CN105754971B

CN105754971B - 一种具有纤维素酶活性的短肽及其应用

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Publication number: CN105754971B
Application number: CN201610153440.XA
Authority: CN
Inventors: 李刚; 刘秋云; 肖月; 张颖
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2016-03-17
Publication date: 2019-06-14
Anticipated expiration: 2036-03-17
Also published as: CN105754971A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种具有纤维素酶活性的短肽及其应用。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述多肽能利用稻草作为唯一碳源供自身生长，说明其具有较强的分解纤维素的能力，表现出更强的降解稻草的能力和酶学活性。该多肽对金属离子和表面活性剂的耐受性也大大提高，其耐高温和表面活性剂的特性可作为一种新的酶源用于纺织或洗涤剂领域，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种具有纤维素酶活性的短肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种具有纤维素酶活性的短肽及其应用。

背景技术

天然纤维素原料是地球上最丰富的可再生的有机物质。在全世界通过光合作用产生的植物每年约高达10000亿吨，其中只有11%用作农作物产品、饲草、造纸和建筑原料，其利用率低主要是由于纤维素具有水不溶性的高结晶结构，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难。早在1850年，Mitscherlich就已观察到微生物分解纤维素的现象。1912年，Pringsheim开始进行纤维素微生物的酶学研究。纤维素结构的复杂性，决定了任何一种单一的酶都难以高效地水解它，能水解天然纤维素的纤维素酶都是一个复杂的多酶体系。按底物特异性可将纤维素酶分成：外切β-1,4葡聚糖酶，内切β-1,4葡聚糖酶和β-1,4葡萄糖苷酶。

纤维素酶用途广泛，目前已用在食品，农业，再生能源等行业。纤维素酶也属于糖基水解酶类，它与蛋白酶，脂肪酶组成目前的三大工业酶，其中洗涤剂用酶占了工业酶的32%。已报道富含内切葡聚糖酶的纤维素酶预混物最适合在生物抛光中增强织物观感、触感和色泽，而无需任何化学涂层。纤维素酶能去除这些微纤维，恢复衣服原有的平整和色泽，还有助于软化衣物，并去除藏匿在微纤维内部的尘土、污垢等，使清洁更加彻底。将纤维素酶与蛋白酶和脂肪酶一起作为洗涤剂添加酶，是纺织和洗涤剂近年来的创新方式。人们正在尽力寻找具有洗涤剂添加酶应用潜力的碱性纤维素酶，这些酶能在更多的传统洗涤成分中有效去除纤维内部的污垢。此外，纤维素酶作为一种饲料添加剂，能提高粗饲料的转化率、改善动物的生产性能，在畜牧业中有着广阔的研究和应用前景。研究发现，在青贮饲料中加入纤维素酶能发酵纤维素分解产生戊糖、乳酸和少量乙酸，抑制腐败菌生长，提高饲料的贮藏期。此外，将外源性纤维素酶添加到反刍动物饲料中能与半纤维素酶、果胶酶和葡聚糖酶等瘤胃微生物产生的内源酶协同作用改善瘤胃内环境。家禽等动物胃液中缺乏消化粗纤维的酶类，在日粮中添加纤维素酶帮助其消化粗纤维饲料，不仅可以提高饲料的转化率，还利于缓解当前人畜争粮的问题。

虽然目前来源于细菌、真菌或动植物的纤维素酶在食品，医药，洗涤或能源行业的应用有限，但是随着对纤维素酶研究的不断深入，以及结构生物学、生物信息学、基因工程和分子生物学等多学科交叉研究，需要筛选到更多适合工业化生产的性能优良的纤维素酶。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有纤维素酶的局限和不足，提供一种具有纤维素酶活性的多肽。

本发明的第二个目的是提供编码所述多肽的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供所述多肽的制备方法。

本发明的第四个目的是提供所述多肽的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种具有纤维素酶活性的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。

发明人研究发现，突变野生型的粗糙脉孢霉纤维素酶基因后，其新编码的蛋白多肽有些仍具有纤维素酶活性（即内切葡聚糖酶的特点），且新的纤维素酶的使用范围更广。

本发明还提供所述具有纤维素酶活性的多肽的核苷酸序列，序列如：

（1）SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或者

（2）与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述序列具有80%以上同源性，且编码与SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所述多肽相同功能的核苷酸序列。

需要说明的是，本发明所述SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的多肽可以人工合成，也可以通过生物技术的方法合成，但人工合成的成本较高，可以先通过基因工程的方法合成。

因此，这里，本发明还保护含有具有纤维素酶活性的多肽的核苷酸序列的重组表达载体；所述表达载体为本领域常用的表达载体，不做严格控制，如pET-32a载体等。

本发明还提供含有所述重组表达载体的重组菌或重组细胞，所述重组菌或重组细胞为原核细胞或真核细胞，原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或分支杆菌；真核细胞包括酵母细胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各种动植物细胞。

本发明还提供SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的多肽制备方法，其中，SEQ ID NO：1是将SEQ ID NO：5所述氨基酸序列的第4位和第9位的异亮氨酸均突变为亮氨酸获得；SEQ IDNO：2是将SEQ ID NO：5所述氨基酸序列的第4位和第9位的异亮氨酸，第6位的缬氨酸均突变为亮氨酸获得。

本发明所述SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的多肽相比于野生型的纤维素酶，表现出更好的耐碱耐高温及重金属和有机溶剂的能力，因此，本发明还提供所述多肽在降解纤维素方面的应用；还提供所述多肽作为洗涤剂添加酶方面的应用；还提供所述多肽作为饲料添加剂方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种具有纤维素酶活性的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示，所述多肽能利用稻草作为唯一碳源供自身生长，说明其具有较强的分解纤维素的能力，该多肽对金属离子和表面活性剂的耐受性也大大提高，其耐高温和表面活性剂的特性可作为一种新的酶源用于纺织或洗涤剂领域，具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1为实施例2中突变产物电转大肠杆菌后，在羧甲基纤维素钠（CMC）平板上的生长情况。

图2为实施例3突变产物电转酿酒酵母后，在稻草平板上的生长情况。

图3为根据tox-1基因及其突变产物合成的多肽作用于不同底物的酶活，以纤维二糖为底物时的酶活作为100%，***P＜0.001表示与TOX-1组相比。

图4为温度对三条多肽降解纤维二糖底物的活性和稳定性的影响。

图5为三条多肽在不同温度条件（4°C，30°C，50°C，60°C，70°C）下处理6 h后，残余的对纤维二糖底物的活性的情况，**P＜0.01，***P＜0.001表示与 TOX-1组相比。

图6为pH对三条多肽降解纤维二糖底物的活性和稳定性的影响。

图7为三条多肽在不同碱性条件（pH 4.0-8.0）下处理6 h后，残余的对纤维二糖底物的酶活的情况，**P＜0.01，***P＜0.001表示与TOX-1组相比。

图8是对比例1所述多肽和TOX-1的酶活比较，Asp替换即对比例1所述多。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

粗糙脉孢霉基因序列如登录号：KT372214.1所示，其编码的氨基酸序列如登录号：ALA65344.1所示（SEQ ID NO：5）。

实施例1 突变产物的获得

是将SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列进行突变，突变1（TOX-v2）是将SEQ ID NO：5所示氨基酸的第4位异亮氨酸和第9位异亮氨酸突变为亮氨酸获得，突变2（TOX-v3）是将SEQID NO：5所示氨基酸的第4位和第9位的异亮氨酸，第6位的缬氨酸均突变为亮氨酸获得。

设计三条引物，引物P1为TOX-v2的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物P2为TOX-v3的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，引物P3为下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。将两对引物（P1和P3，P2和P3）以粗糙脉孢霉基因（登录号：KT372214.1）为模板，用Takara的PrimeSTAR酶在28℃的退火温度下扩增8个循环，在55℃退火温度下扩增28个循环，扩增结束后，用琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。

实施例2突变产物在大肠杆菌中的功能研究

将2倍体积的无水乙醇和1/20体积的3M 醋酸钠加入到PCR产物体系中，混匀后-20℃沉淀1 h，再于4℃，12,000 rpm离心10 min，用4℃预冷的70%乙醇洗涤一次，4℃，12,000rpm离心10 min后，弃上清，风干后，加入10μ

l 65℃预冷的去离子水溶解，将实施例1获得的PCR产物纯化后直接电击MG1655感受态，以未转任何DNA的感受态为负对照，活化后涂CMC培养基：0.5% CMC，2% Agar，0.67%YNB（含硫酸铵）。如果其突变产物成功整合会利用CMC生长，拍照记录平板的菌落生长情况，菌落PCR鉴定基因整合情况，送出进行测序，F1和CK测序失败，F2和F3测序结果表明氨基酸替换成功，以上结果证明突变PCR产物直接电击MG1655后，能利用CMC为唯一碳源生长，测序结果表明突变成功。

实施例3 突变产物在酵母菌中的功能研究

为了增强突变产物的蛋白表达，通过两次不对称PCR，将强启动子GPD序列分别构建到突变产物序列中，首先，引物P4，P5分别与P6以1：5终浓度配对，以SEQ ID NO：5所示粗糙脉孢霉基因为模板，用Takara的PrimeSTAR酶与实施例1相同的条件扩增，PCR产物作为第二次扩增的下游引物与P7以1： 5终浓度配对，P4~P7的核苷酸序列如SEQ ID NO.9~SEQ IDNO.12所示。以酿酒酵母INVSc1为模板，PCR体系中含 0.31 U PrimerSTAR DNA聚合酶，0.94U exTaq 聚合酶以及终浓度为0.25 % (v/v) 去离子甲酰胺。PCR反应条件为：前8个循环：93˚C 30 s，16˚C 30 s，63˚C 80 s；后30个循环：93˚C 30 s，30˚C 30 s 和63˚C 80 s。扩增产物纯化后直接电击野生型酿酒酵母（GIM2.207）。转化子涂1%CMC培养基（包括0.5% CMC，2% Agar和0.67% YNB（含硫酸铵））。菌落PCR鉴定阳性克隆，将阳性菌接种到YPD培养基（1% 酵母提取物，2 % 胰蛋白胨，2 %葡萄糖，50μ

g / ml氨苄），细胞培养至OD600 为1.5时，收集相同湿重的细胞用无菌水洗涤一次，接种相同重量的细胞于稻草培养基上（0.5 % 液氮研磨后的稻草，2 % 琼脂，50μ

g/ml 氨苄）30 ˚C培养5 d后观察菌落生长情况。

实施例4 三条多肽最适底物的研究

每条多肽浓度均为100μ

g/ml，TOX-1（SEQ ID NO：5所示序列的多肽）用50%乙醇溶解，TOX-v2和TOX-v3用30%乙醇溶解，在后续的酶活测定过程中，TOX-1以50%的乙醇为阴性对照，TOX-v2和TOX-v3以30%乙醇为阴性对照。酶活测定条件：用50 mM的PBS溶液作为反应缓冲液（pH 7.4），反应体系共200μl，其中含0.1% (m/v)底物的PBS 190μl，酶液10μl (100μg/ml)，反应在50℃进行15 min后，加入等体积（200μl）的DNS终止，并煮沸5 min，各取200μl测OD₅₄₀，反应均平行三组，用Two-way ANOVA分析数据的统计学差异。

在最适底物的研究中，分别以CMC，琼脂，可溶淀粉这三种多糖和纤维二糖，麦芽糖，蔗糖这三种寡糖测多肽的最适底物，以没添加多肽的溶液为阴性对照，吸光值最高的酶活为100%，算出各自的相对酶活。得到三条多肽的最适底物均为纤维二糖，所以后续酶活的测定均以纤维二糖为底物（图3）。

实施例5 温度对三条多肽分解纤维二糖活性和稳定性的影响

以SEQ ID NO：5所述氨基酸序列的多肽为阳性对照，选取4℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃和80℃这7个温度条件测突变产物降解纤维二糖的最适温度，以最高值的酶活为100%，其余为相对酶活，平行三组，得到三条多肽的最适反应温度为70℃。进一步缩小范围，在70°前后每两度一个梯度确定具体最适温度，根据测得的结果，TOX-1的最适温度为64℃，TOX-v2的最适温度为72℃，TOX-v3的最适温度为68℃（图4）。

在温度稳定性的研究中，将三条多肽分别在4℃、30℃、50℃、60℃、70℃这五个温度条件下处理6小时后，以处理前的多肽溶液酶活为100%，测各自剩余酶活，TOX-1的残余酶活为23%，TOX-v2和TOX-v3仍保留53%和60%的残余酶活，与TOX-1差异显著（P<0.001）（图5）。

实施例6 pH对三条多肽分解纤维二糖活性和稳定性的影响

选取4，5，6，7，8，9，10这7个pH范围，每个样品平行三组，以酶活最高值为100%，算出相对酶活，并在pH 6~7前后以0.2个pH为一个梯度，得到各自的最适pH，TOX-1的最适pH为6.4，TOX-v2的为6.8，TOX-v3的为7.2（图6）。

在pH稳定性的研究中，将三条多肽分别在pH 4、5、6、7、8五种条件下处理6小时后，以处理前的酶活为100%，测各自剩余酶活，三条多肽在pH8的缓冲液中处理6小时，TOX-1的残余酶活为20%，TOX-v2和TOX-v3的残余酶活分别为30%和45%，与TOX-1的残余酶活有统计学差异（P<0.001）（图7）。

实施例7 部分金属离子和有机溶剂对三条多肽分解纤维二糖活性的影响

从表1可以看出，高浓度（10 mM）金属离子对三条多肽降解纤维二糖底物活性的影响截然不同。Na⁺对TOX-1的酶活几乎没有影响，能轻微提高TOX-v2和TOX-v3的酶活，说明氨基酸替换可提高多肽的耐盐性，Zn²⁺与Na⁺的作用相反。Fe²⁺对三条多肽的酶活都有提高作用，但影响程度不同，TOX-1的酶活提高了约2.2倍，TOX-v2的酶活仅提高了1.2倍，两者具有显著性差异（P<0.001）。Ca²⁺对三条多肽的酶活都有抑制作用，典型的表面活性剂Tritonx-100和Tween-80能提高三条多肽的酶活，且对氨基酸替换后的多肽酶活提高作用更明显。DMSO对TOX-1和TOX-v3的酶活有轻微抑制作用，但却能提高TOX-v2的酶活1.13倍，与TOX-1的酶活相比差异明显（P<0.001）。

对比例1

实验方法同实施例4，唯一不同的是，序列中的两个异亮氨酸用天冬氨酸替换，该对比例所用的多肽的氨基酸序列如下：

MMLDYVAEDCLSVWLWDGLGDKKKGYAMLGWARPLILGCGSKNQ。

结果表明：与阴性对照组相比，天冬氨酸替换后，降解CMC底物的活性无显著性差异，而阳性对照组（TOX-1）具有明显的纤维素降解酶活性（P<0.001）（图8）。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种具有纤维素酶活性的短肽及其应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 44

<212> PRT

<213> TOX-v2氨基酸序列

<400> 1

Met Met Leu Leu Tyr Val Ala Glu Leu Cys Leu Ser Val Trp Leu Trp

1 5 10 15

Asp Gly Leu Gly Asp Lys Lys Lys Gly Tyr Ala Met Leu Gly Trp Ala

20 25 30

Arg Pro Leu Ile Leu Gly Cys Gly Ser Lys Asn Gln

35 40

<210> 2

<211> 44

<212> PRT

<213> TOX-v3氨基酸序列

<400> 2

Met Met Leu Leu Tyr Leu Ala Glu Leu Cys Leu Ser Val Trp Leu Trp

1 5 10 15

Asp Gly Leu Gly Asp Lys Lys Lys Gly Tyr Ala Met Leu Gly Trp Ala

20 25 30

Arg Pro Leu Ile Leu Gly Cys Gly Ser Lys Asn Gln

35 40

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> 编码TOX-v2的核苷酸序列

<400> 3

atgatgttac tgtacgtagc tgagctgtgt ctgtctgtct ggctttggga tgggttagga 60

gacaagaaaa aaggctatgc tatgctaggc tgggctaggc cacttattct aggttgtgga 120

agcaaaaatc aataa 135

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 编码TOX-v3的核苷酸序列

<400> 4

atgatgttac tgtacctggc tgagctgtgt ctgtctgtct ggctttggga tgggttagga 60

gacaagaaaa aaggctatgc tatgctaggc tgggctaggc cacttattct aggttgtgga 120

agcaaaaatc aataa 135

<210> 5

<211> 44

<212> PRT

<213> TOX-1氨基酸序列

<400> 5

Met Met Leu Ile Tyr Val Ala Glu Ile Cys Leu Ser Val Trp Leu Trp

1 5 10 15

Asp Gly Leu Gly Asp Lys Lys Lys Gly Tyr Ala Met Leu Gly Trp Ala

20 25 30

Arg Pro Leu Ile Leu Gly Cys Gly Ser Lys Asn Gln

35 40

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物P1序列

<400> 6

tggcggaata tcagcggcgt atgatgttaa tttacgtagc tgag 44

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 引物P2序列

<400> 7

ggcggaatat cagcggcgta tgatgttact gtacgtagct gagctgtgtc tgtctgtc 58

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物P3序列

<400> 8

tggcggaata tcagcggcgt atgatgttac tgtacctggc tgagctgtgt ctgtctgtc 59

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物P4序列

<400> 9

ccgccaacag tcaatcgaat tatcagaagc cattattgat ttttgcttcc acaacctag 59

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> 引物P5序列

<400> 10

gttttaaaac accaagaact tagtttcgaa tgatgttaat ttacgtagct gag 53

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> 引物P6序列

<400> 11

gttttaaaac accaagaact tagtttcgaa tgatgttact gtacgtagct g 51

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 引物P7序列

<400> 12

gttttaaaac accaagaact tagtttcgaa tgatgttact gtacctggct g 51

<210> 13

<211> 44

<212> PRT

<213> 对比例1所述多肽的氨基酸序列

<400> 13

Met Met Leu Asp Tyr Val Ala Glu Asp Cys Leu Ser Val Trp Leu Trp

1 5 10 15

Asp Gly Leu Gly Asp Lys Lys Lys Gly Tyr Ala Met Leu Gly Trp Ala

20 25 30

Arg Pro Leu Ile Leu Gly Cys Gly Ser Lys Asn Gln

35 40

Claims

1.一种具有纤维素酶活性的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2. 编码权利要求1所述具有纤维素酶活性的多肽的核苷酸序列，其特征在于，序列如：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

3.含有权利要求2所述核苷酸序列的重组表达载体。

4.含有权利要求3所述重组表达载体的重组菌或重组细胞。

5. 权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于，SEQ ID NO：1是将SEQ ID NO：5所述氨基酸序列的第4位和第9位的异亮氨酸均突变为亮氨酸获得；SEQ ID NO：2是将SEQ IDNO：5所述氨基酸序列的第4位和第9位的异亮氨酸，第6位的缬氨酸均突变为亮氨酸获得。

6.权利要求1所述多肽在降解纤维素方面的应用。

7.权利要求1所述多肽作为洗涤剂添加酶方面的应用。

8.权利要求1所述多肽作为饲料添加剂方面的应用。