延伸PCR技术扩增内切木聚糖水解酶基因。其中正向引物F1:5’-CCGgaattcGCGCCTTCGAGCAGCAAGAA-3’(SEQID NO.4)带有一个EcoRI酶切位点，反向引物R1:5’-CTAGtctagaTCAGCATACAGTGCAGGGCTTG-3’(SEQ ID NO.5)带有一个XbaI酶切位点，用于扩增内切木聚糖水解酶基因去除信号肽后的所有序列。PCR反应以木聚糖诱导的cDNA为模板进行扩增。

扩增体系：

PCR扩增程序：

98℃变性10sec，60℃退火10sec，72℃延伸1.5min，进行30个循环；

72℃延伸10min；

4℃冷却10min。

扩增完成后的基因序列经胶回收后溶于双蒸水中，-20℃保存。

2.表达载体pPICZαA-x10c构建

将所述的内切木聚糖水解酶基因片段和pPICZalphaA表达质粒分别用EcoRI和XbaI充分酶切。

酶切体系：

在37℃水浴中，反应3h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳切胶回收。回收后的基因片段和表达质粒片段按10：1混合，在连接液作用下，16℃水浴过夜。酶连体系如下：

3.酶连产物的转化和阳性克隆子的筛选

将10μl酶连产物加入200μl在冰上融化后的E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s后，快速转移到冰浴中冷切1-2min，向每管中加入800μl液体LLB培养基，37℃摇床100rpm温浴1h，复苏细胞。4000rpm离心3min，剩余200μl感受态细胞涂布于含有25mg/l博来霉素的LLB琼脂平板上，37℃培养箱培养，16h后出现菌落，挑选10个单菌落编号后接种于3ml含有25mg/l博来霉素的LLB液体试管中，待长出菌落悬液后提质粒测序验证，确保其精确无误。将获得的阳性质粒命名为pPICZαA-x10c。

4.耐低pH值内切木聚糖水解酶基因在P.pastoris X33中的高效表达

将含有内切木聚糖水解酶基因的pPICZαA-x10c重组质粒用PmeI进行线性化。线性化好的重组质粒通过电转的方法转化到表达宿主菌毕赤酵母X33中，电转后立刻加入1ml1M山梨醇30℃静置1h，400rpm离心后去上清留100μl菌液，涂布于含有25mg/l博来霉素的YPD培养基上，30℃培养2-3天后，挑取具有明显菌落的阳性克隆子，转接到另一块含有博来霉素抗性的YPD培养基上，待菌落形成后挑取做菌落PCR验证突变子无误。

将上述阳性克隆子在BMGY培养基中30℃，200rpm培养20h后，4000rpm离心5分钟得菌体，用新的BMMY液体培养基重新悬浮菌体，30℃，200rpm继续培养，每24小时重新加入100％的甲醇使培养瓶中甲醇终浓度维持在1％。最低诱导48h后，离心培养液留上清，即为内切木聚糖水解酶粗酶液。取10μl内切木聚糖水解酶粗酶液加入1ml含有1％燕麦木聚糖的醋酸缓冲液pH5.5中，于90℃反应10分钟后，加入1ml的DNS试剂充分混匀后沸水浴10min，用540nm波长处的吸光值强弱来了解木聚糖的降解情况。酶活单位定义为每分钟产生1μmol还原糖即为一个单位，测得粗酶活的比活力为25.32μmol/min/mg，即1mg该粗酶以燕麦木聚糖为底物在最适条件下反应每分钟可获得31.57μmol的还原糖。

实施例2内切木聚糖水解酶水解燕麦木聚糖时最适反应温度的检测

将2μl纯化的内切木聚糖水解酶加入到1ml含有1％燕麦木聚糖或的醋酸缓冲液pH5.5中，分别放置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃的水浴锅中反应10min，每个温度设3个重复。反应过程中每隔2分钟充分混匀反应体系。反应结束后立即加入1ml的DNS试剂并充分混匀，沸水浴10min后稀释5倍吸取200μl用分光光度计在540nm波长下，检测吸光值强弱来判断内切木聚糖水解酶以燕麦木聚糖为底物时的最适反应温度。结果表明内切木聚糖水解酶水解燕麦木聚糖时，随着反应温度从20℃逐渐升高时，酶活也随之升高，并在70℃的反应温度达到最高酶活。

实施例3内切木聚糖水解酶水解燕麦木聚糖时pH稳定性检测

将纯化的内切木聚糖水解酶分别置于pH值为(1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0)的缓冲液中，4℃保存1h，之后在最适温度和最适pH值条件下利用DNS法测定其酶活。针对低pH值区域，重新设计该酶在pH 1.0和pH2.0的缓冲液中4℃储存(10min，30min，1h，2h，4h，6h)，并利用DNS法测定该酶分别在pH 1.0和pH 2.0条件下随着时间的酶活动态变化曲线。最终得出，耐低pH值内切木聚糖水解酶X10C能够在pH 2.0条件下稳定存在，pH 1.0条件下较稳定存在。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种耐低pH值的内切木聚糖酶及其编码基因和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> Aspergillus fumigatus Z5

<400> 1

atgcgtttct cccttgccgc caccactctt ctcgctggcc tggccacggc agcgccttcg 60

agcagcaaga acgacgtcaa tctcgataag cttgctcgac gtaatggcat gctttggttc 120

ggcactgcag ccgatatccc tggtacctca gagacaaccg acaagtctta tctgagcatc 180

ctgcgcaaga agttcggcga aatgactccc gcaaacgcat tgaagttcat gtataccgag 240

cccgagcaaa atgtcttcaa cttcactcaa ggggactact tcatggactt ggccgatcac 300

tatggtcacg ccgtgcgctg ccataacctc gtctgggcca gccaagtgtc cgactgggtc 360

acctccagga actggaccgc cacagaactc aaagaagtga tgaagaacca catcttcaag 420

accgtccagc attttggcaa gcgctgctac gcgtgggacg tcgtcaatga agctgttaat 480

ggggacggga ccttctcctc cagtgtgtgg tacgacacaa ttggcgagga atacttctac 540

cttgcattcc agtatgccca ggaagccctg gcgcagattc acgccaacca ggtcaagctt 600

tactataacg actacggcat tgagaacccc ggccccaagg cagatgctgt tctgaagcta 660

gtcgccgagt tgcggaagcg gggcattcgc attgacggag tcggtctcga gtcccacttc 720

atcgtcggcg agactccttc gctcgctgac cagctcgcca ccaagaaggc ttatatcgag 780

gccggacttg aggtcgccat caccgaactt gacgtccgtt tttctcaggc cccgttctac 840

accgccgagg cccaaaagca gcaggctgcc gactactatg ctagcgtcgc cagttgcaag 900

catgccggac cgcgctgtgt tggtgttgta gtctgggatt tcgatgacgc ctactcgtgg 960

attccgggta ccttcgaggg acagggtggc gcctgtctat ataatgagac actcgaggtg 1020

aagccggcct tctatgctgc tgccgaggcg ttggagaaca agccctgcac tgtatgctag 1080

<210> 2

<211> 359

<212> PRT

<213> Aspergillus fumigatus Z5

<400> 2

Met Arg Phe Ser Leu Ala Ala Thr Thr Leu Leu Ala Gly Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ala Ala Pro Ser Ser Ser Lys Asn Asp Val Asn Leu Asp Lys Leu Ala

20 25 30

Arg Arg Asn Gly Met Leu Trp Phe Gly Thr Ala Ala Asp Ile Pro Gly

35 40 45

Thr Ser Glu Thr Thr Asp Lys Ser Tyr Leu Ser Ile Leu Arg Lys Lys

50 55 60

Phe Gly Glu Met Thr Pro Ala Asn Ala Leu Lys Phe Met Tyr Thr Glu

65 70 75 80

Pro Glu Gln Asn Val Phe Asn Phe Thr Gln Gly Asp Tyr Phe Met Asp

85 90 95

Leu Ala Asp His Tyr Gly His Ala Val Arg Cys His Asn Leu Val Trp

100 105 110

Ala Ser Gln Val Ser Asp Trp Val Thr Ser Arg Asn Trp Thr Ala Thr

115 120 125

Glu Leu Lys Glu Val Met Lys Asn His Ile Phe Lys Thr Val Gln His

130 135 140

Phe Gly Lys Arg Cys Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Val Asn

145 150 155 160

Gly Asp Gly Thr Phe Ser Ser Ser Val Trp Tyr Asp Thr Ile Gly Glu

165 170 175

Glu Tyr Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Tyr Ala Gln Glu Ala Leu Ala Gln

180 185 190

Ile His Ala Asn Gln Val Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Gly Ile Glu

195 200 205

Asn Pro Gly Pro Lys Ala Asp Ala Val Leu Lys Leu Val Ala Glu Leu

210 215 220

Arg Lys Arg Gly Ile Arg Ile Asp Gly Val Gly Leu Glu Ser His Phe

225 230 235 240

Ile Val Gly Glu Thr Pro Ser Leu Ala Asp Gln Leu Ala Thr Lys Lys

245 250 255

Ala Tyr Ile Glu Ala Gly Leu Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val

260 265 270

Arg Phe Ser Gln Ala Pro Phe Tyr Thr Ala Glu Ala Gln Lys Gln Gln

275 280 285

Ala Ala Asp Tyr Tyr Ala Ser Val Ala Ser Cys Lys His Ala Gly Pro

290 295 300

Arg Cys Val Gly Val Val Val Trp Asp Phe Asp Asp Ala Tyr Ser Trp

305 310 315 320

Ile Pro Gly Thr Phe Glu Gly Gln Gly Gly Ala Cys Leu Tyr Asn Glu

325 330 335

Thr Leu Glu Val Lys Pro Ala Phe Tyr Ala Ala Ala Glu Ala Leu Glu

340 345 350

Asn Lys Pro Cys Thr Val Cys

355

<210> 3

<211> 342

<212> PRT

<213> Aspergillus fumigatus Z5

<400> 3

Ala Pro Ser Ser Ser Lys Asn Asp Val Asn Leu Asp Lys Leu Ala Arg

1 5 10 15

Arg Asn Gly Met Leu Trp Phe Gly Thr Ala Ala Asp Ile Pro Gly Thr

20 25 30

Ser Glu Thr Thr Asp Lys Ser Tyr Leu Ser Ile Leu Arg Lys Lys Phe

35 40 45

Gly Glu Met Thr Pro Ala Asn Ala Leu Lys Phe Met Tyr Thr Glu Pro

50 55 60

Glu Gln Asn Val Phe Asn Phe Thr Gln Gly Asp Tyr Phe Met Asp Leu

65 70 75 80

Ala Asp His Tyr Gly His Ala Val Arg Cys His Asn Leu Val Trp Ala

85 90 95

Ser Gln Val Ser Asp Trp Val Thr Ser Arg Asn Trp Thr Ala Thr Glu

100 105 110

Leu Lys Glu Val Met Lys Asn His Ile Phe Lys Thr Val Gln His Phe

115 120 125

Gly Lys Arg Cys Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Val Asn Gly

130 135 140

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145 150 155 160

Tyr Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Tyr Ala Gln Glu Ala Leu Ala Gln Ile

165 170 175

His Ala Asn Gln Val Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Gly Ile Glu Asn

180 185 190

Pro Gly Pro Lys Ala Asp Ala Val Leu Lys Leu Val Ala Glu Leu Arg

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225 230 235 240

Tyr Ile Glu Ala Gly Leu Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val Arg

245 250 255

Phe Ser Gln Ala Pro Phe Tyr Thr Ala Glu Ala Gln Lys Gln Gln Ala

260 265 270

Ala Asp Tyr Tyr Ala Ser Val Ala Ser Cys Lys His Ala Gly Pro Arg

275 280 285

Cys Val Gly Val Val Val Trp Asp Phe Asp Asp Ala Tyr Ser Trp Ile

290 295 300

Pro Gly Thr Phe Glu Gly Gln Gly Gly Ala Cys Leu Tyr Asn Glu Thr

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Leu Glu Val Lys Pro Ala Phe Tyr Ala Ala Ala Glu Ala Leu Glu Asn

325 330 335

Lys Pro Cys Thr Val Cys

340

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggaattcg cgccttcgag cagcaagaa 29

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagtctaga tcagcataca gtgcagggct tg 32

Claims (1)

1.SEQ ID NO.1所示的基因编码的蛋白在低pH环境水解木聚糖中的应用。