CN114634942B

CN114634942B - 一种耐冷木聚糖酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用

Info

Publication number: CN114634942B
Application number: CN202210125774.1A
Authority: CN
Inventors: 崔中利; 李周坤; 李旭; 钟玲丽
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-02-10
Filing date: 2022-02-10
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2042-02-10
Also published as: CN114634942A

Abstract

本发明公开了一种具有耐冷特性的新型木聚糖酶及其编码基因和应用。本发明提供了属于糖苷水解酶第8家族的新型木聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，所编码的木聚糖酶蛋白质氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。利用该基因构建的工程菌株获得的重组木聚糖酶以玉米芯木聚糖为底物，通过DNS还原糖活性测定的方法测定其比活力为5546.9U/mg。该木聚糖酶能够在低温条件表现出较高的底物亲和力和催化效率，低温下比活力为1521.1U/mg。利用基因生产的木聚糖酶可用于木聚糖转化和木聚寡糖的制备以及食品烘焙中提高面包的品质和延长面包的货架期。

Description

一种耐冷木聚糖酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物领域，公开了一种耐冷木聚糖酶及其基因、含有该基因的工程菌及其在木聚糖转化、食品烘焙与饲料方面的应用。

背景技术

木聚糖是自然界中除纤维素外第二丰富的可再生生物质多糖,并广泛存在于硬木(15％-30％)、软木(7％-10％)和草本类植物中(低于30％)。此外，在小麦、大麦和高粱等植物性饲料或者食品原料中也存在大量的木聚糖。在木聚糖转化方面，木聚糖酶能够将半纤维素、玉米芯、麸皮等非淀粉多糖转化为木聚寡糖，作为一类功能性低聚糖在维持肠道健康、免疫调节、饮料和食品添加剂等方面具有重要的应用价值；在食品烘焙方面，由于木聚糖是小麦面粉中的重要功能性成分，影响面团的特性和烘焙制品的品质，而木聚糖酶在水解产生木聚糖寡糖的同时，也会改变面粉中多糖、蛋白及脂等组分的相互作用，从而在提高面制品品质、延长货架期等方面具有重要的作用；在饲料领域，木聚糖难以被动物快速消化吸收，而木聚糖酶能够将饲料中的非淀粉多糖-木聚糖水解，从而改善饲料的性能。目前多数报道的木聚糖酶在催化特性研究中主要以山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖以及燕麦葡聚糖等外源化学提取的木聚糖作为反应底物。由于木聚糖在植物细胞壁中与其他类型多糖相互交联，实际结构较为复杂，导致多数木聚糖酶无法发挥催化作用，这也是只有少数木聚糖酶应用于食品烘焙和饲料等行业的原因之一。

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)作为一种重要的工业用酶，广泛的应用于食品、饲料、造纸、木聚糖转化等领域。木聚糖酶根据其结构与生化特性主要归类为糖苷水解酶第8家族，第10家族和第11家族，也有部分报道的木聚糖酶分布在第5、7、30和43家族等。目前，专利报道的木聚糖酶主要来源于芽孢杆菌和木霉与曲霉(ZL 201210529320.7)，链霉菌(ZL201410752428.1)等微生物，其中，耐高温以及酸碱稳定性木聚糖酶的鉴定(ZL201510947137.2；ZL201510577598.5)、木聚糖酶的高效生产(ZL 201810954604.8)以及木聚糖酶在木质纤维素转化等方面成为关注的重点。

在低温环境条件下工业酶保持较高的催化效率，在降低能耗污染负荷、提高绿色生物制造水平、减少碳排放等方面具有重要作用。然而，目前具有耐冷特性的木聚糖酶报道较少，已报道的耐冷性木聚糖酶主要来源于南极磷虾、单胞菌属、嗜中温居水菌等，主要分布在GH8和GH10家族。同时，具有耐冷活性的新型木聚糖酶的专利申请较少，且尚无应用评估的报道，主要归因于在低温环境条件下，酶较低的催化效率限制了其实际的工业应用。因此，为了降低因高温催化带来的能耗和污染负荷，开发具有低温高效催化性能的新型木聚糖酶具有重要的价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有耐冷特性的木聚糖酶及其编码基因，所述酶可以通过氨基酸序列基序(一级结构)、二级结构元件以及三级结构元件和氨基酸序列在线BLAST比对来识别。该木聚糖酶来源于粘细菌，纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)。

本发明的另一目的是提供含有该木聚糖酶基因的基因工程菌。

本发明的又一目的是提供该基因以及该基因所编码的蛋白质的应用。

本发明所述木聚糖酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为67.03％，编码458个氨基酸，理论分子量大小为50.23KD，等电点为4.32。

本发明所述的木聚糖酶基因编码的木聚糖酶蛋白质,其氨基酸序列为：SEQ IDNO.2，该蛋白N端前19个氨基酸为信号肽序列，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.3。所述的木聚糖酶最适反应pH为6.0，最适反应温度为50℃，并在30℃-50℃(2h)和pH 5.0-11.0(12h)之间保持活性稳定。

含本发明所述的重组质粒的重组微生物。

所述的重组微生物，优选以大肠杆菌、毕氏酵母和枯草芽孢杆菌为宿主菌。

本发明所述木聚糖酶基因在木聚糖低温转化、食品、烘焙或饲料领域的基因工程应用。所述的低温转化是4～10℃。

本发明所述木聚糖酶在木聚糖低温转化方面的应用，优选为以不同来源的木聚糖为底物制备低聚木聚寡糖，包括玉米芯和小麦麸皮等。所述的低温为4～10℃。

本发明所述木聚糖酶作为酶制剂在木聚糖转化、食品或饲料领域的生产应用。

本发明所述木聚糖酶作为酶制剂在面包烘焙中的应用。

有益效果

1.本发明以从土样中筛选出的粘细菌菌株纤维堆囊菌为材料，参考基因组序列信息并结合PCR扩增，成功获得木聚糖酶基因序列。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为67.03％，编码458个氨基酸，N端前19个氨基酸为信号肽。

2.该木聚糖酶基因表达的产物，通过DNS法(二硝基水杨酸法)测定还原糖的方法进行酶的活性进行测定，该木聚糖酶能高效的作用于山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖和小麦麸皮，以玉米芯木聚糖为底物时活力高达5546.9U/mg。

3.该木聚糖酶在4℃时依然具有较高的木聚糖催化活性，与最适温度相比其相对活性依然保留20％，表现出明显的低温催化特性。同时，对比与在50℃条件下，该木聚糖酶在4℃条件下表现出较高的底物亲和力。

4.所获得的重组木聚糖酶在木聚糖转化和食品烘焙方面表现良好的性能，作用于不同植物来源的木聚糖和小麦麸皮能够显著提高低聚木聚寡糖的含量，同时应用于面包烘焙中，该酶在0.05-0.4mg/kg的添加剂量下，能够显著提高面包的体积和品质，延长面包的货架期，与商业化的木聚糖酶相比，在低添加剂量情况下显示出较好的有益效果。

附图说明

图1木聚糖酶编码基因的PCR扩增电泳图

图2重组木聚糖酶的SDS-PAGE电泳图

M：蛋白marker；1：纯化的重组蛋白；2：含有目的基因的宿主细胞破碎上清；3：不含目的基因的宿主细胞破碎上清

图3木聚糖酶酶学性质

a:重组蛋白的温度稳定性；b：重组蛋白的最适温度；c：重组蛋白的pH稳定性；d：重组蛋白的最适pH

图4木聚糖酶对不同来源木聚糖的水解产物分析

山毛榉木聚糖和玉米芯木聚糖作为底物，木聚糖酶在4℃和50℃条件下水解底物的产物利用薄层层析进行分析

图5木聚糖酶在食品烘焙中的应用

生物材料保藏信息

Sorangium cellulosum Sc20，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省科学院微生物所，保藏日期为2021年12月15日，保藏号为GDMCC NO:62127。

具体实施方式

实施例1木聚糖酶编码基因的PCR扩增

参考Sorangium cellulosum Sc20基因组序列并结合NCBI基因组信息进行ORF预测，以全长序列设计木聚糖酶编码基因引物，以粘细菌Sc20(GDMCC NO:62127)的基因组DNA为模板，进行木聚糖酶基因全长的PCR扩增，得到木聚糖酶基因的全长序列。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为67.03％，基因序列为SEQ ID NO.1，编码458个氨基酸，N端前19个氨基酸为信号肽,其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。在该蛋白异源表达过程中，去掉N端信号肽，其在大肠杆菌中表达所用引物为F1和R1，毕赤酵母中表达所用引物为F2和R2，枯草芽孢杆菌中表达所用引物为F3和R3，PCR扩增结果见图1。

F1：5-cgccatatgatgaatcggaattcgctgcg-3(Nde I)(SEQ ID NO.4)；

R1：5-ccgctcgagtcaatgatgatgatgatgatgctgcggcgcgtacgc-3(Xho I)(SEQ IDNO.5)

F2：5-tgctctagaatgaatcggaattcgctgcg-3(XbaI)(SEQ ID NO.6)；

R2：5-ccgctcgagtcaatgatgatgatgatgatgctgcggcgcgtacgc-3(XhoI)(SEQ IDNO.7)

F3：5-gtccagactgtccgctgactgtttgtagagca-3(-)(SEQ ID NO.8)；

R3：5-gtgaaaaaagcccgctcaatgatgatgatgatg-3(-)(SEQ ID NO.9)

实施例2木聚糖酶在大肠杆菌中的表达纯化与活性测定

以大肠杆菌BL21作为表达宿主，将去掉信号肽的木聚糖酶编码基因的PCR扩增产物通过酶连转化连接至pET29a载体上，构建pET29a-xynSc8质粒，后将该质粒导入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布含有50mg/L卡那霉素的LB平板，挑取单菌落通过测序验证获取含有pET29a-xynSc8质粒的大肠杆菌细胞。将构建好的含有表达质粒的大肠杆菌采用IPTG诱导的方法，诱导重组蛋白在大肠杆菌中的表达，重组蛋白的纯化采用Ni柱亲和层析的方法。结果表明该木聚糖酶在大肠杆菌具有较好的表达量，达到25mg/L，通过Ni柱纯化获得纯度较高的异源表达重组木聚糖酶(图2)。后续以大肠杆菌重组表达的异源表达蛋白开展该木聚糖酶的活性测定与评估。

实施例3木聚糖酶在毕氏酵母中的表达与活性测定

以毕氏酵母作为表达宿主，将去掉信号肽的木聚糖酶编码基因的PCR扩增产物通过酶连转化连接至pEFaA载体上，构建pEFaA-xynSc8质粒，经测序验证后，将构建好的质粒利用限制性内切酶Sca I对正确的重组质粒进行线性化。利用电转的方法将线性化质粒导入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布到含有100μg/mL Zeocin的YPD平板上，待长出后使用目的基因的特征引物进行菌落PCR，以检测目的基因是否整合到酵母染色体中。阳性克隆命名为P.pastoris GS115(pEFaA-xynSc8)。将表达菌株P.pastoris GS115(pEFαA-xynSc8)划线平板培养，挑取单菌落至50mL液体YPD三角瓶中，28℃，200rpm培养24h；然后在室温下4000rpm，离心5min，弃去上清液，将菌体用25mL BMMY培养基重悬，开始诱导酵母细胞的表达；继续28℃条件下，200rpm培养，每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，共培养96h；待培养结束后，检测目的蛋白的酶活。利用DNS法对发酵上清中的木聚糖酶活力和含量进行测定，其表达量为50mg/L。

实施例4木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达与活性测定

以枯草芽孢杆菌B.subtilis PD8为宿主，通过同源臂重组的方式构建融合有去掉信号肽的木聚糖酶编码基因的PCR扩增产物的表达盒。将融合好的线性表达盒转进芽孢杆菌的感受态细胞中，37℃和100rpm条件下复苏1h，涂布于终浓度5mg/ml的Cm抗性平板上，待长出单菌落后，通过PCR方法验证目的基因是否整合到芽孢杆菌的基因组上。将构建好的带有目的基因表达盒的转化子在SR发酵培养基中，37℃条件下进行发酵培养3-4天，测定胞外上清中木聚糖酶的活性。利用DNS法对发酵上清中的木聚糖酶活力和含量进行测定，其表达量为20mg/L。

实施例5木聚糖酶XynSc8酶学特性研究

5.1温度对酶活力的影响

最适反应温度的测定：在不同温度(4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃)，pH6.0的条件下测定重组酶纯化酶的活性，将最高酶活力设定为100％(图3a)。热稳定性的测定：将重组酶纯化酶液在30℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃、80℃，pH6.0下保温0.5，1h和2h，各自测定残余酶活力，以未保温的酶活力为100％(图3b)。经测定该木聚糖酶最适反应温度为50℃，并在低于50℃保持稳定。同时该酶具有明显的耐冷特性，在4℃条件下依然具有约20％的催化活性。

5.2pH对酶活力的影响

最适反应pH的测定：在不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)，50℃下测定重组酶纯化酶液的活性，将最高活力设定为100％(图3c)。pH稳定性的测定：将重组酶纯化酶液在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0下，4℃保持12h，后各自测定其残余活力，以pH7.0的酶活力为100％(图3d)。经测定该木聚糖酶最适反应pH为6.0，并在pH 6.0-11.0保持稳定。

实施例6木聚糖酶XynSc8在不同来源木聚糖和麸皮转化方面的应用分析

以山毛榉木聚糖、玉米芯木聚糖等不同来源的木聚糖和小麦麸皮为底物，该木聚糖酶均具有良好的催化能力，其中在玉米芯木聚糖为底物时比活力高达5526.5U/mg，同时能够将山毛榉木聚糖转化为聚合度≥3的低聚木聚糖，能够将玉米芯木聚糖转化为木三糖(图4)。在以1％小麦麸皮为底物，添加5×10⁶U/kg的本专利所述的木聚糖酶XynSc8和孢囊杆菌来源的木聚糖酶(ATB38668.1)进行对比分析，分别在常温(30℃)和低温(4℃)条件下反应12h，发现本专利所述的木聚糖酶XynSc8处理能够将小麦麸皮中低聚木聚寡糖的含量分别提升了3.6％和5％，而孢囊杆菌来源的木聚糖酶(ATB38668.1)在12h的反应时间内并没有检测到木聚寡糖的产生。该结果表明本发明所涉及的木聚糖在低聚木聚糖转化和饲料行业具有重要的应用价值。

实施例7木聚糖酶XynSc8在食品烘焙中的应用分析

利用商品小麦粉建立面包烘焙实验，配方包括小麦面粉(100g),氯化钠(1.5g),酵母(1.8g),水(40ml),脱脂奶粉(4g),和糖(6g),同时补充0.05-0.4mg/kg的木聚糖酶，并以宁夏夏盛实业集团有限公司来源的商品化木聚糖酶SBE-02X为对照，评估木聚糖在面包烘焙方面的应用潜力。结果表明本专利所涉及的木聚糖在0.05-0.2mg/kg添加剂量下，可以现在提高面包的体积和品质，延长面包的货架，对照组的硬度和咀嚼度随着存储时间的延长显著上升，而加酶处理组显著延迟；对照组的弹性和粘结性着存储时间的延长显著下降，而加酶处理组在短期存储是显著提高了弹性和粘结性(表1)，其效果与商品化的木聚糖相比(商业化木聚糖酶的推荐剂量10-30mg/kg制剂)表现出良好的性能(图5)。该结果表明本发明所涉及的木聚糖在食品烘焙行业具有重要的应用价值。

表1不同木聚糖处理的面包在不同存储时间内的质构分析.

小写字母表示横向比较不同处理与对照组之间的差异分析；大写字母表示纵向比较不同处理组之间的差异分析。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种耐冷木聚糖酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> 纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)

<400> 1

atgaatcgga attcgctgcg gtttctctcg gtgggtctgc tcttggcggc cgtcgcgtgc 60

ggggatgacg acggtggctc cggcggtgcc gggagcgtgt cctcgggcac gggcggggca 120

ggggggaccg gcggctctgc cgatggcgga ggcgggagcg ggagcgggag cggggctgtc 180

gatacggggg agtaccgcaa cctcttcgtc gagaacgggc gcacgcagga cgaggtgaat 240

gcgaagatcg cggccgcctg ggaccatctc ttccagggcg atccggccga ggagtccctc 300

tatttcgagc aggaggagaa cgacaacggc ccgctcgcgc agatccgcga catcgcgagc 360

gaggacgtgc gctcggaggg catgagctac ggcatgatga tcgccgtcca gacagaccat 420

caggcggagt tcaacgcgct ctggaactgg gcgaagacct acatgttcca cgccgacgag 480

acgcacccgg cgtacggata cttctcgtgg tcgatgaatg tcgacggcac cccgctggac 540

gagatgccgg cgccggatgg cgaggagtac ttcgcgacgg cgctctattt cgcgtcgggg 600

cgctggggca acggtgaggg catctacaat taccgggagg aagcggatcg cttgctcgac 660

ctgatgaaga accggccgga cgtcacgggg gaggtcttcg ccaacgggga gacgcgcacg 720

acgaccgggt cgacgctctt caacacggag aaccatcaga tccgcttcac gccggacacg 780

gggaacttcg agaccaacgg ggaccacacc gatccgtcgt atcacctgcc ggccttctac 840

gagatctggg ccaagtacgg tccggaggcg gaccgcgcgt tctggagcga ggcggccgag 900

gtgagccgcg attacttcca cctcgcggct cacccggaga cggggctcac gcccgattac 960

gcgaatttcg acggcacgcc caaggcggcg tcctggaagc ccgagtccgt ggacttccgc 1020

ttcgacgcgt ggcgcacggc gatgaactgg tccgtcgact gggcgtggtg ggcgaaggat 1080

cagcgccagc aggagctcag cgatcggatc caggcgttct tcgaggggca aggcgcgggg 1140

tacgggaacc agttctccct cgacggcgag cagctgggcg ccgaccactc ctcggggctc 1200

gtcgccatga acgcggtcgc gagcctggcg gccaccgacc agcggtctgc cgatttcgtc 1260

caggcgctct gggacctcga tcccccgagc gggcagtacc gctactacga cggcatgctg 1320

tatttcatgg cgctgctgca cgtgagcggc cagttccagg cgtacgcgcc gcagtga 1377

<210> 2

<211> 458

<212> PRT

<213> 纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)

<400> 2

Met Asn Arg Asn Ser Leu Arg Phe Leu Ser Val Gly Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Ala Cys Gly Asp Asp Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser

20 25 30

Val Ser Ser Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ser Ala Asp

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Val Asp Thr Gly Glu

50 55 60

Tyr Arg Asn Leu Phe Val Glu Asn Gly Arg Thr Gln Asp Glu Val Asn

65 70 75 80

Ala Lys Ile Ala Ala Ala Trp Asp His Leu Phe Gln Gly Asp Pro Ala

85 90 95

Glu Glu Ser Leu Tyr Phe Glu Gln Glu Glu Asn Asp Asn Gly Pro Leu

100 105 110

Ala Gln Ile Arg Asp Ile Ala Ser Glu Asp Val Arg Ser Glu Gly Met

115 120 125

Ser Tyr Gly Met Met Ile Ala Val Gln Thr Asp His Gln Ala Glu Phe

130 135 140

Asn Ala Leu Trp Asn Trp Ala Lys Thr Tyr Met Phe His Ala Asp Glu

145 150 155 160

Thr His Pro Ala Tyr Gly Tyr Phe Ser Trp Ser Met Asn Val Asp Gly

165 170 175

Thr Pro Leu Asp Glu Met Pro Ala Pro Asp Gly Glu Glu Tyr Phe Ala

180 185 190

Thr Ala Leu Tyr Phe Ala Ser Gly Arg Trp Gly Asn Gly Glu Gly Ile

195 200 205

Tyr Asn Tyr Arg Glu Glu Ala Asp Arg Leu Leu Asp Leu Met Lys Asn

210 215 220

Arg Pro Asp Val Thr Gly Glu Val Phe Ala Asn Gly Glu Thr Arg Thr

225 230 235 240

Thr Thr Gly Ser Thr Leu Phe Asn Thr Glu Asn His Gln Ile Arg Phe

245 250 255

Thr Pro Asp Thr Gly Asn Phe Glu Thr Asn Gly Asp His Thr Asp Pro

260 265 270

Ser Tyr His Leu Pro Ala Phe Tyr Glu Ile Trp Ala Lys Tyr Gly Pro

275 280 285

Glu Ala Asp Arg Ala Phe Trp Ser Glu Ala Ala Glu Val Ser Arg Asp

290 295 300

Tyr Phe His Leu Ala Ala His Pro Glu Thr Gly Leu Thr Pro Asp Tyr

305 310 315 320

Ala Asn Phe Asp Gly Thr Pro Lys Ala Ala Ser Trp Lys Pro Glu Ser

325 330 335

Val Asp Phe Arg Phe Asp Ala Trp Arg Thr Ala Met Asn Trp Ser Val

340 345 350

Asp Trp Ala Trp Trp Ala Lys Asp Gln Arg Gln Gln Glu Leu Ser Asp

355 360 365

Arg Ile Gln Ala Phe Phe Glu Gly Gln Gly Ala Gly Tyr Gly Asn Gln

370 375 380

Phe Ser Leu Asp Gly Glu Gln Leu Gly Ala Asp His Ser Ser Gly Leu

385 390 395 400

Val Ala Met Asn Ala Val Ala Ser Leu Ala Ala Thr Asp Gln Arg Ser

405 410 415

Ala Asp Phe Val Gln Ala Leu Trp Asp Leu Asp Pro Pro Ser Gly Gln

420 425 430

Tyr Arg Tyr Tyr Asp Gly Met Leu Tyr Phe Met Ala Leu Leu His Val

435 440 445

Ser Gly Gln Phe Gln Ala Tyr Ala Pro Gln

450 455

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)

<400> 3

Met Asn Arg Asn Ser Leu Arg Phe Leu Ser Val Gly Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Ala

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgccatatga tgaatcggaa ttcgctgcg 29

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgctcgagt caatgatgat gatgatgatg ctgcggcgcg tacgc 45

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgctctagaa tgaatcggaa ttcgctgcg 29

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgctcgagt caatgatgat gatgatgatg ctgcggcgcg tacgc 45

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtccagactg tccgctgact gtttgtagag ca 32

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgaaaaaag cccgctcaat gatgatgatg atg 33

Claims

1.一种木聚糖酶基因，其特征在于该基因全长核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的木聚糖酶基因编码的具有耐冷特性的木聚糖酶，其特征在于氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

3.含权利要求1所述木聚糖酶基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒是将权利要求1所述木聚糖酶基因克隆到质粒pET29a或pEFαA中所得。

5.含权利要求1所述的木聚糖酶基因或权利要求3或4所述的重组质粒的重组微生物。

6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于以大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌为宿主菌。

7.权利要求1所述木聚糖酶基因在木聚糖低温转化、食品或饲料领域的基因工程应用，所述的低温为4-10℃。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于权利要求1所述木聚糖酶基因在不同来源木聚糖或麸皮的低温转化、面包烘焙中的基因工程应用。

9.权利要求2所述木聚糖酶在木聚糖低温转化、食品或饲料领域的生产应用，所述的低温为4-10℃。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于权利要求2所述木聚糖酶在不同来源木聚糖或麸皮的低温转化、面包烘焙中的应用。