MX2015005424A - Beta-glucosidasa de neurospora crassa. - Google Patents

Abstract

Las presentes composiciones y métodos se refieren a una beta-glucosidasa de Neurospora crassa, polinucleótidos que codifican la beta-glucosidasa, y métodos para la preparación y uso de estas. Las formulaciones que contienen la betaglucosidasa son adecuadas para el uso en la hidrólisis de sustratos de biomasa.

Description

BETA-GLUCOSIDASA DE NEUROSPORA CRASSA CAMPO DE LA INVENCIÓN Las presentes composiciones y métodos se refieren a un polipéptido de beta-glucosidasa que se obtiene a partir de polinucleótidos de Neurospora crassa que codifican el polipéptido de beta-glucosidasa, y métodos para la preparación y uso de estos. Las formulaciones y composiciones que comprenden el polipéptido de beta-glucosidasa son útiles para degradar o hidrolizar biomasa lignocelulósica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La celulosa y la hemicelulosa son los materiales vegetales más abundantes que produce la fotosíntesis. Se pueden degradar y usar como fuente de energía por parte de microorganismos numerosos microorganismos (por ejemplo, bacterias, levaduras y hongos) que producen enzimas extracelulares capaces de hidrolizar los sustratos poliméricos a azúcares monoméricos (Aro et al . , (2001) J. Biol. Chem., 276: 24309-24314). Ya que nos acercamos a los límites de recursos renovables, el potencial de la celulosa para convertirse un recurso de energía renovable importante es enorme (Krishna et al . , (2001) Bioresource Tech., 77: 193-196) El uso eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos es un enfoque para superar la escasez de alimentos, piensos y combustibles (Ohmiya et al . , (1997) Ref . 255191 Biotechnol. Gen. Engineer Rev., 14: 365-414).

Las celulasas son enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta-1,4-glucana o D-glucosídicos), lo que da lugar a la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos y similares. Tradicionalmente, las celulasas se han dividido en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) (“EG”), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) (“CBH”) y beta-glucosidasas ([beta]-D-glucósido glucohidrolasa; EC 3.2.1.21) (“BG”) (Knowles et al.,(1987) TIBTECH 5: 255-261; y Schulein, (1988) métodos Enzymol., 160: 234-243). Las endoglucanasas actúan, principalmente, en las partes amorfas de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas también son capaces de degradar la celulosa cristalina (Nevalainen y Penttila (1995) Mycota, 303-319). Así, se requiere la presencia de un celobiohidrolasa en un sistema de celulasa para la solubilización eficiente de la celulosa cristalina (Suurnakki et al., (2000) Cellulose, 7: 189-209). Las beta-glucosidasa actúan para liberar las unidades de D-glucosa de la celobiosa, celooligosacáridos, y otros glucósidos (Freer, J. (1993) Biol. Chem., 268: 9337-9342).

Se sabe que un gran número de bacterias, levaduras y hongos produce celulasas. Algunos hongos producen un sistema de celulasa completa capaz de degradar formas cristalinas de celulosa. Estos hongos pueden fermentarse para producir juegos de celulasas o mezclas de celulasa. Los mismos hongos y otros hongos pueden diseñarse, además, mediante ingeniería genética para producir o sobreproducir ciertas celulasas, lo que resulta en mezclas de celulasas que comprenden diferentes tipos o proporciones de celulasas. Los hongos pueden diseñarse, además, de tal manera que produzcan diversas celulasas en grandes cantidades a través de la fermentación. Los hongos filamentosos desempeñan un papel especial, ya que muchas levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, carecen de la capacidad para hidrolizar la celulosa en su estado natural (ver, por ejemplo, Wood et al . , (1988) Methods in Enzymology, 160: 87-116).

Las clasificaciones de la celulasa fúngica de CBH, EG y BG pueden ampliarse para incluir múltiples componentes dentro de cada clasificación. Por ejemplo, se han aislado múltiples CBH, EG y BG a partir de una variedad de fuentes fúngicas que incluyen Trichoderma reesei (mencionada además como Hypocrea jecorina) , que contiene genes conocidos para CBHs, es decir, CBH I (“CBH1”) y CBH II (“CBH2”), al menos ocho EGs, es decir, EG I, EG II, EG III, EGIV, EGV, EGVI, EGVII y EGVIII, y al menos cinco BGs, es decir, BG1, BG2, BG3, BG4, BG5 y BG7 (Foreman et al . (2003), J. Biol. Chem.278(34):31988-31997). EGIV, EGVI y EGVIII también tienen actividad xiloglucanasa.

Para convertir eficientemente la celulosa cristalina en glucosa se requiere el sistema de celulasas completo que comprende los componentes de cada una de las clasificaciones de CBH, EG y BG, con componentes aislados menos eficaces en la hidrólisis de la celulosa cristalina (Filho et al . , ( 1996 ) Can. J. Microbiol., 42:1-5). Las endo-1,4-beta-glucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de celulosa en celooligosacáridos (celobiosa como un producto principal), mientras que las beta-glucosidasas (BGL) convierten los oligosacáridos en glucosa. Una relación sinérgica se ha observado entre los componentes de celulasa de distintas clasificaciones. Particularmente, las celulasas de tipo EG y las celulasas de tipo CBH interactúan sinérgicamente para degradar eficientemente la celulosa. Las beta-glucosidasas sirven para la función importante de liberar glucosa de los celooligosacáridos tales como la celobiosa, que es tóxica para los microorganismos, tales como, por ejemplo, levaduras, que se usan para fermentar los azúcares en etanol; y que es, además, inhibidora de las actividades de endoglucanasas y celobiohidrolasas, lo que las hace ineficaces para la hidrólisis adicional de la celulosa cristalina.

En vista de la función importante que juegan las beta-glucosidasas en la degradación o conversión de materiales celulósicos, el descubrimiento, la caracterización, la preparación, y la aplicación de homólogos de la beta-glucosidasa con eficacia o capacidad mejorada para hidrolizar materia prima celulósica es deseable y ventajoso.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Beta-glucosidasa obtenible de Neurospora crassa y su uso La hidrólisis enzimática de la celulosa sigue siendo una de las principales etapas limitantes de la producción biológica a partir de materia prima de biomasa lignocelulósica de un material, que puede ser azúcares celulósicos y/o productos corriente abajo. Las beta-glucosidasas juegan una función importante para catalizar la última etapa de ese proceso, en donde se libera la glucosa a partir de la celobiosa inhibidora y, por lo tanto, su actividad y eficacia contribuyen directamente a la eficacia general de la conversión enzimática de la biomasa lignocelulósica, y por consiguiente al costo en el uso de la solución enzimática. En consecuencia, existe un gran interés por encontrar, producir y usar beta-glucosidasas nuevas y más eficaces.

Aunque se conoce una serie de beta-glucosidasas, que incluyen las beta-glucosidasas Bgll, Bgl3, Bgl5, Bgl7, etc., a partir de Trichoderma reesei o Hyprocrea j ecorina (Korotkova O.G. et al., (2009) Biochemistry 14 : 569-577 ; Chauve, M. et al., (2010) Biotechnol. Biofuels 3:3-3), las beta-glucosidasas a partir de Humicola grísea var. thermoidea (Nascimento, C.V. et al., (2010) J. Microbiol.48, 53-62); a partir de Sporotrichum pulverulentum, Deshpande V. et al., (1988) métodos Enzymol., 160:415-424); de Aspergillus oryzae (Fukuda T. et al . , (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 76:1027-1033, a partir de Talaromyces thermophilus CBS 236.58 (Nakkharat P. et al . , (2006) J. Biotechnol., 123:304-313), a partir de Talaromyces emersonii (Murray P., et al, (2004) Protein Expr. Purif.38:248-257), hasta el momento la beta-glucosidasa Bgll de Trichoderma reesei y la beta-glucosidasa SP188 de Aspergillus niger se consideran beta-glucosidasas de referencia contra las que se evalúan las actividades y el desempeño de otras beta-glucosidasas. Se ha informado que la Bgll de Trichoderma reesei tiene mayor actividad específica que la beta-glucosidasa SP188 de Aspergillus niger, pero la primera se secreta poco, mientras que la última es más sensible a la inhibición por glucosa (Chauve, M. et al . , (2010) Biotechnol. Biofuels, 3(1):3).

Un aspecto de las presentes composiciones y métodos es la aplicación o uso de una beta-glucosidasa muy activa aislada a partir de la especie fúngica Neurospora crassa, para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica. El genoma de Neurospora crassa, un hongo filamentoso, fue anotado en el 2003 por Galagan et al . , en Nature, 422 (6934):859-868 (2003). La secuencia descrita en la presente descripción de la sec. con núm. de ident.:2 se publicó por el Centro Nacional para la Información Bioteenológica, Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos (NCBI) con el núm. de acceso XP_956104, y se designó como un precursor de la beta-glucosidasa I de Neurospora crassa 0R74A. La enzima no se ha producido anteriormente en formas recombinantes, o se ha incluido en una composición enzimática útil para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica. La enzima o una composición que comprende la enzima no se ha aplicado a un sustrato de biomasa lignocelulósica en un método adecuado de hidrólisis enzimática del sustrato. Además, la beta-glucosidasa de Neurospora crassa no se ha expresado anteriormente en un microorganismo diseñado mediante ingeniería genética. Ni se ha coexpresado con uno o más genes de celulasa y/o uno o más genes de hemicelulasa . La expresión en microorganismos adecuados, que, a través de muchos años de desarrollo, se han convertido en productores muy eficaces y eficientes de proteínas y enzimas heterólogas, con la ayuda de un arsenal de herramientas genéticas, hace posible expresar estas útiles beta-glucosidasas en cantidades sustancialmente mayores que cuando se expresan de forma endógena en un microorganismo no diseñado mediante ingeniería genética, o cuando se expresan en plantas. Las enzimas clasificadas como beta-glucosidasas son diversas no solo en sus orígenes sino también en sus actividades sobre los sustratos lignocelulósicos, aunque la mayoría sino todas las beta-glucosidasas pueden catalizar la hidrólisis de la celobiosa bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, algunas son activas no solo sobre la celobiosa, sino también sobre oligosacáridos de cadenas más largas, mientras que otras son exclusivamente más activas solo sobre la celobiosa. Aun para aquellas beta-glucosidasas que tienen preferencias de sustrato similares, algunas tienen perfiles de cinética enzimática que las hacen más activas y eficientes catalíticamente, y en consecuencia más útiles en aplicaciones industriales en donde no puede permitirse que la hidrólisis catalizada enzimáticamente tenga lugar por más de unos pocos días como máximo. Además, no se ha diseñado un microorganismo fermentador o etanologénico capaz de convertir azúcares celulósicos obtenidos a partir de la hidrólisis enzimática de biomasa lignocelulósica para expresar una beta-glucosidasa de Neurospora crassa, tal como un polipéptido Nc3A en la presente descripción. La expresión de beta-glucosidasas en microorganismos etanologénicos proporciona una oportunidad importante para liberar, adicionalmente, D-glucosa a partir de la celobiosa restante que no se ha convertido completamente por la sacarificación enzimática, en donde la D-glucosa producida de esa manera puede consumirse o fermentarse inmediatamente justo a tiempo por el etanologénico.

Un aspecto de la presente composición y de los métodos pertenece a los polipéptidos de beta-glucosidasa de la familia 3 de glicosil hidrolasa derivados de Neurospora crassa, mencionados en la presente descripción como “Nc3A” o “polipéptidos Nc3A”, ácidos nucleicos que los codifican, composiciones que los comprenden, y métodos para producir y aplicar los polipéptidos de beta-glucosidasa y las composiciones que los comprenden para hidrolizar o convertir biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables, solubles. Tales azúcares fermentables pueden convertirse, después, en etanol celulósico, combustibles, y otros bioquímicos y productos útiles. En ciertas modalidades, los polipéptidos Nc3A de beta-glucosidasa tienen una actividad beta-glucosidasa superior y/o exhiben un aumento de la capacidad para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica dado en comparación con la Bgll de Trichderma reesei de referencia, la que se conoce como beta-glucosidasa de alta fidelidad. (Chauve, M. et al . , (2010) Biotechnol. Biofuels, 3(1):3).

En algunas modalidades, un polipéptido Nc3A se aplica junto con, o en presencia de, una o más de otras celulasas en una composición enzimática para hidrolizar o descomponer un sustrato de biomasa adecuado. Una o más de otras celulasas pueden ser, por ejemplo, otras beta-glucosidasas, celobiohidrolasas, y/o endoglucanasas. Por ejemplo, la composición enzimática puede comprender un polipéptido Nc3A, una celobiohidrolas , y una endoglucanasa. En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A se aplica junto con, o en presencia de, una o más hemicelulasas en una composición enzimática. Una o más hemicelulasas pueden ser, por ejemplo, xilanasas, beta-xilosidasas, y/o L-arabinofuranosidasas. En modalidades adicionales, el polipéptido Nc3A se aplica junto con, o en presencia de, una o más celulasas y una o más hemicelulasas en una composición enzimática. Por ejemplo, la composición enzimática comprende un polipéptido Nc3A, ninguna o una o dos de otras beta-glucosidasas, una o más celobiohidrolasas, una o más endoglucanasas; opcionalmente ninguna o una o más xilanasas, ninguna o una o más beta-xilosidasas, y ninguna o una o más L-arabinofuranosidasas.

En ciertas modalidades, un polipéptido Nc3A, o una composición que comprende el polipéptido Nc3A se aplica a un sustrato de biomasa lignocelulósica o a un sustrato de biomasa lignocelulósica parcialmente hidrolizado en presencia de un microbio etanologénico, que es capaz de metabolizar los azúcares solubles fermentables producidos por la hidrólisis enzimática del sustrato de biomasa lignocelulósica, y convertir los azúcares en etanol, bioquímicos u otros materiales útiles. Tal proceso puede ser un proceso estrictamente secuencial mediante el cual la etapa de hidrólisis se produce antes de la etapa de fermentación. El proceso puede ser, alternativamente, un proceso híbrido, de manera que la etapa de hidrólisis inicia primero pero durante un período se traslapa con la etapa de fermentación, que inicia más tarde. El proceso puede ser, en una alternativa adicional, un proceso simultáneo de hidrólisis y fermentación, de manera que la hidrólisis enzimática del sustrato de biomasa se produce mientras que los azúcares producidos a partir de la hidrólisis enzimática son fermentados por el etanologénico.

El polipéptido Nc3A, por ejemplo, puede ser una parte de una composición enzimática, que contribuye al proceso de hidrólisis enzimática y a la liberación de D-glucosa a partir de oligosacáridos tales como la celobiosa. En ciertas modalidades, el polipéptido Nc3A puede ser diseñado mediante ingeniería genética para expresarse en un etanologénico, de tal manera que el microbio etanologénico exprese y/o secrete la actividad beta-glucosidasa. Además, el polipéptido Nc3A puede ser una parte de la composición enzimática de hidrólisis mientras que al mismo tiempo también se expresa y/o secreta por el etanologen, de manera que los azúcares fermentables solubles producidos por la hidrólisis del sustrato de biomasa lignocelulósica que usa la composición enzimática de hidrólisis se etaboliza y/o se convierte en etanol por un microbio etanologénico que también expresa y/o secreta el polipéptido Nc3A. La composición enzimática de hidrólisis puede comprender el polipéptido Nc3A, además de una o más de otras celulasas y/o una o más hemicelulasas. El etanologen puede modificarse de manera que exprese el polipéptido Nc3A, una o más de otras celulasas, una o más de otras hemicelulasas, o una combinación de estas enzimas. Una o más de las beta-glucosidasas puede estar en la composición enzimática de hidrólisis y expresarse y/o secretarse por el etanologen. Por ejemplo, la hidrólisis del sustrato de biomasa lignocelulósica puede lograrse mediante el uso de una composición enzimática que comprende un polipéptido Nc3A, y los azúcares producidos a partir de la hidrólisis pueden fermentarse después con un microorganismo diseñado mediante ingeniería genética para expresar y/o secretar el polipéptido Nc3A. Alternativamente, una composición enzimática que comprende una primera beta-glucosidasa participa en la etapa de hidrólisis y una segunda beta-glucosidasa, que es diferente a la primera beta-glucosidasa, se expresa y/o se secreta por el etanologen. Por ejemplo, la hidrólisis del sustrato de biomasa lignocelulósica puede lograrse mediante el uso de una composición enzimática de hidrólisis que comprende Bgll de Trichoderma reesei, y los azúcares fermentables producidos a partir de la hidrólisis son fermentados por un microorganismo etanologénico que expresa y/o secreta un polipéptido Nc3A, o viceversa .

Como se demuestra en la presente descripción, los polipéptidos Nc3A y las composiciones que comprenden polipéptidos Nc3A tienen eficacia mejorada en condiciones bajo las que tiene lugar la sacarificación y degradación de la biomasa lignocelulósica. La eficacia mejorada de una composición enzimática que comprende un polipéptido Nc3A se demuestra cuando su desempeño al hidrolizar un sustrato de biomasa dado se compara al de una composición enzimática comparable de cualquier otra manera que comprende Bgll de Trichoderma reesei . En algunas modalidades, el sustrato de biomasa es celulosa dilatada tratada con ácido fosfórico (PASC), por ejemplo, un Avicel tratado previamente de esta manera se trata previamente mediante el uso de un protocolo de Walseth adaptado, TAPPI 1971, 35:228 y Wood, Biochem. J. 1971, 121:353-362. En otras modalidades, el sustrato de biomasa es una chala de maíz tratada previamente con amoniaco diluido, por ejemplo, uno descrito en solicitudes de patente internacionales publicadas núm.: W02006110891, W02006110899, W02006110900, W02006110901, y W02006110902; patentes de los Estados Unidos núms.7,998,713, 7,932,063.

En ciertas modalidades, la mejora o aumento de la actividad beta-glucosidasa se refleja en una mejora o aumento de la actividad celobiasa de los polipéptidos Nc3A, que se mide mediante el uso de celobiosa como sustrato, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 65°C (por ejemplo, aproximadamente 35°C a aproximadamente 60°C, aproximadamente 40°C a aproximadamente 55°C, aproximadamente 45°C a aproximadamente 55°C, aproximadamente 48°C a aproximadamente 52°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 55°C, etc.). En algunas modalidades, la mejora de la actividad beta-glucosidasa de un polipéptido Nc3A en comparación con la de Bgll de Trichoderma reesei, se observa cuando los polipéptidos de beta-glucosidasa se usan para hidrolizar una celulosa dilatada tratada con ácido fosfórico (PASC), por ejemplo, un Avicel tratado previamente de esta manera que se trata previamente mediante el uso de un protocolo de Walseth adaptado, TAPPI 1971, 35:228 y Wood, Biochem. J. 1971, 121:353-362. En algunas modalidades, la mejora de la actividad beta-glucosidasa de un polipéptido Nc3A en comparación con la de Trichoderma reesei Bgll, se observa cuando los polipéptidos de beta-glucosidasa se usan para hidrolizar una chala de maíz tratada previamente con amoniaco diluido, por ejemplo, una descrita en las solicitudes de patente internacionales publicadas: W02006110891, W02006110899, W02006110900, W02006110901, y W02006110902; patentes de los Estados Unidos núms.7,998,713, 7,932,063.

En algunos aspectos, un polipéptido Nc3A y/o cuando se aplica en una composición enzimática o en un método para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica es (a) derivado de, obtenido de, o producido por Neurospora crassa; (b) un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% (por ejemplo, al menos 80%, 100%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:2; (c) un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) idéntica al dominio catalítico de la sec. con núm. de ident.:2, específicamente los residuos de aminoácido 19-875; (d) un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) idéntica a la forma madura de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:3, específicamente los residuos de aminoácido 19-875 de la sec. con núm. de ident.:2; o (e) un fragmento de (a), (b), (c) o (d) que tiene actividad beta-glucosidasa. En ciertas modalidades, se proporciona un polipéptido variante que tiene actividad beta-glucosidasa, que comprende una sustitución, una supresión y/o una inserción de uno o más residuos de aminoácido de la sec. con núm. de ident.:2.

En algunos aspectos, un polipéptido Nc3A y/o cuando se aplica en una composición enzimática o en un método para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica es (a) un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 80% (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:l, o (b) una que híbrida en condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta a la sec. con núm. de ident.:1 o a una subsecuencia de la sec. con núm. de ident.:1 de al menos 100 nucleótidos contiguos, o a la secuencia complementaria de esta, en donde el polipéptido tiene actividad beta-glucosidasa. En algunas modalidades, un polipéptido Nc3A y/o cuando se aplica a una composición o en un método para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica es uno que, debido a la degeneración del código genético, no híbrida en condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta a la sec. con núm. de ident.:1 o a una subsecuencia de la sec. con núm. de ident.:1 de al menos 100 nucleótidos contiguos, pero sin embargo codifica un polipéptido que tiene actividad beta-glucosidasa y que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) idéntica a la de la sec. con núm. de ident.:2 o a la secuencia de beta-glucosidasa madura de la sec. con núm. de ident.:3. Las secuencias de ácido nucleico pueden ser sintéticas, y no necesariamente derivadas de Neurospora crassa, pero la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad beta-glucosidasa y comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a la sec. con núm. de ident.:2 o a la sec. con núm. de ident.:3.

En algunas modalidades preferidas, el polipéptido Nc3A o la composición que comprende el polipéptido Nc3A tiene actividad de beta-glucosidasa mejorada, en comparación con la de Bgll de Trichoderma reesei silvestre (de la sec. con núm. de ident.: 4), o la composición enzimática que comprende la Bgll de Trichoderma reesei . En ciertas modalidades, la actividad celulasa del polipéptido Nc3A de las composiciones y métodos en la presente invención, medida con el uso de un ensayo de hidrólisis con cloro-nitro-fenil-glucósido (CNPG), es al menos aproximadamente 25% inferior, o aproximadamente 40% inferior, o aproximadamente 55% inferior, o aproximadamente 70% inferior, o aun aproximadamente 80% inferior que la de Bgll de Trichoderma reesei . El ensayo CNPG se describe en el Ejemplo 2B en la presente descripción. En algunas modalidades, la actividad celulasa del polipéptido Nc3A de las composiciones y métodos en la presente invención, medida con el uso un ensayo de hidrólisis CNPG, es al menos aproximadamente 15% superior, al menos aproximadamente 30% superior, al menos aproximadamente 45% superior, al menos aproximadamente 60% superior, al menos aproximadamente 75% superior, al menos aproximadamente 90% superior, o aun al menos aproximadamente 2 veces mayor que la de B-glu de Aspergillus niger.

Por ejemplo, la actividad beta-glucosidasa del polipéptido Nc3A de las composiciones y métodos en la presente invención, medida con el uso un ensayo de hidrólisis de celobiosa, es al menos aproximadamente 2 veces mayor (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 veces mayor, al menos aproximadamente 3 veces mayor, al menos aproximadamente 4 veces mayor, al menos aproximadamente 4.5 veces mayor, tal como, por ejemplo al menos aproximadamente 5 veces mayor) que la de Bgll de Trichoderma reesei . El ensayo de hidrólisis de celobiosa se describe en el Ejemplo 2C en la presente descripción. En algunas modalidades, la actividad beta-glucosidasa del polipéptido Nc3A de las composiciones y métodos en la presente invención, medida con el uso a ensayo de hidrólisis de celobiosa, es aproximadamente 8/9 o menor, aproximadamente 7/9 o menor, aproximadamente 2/3 o menor, tal como aproximadamente 1/2 o menor, que la de B-glu de Aspergillus niger.

En algunas modalidades, los polipéptidos Nc3A de las composiciones y métodos en la presente invención aumentaron dramáticamente (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 veces mayor, al menos aproximadamente 3 veces mayor, al menos aproximadamente 4 veces mayor, al menos aproximadamente 4.5 veces mayor, tal como, por ejemplo al menos aproximadamente 5 veces mayor) la actividad de hidrólisis de celobiosa pero disminuyeron o redujeron sustancialmente (por ejemplo, al menos aproximadamente 25% inferior, o aproximadamente 40% inferior, o aproximadamente 55% inferior, o aproximadamente 70% inferior, o aun aproximadamente 80%)la capacidad para hidrolizar cloro-nitro-fenilo-glucósido (CNPG) en comparación con Bgll de Trichoderma reesei . Por ejemplo, los polipéptidos Nc3A de las composiciones y métodos en la presente invención aumentaron sustancialmente actividad de hidrólisis de CNPG en comparación con la B-glu de Aspergillus niger, pero considerablemente menos actividad de hidrólisis de la celobiasa o celobiosa en comparación con la B-glu de Aspergillus niger.

En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante, en comparación con la Bgll de Trichoderma reesei, tiene una relación de actividad de hidrólisis 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, o aun 30 veces reducida sobre CNPG/celobiosa. En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A, en comparación con la B-glu de Aspergillus niger, tiene aproximadamente la misma relación de actividad de hidrólisis relativa sobre CNPG/celobiosa.

En ciertos aspectos, los polipéptidos Nc3A y las composiciones que comprenden los polipéptidos Nc3A de la invención tienen mejor desempeño para hidrolizar los sustratos de biomasa lignocelulósica, en comparación con la de Bgll de Trichoderma reesei silvestre (de la sec. con núm. de ident.:4). En algunas modalidades, la mejora en el desempeño de la hidrólisis de los polipéptidos Nc3A o composiciones que comprenden los polipéptidos Nc3A se observa por la producción de una cantidad mayor de glucosa a partir de un sustrato de biomasa lignocelulósica dado, tratado previamente de cierta manera, en comparación con el nivel de glucosa producido por Bgll de Trichoderma reesei o una composición enzimática idéntica que comprende Bgll de Trichoderma reesei a partir de la misma biomasa tratada previamente de la misma manera, bajo las mismas condiciones de sacarificación. Por ejemplo, la cantidad de glucosa producida por los polipéptidos Nc3A o por las composiciones enzimáticas que comprenden los polipéptidos Nc3A es al menos aproximadamente 10% (por ejemplo, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, o aun al menos aproximadamente 30% o más) mayor que la cantidad producida por la Bgll de Trichoderma reesei o una composición enzimática de cualquier otra manera idéntica que comprende la Bgll de Trichoderma reesei (en lugar de un polipéptido Nc3A), cuando se usa 0-10 mg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg) de beta-glucosidasa (un polipéptido Nc3A o Bgll de Trichoderma reesei) para hidrolizar 1 g de glucano en el sustrato de biomasa.

En algunos aspectos, la mejora en el desempeño de la hidrólisis de los polipéptidos Nc3A o composiciones que comprenden los polipéptidos Nc3A se observa por un incremento del% de la conversión de glucano a partir de un sustrato de biomasa lignocelulósica dado tratado previamente de cierta manera, en comparación con el nivel en% de conversión de glucano por Bgll de Trichoderma reesei o una composición enzimática de cualquier otra manera idéntica que comprende Bgll de Trichoderma reesei a partir de la misma biomasa tratada previamente de la misma manera, bajo las mismas condiciones de sacarificación. Por ejemplo, el% de conversión de glucano por los polipéptidos Nc3A o la composición enzimáticas que comprende los polipéptidos Nc3A es el mismo o al menos aproximadamente 5% (por ejemplo, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, o al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, o al menos aproximadamente 30%) mayor que el% de conversión de glucano por Bgll de Trichoderma reesei o una composición enzimática de cualquier otra manera idéntica que comprende Bgll de Trichoderma reesei (en lugar de un polipéptido Nc3A), cuando se usa 0-10 mg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg) de beta-glucosidasa (un polipéptido Nc3A o Trichoderma reesei Bgll) para hidrolizar 1 g de glucano en el sustrato de biomasa.

En aspectos adicionales, la mejora en el desempeño de la hidrólisis de los polipéptidos Nc3A y composiciones que comprenden los polipéptidos Nc3A se observa por un aumento de la actividad celobiasa y/o cantidad reducida de celobiosa residual en la mezcla del producto, a partir de la hidrólisis de un sustrato de biomasa lignocelulósica dado tratado previamente de cierta manera, en comparación con la cantidad residual de celobiosa cuando el mismo sustrato de biomasa se hidroliza por Bgll de Trichoderma reesei o una composición de cualquier otra manera idéntica que comprende Bgll de Trichoderma reesei bajo las mismas condiciones de sacarificación. Por ejemplo, la cantidad de celobiosa residual en la mezcla del producto producido a partir de la hidrólisis un sustrato de biomasa dado tratado previamente de cierta manera, por los polipéptidos Nc3A o las composiciones que comprenden los polipéptidos Nc3A es al menos aproximadamente 5% (por ejemplo, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, o al menos aproximadamente 15%) menor que la cantidad de celobiosa residual producida en la mezcla del producto producida a partir de la hidrólisis de el mismo sustrato de biomasa tratado previamente de la misma manera por la Bgll de Trichoderma reesei o por una composición enzimática de cualquier otra manera idéntica que comprende Bgll de Trichoderma reesei bajo las mismas condiciones de sacarificación. Este es el caso cuando se usa 0-10 g de beta-glucosidasa (por ejemplo, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 3 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 7 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 9 mg, aproximadamente 10 mg) de beta-glucosidasa (por ejemplo, un polipéptido Nc3A o una Bgll de Trichoderma reesei) para hidrolizar 1 g de glucano en el sustrato de biomasa.

Los aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen una composición que comprende un polipéptido Nc3A recombinante como se detalló anteriormente y una biomasa lignocelulósica. La biomasa lignocelulósica adecuada puede derivarse, por ejemplo, de un cultivo agrícola, un subproducto de la producción de alimento o pienso, un producto de desecho lignocelulósico, un residuo de la planta, que incluye, por ejemplo, un residuo de pasto, o un producto de papel de desecho o residuos de papel. En ciertas modalidades, la biomasa lignocelulósica se somete a una o más etapas de tratamiento previo para hacer que el xilano, hemicelulosa, celulosa y/o material de lignina sean más accesibles o susceptibles a las enzimas y por lo tanto más modificable a la hidrólisis enzimática. Un método de tratamiento previo adecuado puede ser, por ejemplo, someter el material de biomasa a un catalizador que comprende una solución diluida de un ácido fuerte y una sal de metal en un reactor. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 6,660,506, 6,423,145. Alternativamente, un tratamiento previo adecuado puede ser, por ejemplo, un proceso de múltiples etapas como se describe en patente de los EE. UU. núm. 5,536,325. En ciertas modalidades, el material de biomasa puede someterse a una o más etapas de hidrólisis ácida diluida mediante el uso de aproximadamente 0.4% a aproximadamente 2% de un ácido fuerte, de acuerdo con la descripción de la patente de los EE. UU. núm. 6,409,841. Otras modalidades de los métodos de tratamiento previos pueden incluir los descritos en, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,705,369; en Gould, (1984) Biotech. & Bioengr., 26:46-52; en Teixeira et al . , (1999) Appl. Biochem & Biotech., 77-79:19-34; en la publicación de la solicitud internacional de patente núm. W02004/081185; o en la publicación de patente de los EE. UU. núm.20070031918, o la publicación de la solicitud internacional de patente núm. W006110901.

La presente invención se refiere, además, a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos que tienen actividad de beta-glucosidasa, en donde los polinucleótidos aislados se seleccionan de: (1) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80% (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) de identidad con la sec. con núm. 5 de ident.:2 o la sec. con núm. de ident.:3; (2) un polinucleótido que tiene al menos 80% (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) de identidad con la sec. con núm. de ident.:1, o híbrida en condiciones de rigurosidad media, condiciones de 10 rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy.alta a la sec. con núm. de ident.:1, o a una secuencia complementaria de ella.

Los aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen métodos para preparar o producir un polipéptido Nc3A 15 que tiene actividad beta-glucosidasa, con el empleo de una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 20 99%, o 100%) a la de la sec. con núm. de ident.:2, o la de la secuencia madura de sec. con núm. de ident.:3. En algunas modalidades, el polipéptido comprende, adicionalmente, un péptido señal natural o no natural de manera que el polipéptido Nc3A que se produce se secrete por un organismo 25 hospedero, por ejemplo, el péptido señal comprende una secuencia que es al menos 90% idéntica a la sec. con núm. de ident.:13 (la secuencia señal de Bgll de Trichoderma reesei) . En ciertas modalidades, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que es al menos 80% (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) idéntica a la sec. con núm. de ident.:1. En ciertas modalidades, el ácido nucleico aislado comprende, adicionalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia del péptido señal. En ciertas modalidades, la secuencia del péptido señal puede ser una seleccionada de las sec. con núms. de ident.:13-42. En ciertas modalidades particulares, una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia del péptido señal de la sec. con núm. de ident.:13 se usa para expresar un polipéptido Nc3A en Trichoderma reesei .

Los aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado como se describió anteriormente en combinación operativa con una secuencia amortiguadora.

Los aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen una célula hospedera que comprende el vector de expresión. En ciertas modalidades, la célula hospedera es una célula bacteriana o una célula fúngica. En ciertas modalidades, la célula hospedera que comprende el vector de expresión es un microbio etanologénico capaz de metabolizar los azúcares solubles producidos a partir de una hidrólisis de una biomasa lignocelulósica, en donde la hidrólisis es el resultado de un proceso químico y/o enzimático.

Los aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen una composición que comprende la célula hospedera descrita anteriormente y un medio de cultivo. Los aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen un método para producir un polipéptido Nc3A que comprende: cultivar la célula hospedera descrita anteriormente en un medio de cultivo, bajo condiciones adecuadas para producir la beta-glucosidasa.

Los aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen una composición que comprende un polipéptido Nc3A en el sobrenadante de un medio de cultivo producido de acuerdo con los métodos para producir la beta-glucosidasa como se describió anteriormente.

En algunos aspectos, la presente invención se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores de expresión recombinantes, células hospederas modificadas que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad beta-glucosidasa, como se describió anteriormente y en la presente descripción. En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a métodos para preparar o producir los polipéptidos de beta-glucosidasa de la invención o composiciones que comprenden tales polipéptidos de beta- glucosidasa mediante el uso de constructos de ácido nucleico, vectores de expresión recombinantes, y/o células hospederas modificadas. Particularmente, la presente invención se refiere, por ejemplo, a constructos de ácido nucleico que comprenden un péptido señal adecuado unido operativamente a la secuencia madura de la beta-glucosidasa que es al menos 80% idéntica a la sec. con núm. de ident.:2 o a la secuencia madura de la sec. con núm. de ident.:3, o es codificada por un polinucleótido que es al menos 80% idéntico a la sec. con núm. de ident.:1, un polinucleótido aislado, un constructo de ácido nucleico, un vector de expresión recombinante, o una célula hospedera modificada que comprende el constructo de ácido nucleico. En algunas modalidades, las secuencias del péptido señal y beta-glucosidasa se derivan de diferentes microorganismos.

Se proporciona, además, un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado en combinación operable con una secuencia amortiguadora. Además, se proporciona una célula hospedera que comprende el vector de expresión. Aun en otras modalidades, se proporciona una composición que comprende la célula hospedera y un medio de cultivo.

En algunas modalidades, la célula hospedera es una célula bacteriana o una célula fúngica. En ciertas modalidades, la célula hospedera es un microbio etanologénico, que es capaz de metabolizar los azúcares solubles producidos a partir de la hidrólisis de un sustrato de biomasa lignocelulósica, en donde la hidrólisis puede ser a través de una hidrólisis química o hidrólisis enzimática o una combinación de estos procesos, pero es capaz además de la expresión de enzimas heterólogas. En algunas modalidades, la célula hospedera es una célula de Saccharomyces cerevisiae o una Zymomonas m obilis, que no solo son capaces de expresar un polipéptido heterólogo tal como un polipéptido Nc3A de la invención, sino que son capaces además de fermentar azúcares en etanol y/o productos corriente abajo. En ciertas modalidades particulares, la célula de Saccharomyces cerevisiae o la célula de Zymomonas mobilis, que expresa la beta-glucosidasa, es capaz de fermentar los azúcares producidos a partir de una biomasa lignocelulósica por una composición enzimática que comprende una o más beta-glucosidasas. La composición enzimática que comprende una o más beta-glucosidasas puede comprender la misma beta-glucosidasa o puede comprender una o más beta-glucosidasas diferentes. En ciertas modalidades, la composición enzimática que comprende una o más beta-glucosidasas puede ser una mezcla de enzimas producida por una célula hospedera modificada, que puede ser una célula bacteriana o una fúngica. Cuando una célula de Saccharomyces cerevisiae o una de Zymomonas mobilis expresa el polipéptido Nc3A de la presente descripción, el polipéptido Nc3A puede ser expresado pero no secretado. En consecuencia, la celobiosa debe introducirse o “transportarse” en una célula hospedera para que el polipéptido Nc3A de beta-glucosidasa catalice la liberación de D-glucosa. Por lo tanto, en ciertas modalidades, la célula de Saccharomyces cerevisiae o una de Zymomonas mobilis se transforman con un gen transportador de celobiosa además de uno que codifica el polipéptido Nc3A. Un transportador de celobiosa y una beta-glucosidasa se expresaron en Saccharomyces cerevisiae, de manera que el microbio resultante es capaz de fermentar la celobiosa, por ejemplo, en Ha et al . , (2011) PNAS, 108(2):504-509. Otro transportador de celobiosa se expresó en una levadura Pichia, por ejemplo, en la solicitud de patente de los EE. UU. publicada núm.20110262983. Un transportador de celobiosa se introdujo en E. coli , por ejemplo, en Sekar et al . , (2012) Applied Environmental Microbiology, 78(5):1611-1614.

En modalidades adicionales, el polipéptido Nc3A se expresa de forma heteróloga por una célula hospedera. Por ejemplo, el polipéptido Nc3A se expresa por un microorganismo modificado que no es Neurospora crassa . En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A se coexpresa con uno o más genes de celulasa diferentes. En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A se coexpresa con uno o más genes de hemicelulasa.

En algunos aspectos, se proporcionan composiciones que comprenden los polipéptidos Nc3A recombinantes de los párrafos precedentes y métodos para preparar tales composiciones. En algunas modalidades, la composición comprende, adicionalmente, una o más celulasas distintas, de manera que la una o más otras celulasas se coexpresan por una célula hospedera con el polipéptido Nc3A. Por ejemplo, la una o más otras celulasas pueden seleccionarse de ninguna, o una, o más de otras beta-glucosidasas, una o más celobiohidroliasas, y/o una o más endoglucanasas. Tales otras beta-glucosidasas, celobiohidrolasas y/o endoglucanasas, si están presentes, pueden coexpresarse con el polipéptido Nc3A por una sola célula hospedera. Al menos dos de las dos o más celulasas pueden ser heterólogas entre sí o derivarse de organismos diferentes. Por ejemplo, la composición puede comprender dos beta-glucosidasas, la primera es un polipéptido Nc3A, y la segunda beta-glucosidasa no se deriva de una cepa de Neurospora crassa . Por ejemplo, la composición puede comprender al menos una celobiohidrolasa, una endoglucanasa, o una beta-glucosidasa que no se deriva de Neurospora crassa . En algunas modalidades, una o más de las celulasas son endógenas a la célula hospedera, pero se sobreexpresan o se expresan a un nivel que es diferente del que de cualquier otra manera sería de origen natural en la célula hospedera. Por ejemplo, una o más de las celulasas puede ser una CBH1 y/o CBH2 de Trichoderma reesei, que son naturales para una célula hospedera de Trichoderma reesei, pero una o ambas CBH1 y CBH2 se sobreexpresan o subexpresan cuando estas se coexpresan en la célula hospedera de Trichoderma reesei con un polipéptido Nc3A.

En ciertas modalidades, la composición que comprende el polipéptido Nc3A recombinante puede comprender adicionalmente una o más hemicelulasas, de manera que la una o más hemicelulasas se coexpresan por una célula hospedera con el polipéptido Nc3A. Por ejemplo, una o más hemicelulasas puede seleccionarse de una o más xilanasa, una o más beta-xilosidasas, y/o una o más L-arabinofuranosidasas. Tales otras xilanasas, beta-xilosidasas y L-arabinofuranosidasas, si están presentes, pueden coexpresarse con el polipéptido Nc3A por una sola célula hospedera. En algunas modalidades, la composición puede comprender al menos una beta-xilosidasa, xilanasa o arabinofuranosidasa que no se deriva de Neurospora crassa.

En aspectos adicionales, la composición que comprende el polipéptido Nc3A recombinante puede comprender, adicionalmente, una o más de otras celulasas y una o más hemicelulasas, de manera que la una o más celulasas y/o una o más hemicelulasas se coexpresan por una célula hospedera con el polipéptido Nc3A. Por ejemplo, un polipéptido Nc3A puede ser coexpresado con una o más de otras beta-glucosidasas, una o más celobiohidrolasas, una o más endoglucanasas, una o más endo-xilanasas, una o más beta-xilosidasas, y una o más L-arabinofuranosidasas, además de otras enzimas o proteínas no celulasa, no hemicelulasa, en la misma célula hospedera. Los aspectos de las presentes composiciones y métodos incluyen, en consecuencia, una composición que comprende la célula hospedera descrita anteriormente que coexpresa una serie de enzimas además del polipéptido Nc3A y un medio de cultivo. Los aspectos de las presentes composiciones y métodos en consecuencia incluyen un método para producir una composición enzimática que contiene Nc3A que comprende: cultivar la célula hospedera, que coexpresa una serie de enzimas como se describió anteriormente con el polipéptido Nc3A en un medio de cultivo, bajo condiciones adecuadas para producir Nc3A y las otras enzimas. Además se proporcionan composiciones que comprenden el polipéptido Nc3A y las otras enzimas producidas de acuerdo con los métodos en la presente descripción en el sobrenadante del medio de cultivo. El sobrenadante del medio de cultivo puede usarse como está, con un mínimo o ningún procesamiento posterior a la producción, que puede incluir típicamente filtración para eliminar los restos celulares, procedimientos para provocar la muerte celular, y/o ultrafiltración u otras etapas para enriquecer o concentrar las enzimas en este. Los sobrenadantes se denominan “caldos de cultivo completos” o “caldos de cultivo de celulasa completa” en la presente descripción.

En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a un método para aplicar o usar la composición como se describió anteriormente bajo condiciones adecuadas para degradar o convertir un material celulósico y para producir una sustancia a partir de un material celulósico.

En un aspecto adicional, se proporcionan métodos para degradar o convertir un material celulósico en azúcares fermentables, que comprende: poner en contacto el material celulósico, preferentemente que ya se haya sometido a una o más etapas de tratamiento previo, con los polipéptidos Nc3A o las composiciones que comprenden los polipéptidos de uno de los párrafos precedentes para producir azúcares fermentables.

En consecuencia, la presente descripción recoge siguientes aspectos particulares: En un primer aspecto, un polipéptido recombinante comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:2 o sec. con núm. de ident.:3, en donde el polipéptido tiene actividad beta-glucosidasa.

En un segundo aspecto, el polipéptido recombinante del primer aspecto, en donde el polipéptido tiene actividad de beta-glucosidasa mejorada en comparación con Bgll de Trichoderma reesei cuando se usa el polipéptido recombinante y la Bgll de Trichoderma reesei para hidrolizar sustratos de biomasa lignocelulósica. Por ejemplo, el sustrato de biomasa lignocelulósica es uno que se sometió a uno o más tratamientos previos adecuados.

En un tercer aspecto, el polipéptido recombinante del primer o segundo aspecto, en donde la mejora de la actividad beta-glucosidasa es un aumento de la actividad celobiasa o una mejora de la capacidad para hidrolizar celobiosa y, de esa manera, liberar D-glucosa.

En un cuarto aspecto, el polipéptido recombinante de cualquiera del primer al tercer aspectos, en donde la mejora de la actividad beta-glucosidasa es un aumento del rendimiento de glucosa y un rendimiento igual o inferior de azúcares totales a partir de una biomasa lignocelulósica bajo las mismas condiciones de sacarificación.

En un quinto aspecto, el polipéptido recombinante de cualquiera del primer al cuarto aspectos anteriores, en donde la biomasa lignocelulósica es una que se sometió a un tratamiento previo antes de la sacarificación. El tratamiento previo puede ser, de manera favorable, conocido en la materia, que haga que el sustrato de biomasa lignocelulósica sea más susceptible del acceso enzimático y la hidrólisis, que puede incluir, por ejemplo, los métodos de tratamiento previos descritos en la presente descripción.

En un sexto aspecto, el polipéptido recombinante de cualquiera del primer al quinto aspectos, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:2 o sec. con núm. de ident.:3.

En un séptimo aspecto, el polipéptido recombinante de cualquiera del primer al quinto aspectos, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:2 o sec. con núm. de ident.:3.

En un octavo aspecto, una composición comprende el polipéptido recombinante de cualquiera del primer al séptimo aspectos anteriores, que comprende, además, una o más de otras celulasas.

En un noveno aspecto, la composición del octavo aspecto, en donde la una o más de otras celulasas se seleccionan de ninguna o una o más de otras beta-glucosidasas, una o más celobiohidrolasas y una o más endoglucanasas.

En un décimo aspecto, una composición comprende el polipéptido recombinante de cualquiera del primer al séptimo aspectos anteriores, que comprende, además, una o más hemicelulasas.

En un onceno aspecto, la composición del octavo o noveno aspecto anteriores, comprende además una o más hemicelulasas.

En un duodécimo aspecto, la composición del décimo u onceno aspecto anteriores, en donde la una o más hemicelulasas se seleccionan de una o más xilanasas, una o más beta-xilosidasas, y una o más L-arabinofuranosidasas.

En un decimotercer aspecto, un ácido nucleico codifica el polipéptido recombinante de cualquiera del primer al séptimo aspectos.

En un decimocuarto aspecto, el ácido nucleico del decimotercer aspecto comprende, además, una secuencia señal.

En un decimoquinto aspecto, el ácido nucleico del decimocuarto aspecto, en donde la secuencia señal se selecciona del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.: 13-42.

En un decimosexto aspecto, un vector de expresión comprende el ácido nucleico de cualquiera del decimotercer al decimoquinto aspectos en combinación operativa con una secuencia amortiguadora.

En un decimoséptimo aspecto, una célula hospedera comprende el vector de expresión del decimosexto aspecto.

En un decimoctavo aspecto, la célula hospedera del decimoséptimo aspecto, en donde la célula hospedera es una célula bacteriana o una célula fúngica. Se conoce un número de células bacterianas por ser células hospederas adecuadas como se describe en la presente descripción. Una serie de células fúngicas son adecuadas también. En algunas modalidades, la célula hospedera bacteriana o fúngica puede ser una que es un etanologénico, capaz de fermentar o metabolizar ciertos azúcares monoméricos en etanol . Por ejemplo, el etanolgen bacteriano de Zymomonas mobilis puede ser una célula hospedera que expresa un polipéptido de beta-glucosidasa de la presente descripción. Por ejemplo, un etanologénico fúngico de levadura de Saccharomyces cerevisiae puede servir, además, como una célula hospedera para producir un polipéptido de beta-glucosidasa de la presente descripción.

En un decimonoveno aspecto, una composición comprende la célula hospedera del decimosexto o decimoséptimo aspecto y un medio de cultivo.

En un vigésimo aspecto, un método para producir una beta-glucosidasa que comprende cultivar la célula hospedera del decimoséptimo o decimoctavo aspecto, en un medio de cultivo, bajo condiciones adecuadas para producir la beta-glucosidasa.

En un 21° aspecto, una composición que comprende la beta-glucosidasa producida de acuerdo con el método del aspecto 20.° anterior, en el sobrenadante del medio de cultivo.

En un 22° aspecto, un método para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica, que comprende poner en contacto el sustrato de biomasa lignocelulósica con el polipéptido de cualquiera del primer al séptimo aspectos o con la composición del 21.° aspecto, para producir una glucosa y/u otros azúcares.

Estos y otros aspectos de las composiciones y métodos de Nc3A resultarán evidentes de la siguiente descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa un mapa del vector pENTR/D-TOPO-Bgll(943/942).

La Figura 2 representa un mapa del constructo pTrex3g 943/942.

Las Figuras 3A-3C representan las comparaciones del desempeño de la hidrólisis de Nc3A en comparación con la Bgll de referencia de Trichoderma reesei mediante el uso de una celulasa dilatada tratada con ácido fosfórico (PASC) como sustrato, a 50°C, y 1.5 h, en donde el Nc3A y la Bgll se agregaron a una celulasa completa de fondo producida a partir de una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con lo que se describe en la solicitud de patente publicada núm. O 2011/038019, y la mezcla de beta-glucosidasa+celulasa completa se mezcló con el sustrato PASC a varias dosis de beta-glucosidasa. La Figura 3A representa las mediciones y la comparación del% de conversión de glucano a varias dosis de beta-glucosidasa de acuerdo con las condiciones descritas en el Ejemplo 4-A en la presente descripción. Son curvas de dosis que representan las mediciones y una comparación de % total de conversión de glucano a partir de un sustrato PASC dado, por la composición de celulosa total (producida a partir de una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con lo que se describe en la publicación de la solicitud internacional de patente núm. W02011/038019) que comprende la misma concentración de Bgll de T reesei en comparación con Nc3A. La Figura 3B representa las mediciones y la comparación de la producción total de glucosa a varias dosis de beta-glucosidasa de acuerdo con las condiciones descritas en el Ejemplo 4-A en la presente descripción. Son curvas de dosis que representan las mediciones y una comparación de los rendimientos de glucosa de la hidrólisis de un sustrato PASC dado por la composición de celulosa completa (producida a partir de una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con lo que se describe en la publicación de la solicitud internacional de patente (W02011/038019) que comprende las mismas concentraciones de Bgll de T. reesei en comparación con Nc3A. La Figura 3C representa las mediciones y la comparación de la celobiosa producida a partir de la hidrólisis de PASC a varias dosis de beta-glucosidasa, de acuerdo con las condiciones descritas en el Ejemplo 4-A en la presente descripción. Son curvas de dosis que representan las mediciones y una comparación de los rendimientos de celobiosa de la hidrólisis de un sustrato PASC dado por la composición de celulosa completa (producida a partir de una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con lo que se describe en la publicación de la solicitud internacional de patente núm. WO 2011/038019) que comprende las mismas concentraciones de Bgll de T reesei en comparación con Nc3A.

Las Figuras 4A-4C representan las comparaciones del desempeño de la hidrólisis de Nc3A en comparación con la Bgll de referencia de Trichoderma reesei mediante el uso de una chala de maíz tratada previamente con amoniaco diluido (DACS) como sustrato, a 50°C, durante 2 días, en donde el Nc3A y la Bgll se agregaron a una celulasa completa de fondo producida a partir de una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con lo que se describe en la solicitud de patente publicada núm. WO 2011/038019, y la mezcla de beta-glucosidasa+celulasa completa se mezcló con el sustrato DACS a varias dosis de beta-glucosidasa. La Figura 4A representa las mediciones y la comparación de la conversión total de glucano a varias dosis de beta-glucosidasa. Son curvas de dosis que representan las mediciones y una comparación del % total de conversión de glucano de un sustrato DASC dado, por la composición de celulosa completa (producida a partir de una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con lo que se describe en la publicación de la solicitud internacional de patente núm. WO 2011/038019) que comprende las mismas concentraciones de Bgll de T reesei en comparación con Nc3A. La Figura 4B representa las mediciones y la comparación de la producción total de glucosa a varias beta-glucosidasa. Son curvas de dosis que representan las mediciones y una comparación de los rendimientos de glucosa de la hidrólisis de un sustrato DASC dado por la composición de celulosa completa (producida a partir de una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con lo que se describe en la publicación de la solicitud internacional de patente W02011/038019) que comprende la misma concentración de Bgll de T reesei en comparación con Nc3A. La Figura 4C representa las mediciones y la comparación de los niveles de celobiosa en las mezclas de sacarificación obtenidas a partir de la hidrólisis del DACS a varias dosis de beta-glucosidasa. Son curvas de dosis que representan las mediciones y una comparación de los rendimientos de celobiosa de la hidrólisis de un sustrato DASC dado por la composición de celulosa completa (producida a partir de una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con lo que se describe en la publicación de la solicitud internacional de patente núm. WO 2011/038019) que comprende las mismas concentraciones de Bgll de T reesei en comparación con Nc3A.

La Figura 5 representa un constructo del vector lanzadera de levadura pSCll, que comprende un gen Nc3A optimizado y sintetizado para la expresión del polipéptido Nc3A en una Saccharomyces cerevisiae etanologénica.

La Figura 6 representa un vector de integración pZCll de Zymomonas mobilis , que comprende un gen Nc3A optimizado y sintetizado para la expresión del polipéptido Nc3A en una Zymomonas mobilis etanologénica.

Las Figuras 7A-7D representan las secuencias y los identificadores de secuencias de la presente descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Generalidades En la presente descripción se describen composiciones y métodos que se relacionan con una beta-glucosidasa Nc3A recombinante que pertenece a la familia 3 de glicosil hidrolasas de Neurospora crassa . Las presentes composiciones y métodos se basan, en parte, en las observaciones de que los polipéptidos Nc3A recombinantes tienen actividades celulasa mayores y son más robustos como un componente de una composición enzimática cuando la composición se usa para hidrolizar un material o materia prima de biomasa lignocelulósica que, por ejemplo, una beta-glucosidasa Bgll de alta fidelidad de referencia de Trichoderma reesei conocida. Estas características de los polipéptidos Nc3A los hacen, o a las variantes de estos, adecuados para el uso en numerosos procesos, que incluyen, por ejemplo, en la conversión o hidrólisis de una materia prima de biomasa lignocelulósica.

Antes de describir en más detalle las presentes composiciones y métodos, debe entenderse que las presentes composiciones y métodos no están limitados a las modalidades particulares descritas, como tal pueden, por supuesto, variar. Además, debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción es para el solo propósito de describir modalidades particulares, y no pretende ser limitante, dado que el alcance de las presentes composiciones y métodos estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto lo dicte claramente de cualquier otra manera, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está abarcado dentro de las presentes composiciones y métodos. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están abarcados dentro de las presentes composiciones y métodos, sometidos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos límites incluidos también se incluyen en las presentes composiciones y métodos.

Ciertos intervalos se presentan en la presente descripción con valores numéricos que están precedidos del término “aproximadamente.” El término “aproximadamente” se usa en la presente descripción para proporcionar soporte literal para el número exacto al que precede, así como también un número que es cercano a o aproximadamente el número al que precede el término. Al determinar si un número es cercano a o aproximadamente un número mencionado específicamente, el número cercano o aproximado sin mencionar puede ser un número que, en el contexto en que se presenta, proporciona el equivalente sustancial del número mencionado específicamente. Por ejemplo, en relación con un valor numérico, el término “aproximadamente” se refiere a un intervalo de -10% a +10% del valor numérico, a menos que el término se defina específicamente de cualquier otra manera en el contexto. En otro ejemplo, la frase un “valor de pH de aproximadamente 6” se refiere a valores de pH de 5.4 a 6.6, a menos que el valor de pH se defina específicamente de cualquier otra manera.

Los encabezados proporcionados en la presente descripción no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de las presentes composiciones y métodos que se pueden tomar como referencia para la descripción en general. Por lo tanto, los términos definidos en seguida se definen completamente como referencia para la descripción en general.

El presente documento se organiza en una serie de secciones para una lectura más fácil; sin embargo, el lector apreciará que las declaraciones hechas en una sección pueden aplicarse a otras secciones. De esta manera, los encabezados usados para las diferentes secciones de la descripción no deberán interpretarse como limitantes.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comprende comúnmente una persona con experiencia en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción también pueden usarse en la práctica o prueba de las presentes composiciones y métodos, los métodos y materiales ilustrativos representativos se describen a continuación.

Todas las publicaciones y patentes citadas en esta descripción se incorporan en la presente descripción como referencia como si cada publicación o patente individual se indicara específicamente e individualmente para incorporarse como referencia y se incorporan en la presente descripción como referencia para describir y describir los métodos y/o materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones. La mención de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que las presentes composiciones y métodos no tienen derecho a preceder a la publicación en virtud de una invención anterior. Adicionalmente, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales lo que puede necesitar confirmarse independientemente.

De conformidad con esta descripción detallada se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Note que las formas singulares “un”, “una”, y “el/la” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “una enzima” incluye una pluralidad de tales enzimas y la referencia a “la dosificación” incluye referencia a una o más dosificaciones y equivalentes de estas conocidas para las personas con experiencia en la materia, etc.

Cabe destacar, además, que las reivindicaciones se pueden redactar para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como una base antecedente para el uso de terminología exclusiva tal como “solamente”, “solo” y lo similar en relación con la mención de los elementos reivindicados, o el uso de una limitación “negativa” .

El término “recombinante”, cuando se usa en referencia a una célula, ácido nucleico, polipéptidos/enzimas o vector de interés, indica que el sujeto se ha modificado a partir de su estado nativo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos a diferentes niveles o bajo diferentes condiciones que las encontradas en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes pueden diferir de una secuencia natural en uno o más nucleótidos y/o se unen operativamente a secuencias heterólogas, por ejemplo, un promotor heterólogo, secuencias señal que permiten la secreción, etc., en un vector de expresión. Los polipéptidos/enzimas recombinantes pueden diferir de una secuencia natural en uno o más aminoácidos y/o se fusionan con secuencias heterólogas. Un vector que comprende un ácido nucleico que codificas una beta-glucosidasa es, por ejemplo, un vector recombinante.

Cabe destacar, además, que el término “que consiste esencialmente en”, como se usa en la presente descripción se refiere a una composición en donde el(los) componente(s) después del término está en presencia de otro(s) componente(s) conocido(s) en una cantidad total que es menor que 30% en peso de la composición total y no contribuye a o interfiere con las acciones o actividades del(de los) componente(s).

Cabe destacar, además, que el término “que comprende”, como se usa en la presente descripción, significa que incluye, pero sin limitarse a, el(los) componente(s) después del término “que comprende.” El(los) componente(s) después del término “que comprende” se requieren o son obligatorios, pero la composición que comprende el (los) componente(s) pueden incluir adicionalmente otro(s) componente(s) no obligatorios u opcionales.

Cabe destacar, además, que el término “que consiste en”, como se usa en la presente descripción, significa que incluye, y se limita a los componente(s) después del término “que consiste en.” El(los) componente(s) después del término “que consiste en” son, por lo tanto, requeridos u obligatorios, y ningún otro(s) componente (s) está(n) presente(s) en la composición.

Como resultará evidente para aquellos con experiencia en la materia tras la lectura de esta descripción, cada una de las modalidades individuales descritas e ilustradas en la presente descripción tiene componentes y características distintas que fácilmente pueden separarse de o combinarse con las características de cualquiera de las otras varias modalidades sin apartarse del alcance o el espíritu de las presentes composiciones y métodos descritos en la presente descripción. Cualquier método mencionado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos mencionados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

II . Definiciones “Beta-glucosidasa” se refiere a una beta-D-glucósido glucohidrolasa de E.C. 3.2.1.21. El término “actividad beta-glucosidasa” se refiere, por lo tanto, a la capacidad de catalizar la hidrólisis de beta-D-glucosa o celobiosa para liberar D-glucosa. La actividad beta-glucosidasa puede determinarse mediante el uso de un ensayo de celobiasa, por ejemplo, el cual mide la capacidad de la enzima para catalizar la hidrólisis de un sustrato de celobiosa para producir D-glucosa, como se describe en el Ejemplo 2C de la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, “Nc3A” o “un polipéptido Nc3A” se refiere a una beta-glucosidasa que pertenece a la familia 3 de glicosil hidrolasas (por ejemplo, una beta-glucosidasa recombinante) derivada de Neurospora crassa (y variantes de esta), que tiene mejor desempeño al hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica cuando se compara con una beta-glucosidasa de referencia, el polipéptido silvestre Bgll de Trichoderma reesei que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:4. De acuerdo con los aspectos de las presentes composiciones y métodos, los polipéptidos Nc3A incluyen los que tienen la secuencia de aminoácidos representada en la sec. con núm. de ident. 2, así como también derivados o variantes de polipéptidos que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 2, o la secuencia madura de la sec. con núm. de ident.:2, o con un fragmento de al menos 100 residuos de longitud de la sec. con núm. de ident. 2, en donde los polipéptidos Nc3A no solo tienen actividad beta-glucosidasa y son capaces de catalizar la conversión de celobiosa en D-glucosa, sino que tienen además mayor actividad beta-glucosidasa y tienen mayor capacidad para catalizar la conversión de celobiosa a D-glucosa que la Bgll de Trichoderma reesei .

Los polipéptidos Nc3A a usar en las composiciones y métodos de la presente descripción tendrían al menos 5%, preferentemente, al menos 10%, con mayor preferencia, al menos 20%, aún con mayor preferencia, al menos 25%, o más de la actividad beta-glucosidasa del polipéptido de la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:2, o del polipéptido que consiste en residuos 19 a 875 de la sec. con núm. de ident.:2; o de la secuencia madura sec. con núm. de ident.:3.

“Familia 3 de glicosil hidrolasas” o “GH3” se refiere a polipéptidos que caen dentro de la definición de familia 3 de glicosil hidrolasas de acuerdo con la clasificación de Henrissat, Biochem. J. 280:309-316 (1991), y por Henrissat & Cairoch, Biochem. J., 316:695-696 (1996).

Los polipéptidos Nc3A de acuerdo con las presentes composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden aislarse o purificarse. Por purificación o aislamiento se entiende que el polipéptido Nc3A se altera de su estado natural en virtud de la separación del Nc3A de algunos o de todos los constituyentes de origen natural a los que se asocia en la naturaleza. El aislamiento o purificación puede lograrse mediante téenicas de separación reconocidas en la materia tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, separación hidrofóbica, diálisis, tratamiento con proteasas, precipitación con sulfato de amonio u otra precipitación salina de proteínas, centrifugación, cromatografía de exclusión por tamaño, filtración, microfiltración, electroforesis en gel o separación en un gradiente para eliminar células completas, restos celulares, impurezas, proteínas extrañas, o enzimas no deseadas en la composición final. Entonces es posible agregar, además, constituyentes a la composición que contiene Nc3A, lo que proporciona beneficios adicionales, por ejemplo, agentes activadores, agentes contra la inhibición, iones deseables, compuestos para controlar el pH u otras enzimas o sustancias químicas.

Como se usa en la presente descripción, “microorganismo” se refiere a una bacteria, un hongo, un virus, un protozoo, y otros microbios u organismos microscópicos.

Como se usa en la presente descripción, un “derivado” o “variante” de un polipéptido se refiere a un polipéptido, que se deriva de un polipéptido precursor (por ejemplo, el polipéptido natural) mediante la adición de uno o más aminoácidos a uno o ambos extremos C- y N-terminal, sustitución de uno o más aminoácidos en uno o varios sitios diferentes en la secuencia de aminoácidos, supresión de una o más aminoácidos uno o más aminoácidos en uno o ambos extremos del polipéptido o en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos, o inserción de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de aminoácidos. La preparación de un derivado o variante de Nc3A puede lograrse de cualquier manera conveniente, por ejemplo, mediante la modificación de una secuencia de ADN que codifica los polipéptidos nativos, la transformación de esa secuencia de ADN en un hospedero adecuado, y la expresión de la secuencia de ADN modificada para formar el derivado/variante de Nc3A. Los derivados o variantes incluyen, además, polipéptidos Nc3A que están modificados químicamente, por ejemplo, glicosilación o cambiar de cualquier otra manera una característica del polipéptido Nc3A. Si bien los derivados y variantes de Nc3A están abarcados por las presentes composiciones y métodos, los derivados y variantes mostrarán mayor actividad beta-glucosidasa cuando se compara con la de la Bgll silvestre de Trichoderma reesei de la sec. con núm. de ident.:4, bajo las mismas condiciones de hidrólisis del sustrato de biomasa lignocelulósica.

En ciertos aspectos, un polipéptido Nc3A de las composiciones y métodos en la presente invención también puede abarcar el fragmento funcional de un polipéptido o un fragmento de polipéptido que tiene actividad beta-glucosidasa, que se deriva de un polipéptido progenitor, que puede ser el polipéptido en toda su extensión que comprende o consiste en la sec. con núm. de ident.:2, o la secuencia madura que comprende o consiste en la sec. con núm. de ident.:3. El polipéptido funcional puede haber sido truncado ya sea en la región N-terminal, o la región C-terminal, o en ambas regiones para generar un fragmento del polipéptido progenitor. Para los fines de la presente descripción, un fragmento funcional debe tener al menos 20%, con mayor preferencia, al menos 30%, 40%, 50%, o preferentemente, al menos 60%, 70%, 80%, o aún con mayor preferencia, al menos 90% de la actividad beta-glucosidasa de la del polipéptido progenitor.

En ciertos aspectos, un derivado/variante de Nc3A tendrá en cualquier parte de 80% a 99% (o más) de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:2, o la secuencia madura de la sec. con núm. de ident.:3, por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:2 o la secuencia madura de la sec. con núm. de ident.:3. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son “sustituciones de aminoácidos conservadoras” que usan L-aminoácidos, en donde un aminoácido es reemplazado por otro aminoácido biológicamente similar. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas que preservan la carga general, la hidrofobicidad/hidrofilicidad, y/o el volumen estérico del aminoácido que se sustituye. Los ejemplos de sustituciones conservadoras son aquellas entre los siguientes grupos: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr, y Phe/Trp/Tyr. Un derivado puede diferir, por ejemplo, en tan poco como 1 a 10 residuos de aminoácido, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2, o aun 1 residuo de aminoácido. En algunas modalidades, un derivado de Nc3A puede tener una supresión N-terminal y/o C-terminal, en donde el derivado de Nc3A que excluye la(s) porción (ones) terminal(s) es idéntico a una subregión contigua en la sec. con núm. de ident.: 2 o la sec. con núm. de ident.:3.

Como se usa en la presente descripción, “porcentaje (%) de identidad de secuencia” con respecto a las secuencias de aminoácidos o nucleótidos identificadas en la presente descripción se define como el porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia de Nc3A, después de alinear las secuencias e introducir interrupciones, de ser necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia.

Por “homólogo” se entiende una entidad que tiene un grado específico de identidad con la secuencia de aminoácidos de interés y las secuencias de nucleótidos de interés. Una secuencia homologa incluye una secuencia de aminoácido que es al menos 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o aun 99% idéntica a la secuencia de interés, con el uso de herramientas convencionales de alineación de secuencia (por ejemplo, Clustal, BLAST, y lo similar). Típicamente, los homólogos incluirán los mismos residuos del sitio activo que la secuencia de aminoácidos en cuestión, a menos que se especifique de cualquier otra manera.

Los métodos para realizar la alineación de secuencias y determinar la identidad de secuencias son conocidos para el téenico con experiencia, pueden realizarse sin excesiva experimentación, y los cálculos de los valores de identidad pueden obtenerse con definición. Ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19 (Greene Publishing y Wilcy-Interscience, Nueva York); y el programa ALIGN (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein secuencia y Structure 5:Suppl.3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.). Una serie de algoritmos están disponibles para alinear las secuencias y determinar la identidad de secuencia e incluyen, por ejemplo, el algoritmo de alineación por homología de Needleman et al . (1970) J. Mol . Biol . 48 :443; el algoritmo de homología local de Smith et al . (1981) Adv. Appl . Math. 2 :482; el método de búsqueda de similitud de Pearson et al . (1988) Proc . Nati . Acad. Sci . 85:2444; el algoritmo de Smith-aterman [Meth. Mol . Biol . 70: 173-187 (1997); y los algoritmos BLASTP, BLASTN, y BLASTX (ver Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-410).

Los programas de computadora que usan estos algoritmos están disponibles, además, e incluyen, pero no se limitan a: software ALIGN o Megalign (DNASTAR), o WU-BLAST-2 (Altschul et al., (1996) Meth. Enzym., 266:460-480); o GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA, disponibles en el paquete Genetics Computing Group (GCG), versión 8, Madison, Wisconsin, USA; y CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California. Aquellos con experiencia en la materia puede determinar parámetros adecuados para medir la alineación, que incluyen algoritmos necesarios para alcanzar un alineación máxima sobre la que se compara la longitud de las secuencias. Preferentemente, la identidad de secuencia se determina por medio del uso de parámetros por defecto determinados por el programa. Específicamente, la identidad de secuencia puede determinarse mediante el uso de Clustal W (Thompson J.D. et al . (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) con los parámetros por defecto, es decir: 10.0 penalización de apertura de interrupción: penalización de extensión de interrupción: 0.05 matriz de peso de proteínas: serie BLOSUM matriz de peso del ADN: IUB % de secuencias divergentes con retardo: 40 distancia de la separación de interrupción: 8 peso de transiciones de ADN: 0.50 lista de residuos hidrófilos: GPSNDQEKR uso de matriz negativa: APAGADO penalizaciones de residuos específicos ENCENDIDO cambiados: penalizaciones de hidrofílicos cambiados: ENCENDIDO penalización por separación de interrupción APAGADO final cambiada Como se usa en la presente descripción, “vector de expresión” significa un constructo de ADN que incluyen una secuencia de ADN que se une operativamente a una secuencia control adecuada capaz de afectar la expresión del ADN en un hospedero adecuado. La s secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia del operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión del ribosoma adecuados en el ARNm, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Diferentes tipos de células puede usarse con diferentes vectores de expresión. Un promotor ilustrativo para los vectores que se usan en Bacillus subtilis es el promotor AprE; un promotor ilustrativo que se usa en Streptomyces lividans es el promotor A4 (de Aspergillus niger ) ; un promotor ilustrativo que se usa en E. coli es el promotor Lac, un promotor ilustrativo que se usa en Saccharomyces cerevisiae es PGK1 , un promotor ilustrativo que se usa en Aspergillus niger es glaA, y un promotor ilustrativo para Trichoderma reesei es cbhl . El vector puede ser un plásmido, una partícula fago o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un hospedero adecuado, el vector puede replicar y funcionar, independientemente del genoma hospedero, o puede, bajo condiciones adecuadas, integrarse en el genoma en sí. En la presente descripción, el plásmido y vector se usan algunas veces indistintamente. Sin embargo, las presentes composiciones y métodos pretenden incluir otras formas de vectores de expresión que tienen funciones equivalentes y que son, o llegan a ser, conocidos en la materia. Por lo tanto, puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de hospedero/vector de expresión en la expresión de las secuencias de ADN descritas en la presente descripción. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético tales como varios derivados conocidos de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, plásmidos de E. coli que incluyen col El, pCRl, pBR322, pMb9, pUC 19 y sus derivados, plásmidos de variedad de hospederoes más amplia, por ejemplo, RP4, ADN de fago por ejemplo, los numerosos derivados del fago l, por ejemplo, NM989, y otros fagos de ADN, por ejemplo, M13 y fagos filamentosos de ADN de simple cadena, plásmidos de levadura tales como el plásmido 2 m o derivados de este, vectores útiles en células eucariotas, tales como vectores útiles en células animales y vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de expresión. Las téenicas de expresión que usan los vectores de expresión de las presentes composiciones y métodos se conocen en la materia y se describen generalmente en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Coid Spring Harbor Press (1989). Frecuentemente, los vectores de expresión que incluyen las secuencias de ADN descritas en la presente descripción se transforman en un hospedero unicelular mediante la inserción directa en el genoma de una especie particular a través de un evento de integración (ver, por ejemplo, Bennett & Lasure, More Gene Manipulations in Fungí, Academic Press, San Diego, págs.70-76 (1991) y los artículos citados en esta que describen la inserción genómica dirigida en hospedero fúngico).

Como se usa en la presente descripción, “cepa hospedera” o “célula hospedera” se refiere a un hospedero adecuado para un vector de expresión que incluyen ADN de acuerdo con las presentes composiciones y métodos. Las células hospederas útiles en las presentes composiciones y métodos son, generalmente, hospederoes procariotas, eucariotas, que incluyen cualquier microorganismo transformable en el que puede alcanzarse la expresión. Específicamente, cepas hospedero pueden ser Bacillus subtilis , Streptomyces lividans , Escherichia coli , Trichoderma reesei , Saccharomyces cerevisiae o Aspergillus niger. En ciertas modalidades, la célula hospedera puede ser un microbio etanologénico, que puede ser, por ejemplo, una levadura tales como Saccharomyces cerevisiae o un bacteria etanologénico tal como una Zymomonas mobilis . Cuando se usa una Saccharomyces cerevisiae o una Zymomonas mobilis como la célula hospedera, y si el gen beta-glucosidasa no se produce para secretarse de la célula hospedera sino que se expresa intracelularmente, puede introducirse un gen transportador de celobiosa en la célula hospedera para permitir que la beta-glucosidasa expresada intracelularmente actúe sobre el sustrato celobiosa y libere glucosa, la que después será metabolizada posteriormente o inmediatamente por los microorganismos y convertida en etanol.

Las células hospederas se transforman o se transfectan con vectores construidos mediante el uso de téenicas de ADN recombinante. La s células hospederas transformadas pueden ser capaces de uno o ambos de replicar los vectores que codifican Nc3A (y sus derivados o variantes (mutantes)) y expresar el producto peptídico deseado. En ciertas modalidades de acuerdo con las presentes composiciones y métodos, “célula hospedera” significa las células y protoplastos creados a partir de las células de Trichoderma sp.

Los términos “transformado”, “transformado de manera estable”, y “transgénico”, usados con referencia a una célula significa que la célula contiene una secuencia de ácido nucleico no natural (por ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o transportada como un episoma que se mantiene a través de múltiples generaciones.

El término “introducido” en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa “transí ección”, “transformación” o “transducción”, como se conoce en la materia.

Una “cepa hospedera” o “célula hospedera” es un organismo en el que se ha introducido un vector de expresión, fago, virus, u otro constructo de ADN, que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés ( por ejemplo, una beta-glucosidasa). Las cepas hospederas ilustrativas son células microbianas ( por ejemplo, bacterias, hongos filamentosos, y levadura) capaces de expresar el polipéptido de interés. El término “célula hospedera” incluye protoplastos creados a partir de células.

El término “heterólogo”, con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que no es de origen natural en una célula hospedera.

El término “endógeno” con referencia a un polinucleótido o polipéptido se refiere a un polinucleótido o polipéptido de origen natural en la célula hospedera.

El término “expresión” se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido en base a una secuencia de ácido nucleico. El proceso incluye la transcripción y la traducción.

En consecuencia, el proceso de convertir un sustrato de biomasa lignocelulósica a un etanol puede, en algunas modalidades, comprende dos actividades beta-glucosidasa. Por ejemplo, una primera actividad beta-glucosidasa puede aplicarse al sustrato de biomasa lignocelulósica durante la etapa de sacarificación o hidrólisis, y una segunda actividad beta-glucosidasa puede aplicarse como parte del microbio etanologénico en la etapa de fermentación durante la cual se metabolizan los azúcares onoméricos o fermentables que resultaron de la etapa de sacarificación o hidrólisis. La primera y segunda actividades beta-glucosidasa pueden, en algunas modalidades, resultar de la presencia del mismo polipéptido de beta-glucosidasa. Por ejemplo, la primera actividad beta-glucosidasa en la sacarificación puede resultar de la presencia de un polipéptido Nc3A de la invención, mientras que la segunda actividad beta-glucosidasa en la etapa de fermentación puede resultar de la expresión por el microbio etanologénico de una beta-glucosidasa diferente. En otro ejemplo, la primera y segunda actividades beta-glucosidasa pueden resultar de la presencia del mismo polipéptido en la etapa de sacarificación o hidrólisis y la etapa de fermentación. Por ejemplo, el mismo polipéptido Nc3A de la invención puede, en algunas modalidades, proporcionar las actividades beta-glucosidasa tanto para la etapa de hidrólisis o sacarificación como para la etapa de fermentación.

En ciertas otras modalidades, el proceso de convertir un sustrato de biomasa lignocelulósica en etanol puede, comprender dos actividades beta-glucosidasa mientras que la etapa de sacarificación o hidrólisis y la etapa de fermentación se producen de forma simultánea, por ejemplo, en el mismo tanque. Dos o más polipéptidos de beta-glucosidasa pueden contribuir a las actividades beta-glucosidasa, uno de los cuales puede ser un polipéptido Nc3A de la invención.

En ciertas modalidades adicionales, el proceso de convertir una biomasa lignocelulósica en etanol puede comprender una sola actividad beta-glucosidasa mientras que la etapa de sacarificación o hidrólisis o la etapa de fermentación, pero no ambas etapas involucran la participación de una beta-glucosidasa. Por ejemplo, un polipéptido Nc3A de la invención o una composición que comprende el polipéptido Nc3A puede usarse en la etapa de sacarificación. En otro ejemplo, la composición enzimática que se usa para hidrolizar el sustrato de biomasa lignocelulósica no comprende una actividad beta-glucosidasa, mientras que el microbio etanologénico expresa un polipéptido de beta-glucosidasa, por ejemplo, un polipéptido Nc3A de la invención.

Como se usa en la presente descripción, “secuencia señal” significa una secuencia de aminoácidos unida a una porción N-terminal de un polipéptido que facilita la secreción de la forma madura del polipéptido fuera de la célula. Esta definición de una secuencia señal es una funcional. La forma madura del polipéptido extracelular carece de la secuencia señal que está cortada durante el proceso de secreción. Aunque la secuencia señal nativa de Nc3A puede emplearse en aspectos de las presentes composiciones y métodos, pueden emplearse otras secuencias señales no nativas (por ejemplo, sec. con núm. de ident.: 13). El término “maduro”, cuando se refiere a un polipéptido en la presente descripción, significa un polipéptido en su(s) forma(s) final(es) después de la traducción y cualquiera de las modificaciones postraducionales . Por ejemplo, los polipéptidos Nc3A de la invención tienen una o más formas maduras, al menos una de las cuales tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:3.

Los polipéptidos de beta-glucosidasa de la invención pueden mencionarse como “precursores”, “inmaduros”, o “en toda su extensión”, en cuyo caso incluyen una secuencia señal, o pueden mencionarse como “maduros”, en cuyo caso carecen de una secuencia señal. Las formas maduras de los polipéptidos son, generalmente, las más útiles. A menos que se señale de cualquier otra manera, la numeración de los residuos de aminoácidos usada en la presente descripción se refiere a las formas maduras de los polipéptidos de amilasa respectivos. Los polipéptidos de beta-glucosidasa de la invención pueden, además, truncarse para eliminar los N o C-terminales, siempre que los polipéptidos resultantes retengan la actividad beta-glucosidasa.

Los polipéptidos de beta-glucosidasa de la invención pueden ser, además, un polipéptido “quimérico” o “híbrido”, en que incluye al menos una porción de un primer polipéptido de beta-glucosidasa, y al menos una porción de un segundo polipéptido de beta-glucosidasa (los polipéptidos quiméricos de beta-glucosidasa pueden, por ejemplo, derivarse de la primera y segunda beta-glucosidasas mediante el uso de teenologías conocidas que involucran el intercambio de dominios de cada una de las beta-glucosidasas). Los presentes polipéptidos de beta-glucosidasa pueden incluir, adicionalmente, una secuencia señal heteróloga, un epítopo para permitir el seguimiento o la purificación, o similares. Cuando se usa el término “heterólogo” para referirse a una secuencia señal usada para expresar un polipéptido de interés, significa que la secuencia señal, por ejemplo, se deriva de un microorganismo diferente al del polipéptido de interés. Ejemplos de secuencias señales heterólogas adecuadas para expresar los polipéptidos Nc3A en la presente descripción, pueden ser, por ejemplo, las de Trichoderma reesei .

Como se usa en la presente descripción, “unido funcionalmente” o “unido operativamente” significa que una región amortiguadora o un dominio funcional que tiene una actividad conocida o deseada, tales como un promotor, un terminador, una secuencia señal o una región potenciadora, está unido a o enlazado a un objetivo (por ejemplo, un gen o un polipéptido) de tal manera que permite a la región amortiguadora o al dominio funcional controlar la expresión, secreción o función de ese objetivo de acuerdo con su actividad conocida o deseada.

Como se usa en la presente descripción, los términos “polipéptido” y “enzima” se usan indistintamente para referirse a polímeros de cualquier longitud que comprenden residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. En la presente descripción se usan los códigos de una letra o tres letras convencionales para los residuos de aminoácidos. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos abarcan, además, un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por medio de intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado. Dentro de esta definición se incluyen, además, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como también otras modificaciones conocidas en la materia.

Como se usa en la presente descripción, genes “silvestre” y “naturales”, enzimas, o cepas, son las que se encuentran en la naturaleza.

Los términos “en estado natural”, “progenitor”, o “referencia”, con respecto a un polipéptido, se refieren a un polipéptido que ocurre naturalmente que no incluye una sustitución hecha por el hombre, inserción o supresión en una o más posiciones de aminoácido. Similarmente, los términos “silvestre”, “progenitor”, o “referencia”, con respecto a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido de origen natural que no incluye un cambio de nucleósido hecho por el hombre. Sin embargo, un polinucleótido que codifica un polinucleótido silvestre, progenitor, o de referencia no se limita a un polinucleótido de origen natural, sino que abarca cualquier polinucleótido que codifica el polipéptido silvestre, progenitor, o de referencia.

Como se usa en la presente descripción, una “variante de polipéptido” se refiere a un polipéptido que deriva de un polipéptido progenitor (o de referencia) por la sustitución, adición o supresión de uno o más aminoácidos, típicamente, por téenicas de ADN recombinante. Las variantes de polipéptidos pueden diferir del polipéptido progenitor en un pequeño número de residuos de aminoácido. Pueden definirse por su nivel de homología/identidad de la secuencia de aminoácidos primaria con un polipéptido progenitor. Favorablemente, las variantes de polipéptidos tienen al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o aun al menos 99% de identidad de secuencia de aminoácido con un con un polipéptido progenitor.

Como se usa en la presente descripción, una “variante de polinucleótido” codifica una variante de polipéptido, tiene un grado específico de homología/identidad con un polinucleótido progenitor, o híbrida bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido progenitor o el complemento de este. De manera favorable, una variante de polinucleótido tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o aun al menos 99% de identidad de secuencia de nucleótidos con un polinucleótido progenitor o con un complemento del polinucleótido progenitor. Los métodos para determinar el porcentaje de identidad se conocen en la materia y se encuentran descritos anteriormente.

El término “derivado de” abarca los términos “originado de”, “obtenido de” “obtenible de”, “aislado de” y “creado de” y, generalmente, indica que un material especificado encuentra su origen en otro material especificado o tiene características que pueden describirse con referencia al otro material especificado.

Como se usa en la presente descripción, el término “condiciones de hibridación” se refiere a las condiciones bajo las cuales se conducen las reacciones de hibridación. Estas condiciones se clasifican, típicamente, por grado de “rigurosidad” de las condiciones bajo las cuales se mide la hibridación. El grado de rigurosidad puede basarse, por ejemplo, en la temperatura de fusión (Tm, por sus siglas en inglés) del complejo de unión del ácido nucleico o sonda. Por ejemplo, “la rigurosidad máxima” ocurre, típicamente, a aproximadamente Tm -5°C (5°C por debajo de la Tm de la sonda); “alta rigurosidad” a aproximadamente 5-10°C menor que la Tm; “rigurosidad intermedia” a aproximadamente 10-20°C menor que la Tm de la sonda; y “rigurosidad baja” a aproximadamente 20-25°C menor que la Tm. Alternativamente o adicionalmente, las condiciones de hibridación pueden basarse en la sal o las condiciones de potencia iónica de la hibridación, y/o con uno o más lavados de rigurosidad, por ejemplo: 6X SSC = rigurosidad muy baja; 3X SSC = rigurosidad baja a media; IX SSC = rigurosidad media; y 0.5X SSC = rigurosidad alta. Funcionalmente, las condiciones de rigurosidad máxima pueden usarse para identificar las secuencias de ácido nucleico, que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación; mientras que las condiciones de rigurosidad alta se usan para identificar las secuencias de ácido nucleico que tienen aproximadamente un 80% o más de identidad de secuencia con la sonda. Para aplicaciones que requieren selectividad alta es preferible, típicamente, usar condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos (por ejemplo, se usan sal relativamente baja y/o condiciones de temperatura alta).

Como se usa en la presente descripción, el término “hibridación” se refiere al proceso por el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de apareamiento de base, como se conoce en la materia. Más específicamente, “hibridación” se refiere al proceso mediante el que una hebra de ácido nucleico forma un dúplex con, por ejemplo, pares de bases con, una cadena complementaria, como ocurre durante las téenicas de hibridación con transferencia y las técnicas de PCR. Una secuencia de ácido nucleico se considera “selectivamente hibridable” a una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias hibridan específicamente entre sí bajo condiciones de hibridación y lavado de rigurosidad moderada a alta. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo o sonda de unión al ácido nucleico. Por ejemplo, la “rigurosidad máxima” ocurre, típicamente, a aproximadamente Tm-5°C (5 ° menor que la Tm de la sonda); “alta rigurosidad” a aproximadamente 5-10°C menor que la Tm; “rigurosidad intermedia” a aproximadamente 10-20°C menor que la Tm de la sonda; y “rigurosidad baja” a aproximadamente 20-25°C menor que la Tm. Funcionalmente, las condiciones de rigurosidad máxima pueden usarse para identificar las secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridación; aunque la hibridación de rigurosidad intermedia o baja puede usarse para identificar o detectar homólogos de secuencia del polinucleótido.

Las condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia y alta se conocen bien en la materia. Por ejemplo, las hibridaciones de rigurosidad intermedia pueden llevarse a cabo con una incubación a 37°C durante la noche en una solución que comprende formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguida del lavado de los filtros en SSC lx a aproximadamente 37 - 50°C. Las condiciones de hibridación de rigurosidad alta pueden ser hibridación a 65°C y SSC 0.IX (en donde SSC IX = NaCl 0.15 M, citrato Na30.015 M, pH 7.0). Alternativamente, las condiciones de hibridación de rigurosidad alta pueden llevarse a cabo a aproximadamente 42°C en formamida al 50%, SSC 5X, solución de Denhardt 5X, SDS al 0.5% y 100 mg/ml de ADN portador desnaturalizado seguido de lavar dos veces en SSC 2X y SDS al 0.5% a temperatura ambiente y dos veces adicionales en SSC 0.IX y SDS al 0.5% a 42°C. Y las condiciones de hibridación muy rigurosas pueden ser hibridación a 68°C y SSC 0.1X. Aquellos con experiencia en la materia conocen cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y lo similar.

Un ácido nucleico que codifica una variante de beta-glucosidasa puede tener una Tm reducida en 1°C - 3°C o más en comparación con un híbrido formado entre el nucleótido de la sec. con núm. de ident.: 1 y su complemento idéntico.

La frase “sustancialmente similar” o “sustancialmente idéntica”, en el contexto de al menos dos ácidos nucleicos o polipéptidos, significan que un polinucleótido o polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o aun al menos aproximadamente 99% de identidad con una secuencia de referencia o progenitora, o no incluye sustituciones de aminoácido, inserciones, supresiones, o modificaciones hechas solamente para evitar la presente descripción sin añadir funcionalidad.

Como se usa en la presente descripción, un “vector de expresión” se refiere a un constructo de ADN que contiene una secuencia de ADN que codifica un polipéptido específico y está unido, operablemente, a una secuencia de control apropiado capaz de efectuar la expresión de los polipéptidos en un hospedero adecuado. La s secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia del operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión del ribosoma ARNm adecuados y/o las secuencias que controlan la terminación de transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula fago o un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un hospedero adecuado, el vector puede replicar y funcionar independientemente del genoma hospedero, o puede, en algunas instancias, integrarse en el genoma del hospedero.

El término “recombinante” se refiere a un material genético (es decir, ácidos nucleicos, los polipéptidos que codifican, y los vectores y células que comprenden los polinucleótidos) que se ha modificado para alterar su secuencia o características de expresión, tal como, mutación de la secuencia codificante para producir un polipéptido alterado, fusión de la secuencia codificante a aquella de otro gen, colocación de un gen bajo el control de un promotor diferente, expresar un gen en un organismo heterólogo, expresar un gen en niveles elevados o disminuidos, expresar un gen condicional o constitutivamente de manera diferente a su perfil de expresión natural, y lo similar. Generalmente, el hombre ha manipulado los ácidos nucleicos, los polipéptidos y las células recombinantes basados en estos, de manera que no son idénticos a los ácidos nucleicos, polipéptidos y células relacionados encontrados en la naturaleza.

Una “secuencia señal” se refiere a una secuencia de aminoácidos unida a la porción N-terminal de un polipéptido, y que facilita la secreción de la forma madura del polipéptido de la célula. La forma madura del polipéptido extracelular carece de la secuencia señal que está cortada durante el proceso de secreción.

El término “marcador selectivo” o “marcador seleccionable”, se refiere a un gen capaz de expresión en una célula hospedera que permite la facilidad de selección de aquellos hospederoes que contienen un vector o ácido nucleico introducido. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, sustancias antimicrobiales (por ejemplo, higromicina, bleomicina, o cloranlenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, tal como una ventaja nutricional, en la célula hospedera.

El término “elemento amortiguador” se refiere a un elemento genético que controla algún aspecto de la expresión de las secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es un elemento amortiguador que facilita la iniciación de transcripción de una región codificante unida operablemente. Los elementos amortiguadores adicionales incluyen señales de corte y empalme, señales de poliadenilación y señales de terminación.

Como se usa en la presente descripción, “células hospederas” son, generalmente, células de hospederoes procariotas o eucariotas transformadas o transfectadas con vectores construidos por medio del uso de téenicas de ADN recombinante conocidas en la materia. Las células hospederases transformadas pueden replicar los vectores que codifican las variantes del polipéptido o expresar la variante de proteína deseada. En el caso de vectores, que codifican la pre o proforma de la variante de polipéptido, la s variantes, cuando se expresan, se excretan, típicamente, de la célula hospedera al medio de célula hospedera.

El término “introducido”, en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula significa transformación, transducción o transíección. Los medios de transformación incluyen transformación por protoplasto, precipitación de cloruro cálcico, electroporación, ADN desnudo y lo similar, como se conoce en la materia. (Ver, Chang y Cohén (1979) Mol . Gen. Gene t . 168:111-115; Smith et al., (1986) Appl . Env . Microbiol . 51:634; y el artículo de revisión por Ferrari et al., en Harwood, Bacillus, Plenum Publishing Corporation, págs.57-72, 1989).

Las secuencias de polipéptidos “fusionadas” están conectadas, es decir, unidas operativamente, a través de un enlace peptídico entre las dos secuencias de polipéptidos de interés.

El término “hongos filamentosos” se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina, particularmente las especies Pezizomycotina.

Un “microorganismo etanologénico” se refiere a un microorganismo con la capacidad de convertir un azúcar u oligosacárido en etanol.

Otros términos científicos y téenicos tienen el mismo significado a criterio de las personas con conocimiento ordinario en la materia a la cual pertenece esta descripción { Ver, por ejemplo, Singleton y Sainsbury, Dictionary of Microbiology y Molecular Biology, 2.° ed., John Wilcy y Sons, NY 1994; y Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY 1991).

III. Polipéptidos de beta-glucosidasa, polinucleótidos, vectores, y células hospederas A. Polipéptidos Nc3A En un aspecto, las presentes composiciones y métodos proporcionan un polipéptido Nc3A de beta-glucosidasa recombinante, fragmentos de este, o variantes de este que tienen actividad beta-glucosidasa. Un ejemplo de un polipéptido de beta-glucosidasa recombinante se aisló a partir de Neurospora crassa . El polipéptido Nc3A maduro tiene la secuencia de aminoácidos que se expone como la sec. con núm. de ident.:3. Los polipéptidos Nc3A similares, sustancialmente similares pueden producirse en la naturaleza, por ejemplo, en otras cepas o aislados de Neurospora crassa o Neurospora spp. Estos y otros polipéptidos Nc3A recombinantes están abarcados por las presentes composiciones y métodos.

En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante es una variante de polipéptido Nc3A que tiene un grado específico de identidad de secuencia de aminoácidos al polipéptido Nc3A ejemplificado, por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o aun al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.:2 o con la secuencia madura sec. con núm. de ident.:3. La identidad de secuencia puede determinarse por la alineación de la secuencia de aminoácido, por ejemplo, mediante el uso de un programa tal como BLAST, ALIGN, o CLUSTAL, como se describe en la presente descripción.

En ciertas modalidades, los polipéptidos Nc3A recombinantes se producen de forma recombinante, en un microorganismo, por ejemplo, en un organismo hospedero bacteriano o fúngico, mientras que en otras los polipéptidos Nc3A se producen de forma sintética, o se purifican a partir de la fuente nativa (por ejemplo, Neurospora crassa) .

En ciertas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante incluye sustituciones que no afectan sustancialmente la estructura y/o función del polipéptido. Los ejemplos de estas ituciones son las mutaciones conservadoras, como se men en la Tabla I.

I. Sustituciones de aminoácido Las sustituciones que involucran aminoácidos que ocurren en su estado natural se forman, generalmente, al mutar un ácido nucleico que codifica un polipéptido recombinante de Nc3A y, después, al expresar la variante de polipéptido en un organismo. Las sustituciones que involucran aminoácidos de origen no natural o modificaciones químicas a los aminoácidos se forman, generalmente, al modificar, químicamente, un polipéptido Nc3A después de la sintetización por parte de un organismo.

En algunas modalidades, las variantes de polipéptidos Nc3A recombinantes son sustancialmente idénticas a la sec. con núm. de ident.:2 o a la sec. con núm. de ident.:3, lo que significa que no incluyen sustituciones, inserciones, o supresiones de aminoácidos que no afectan significativamente la estructura, la función, o la expresión del polipéptido. La s variantes de polipéptidos Nc3A recombinantes incluirán las diseñadas para sortear la presente descripción. En algunas modalidades, las variantes de los polipéptidos Nc3A recombinantes, las composiciones y métodos que comprenden estas variantes no son sustancialmente idénticas a la sec. con núm. de ident.:2 o a la sec. con núm. de ident.:3, sino que más bien incluyen sustituciones, inserciones, o supresiones de aminoácidos que afectan, en ciertas circunstancias, sustancialmente, la estructura, la función, o la expresión del polipéptido en la presente descripción de tal manera que pueden lograrse características mejoradas, que incluyen, por ejemplo, actividad específica mejorada para hidrolizar un sustrato lignocelulósico, expresión mejorada en un organismo hospedero deseable, termoestabilidad mejorada, estabilidad frente al pH, etc, en comparación con las de un polipéptido de la sec. con núm. de ident.:2 o de la sec. con núm. de ident.:3.

En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante (que incluye una variante de este) tiene actividad beta-glucosidasa. La actividad beta-glucosidasa puede determinarse y medirse mediante el uso de los ensayos descritos en la presente descripción, por ejemplo, los descritos en el Ejemplo 2, o mediante otros ensayos conocidos en la materia.

Los polipéptidos Nc3A recombinantes incluyen fragmentos de polipéptidos Nc3A de “longitud completa” que retienen la actividad beta-glucosidasa. Preferentemente los fragmentos funcionales (es decir, los fragmentos que retienen la actividad beta-glucosidasa) son al menos 100 residuos de aminoácido de longitud (por ejemplo, al menos 100 residuos de aminoácido, al menos 120 residuos de aminoácido, al menos 140 residuos de aminoácido, al menos 160 residuos de aminoácido, al menos 180 residuos de aminoácido, al menos 200 residuos de aminoácido, al menos 220 residuos de aminoácido, al menos 240 residuos de aminoácido, al menos 260 residuos de aminoácido, al menos 280 residuos de aminoácido, al menos 300 residuos de aminoácido, al menos 320 residuos de aminoácido, o al menos 350 residuos de aminoácido de longitud o mayores). Los fragmentos retienen de manera favorable el sitio activo de los polipéptidos precursores en toda su extensión o de los polipéptidos maduros en toda su extensión pero pueden tener supresiones de residuos de aminoácidos que no son fundamentales. La actividad de los fragmentos puede determinarse fácilmente mediante el uso de los ensayos descritos en la presente descripción, por ejemplo, los descritos en el Ejemplo 2, o mediante otros ensayos conocidos en la materia.

En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos y derivados de Nc3A se producen como una proteína de fusión N-y/o C-terminal, por ejemplo, para auxiliar en la extracción, detección y/o purificación y/o para agregar propiedades funcionales a los polipéptidos Nc3A. Los ejemplos de parejas de proteína de fusión incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa (GST), 6XHis, GAL4 (dominios de unión al ADN y/o de activación transcripcional), etiquetas FLAG, MYC u otras etiquetas conocidas para aquellos con experiencia en la materia. En algunas modalidades, se proporciona un sitio de escisión proteolítica entre la pareja de la proteína de fusión y la secuencia del polipéptido de interés para permitir la eliminación de las secuencias de fusión. De manera favorable, la proteína de fusión no impide la actividad del polipéptido Nc3A recombinante. En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante se fusiona a un dominio funcional que incluye un péptido líder, un propéptido, un dominio de unión y/o un dominio catalítico. Las proteínas de fusión están unidas, opcionalmente, al polipéptido Nc3A recombinante a través de una secuencia enlazadora que une el polipéptido Nc3A y el dominio de fusión sin afectar significativamente las propiedades de ningún componente. El enlazador contribuye, opcionalmente, de manera funcional a la aplicación prevista.

La presente descripción proporciona células hospederas diseñadas para expresar uno o más polipéptidos Nc3A de la descripción. Las células hospederas adecuadas incluyen células de cualquier microorganismo ( por ejemplo, células de una bacteria, un organismo del reino protista, un alga, un hongo (por ejemplo, una levadura u hongo filamentoso) u otro microbio) y son, preferentemente, células de una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso.

Las células hospederas adecuadas de los géneros de bacterias incluyen, pero no se limitan a, células de Escherichia, Bacillus , Lactobacillus , Pseudomonas y Streptomyces . Las células adecuadas de especies bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de Escherichia coli , Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis, Lactobacillus brevis, Pseudomonas aeruginosa y Streptomyces lividans .

Las células hospederas adecuadas de los géneros de levadura incluyen, pero no se limitan a, células de S aechar omy ce s, Schizosaccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, y Phaffia . Las células de especies de levadura adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, P. canadensis, Kluyveromyces marxianus y Phaffia rhodozyma .

Las células hospederas adecuadas de hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina . Las células adecuadas de géneros fúngicos filamentosos incluyen, pero no se limitan a, células de Acremonium, Aspergillus , Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis , Chrysoporium, Coprinus, Coriolus, Corynascus, Chaertomium, Cryptococcus , Filobasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces , Penicillium, Phanerochae te, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Scytaldium, Schizophyllum, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes y Trichoderma .

Las células de especies de hongos filamentosos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens , Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens , Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Penicillium purpurogenum , Penicillium canescens , Penicillium solitum, Penicillium funiculosum Phanerochae te chrysosporium, Phlebia radíate, Pleurotus eryngii, Talaromyces flavus, Thielavia terrestris , Trame tes vi llosa Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, y Trichoderma viride .

Los métodos para transformar ácidos nucleicos en estos organismos son muy conocidos en la materia. Por ejemplo, un procedimiento adecuado para transformar células hospederas de Aspergillus se describe en la patente núm. EP 238023.

En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante se fusiona a un péptido señal para, por ejemplo, facilitar la secreción extracelular del polipéptido Nc3A recombinante. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el péptido señal está codificado por una secuencia seleccionada de las sec. con núm. de ident.:13-42. En modalidades particulares, el polipéptido Nc3A recombinante se expresa en un organismo heterólogo como un polipéptido secretado. Por lo tanto, las composiciones y métodos en la presente invención abarcan métodos para expresar un polipéptido Nc3A como un polipéptido secretado en un organismo heterólogo. En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante se expresa intracelularmente en un organismo heterólogo, por ejemplo, cuando el organismo heterólogo es un microbio etanologénico tal como una Saccharomyces cerevisiae o una Zymomonas mohilis . En esos casos, puede introducirse un gen transportador de celobiosa en el organismo mediante el uso de herramientas de ingeniería genética, para que el polipéptido Nc3A actúe sobre el sustrato celobiosa dentro del organismo para convertir la celobiosa en D-glucosaf la que después es metabolizada o convertida por el organismo en etanol.

La presente descripción proporciona, además, casetes de expresión y/o vectores que comprenden los ácidos nucleicos descritos anteriormente. De manera favorable, el ácido nucleico que codifica un polipéptido Nc3A de la descripción se une operativamente a un promotor. Los promotores son muy conocidos en la materia. Cualquier promotor que funciona en la célula hospedera se puede usar para la expresión de una beta-glucosidasa y/o cualquiera de los otros ácidos nucleicos de la presente descripción. Las regiones de control de iniciación o promotores, que son útiles para activar la expresión de ácidos nucleicos de una beta-glucosidasa y/o cualquiera de los otros ácidos nucleicos de la presente descripción en varias células hospederas son numerosos y conocidas para aquellos con experiencia en la materia (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 2004/033646 y las referencias mencionadas en esta). Prácticamente, puede usarse cualquier promotor con la capacidad de activar estos ácidos nucleicos.

Específicamente, cuando se desea una expresión recombinante en un hospedero fúngico filamentoso, el promotor puede ser un promotor fúngico filamentoso. Los ácidos nucleicos pueden estar, por ejemplo, bajo el control de promotores heterólogos. L Looss ácidos nucleicos pueden expresarse, además, bajo el control de promotores constitutivos o inducibles. Los ejemplos de promotores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un promotor de celulasa, un promotor de xilanasa, el promotor 1818 (identificado anteriormente como una proteína altamente expresada por mapeo de EST de Trichoderma) . Por ejemplo, el promotor puede ser, adecuadamente, un promotor de celobiohidrolasa, endoglucanasa, o beta-glucosidasa. Un promotor particularmente adecuado puede ser, por ejemplo, un promotor de celobiohidrolasa, endoglucanasa o beta-glucosidasa de T. reesei . Por ejemplo, el promotor es un promotor de celobiohidrolasa I (cbhl). Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen un promotor de cbhl, cbh2 , egll, egl2, egl3 , egl4, egl5, pkil, gpdl, xynl , o xyn2. Otros ejemplos no limitantes de promotores incluyen un promotor de T. reesei cbhl, cbh2, egll, egl2, egl3, egl4, egl5, pkil, gpdl , xynl o xyn2.

La secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido Nc3A en la presente descripción puede incluirse en un vector. En algunos aspectos, el vector contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido Nc3A bajo el control de una secuencia de control de expresión. En algunos aspectos, la secuencia de control de expresión es una secuencia natural de control de expresión. En algunos aspectos, la secuencia de control de expresión es una secuencia no natural de control de expresión. En algunos aspectos, el vector contiene un marcador selectivo o marcador seleccionable. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido Nc3A está integrada a un cromosoma de una célula hospedera sin un marcador de selección.

Los vectores adecuados son aquellos compatibles con la célula hospedera usada. Los vectores adecuados se pueden derivar, por ejemplo, de una bacteria, un virus (tal como el bacteriófago T7 o un fago derivado de M-13), un cósmido, una levadura o una planta. Los vectores adecuados se pueden mantener en una serie de copias baja, media o alta en la célula hospedera. Los protocolos para obtener y usar los vectores son conocidos para aquellos con experiencia en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° ed., Coid Spring Harbor, 1989).

En algunos aspectos, el vector de expresión incluye, además, una secuencia de terminación. Las regiones de control de terminación se pueden derivar, además, de diversos genes naturales para la célula hospedera. En algunos aspectos, la secuencia de terminación y la secuencia promotora se derivan de la misma fuente.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido Nc3A puede incorporarse en un vector, tal como un vector de expresión, mediante el uso de téenicas estándar (Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).

En algunos aspectos, se puede preferir sobreexpresar un polipéptido Nc3A y/o uno o más de los otros ácidos nucleicos descritos en la presente descripción a concentraciones mucho mayores que las encontradas actualmente en células de origen natural. En algunas modalidades, se puede preferir subexpresar (por ejemplo, mutar, inactivar o eliminar) una beta-glucosidasa endógena y/o uno o más de los otros ácidos nucleicos descritos en la presente descripción a concentraciones mucho menores que las encontradas actualmente en células de origen natural.

B. Polinucleótidos de Nc3a.

Otro aspecto de las composiciones y métodos descritos en la presente descripción es un polinucleótido o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido Nc3A recombinante (que incluye variantes y fragmentos de este) que tiene actividad beta-glucosidasa. En algunas modalidades el polinucleótido se proporciona en el contexto de un vector de expresión para dirigir la expresión de un polipéptido Nc3A en un organismo heterólogo, tal como uno identificado en la presente descripción. El polinucleótido que codifica un polipéptido Nc3A recombinante puede estar unido, operablemente, a los elementos amortiguadores (por ej mplo, un promotor, terminador, potenciador, y lo similar) para ayudar a expresar los polipéptidos codificados.

Un ejemplo de una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido Nc3A recombinante tiene la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 1. Los polinucleótidos similares, que incluyen los sustancialmente idénticos, que codifican polipéptidos y variantes de Nc3A recombinantes pueden producirse en la naturaleza, por ejemplo, en otras cepas o aislados de Neurospora crassa, o Neurospora sp. En vista de la degeneración del código genético, se observará que los polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar los mismos polipéptidos, variantes o fragmentos de Nc3A.

En algunas modalidades, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos Nc3A recombinantes tienen un grado específico de identidad de secuencia de aminoácidos con el polinucleótido ilustrativo que codifica un polipéptido Nc3A, por ejemplo, al menos 80%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o aun al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 2. La homología puede determinarse por la alineación de la secuencia de aminoácido, por ejemplo, mediante el uso de un programa tal como BLAST, ALIGN, o CLUSTAL, como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica un polipéptido Nc3A recombinante se fusiona dentro del marco posterior (es decir, corriente abajo de) una secuencia codificante para un péptido señal para direccionar la secreción extracelular de un polipéptido Nc3A recombinante. Como se describe en la presente descripción, el término “heterólogo”, cuando se usa para referirse a una secuencia señal usada para expresar un polipéptido de interés, significa que la secuencia señal y el polipéptido de interés son de organismos diferentes. Las secuencias señales heterólogas incluyen, por ejemplo, las de otros genes de celulasas fúngicas, tales como, por ejemplo, la secuencia señal de Bgll de Trichoderma reesei, de la sec. con núm. de ident.:13. Se pueden proporcionar vectores de expresión en una célula hospedera heteróloga adecuada para expresar un polipéptido Nc3A recombinante, o adecuada para propagar el vector de expresión antes de introducirlo en una célula hospedera adecuada.

En algunas modalidades, los polinucleótidos que codifican polipéptidos Nc3A recombinantes se hibridan al polinucleótido de la sec. con núm. de ident.: 1 (o al complemento de este) bajo condiciones de hibridación específicas. Los ejemplos de condiciones son condiciones de rigurosidad intermedia, rigurosidad alta y rigurosidad extremadamente alta, que se describen en la presente descripción.

Los polinucleótidos de Nc3A pueden ocurrir en su estado natural o pueden ser sintéticos (es decir, hechos por el hombre), y pueden ser optimizados por codón para expresión en un hospedero diferente, mutado para introducir sitios de clonación o de lo contrario alterado para agregar funcionalidad.

C. Vectores y células hospederas de Nc3A Para producir un polipéptido Nc3A recombinante descrito, el ADN que codifica el polipéptido puede sintetizarse químicamente a partir de secuencias publicadas o puede obtenerse directamente a partir de células hospederas que albergan el gen (por ejemplo, mediante análisis con genoteca de ADNc o amplificación por PCR). En algunas modalidades, el polinucleótido de Nc3A se incluye en un casete de expresión y/o se clona en un vector de expresión adecuado mediante téenicas estándar de clonación molecular. Los casetes o vectores de expresión contienen secuencias que ayudan a la iniciación y terminación de la transcripción (por ejemplo, promotores y terminadores) y, típicamente, pueden contener además uno o más marcadores de selección.

El casete o vector de expresión se introduce en una célula hospedera de expresión adecuada, que expresa entonces el polinucleótido de Nc3A correspondiente. Los hospederoes de expresión adecuados pueden ser microbios bacterianos o fúngicos. El hospedero de expresión bacteriano puede ser, por ejemplo, Escherichia (por ejemplo, Escherichia coli) , Pseudomonas (por ejemplo, P. fluorescens o P. stutzerei) , Proteus (por ejemplo, Proteus mirabilis) , Ralstonia (por ejemplo, Ralstonia eutropha) , Streptomyces , Staphylococcus (por ejemplo, S. carnosus) , Lactococcus (por ejemplo, L. lactis) , o Bacillus (por ejemplo, Bacillus subtilis , Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, etc.). Los hospedero de expresión en hongos pueden ser, por ejemplo, levaduras, que pueden servir como etanologenes. Los hospedero de expresión en levadura pueden ser, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis o Pichia pastoris. Los hospedero de expresión en hongos pueden ser, por ejemplo, hospedero fúngicos filamentosos que incluyen Aspergillus niger, Chrysosporium lucknowense, Myceliophthora thermophila, Aspergillus (por ejemplo, A. oryzae, A. niger, A. nidulans , etc.) o Trichoderma reesei . También son adecuados hospederoes de expresión mamíferos tales como líneas celulares de ratón (por ejemplo, NSO), ovario de hámster chino (CHO) o riñón de hámster neonato (BHK). Otros hospederoes eucariotas tales como los sistemas de expresión viral o de células de insecto (por ejemplo, bacteriófagos tales como M13, fago T7 o Lambda, o virus tales como Baculovirus) también son adecuados para producir el polipéptido Nc3A.

Los promotores y/o secuencias señales asociados con las proteínas secretadas en un hospedero particular de interés son candidatos para el uso en la producción y secreción heterólogas de polipéptidos Nc3A en ese hospedero o en otros hospederoes. Como un ejemplo, en los sistemas de hongos filamentosos, los promotores que dirigen los genes para celobiohidrolasa I (cbhl), glucoamilasa A (glaA), TAKA-amilasa (amyA), xilanasa (exlA), el promotor de gpd cbhl, cbhll, los genes de endoglucanasa egl-eg5, Cel61B, Cel74A, el promotor gpd, Pgkl, pkil, EF-lalfa, tefl, cADNl y hexl son adecuados y pueden derivarse de una serie de organismos diferentes (por ejemplo, A. niger, T. reesei, A. oryzae, A. awamori, A. nidulans) .

En algunas modalidades, el polinucleótido de Nc3A se asocia de forma recombinante con un polinucleótido que codifica una secuencia señal homologa o heteróloga adecuada que conduce a la secreción del polipéptido Nc3A recombinante en el espacio extracelular (o periplásmico), lo que permite, de esta manera, la detección directa de la actividad enzimática en el sobrenadante celular (o espacio periplásmico o lisado). Las secuencias señales adecuadas para Escherichia coli , otras bacterias Gram negativas y otros organismos conocidos en la materia incluyen las que dirigen la expresión de los genes HlyA, DsbA, Pbp, PhoA, PelB, OmpA, OmpT o los Gilí del fago M13. Para Bacillus subtilis, organismos Gram-positivos y otros organismos conocidos en la materia, las secuencias señales adecuadas incluyen adicionalmente las que dirigen la expresión de AprE, NprB, Mpr, AmyA, AmyE, Blac, SacB, y para S. cerevisiae u otra levadura, que incluyen la secuencia señal de toxina asesina, Barí, Suc2, factor de apareamiento alfa, InulA o Ggplp. Las secuencias señales pueden escindirse mediante una serie de peptidasas señales, que las separan así del resto de la proteína expresada. Las secuencias señales de expresión fúngica pueden ser una que se selecciona de, por ejemplo, las sec. con núm. de ident.: 13-37, en la presente descripción. Las secuencias señales de expresión en levaduras pueden ser una que se selecciona de, por ejemplo, las sec. con núm. de ident.:38-40. Las secuencias señales que podrían ser adecuadas para el uso para expresar los polipéptidos Nc3A de la invención en Zymomonas mobilis pueden incluir, por ejemplo, una seleccionada de las sec. con núm. de ident.:41-42. (Linger J.G. et al., (2010) Appl . Environ. Microbiol . 76(19):6360-6369).

En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante se expresa solo o como una fusión con otros péptidos, etiquetas o proteínas localizadas en el N- o C-terminal (por ejemplo, etiquetas 6XHis, HA o FLAG). Las fusiones adecuadas incluyen etiquetas, péptidos o proteínas que facilitan la purificación o la detección por afinidad (por ejemplo, 6XHis, HA, proteína de unión a quitina, tiorredoxina o etiquetas FLAG), así como también las que facilitan la expresión, secreción o procesamiento de las beta-glucosidasas objetivos. Los sitios de procesamiento adecuados incluyen enterocinasa, STE13, Kex2 u otros sitios de escisión de proteasas para la escisión in vivo o in vitro.

Los polinucleótidos de Nc3A se introducen en las células hospederas de expresión mediante una serie de métodos de transformación que incluyen, pero no se limitan a, electroporación, transformación o transfección asistida por lípidos (“lipofección”), transfección mediada químicamente (por ejemplo, CaCl y/o CaP), transformación mediada por acetato de litio ( por ejemplo, de protoplastos de la célula hospedera), transformación biolística por “pistola de genes”, transformación mediada por PEG (por ejemplo, de protoplastos de la célula hospedera), fusión de protoplastos (por ejemplo, mediante el uso de protoplastos bacterianos o eucariotas), transformación mediada por liposomas, Agrobacterium turne faciens, adenovirus u otra transformación o transducción viral o por fago.

D. Medio de cultivo celular Generalmente, el microorganismo se cultiva en un medio de cultivo celular adecuado para producir los polipéptidos Nc3A descritos en la presente descripción. El cultivo se lleva a cabo en un medio de nutrientes adecuado, que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, mediante el uso de los procedimientos y las variaciones conocidos en la materia. El medio de cultivo adecuado, los intervalos de temperatura y demás condiciones para el crecimiento y la producción de celulasa son conocidos en la materia. Como ejemplo no limitante, un intervalo de temperatura típico para la producción de celulasas por Trichoderma reesei es 24°C a 37°C, por ejemplo, entre 25°C y 30°C. 1. Condiciones de cultivos celulares Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos de hongos son muy conocidos en la materia. En algunos aspectos, las células se cultivan en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de uno o más polipéptidos de beta-glucosidasa codificados por un ácido nucleico insertado en las células hospederas. Se puede usar condiciones de cultivos celulares convencionales para cultivar las células. En algunos aspectos, las células se cultivan y se mantienen a una temperatura, mezcla gaseosa y pH adecuados. En algunos aspectos, las células se cultivan en un medio celular adecuado.

IV. Actividades de Nc3A Los polipéptidos Nc3A recombinantes descritos en la presente descripción tienen actividad beta-glucosidasa o una capacidad de hidrolizar celobiosa y liberar D-glucosa a partir de esta. Los polipéptidos Nc3A de la presente invención tienen mayor actividad beta-glucosidasa y mejora o aumento de la capacidad de liberar D-glucosa a partir de celobiosa respecto a la beta-glucosidasa Bgll de alta fidelidad de referencia de Trichoderma reesei, bajo las mismas condiciones de sacarificación. En algunas modalidades, los polipéptidos Nc3A en la presente descripción pueden tener mayor actividad beta-glucosidasa y/o mejora o aumento de la capacidad de liberar D-glucosa a partir de celobiosa respecto a otra beta-glucosidasa B-glu de referencia de Aspergillus niger Como se muestra en el Ejemplo 3, el polipéptido Nc3A recombinante, en comparación con la Bgll de Trichoderma reesei, tiene aproximadamente 50% o menor, aproximadamente 40% o menor, aproximadamente 30% o menor, o aun aproximadamente 20% o menos actividad hidrolizante para un sustrato de cloro-nitro-fenilo-glucósido (CNPG). En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante, en comparación con la B-glu de Aspergillus niger, tiene al menos aproximadamente 10% más, aproximadamente 20% más, aproximadamente 30% más, aproximadamente 50% más, aproximadamente 60% más, aproximadamente 80% más, o aproximadamente 90% más, o aun aproximadamente 2 veces la actividad hidrolizante del sustrato CNPG.

El polipéptido Nc3A recombinante, en comparación con la Bgll de Trichoderma reesei, ha mejorado o aumentado dramáticamente, por ejemplo, al menos aproximadamente el doble, con mayor preferencia, al menos aproximadamente el triple, preferentemente, al menos aproximadamente 4 veces, o aún con mayor preferencia, al menos aproximadamente 5 veces la actividad celobiasa, la cual mide la capacidad de las enzimas para catalizar la hidrólisis de celobiosa, y liberar D-glucosa. En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante, en comparación con la B-glu de Aspergillus niger, tiene aproximadamente 8/9, aproximadamente 7/9, aproximadamente 6/7, aproximadamente 5/6, aproximadamente 2/3, o aun aproximadamente ½ o menos capacidad para catalizar la hidrólisis de celobiosa, y liberar D-glucosa.

En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A recombinante, en comparación con la Bgll de Trichoderma reesei, tiene aproximadamente 1/5 o menor, aproximadamente 1/10 o menor, aproximadamente 1/15 o menor, aproximadamente 1/20 o menor, o aun aproximadamente 1/25 o menor, tal como, por ejemplo, aproximadamente 1/30 o menor, relación de actividad relativa de hidrólisis en CNPG/celobiosa. En algunas modalidades, el polipéptido Nc3A, en comparación con la B-glu de Aspergillus niger, tiene aproximadamente la misma relación de actividad de hidrólisis relativa sobre CNPG/celobiosa.

Como se muestra en el Ejemplo 4, el polipéptido Nc3A recombinante, en comparación con la Bgll de Trichoderma reesei , produjo más glucosa pero igual o menor cantidad de azúcares totales a partir de un sustrato de celulosa dilatada tratada con ácido fosfórico.

Como se muestra en el Ejemplo 5, el polipéptido Nc3A recombinante, en comparación con la Bgll de Trichoderma reesei, produjo más glucosa y alcanzó niveles mayores de conversión de glucano a partir de un sustrato de biomasa tratado previamente con álcali, tal como un sustrato de chala de maíz tratada previamente con amoniaco diluido.

V. Composiciones que comprenden un polipéptido Nc3A de beta-glucosidasa recombinante La presente descripción proporciona composiciones enzimáticas diseñadas (por ejemplo, composiciones de celulasa) o caldos de fermentación enriquecidos con un polipéptido Nc3A recombinante. En algunos aspectos, la composición es una composición de celulasas. La composición de celulasas puede ser, por ejemplo, una composición de celulasas fúngicas filamentosas, tales como una composición de celulasas de Trichoderma . En algunos aspectos, la composición es una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos de celulasas. En algunos aspectos, la composición es un caldo de fermentación que comprende actividad de celulasas, en donde el caldo tiene la capacidad de convertir más de aproximadamente 50% en peso de la celulosa presente en una muestra de biomasa en azúcares. El término “caldo de cultivo de fermentación” y “caldo de cultivo completo”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una preparación enzimática producida mediante la fermentación de un microorganismo diseñado mediante ingeniería genética que se somete a ninguna o a una mínima recuperación y/o purificación posterior a la fermentación. El caldo de fermentación puede ser un caldo de fermentación de un hongo filamentoso, por ejemplo, un caldo de fermentación de Trichoderma, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus , Pyricularia, Myceliophthora o Chrysosporium. Particularmente, el caldo de fermentación puede ser, por ejemplo, un caldo de fermentación de Trichoderma spp. tal como Trichoderma reesei , o Penicillium spp. , tal como un Penicillium funiculosum. Además, el caldo de fermentación puede ser, adecuadamente, un caldo de fermentación libre de células. En un aspecto, cualquiera de las composiciones de celulasas, células o caldo de fermentación de la presente invención puede comprender, además, una o más hemicelulasas.

En algunos aspectos, la composición de caldo de cultivo completo se expresa en T. reesei o en una cepa diseñada de esta. En algunos aspectos el caldo de cultivo completo se expresa en una cepa de T. reesei integrada, en donde una serie de celulasas que incluyen un polipéptido Nc3A se ha integrado en el genoma de la célula hospedera de T. reesei. En algunos aspectos, uno o más componentes de los polipéptidos expresados en la cepa de T. reesei integrada han sido eliminados.

En algunos aspectos, la composición del caldo de cultivo completa se expresa en A. niger o una cepa modificada de este.

Alternativamente, los polipéptidos Nc3A recombinantes pueden expresarse intracelularmente. Opcionalmente, después de la expresión intracelular de las variantes enzimáticas, o la secreción al espacio periplásmico mediante el uso de secuencias señales tales como las mencionadas anteriormente, puede usarse una etapa de permeabilización o lisis para liberar el polipéptido Nc3A recombinante al sobrenadante. La interrupción de la barrera de la membrana se afecta mediante el uso de medios mecánicos tales como ondas ultrasónicas, tratamiento con presión (prensa de French) , cavitación, o mediante el uso de enzimas que digieren las membranas tales como lisozima o mezclas enzimáticas. Una variación de esta modalidad incluye la expresión intracelular de un polipéptido Nc3A recombinante en un microbio etanologénico . Por ejemplo, puede introducirse un transportador de celobiosa por medio de ingeniería genética en el mismo microbio etanologénico, de tal manera que la celobiosa que resulta de la hidrólisis de una biomasa lignocelulósica puede ser transportada al organismo etanologénico, y puede hidrolizarse en él y convertirse en D-glucosa, la que a su vez puede ser metabolizada por el etanologénico.

En algunos aspectos, los polinucleótidos que codifican el polipéptido Nc3A recombinante se expresan mediante el uso de un sistema adecuado de expresión libre de células. En los sistemas libres de células, el polinucleótido de interés se transcribe, típicamente, con la ayuda de un promotor, pero la unión para formar un vector de expresión circular es opcional. En algunas modalidades, el ARN se agrega de forma exógena o se genera sin transcripción y se traduce en sistemas libres de células.

VI. Usos de los polipéptidos Nc3A para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica En algunos aspectos, en la presente invención se proporcionan métodos para convertir biomasa de lignocelulosas en azúcares, el método comprende poner en contacto el sustrato de biomasa con una composición descrita en la presente descripción que comprende un polipéptido Nc3A en una cantidad eficaz para convertir el sustrato de biomasa en azúcares fermentables. En algunos aspectos, el método comprende, adicionalmente, tratar previamente la biomasa con ácido y/o base y/o medios mecánicos u otros medios físicos.

En algunos aspectos el ácido comprende ácido fosfórico. En algunos aspectos, la base comprende hidróxido sódico o amoníaco. En algunos aspectos, los medios mecánicos pueden incluir, por ejemplo, tracción, presión, compresión, trituración, y otros medios para descomponer físicamente la biomasa lignocelulósica en formas físicas más pequeñas. Otros medios físicos pueden incluir, además, por ejemplo, el uso de vapor de agua u otro humo o vapor presurizado para “aflojar” la biomasa lignocelulósica para aumentar la accesibilidad de las enzimas a la celulosa y la hemicelulosa. En ciertas modalidades, el método de tratamiento previo también puede involucrar enzimas que son capaces de descomponer la lignina del sustrato de biomasa lignocelulósica, de tal manera que aumenta la accesibilidad de las enzimas de la composición enzimática que hidroliza la biomasa a la celulosa y las hemicelulosas de la biomasa.

Biomasa. La descripción proporciona métodos y procesos para la sacarificación de la biomasa, mediante el uso de las composiciones enzimáticas de la descripción, que comprenden un polipéptido Nc3A. El término “biomasa”, como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier composición que comprende celulosa y/o hemicelulosa (opcionalmente, además, lignina en materiales de biomasa lignocelulósica). Como se usa en la presente descripción, biomasa incluye, pero no se limita a, semillas, granos, tubérculos, residuos vegetales (tales como, por ejemplo, racimos de frutas vacías de palmeras, o residuos de fibra de palma) o subproductos del procesamiento de alimentos o del procesamiento industrial (por ejemplo, tallos), maíz (que incluye, por ejemplo, mazorcas, chala, y lo similar), pastos (que incluyen, por ejemplo, pasto indio, tal como Sorghastrum nutans; o césped de pradera, por ejemplo, especies Panicum, tal como Panicum virgatum) , cañas perennes (por ejemplo, cañas bravas), madera (que incluye, por ejemplo, astillas, desechos de procesamiento), papel, pulpa y papel recielado (que incluye, por ejemplo, papel de periódico, papel para impresora y lo similar). Otros materiales de biomasa incluyen, pero no se limitan a, papas, soja (por ejemplo, semilla de colza), cebada, centeno, avena, trigo, betabel y bagazo de caña de azúca .

La descripción proporciona, por lo tanto, métodos de sacarificación que comprenden poner en contacto una composición que comprende un material de biomasa, por ejemplo, un material que comprende xilano, hemicelulosa, celulosa, y/o un azúcar fermentable, con un polipéptido Nc3A de la descripción, o un polipéptido Nc3A codificado por un ácido nucleico o polinucleótido de la descripción, o cualquiera de las composiciones de celulasas o de hemicelulasa de origen no natural que comprende un polipéptido Nc3A, o productos para la fabricación de la La biomasa sacarificada (por ejemplo, material lignocelulósico procesado por enzimas de la descripción) puede convertirse en varios productos bio-derivados por medio de procesos tales como, por ejemplo, fermentación microbiana y/o síntesis química. Como se usa en la presente descripción, “fermentación microbiana” se refiere a un proceso de cultivo y recolección de microorganismos de fermentación en condiciones adecuadas. El microorganismo de fermentación puede ser cualquier microorganismo adecuado para usar en un proceso de fermentación deseado para la producción de productos de base biológica. Los microorganismos de fermentación adecuados incluyen, pero no se limitan a, hongos filamentosos, levadura y bacterias. La biomasa sacarificada se puede convertir, por ejemplo, en un combustible (por ejemplo, un biocombustible, tal como un bioetanol, biobutanol, biometanol, un biopropanol, un biodiesel, un combustible de reactor o similares) por medio de fermentación y/o síntesis química. La biomasa sacarificada puede formarse, además, por ejemplo, en un producto químico (por ejemplo, ácido ascórbico, isopreno, 1,3-propanodiol), lípidos, aminoácidos, polipéptidos, y enzimas, por medio de fermentación y/o síntesis química.

Tratamiento previo. Antes de la sacarificación o hidrólisis enzimática y/o la fermentación de los azúcares fermentables que resultan de la sacarificación, la biomasa (por ejemplo, material lignocelulósico) se somete, preferentemente, a una o más etapa(s) de tratamiento previo para producir material de xilano, hemicelulosa, celulosa y/o lignina más accesible o susceptible a las enzimas en la composición enzimática (por ejemplo, la composición enzimática de la presente invención que comprende un polipéptido Nc3A) y, por lo tanto, más sensible a la hidrólisis por la(s) enzima(s) y/o las composiciones enzimáticas.

En algunos aspectos, un método de tratamiento previo adecuado puede involucrar someter el material de biomasa a un catalizador que comprende una solución diluida de un ácido fuerte y una sal de metal en un reactor. El material de biomasa puede ser, por ejemplo, una materia prima o un material secado. Este tratamiento previo puede reducir la energía de activación o la temperatura de hidrólisis de la celulosa y, en última instancia, puede permitir una mayor producción de azúcares fermentables. Ver, por ejemplo, las patentes de los EE UU. núms.6,660,506; 6,423,145.

En algunos aspectos, un método de tratamiento previo adecuado puede implicar someter el material de biomasa a una primera etapa de hidrólisis en un medio acuoso a una temperatura y una presión seleccionados para efectuar, principalmente, la despolimerización de la hemicelulosa sin una despolimerización significativa de celulosa a glucosa. Esta etapa produce una suspensión en la cual la fase líquida acuosa contiene monosacáridos disueltos que resultan de la despolimerización de hemicelulosa y una fase sólida que contiene celulosa y lignina. Después, la suspensión se expone a una segunda etapa de hidrólisis en condiciones que permiten la despolimerización de una porción importante de la celulosa, lo que produce una fase acuosa líquida que contiene productos de despolimerización de celulosa disueltos/solubles. Ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm.5,536,325.

En aspectos adicionales, un método de tratamiento previo adecuado puede involucrar procesar un material de biomasa mediante una o más etapas de hidrólisis con ácido diluido mediante el uso de aproximadamente 0.4% a aproximadamente 2% de un ácido fuerte; seguido del tratamiento del componente lignocelulósico sólido sin reaccionar del material hidrolizado con ácido con deslignificación alcalina. Ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm.6,409,841.

Aún en aspectos adicionales, un método de tratamiento previo adecuado puede involucrar hidrolizar previamente la biomasa (por ejemplo, materiales lignocelulósicos) en un reactor de prehidrólisis; agregar un líquido acídico en el material lignocelulósico sólido para formar una mezcla; calentar la mezcla hasta la temperatura de la reacción; mantener la temperatura de reacción durante un período de tiempo suficiente para fraccionar el material lignocelulósico en una porción solubilizada que contiene al menos 20% de la lignina del material lignocelulósico y una fracción sólida que contiene celulosa; separar la porción solubilizada de la fracción sólida y eliminar la porción solubilizada mientras está a la temperatura de reacción o a una temperatura cercana a ella; y recuperar la porción solubilizada. De esta manera, la celulosa en la fracción sólida facilita la digestión enzimática. Ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,705,369. En una variación de este aspecto, la prehidrólisis puede involucrar alternativamente o adicionalmente la pre-hidrólisis mediante el uso de enzimas que son, por ejemplo, capaces de descomponer la lignina del material de biomasa lignocelulósica.

Aún en aspectos adicionales, los tratamientos previos adecuados pueden involucrar el uso de peróxido de hidrógeno H2O2. Ver Gould, 1984, Biotech, y Bioengr.26:46-52.

En otros aspectos, el tratamiento previo puede comprender, además, poner en contacto un material de biomasa con cantidades estequiométricas de hidróxido de sodio e hidróxido de amonio a una concentración muy baja. Ver Teixeira et al., (1999) Appl. Biochem. y Biotech.77-79:19- En algunas modalidades, el tratamiento previo puede comprender, además, poner una lignocelulosa en contacto con una sustancia química (por ejemplo, una base, tal como carbonato sódico o hidróxido potásico) a un pH de aproximadamente 9 a aproximadamente 14 a temperatura, presión y pH moderados. Ver, la solicitud internacional publicada núm. W02004/081185. Por ejemplo, en un método preferido de tratamiento previo se usa amoníaco. Ese método de tratamiento previo comprende exponer material de biomasa a una concentración baja de amoniaco en condiciones de sólidos elevados. Ver, por ejemplo, la publicación de patente de los EE. UU. núm. 20070031918 y la solicitud internacional publicada núm. WO 06110901.

A. Proceso de sacarificación En algunos aspectos, la presente descripción proporciona un proceso de sacarificación que comprende tratar la biomasa con una composición enzimática que comprende un polipéptido, en donde el polipéptido tiene actividad beta-glucosidasa, y en donde el proceso resulta en al menos aproximadamente 50% en peso (por ejemplo, al menos aproximadamente 55% en peso, 60% en peso, 65% en peso, 70% en peso, 75% en peso, o 80% en peso) de conversión de biomasa en azúcares fermentables. En algunos aspectos, la biomasa comprende lignina. En algunos aspectos, la biomasa comprende celulosa. En algunos aspectos, la biomasa comprende hemicelulosa. En algunos aspectos, la biomasa que comprende celulosa comprende, además, uno o más de xilano, galactano o arabinano. En algunos aspectos, la biomasa puede ser, pero no se limita a, semillas, granos, tubérculos, desperdicios vegetales (por ejemplo, racimos de frutas vacías de palmeras, o residuos de fibra de palma) o subproductos del procesamiento de alimentos o del procesamiento industrial (por ejemplo, tallos), maíz (que incluye, por ejemplo, mazorcas, chala, y lo similar), pastos (que incluyen, por ejemplo, pasto indio, tal como Sorghas trum nutans; o, césped de pradera, por ejemplo, especies Panicum, tales como Panicum virgatum ) , cañas perennes (por ejemplo, cañas bravas), madera (que incluye, por ejemplo, astillas, desechos de procesamiento), papel, pulpa y papel recielado (que incluye, por ejemplo, papel de periódico, papel para impresora y lo similar), papas, soja (por ejemplo, semilla de colza), cebada, centeno, avena, trigo, betabel y bagazo de caña de azúcar. En algunos aspectos, el material que comprende la biomasa se somete a uno o más métodos/etapas de tratamiento previo antes del tratamiento con el polipéptido. En algunos aspectos, la sacarificación o hidrólisis enzimática comprende, adicionalmente, tratar la biomasa con una composición enzimática que comprende un polipéptido Nc3A de la invención. La composición enzimática puede, por ejemplo, comprender una o más de otras celulasas, además del polipéptido Nc3A. Alternativamente, la composición enzimática puede comprender una o más de otras he icelulasas. En ciertas modalidades, la composición enzimática comprende un polipéptido Nc3A de la invención, una o más de otras celulasas, una o más hemicelulasas. En algunas modalidades, la composición enzimática es una composición de caldo de cultivo completo.

En algunos aspectos, se proporciona un proceso de sacarificación que comprende tratar un material de biomasa lignocelulósico con una composición que comprende un polipéptido, en donde el polipéptido tiene al menos aproximadamente 80% (por ejemplo, al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:2, y en donde el proceso resulta en al menos aproximadamente 50% (por ejemplo, al menos aproximadamente 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, o 90%) en peso de conversión de biomasa en azúcares fermentables. En algunos aspectos, el material de biomasa lignocelulósica se ha sometido a uno o más métodos/etapas de tratamiento previo como se describe en la presente descripción.

Otros aspectos y modalidades de las presentes composiciones y métodos resultarán evidentes a partir de la descripción antes mencionada y los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar ciertas modalidades y aspectos preferidos de la presente invención y no deberá interpretase como limitante.

Ejemplo 1 1-A. Clonación. & Expresión de expresión génica de Nc3A y Bgll de referencia de T. reesei l-A-a. Construcción del vector de expresión de T. reesei bgll La porción N-terminal del gen natural bgll de b-glucosidasa de T. reesei se optimizó por codones (ADN 2.0, Menlo Park, CA). Esta porción sintetizada comprendió las primeras 447 bases de la región codificante de esta enzima. Después, este fragmento se amplificó por PCR con el uso de los iniciadores SK943 y SK941 (a continuación). La región restante del gen bgll natural se amplificó por PCR a partir de una muestra de ADN genómico extraído de la cepa de T. reesei RL-P37 (Sheir-Neiss, G et al . , (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53), con el uso de los iniciadores SK940 y SK942 (más abajo). Estos dos fragmentos de PCR del gen bgll se fusionaron entre sí en una reacción de PCR de fusión con el uso de los iniciadores SK943 y SK942: iniciador directo SK943: (5'- CACCATGAGATATAGAACAGCTGCCGCT- 3') (sec. con núm. de ident.:5) iniciador inverso SK941: (5'- CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG-3') (sec. con núm. de ident.: 6) iniciador directo (SK940): (5'- CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGGCGGTCG-3') (sec. con núm. de ident.:7) iniciador inverso (SK942): (5'- CCTACGCTACCGACAGAGTG-3 ') (sec. con núm. de ident.:8) Los fragmentos de PCR de fusión resultantes se clonaron en el vector de entrada Gateway® pENTR™/D-TOPO® (Figura 1), y se transformaron en células químicamente competentes de E. coli One Shot® TOPI O (Invitrogen) lo que produce el vector intermedio, pENTR TOPO-Bgll(943/942) (Figura 1). Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN insertado. El vector pENTR-943/942 con la secuencia correcta de bgll se recombinó con pTrex3g con el uso de una reacción LR clonase® (ver los protocolos descritos por Invitrogen) . La mezcla de reacción LR clonase se transformó en células químicamente competentes de E. coli One Shot®TOP10 (Invitrogen), lo que produce el vector de expresión, pTrex3g 943/942 (Figura 2). El vector contenía, además, el gen Aspergillus nidulans amdS que codifica acetamidasa, como un marcador seleccionable para la transformación de T. reesei . El casete de expresión se amplificó por PCR con los iniciadores SK745 y SK771 (a continuación) para generar el producto para transformación .

Iniciador directo SK771: (5' - GTCTAGACTGGAAACGCAAC -3') (sec. con núm. de ident.:9) iniciador inverso SK745: (5' GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC -3') (sec. con núm. de ident.:10) 1-A-b. Construcción del vector de expresión de nc3a El marco de lectura abierto del gen de la beta-glucosidasa se amplificó por PCR mediante el uso de ADN genómico extraído a partir de Neurospora crassa como plantilla. El marco de lectura abierto se amplificó con la secuencia señal nativa. El termocielador de PCR usado fue el amplificador de ADN DNA Engine Tetrad 2 Peltier (BioRad Laboratories). La ADN polimerasa usada fue PfuUltra II Fusión HS ADN Polymerase (Stratagene) o una ADN polimerasa con corrección de lectura de calidad similar. Los iniciadores usados para amplificar el marco de lectura abierta fueron de la siguiente manera: Nc3A-F: 51-CAC CAT GAA GTT CGC CAT TCC GCT TG -3' (sec. con núm. de ident.:11) Nc3A-R: 5'-TCA GGG AAG AAC CTC CTC GAG ATC CAA-3' (sec. con núm. de ident.:12) Los iniciadores directos Nc3A-F incluyeron cuatro nucleótidos adicionales (secuencias - CACC) en el extremo 5' para facilitar la clonación direccional en pENTR/D-TOPO. El producto de PCR del marco de lectura abierto se purificó con el uso de un kit de purificación por PCR Qiaquick (Qiagen, Valencia, CA). El producto de PCR purificado se clonó inicialmente en el vector pENTR/D-TOPO (Invitrogen), se transformó en células químicamente competentes TOPIO de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) y sembró en placas de LA que contenían 50 ppm de canamicina. El ADN de plásmidos se obtuvo a partir de los transformantes de E. coli con el uso de un kit de preparación de plásmidos QIAspin (Qiagen).

Los datos de la secuencia para el ADN insertado en el vector pENTR/D-TOPO se obtuvo con el uso de los iniciadores directos e inversos M13. Un vector pENTR/D-TOPO con la secuencia de ADN correcta del marco de lectura abierto se recombinó con el vector de destino pTrex3gM (Figura 2) mediante el uso de la mezcla de reacción LR clonase (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El producto de la reacción de LR clonasa se transformó posteriormente en células químicamente competentes TOPIO de E. coli que, después, se colocaron en placas de LA que contienen 50 ppm de carbenicilina. El constructo pExpression resultante fue pTrex3gM que contenía el marco de lectura abierto Nc3A y el marcador de selección acetamidasa de Aspergillus t ubingensis ( amdS). El ADN del constructo pExpresión se aisló mediante el uso de un kit de minipreparaciones de Qiagen y se usó para la transformación de Trichoderma reese i .

El plásmido pExpresión o un producto de PCR del casete de expresión se transformó en una cepa de T. reesei de seis supresiones (ver, por ejemplo, la descripción en la publicación de solicitud de patente internacional publicada núm. WO 2010/141779) mediante el uso del método de protoplasto mediado por PEG con ligeras modificaciones como se describe más abajo. Para la preparación de protoplastos, las esporas se cultivaron durante 16-24 h a 24°C en medio mínimo MM de Trichoderma, que contenía 20 g/L de glucosa, 15 g/1 de KH2P04, pH 4.5, 5 g/1 de (NH4)2SO4, 0.6 g/1 de MgS04x7H2O, 0.6 g/1 de CaCl2 x 2H20, 1 mi 1000 X de solución de oligoelementos de T. reesei (que contenía 5 g/1 de FeS04 x 7H20, 1.4 g/1 de ZnS04 x 7H20, 1.6 g/1 de MnS04 x H20, 3.7 g/1 de CoCl2 x 6H20) con agitación a 150 rpm. Las esporas de germinación se recolectaron por centrifugación y se trataron con 50 mg/ml de solución Glucanex G200 (Novozymes AG) para lisar las paredes de las células fúngicas. Se realizó más preparación de los protoplastos de conformidad con un método descrito por Penttilá et al. (1987) Gene 61:155-164. Las mezclas de transformación, que contenían aproximadamente 1 pg de ADN y l-5x 107 de protoplastos en un volumen total de 200 ml, se trataron individualmente con 2 mi de solución de PEG al 25%, se diluyeron con 2 volúmenes de sorbitol 1.2 M/Tris 10 mM, pH 7.5, CaCl2 10 mM, se mezclaron con agarosa superior selectiva MM al 3% que contiene uridina de 5 mM y acetamida de 20 mM. Las mezclas resultantes se vertieron en una placa de agarosa selectiva al 2% que contiene uridina y acetamida. Las placas se incubaron, adicionalmente, por 7-10 d a 28°C antes de volver a recolectar los transformantes en placas con MM fresco que contienen uridina y acetamida. Las esporas de los clones independientes se usaron para inocular un medio de fermentación en matraces de agitación.

El medio de fermentación era 36 mi de caldo de cultivo definido que contiene glucosa/soforosa y 2 g/1 de uridina, tal como el medio mínimo de glicina (6.0 g/1 de glicina; 4.7 g/1 de (NH4)2SO4; 5.0 g/1 de KH2P04; 1.0 g/1 de MgS04«7H2O; 33.0 g/1 de PIPPS; pH de 5.5) con adición estéril posterior de mezcla de glucosa/soforosa a ~2% como la fuente de carbono, 10 ml/1 de 100 g/1 de CaCl2, 2.5 l/1 de oligoelementos de T. reesei (400X): 175 g/1 de ácido cítrico anhidro; 200 g/1 de FeS04*7H20; 16 g/1 de ZnS04»7H20; 3.2 g/1 de CuS0·5H20; 1.4 g/1 de MnS04«H20; 0.8 g/1 H3BO3, en 250 mi Thomson Ultra Yield Flasks (Thomson Instrument Co., Oceanside, CA). 1-A-c. Construcción de un vector lanzadera de levadura pSCll Un vector lanzadera de levadura puede construirse de acuerdo con el mapa del vector de la Figura 5. Este vector puede usarse para expresar intracelularmente un polipéptido Nc3A en Saccharomyces cerevisiae . Puede introducirse un transportador de celobiosa en la Saccharomyces cerevisiae en el mismo vector lanzadera o en un vector separado mediante el uso de métodos conocidos, tales como, por ejemplo, los descritos por Ha et al., (2011) en PNAS, 108(2): 504-509.

La transformación de los casetes de expresión puede realizarse mediante el uso del kit de transformación de levaduras EZ. Los transformantes pueden seleccionarse mediante el uso del medio YSC, que contiene 20 g/1 de celobiosa. La introducción exitosa de los casetes de expresión en la levadura puede confirmarse por PCR de colonias con iniciadores específicos.

Las cepas de levadura pueden cultivarse de acuerdo con métodos y protocolos conocidos. Por ejemplo, pueden cultivarse a 30°C en un medio YP (10 g/1 de extracto de levadura, 20 g/1 de Bacto peptona) con 20 g/1 de glucosa. Para seleccionar los transformantes mediante el uso de un marcador auxotrófico aminoacídico, puede usarse el medio completo sintético de levadura (YSC), que contiene 6.7 g/1 de base nitrogenada de levadura más 20 g/1 de glucosa, 20 g/1 de agar, y CSM-Leu-Trp-Ura para suministrar nucleótidos y aminoácidos. 1-A-d. Construcción de un vector de integración pZCll de Zymomonas mobilis.

Un vector de integración pZCll de Zymomonas mobilis puede construirse de acuerdo con el mapa del vector de la Figura 6. Este vector puede usarse para expresar intracelularmente un polipéptido Nc3A en Zymomonas mobilis.

Puede introducirse un transportador de celobiosa en la Zymomonas mobilis en el mismo vector de integración o en un vector separado mediante el uso de métodos conocidos para introducir esos transportadores en una célula bacteriana, tales como, por ejemplo, los descritos por Sekar et al . , (2012) Applied Environmental Microbiology, 78(5):1611-1614.

La introducción exitosa del vector de integración así como también del gen del transportador de celobiosa puede confirmarse mediante el uso de varios enfoques conocidos, por ejemplo, por PCR mediante el uso de iniciadores confirmatorios diseñados específicamente para este propósito.

Las cepas de Zymomonas mobilis pueden cultivarse y fermentarse de acuerdo con métodos conocidos, tales como, por ejemplo, los descritos en la patente de los EE. UU. núm. 7,741,119. 1-B. Purificación de Bgll de T. reesei & Nc3A La Bgll de T. reesei se sobreexpresó en, y se purificó a partir de, el caldo de cultivo de fermentación de una cepa hospedera de Trichoderma reesei de seis supresiones (ver, por ejemplo, la descripción en la publicación de solicitud de patente internacional publicada núm. WO 2010/141779). Un caldo de cultivo concentrado se cargó en una columna G25 SEC (GE Healthcase Bio-Sciences) y se le hizo intercambio de amortiguador contra acetato sódico 50 mM, pH 5.0. La Bgll intercambiada con amortiguador se cargó, después, en una columna de 25 mi compactada con matriz de afinidad de amino bencil-S-glucopiranosil sefarosa. Después del extensivo lavado con cloruro sódico 250 mM en acetato sódico 50 mM, pH 5.0, la fracción unida se eluyó con glucosa 100 mM en acetato sódico 50 mM y cloruro sódico 250 M, pH 5.0. Las fracciones eluidas que resultaron positivas para la actividad cloro-nitro-fenil glucósido (CNPG) se agruparon y se concentraron. Una sola banda que corresponde al peso molecular de la Bgll de T. reesei en SDS-PAGE y confirmada por espectrometría de masa verificó la pureza de la Bgll eluida. Se determinó por absorbancia a 280 nm que la concentración final de la reserva era 2.2 mg/ml.

Un Nc3A expresado por Tricoderma reesei, como se describió anteriormente, puede purificarse a partir de un caldo de cultivo de fermentación concentrado al diluir primero 100 mg en un amortiguador MES 50 mM, pH 6.0. El Nc3A puede enriquecerse al cargar 2 mg de proteína por mi de resina en una resina de intercambio iónico SP Sefarosa (GE Healthcare) cargada a pH 6. Después, el Nc3A puede eluirse en el flujo pasante. Después, el Nc3A enriquecido puede concentrarse mediante el uso de una membrana con peso molecular de corte 10,000 (Vivaspin, GE Healthcare) hasta un volumen 5 veces inferior al volumen original. Los otros componentes de fondo se separan del Nc3A al agregar sulfato amónico al 40% (p/v) en modo por lotes. El Nc3A puro puede recobrarse en el sobrenadante después de la centrifugación. Después, el Nc3A puede dializarse y concentrarse de forma simultánea en amortiguador MES 50 mM, pH 6.0, mediante el uso de una membrana con peso molecular de corte 10,000 (Vivaspin, GE Healthcare). La actividad y la pureza de Nc3A pueden ensayarse mediante el ensayo de cloro-nitro-fenil glucósido y SDS-PAGE, respectivamente. Después el sobrenadante puede dializarse extensivamente contra MES 50 mM, amortiguador de NaCl 100 mM, pH 6.0 mediante el uso de un casete de diálisis de membrana con peso molecular de corte 7,000 (PIERCE). La actividad del lote final de Nc3A puede determinarse mediante el ensayo de cloro-nitro-fenil glucósido. La concentración puede determinarse mediante el ensayo del ácido bicinconínico (PIERCE) y mediante el ensayo de absorbancia a una longitud de onda de 280 nm mediante el uso de un coeficiente de extinción molar calculado por GPMAW v 7.0.

Dos reservas de concentraciones de Nc3A un poco diferentes se prepararon para el propósito de estos experimentos descritos aquí, una a 0.64 mg/ml en concentración, mientras que la otra a 0.72 mg/ml en concentración.

Ejemplo 2, Varios ensayos 2-A. Medición de la concentración de la proteína mediante UPLC Se usó un sistema Agilent HPLC 1290 Infinity para la cuantificación de la proteína con una Columna Waters ACQUITY UPLC BEH C4 (1.7 mm, 1 x 50 mm). Se usó un programa de seis minutos con un gradiente inicial de 5% a 33% de acetonitrilo (Sigma-Aldrich) en 0.5 min, seguido de un gradiente de 33% a 48% en 4.5 min y, después, un gradiente de etapa para 90% de acetronitrilo. Se usó una curva estándar de proteína basada en la Bgll purificada de Trichoderma reesei para cuantificar los polipéptidos Nc3A. 2-B. Ensayo de hidrólisis con cloro-nitro-fenil-glucósido (CNPG) Se colocó doscientos (200) ml de un amortiguador de acetato sódico 50 mM, pH 5, en los pocilios individuales de una placa de microtitulación. Además, cinco (5) ml de enzima, diluidos en amortiguador de acetato sódico 50 mM, pH 5, se agregaron en pocilios individuales. La placa se recubrió y se dejó que se equilibrara a 37°C durante 15 min en un Eppendorf Thermomixer. Se agregó veinte (20) m? de 2-cloro-4-nitrofenil-beta-D-glucopiranosido 2 mM (CNPG, Rose Scientific Ltd., Edmonton, CA) preparado en agua Millipore en pocilios individuales y la placa se trasladó rápidamente a un espectrofotómetro (SpectraMax 250, Molecular Devices). Se realizó una lectura cinética a OD 405 nm durante 15 min y los datos se registraron como la Vmax. Se usó el coeficiente de extinción para CNP para convertir la Vmax de unidades de OD/s a mM de CNP/s. La actividad específica (mM CNP/s/mg proteína) se determinó al dividir mM CNP/s por los mg de proteína enzimática que se usó en el ensayo. Se determinó que el error estándar para el ensayo CNPG fue 3%. 2-C. Ensayo de hidrólisis de celobiosa La actividad celobiasa se determinó a 50°C mediante el uso del método de Ghose, T.K. Pur & Applied Chemistry, 1987, 59 (2), 257-268. Las unidades de celobiosa (derivada como se describe en Ghose) se definen como 0.0926 dividido por la cantidad de enzimas requerida para liberar 0.1 mg de glucosa en las condiciones del ensayo. Se determinó que el error estándar para el ensayo de celobiasa fue 10%. 2-D. Preparación de celulosa dilatada tratada con ácido fosfórico (PASC) La celulosa dilatada tratada con ácido fosfórico (PASC) se preparó a partir de Avicel con el uso de un protocolo adaptado de Walseth, TAPPI 1971, 35:228 y Wood, Biochem. J. 1971, 121:353-362. En pocas palabras, Avicel PH-101 se solubilizó en ácido fosfórico concentrado y, después, se precipitó con el uso de agua desionizada fría. La celulosa se recolectó y se lavó con más agua para neutralizar el pH. Se diluyó a 1% de sólidos en acetato sódico 50 mM pH5.

Ejemplo 3. Mejora del desempeño de la hidrólisis de Nc3A sobre la Bgll de referencia de Trichoderma reesei o sobre la B-glu de referencia de Aspergillus niger, como se observa en los d CNPG celobiasa. 3-A. Actividad CNPG y celobiasa de las beta-glucosidasas producidas en matraz de agitación La concentración de Nc3A en el caldo de cultivo crudo del matraz de agitación se midió mediante UPLC (descrito en la presente descripción) y se determinó que era 0.64 g/1. Se incluyeron dos celobiohidrolasas en los siguientes experimentos como controles de la actividad beta-glucosidasa en el fondo de expresión de la cepa y estuvieron por debajo del límite de detección de los ensayos. La Bgll purificada de Trichoderma reesei se usó de una reserva de 2.2 mg/ml (medición a A280). La beta-glucosidasa B-glu purificada de A. niger se obtuvo de Megazyme International, sin BSA (Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Irlanda, núm. de lote 031809).

Se midió la actividad de cada enzima sobre los sustratos modelos cloro-nitro-fenil-glucósido (CNPG) y celobiosa. Los ensayos se llevaron a cabo a la temperatura en el protocolo estándar; CNPG a 37°C y celobiosa a 50°C.

Tabla 3-1.

Nc3A tenía aproximadamente 1/5 de la actividad sobre CNPG que la Bgll de Trichoderma reesei , y una actividad de hidrólisis de celobiosa 5 veces mayor (o actividad celobiasa). Nc3A tenía aproximadamente el doble de la actividad sobre CNPG que la B-glu de Aspergillus niger, pero aproximadamente 40% o menos actividad sobre la celobiosa que la B-glu de Aspergillus niger. Las celobiohidrolasas no tenían actividad sobre la celobiosa (no se observó glucosa en ninguno de los pocilios).

Tabla 3-2.

Para comparar la actividad de cada molecula independiente de la determinación de la proteína, se calculó la relación de la actividad CNPG a la de celobiasa. La relación de actividades de hidrólisis sobre CNPG/celobiosa para Nc3A fue aproximadamente 30 veces menor que la relación de las actividades de hidrólisis sobre CNPG/celobiosa para Bgll de Trichoderma reesei . La relación de las actividades de hidrólisis sobre CNPG/celobiosa para Nc3A fue aproximadamente la misma que la relación de las actividades de hidrólisis sobre CNPG/celobiosa para B-glu de Aspergillus niger. de la hidrólisis de los polipeptidos Nc3A sobre sustratos PASC.

Las beta-glucosidasas se agregaron de 0-10 mg proteína/g celulosa a una carga constante de 10 mg proteína/g de glucano de celulasa completa de fondo producida por una cepa descrita en la solicitud de patente internacional publicada núm. WO 2011/038019, que expresa Fv43D, Fv3A, Fv51A, AfuXyn2, EG4, y etc., a una concentración de proteína total de 88.8 g/1). Las mezclas se usaron para hidrolizar celulosa dilatada tratada con ácido fosfórico (PASC). Cada dosis de muestra se ensayó por cuadruplicado.

Todas las diluciones de enzimas se realizaron en 50 mM de amortiguador de acetato sódico, pH 5.0. Ciento cincuenta (150) ml de PASC al 0.6% frío se agregaron a 30 ml de solución enzimática en placas de microtitulación (NUNC fondo plano PS, núm. de cat. 269787). Por lo tanto la mezcla enzimática contenía 10 mg de proteína/g de glucano de la celulasa completa más 0-10 mg de Nc3A o Bgll/g de glucano. Las placas se recubrieron con sellos de aluminio para placas y se incubaron durante 1.5 h a 50°C, 200 rpm en una incubadora/agitador Innova. La reacción se detuvo con 100 m? de Glicina 100 mM, pH 10, se filtró (placa de filtrado al vacío de Millipore núm. de cat. MAHVN45) y los azúcares solubles se midieron en un HPLC 5042-1385 de Agilent con una columna Aminex HPX-87P.

El porcentaje de conversión de glucano se determinó como (mg glucosa + mg celobiosa + mg celotriosa) / mg celulosa en la reacción.

Los resultados se indican en las Figuras 3A-3C. Las líneas horizontales a aproximadamente 46% y 62.5% de conversión representan 10 mg/g y 20 mg/g de carga de solo las actividades de fondo de celulasa completa.

Nc3A produjo más glucosa que la misma dosis de Bgll de T. reesei . Esto es consistente con que Nc3A tiene mayor actividad celobiasa que Bgll de T. reesei . Cuando la concentración de azúcares solubles totales, que incluyen glucosa y celobiosa, se midió para determinar el% de conversión de glucano, Nc3A superó a la Bgll de T. reesei . Ejemplo 5. Mejora del desempeño de la hidrólisis de los polipéptidos Nc3A sobre sustratos de chala de maíz tratada previamente con amoniaco diluido^ En este experimento, las beta-glucosidasas se agregaron en dosis crecientes a una carga constante de 10 mg proteína/g de glucano de una celulasa completa producida por una cepa de Trichoderma reesei diseñada mediante ingeniería genética de acuerdo con la publicación de la solicitud internacional de patente núm. WO 2011/038019.

Las mezclas se usaron para hidrolizar DACS durante 2 días a 50°C. Para preparar la mezcla, se agregó Bgll de Trichoderma reesei al ensayo de hidrólisis a partir de una reserva purificada de 2.2 g/1 de proteína total. Se agregó Nc3A de una muestra concentrada de 0.72 mg/ml. La chala de maíz tratada previamente con amoniaco diluido (DACS) se suspendió en acetato sódico 20 mM, pH 5 para un contenido final de 7% de sólidos. De ser necesario, la suspensión se ajustó a pH 5 y la suspensión se transfirió a placas de microtitulación de 96 pocilios.

La chala de maíz tratada previamente con amoniaco diluido en las placas de microtitulación se preparó como se describió anteriormente. Todas las enzimas se cargaron sobre la base de mg proteína/g de glucano en el sustrato. Todas las diluciones de enzimas se realizaron en 50 mM de amortiguador de acetato sódico, pH 5.0. Treinta (30) ml de solución enzimática se agregaron a 45 ug de sustrato por pocilio en las placas de microtitulación. Las placas se recubrieron con sellos de lámina de metal y se incubaron durante 2 días a 50°C, 200 rpm en una incubadora/agitador Innova. La reacción se detuvo con 100 ml de Glicina 100 mM, pH 10, se filtró y los azúcares solubles se midieron por HPLC (serie Agilent 100 equipado con una columna de extracción de cenizas (Biorad 125-0118) y una columna de carbohidratos (Aminex HPX-87P). La fase móvil fue agua con un régimen de flujo de 0.6 ml/min y 20 min de tiempo de ejecución. Una curva estándar de glucosa se generó y se usó para la cuantificación.

El porcentaje de conversión de glucano se define como (mg glucosa + mg celobiosa + mg celotriosa) / mg celulosa en el sustrato.

Los resultados se muestran en las Figuras 4A-4C.

Nc3A superó a la Bgll de Trichoderma reesei en todas las dosis sún se midió por el nivel de conversión de glucano, en la cantidad de glucosa producida. Nc3A y Bgll parecieron eficaces de forma similar en la eliminación de la celobiosa de la mezcla de sacarificación.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:2 o la sec. con núm. de ident.:3, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad beta-glucosidasa.

2. El polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad de beta-glucosidasa mejorada en comparación con Bgll de Trichoderma reesei cuando el polipéptido recombinante y la Bgll de Trichoderma reesei se usan para hidrolizar sustratos de biomasa lignocelulósica.

3. El polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la mejora de la actividad beta-glucosidasa es un aumento de la actividad celobiasa.

4. El polipéptido recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la mejora de la actividad beta-glucosidasa es un incremento del rendimiento de glucosa a partir de una biomasa lignocelulósica bajo las mismas condiciones de sacarificación.

5. El polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la biomasa lignocelulósica se somete a un tratamiento previo antes de la sacarificación.

6. El polipéptido recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:2 o sec. con núm. de ident.:3.

7. El polipéptido recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:2 o sec. con núm. de ident.:3.

8. Una composición que comprende el polipéptido recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque comprende además, una o más de otras celulasas.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la una o más de otras celulasas se seleccionan de ninguna o una o más de otras beta-glucosidasas, una o más celobiohidrolasas, y una o más endoglucanasas.

10. La composición que comprende los polipéptidos recombinantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque comprende además, una o más hemicelulasas.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizada porque comprende además, una o más hemicelulasas.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la una o más hemicelulasas se seleccionan a partir de una o más xilanasas, una o más beta-xilosidasas, y una o más L-arabinofuranosidasas.

13. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica el polipéptido recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

14. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido comprende, adicionalmente, una secuencia del péptido señal.

15. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia del péptido señal se selecciona del grupo que consiste en las sec. con núms. de ident.:13-42.

16. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en combinación operativa con una secuencia amortiguadora.

17. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 16.

18. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la célula hospedera es una célula bacteriana o una célula fúngica.

19. Una composición caracterizada porque comprende la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17 o 18 y un medio de cultivo.

20. Un método para producir una beta-glucosidasa, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17 o 18 en un medio de cultivo, bajo condiciones adecuadas para producir la beta-glucosidasa.

21. Una composición, caracterizada porque comprende la beta-glucosidasa producida de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 20 en sobrenadante del medio de cultivo.

22. Un método para hidrolizar un sustrato de biomasa lignocelulósica, caracterizado porque comprende poner en contacto el sustrato de biomasa lignocelulósica con el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o la composición de conformidad con la reivindicación 21, para producir una glucosa y otros azúcares.