KR101403489B1

KR101403489B1 - 신규한 셀룰로시마이크로비움 펀케이 ｈｙ―１３ 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제

Info

Publication number: KR101403489B1
Application number: KR1020090026366A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 배경숙; 김성욱; 정태숙; 오현우; 김도영; 신동하
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2014-06-11
Also published as: KR20100107966A

Abstract

본 발명은 자일라나제를 생산하는 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13) 균주에 관한 것으로, 구체적으로 무척추동물로부터 분리한, 헤미셀룰로스 등과 같은 섬유소 기질에 대한 분해능이 우수한 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주에 관한 것이다. 상기 균주 및 이로부터 생산된 자일라나제는 다양한 식물성 사료 원료에 첨가하여 사료 가치를 대폭 향상시키는데 사용할 수 있다.

셀룰로시마이크로비움 펀케이, 자일라나제, 자일란, 사료첨가용 효소

Description

신규한 셀룰로시마이크로비움 펀케이 ＨＹ―１３ 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제{Novel Cellulosimicrobium funkei HY-13 strain and xylanase produced from it}

본 발명의 신규한 자일라나제를 생산하는 미생물에 관한 것이다.

자연계에 존재하는 고정 탄소의 최대 저장고인 식물 세포벽은 다음의 3가지 중요한 합성물인 셀룰로오스(불용성 베타-1,4-글루칸 섬유소), 헤미셀룰로오스(글루칸, 만난 및 자일란을 포함하는 비셀룰로오스 다당류) 및 리그닌(복합 폴리페놀 구조)으로 구성되어 있다. 이러한 구조로 인하여 식물의 세포벽을 리그노셀룰로스라고 부르는데, 구성성분 중에서 셀룰로스가 가장 많이 존재하고 그 다음으로 자일란이 주성분인 헤미셀룰로스가 많이 존재하여 이들 두 성분이 전체 식물 바이오매스의 50% 이상을 차지한다. 헤미셀룰로스의 주성분인 자일란을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세 가지 효소, 즉 엔도-β-자일라나제, 엑소-β-자일라나제 및 β-자일라나제가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있으며 이들을 자 일라나제계 효소로 통칭한다. 자일란은 목초 헤미셀룰로스에서는 30%의 당으로 구성되며 콩과류 마초 헤미셀룰로스에서는 20%의 당으로 구성되어 있다. 콩과류 사료의 헤미셀룰로스가 목초의 헤미셀룰로스보다 더욱 복잡한 당복합체로 구성되어 있기 때문에, 콩류 사료의 좀 더 복잡한 구조의 헤미셀룰로스의 분해를 위하여 섬유질을 용해하는 효소가 요구된다. 자일라나제를 곡물 사료에 첨가하면 알곡을 감싸고 있는 헤미셀룰로스 층을 가수분해하여 알곡 내에 있는 영양분의 이용성을 높일 뿐만 아니라 가축의 장내 소화물의 상태가 개선될 수 있다. 특히 헤미셀룰로스 함량이 높은 소맥제품을 사료로 사용할 경우 가축에서 분변의 연변 현상이나 적리 현상이 일어나기 쉬운데, 자일라나제는 이러한 증상을 예방할 수 있고 사료적 가치를 올려줄 뿐만 아니라 소맥제품의 품질의 편차를 개선하여 안정적인 사료원료로 사용할 수 있게 함으로써 사료 첨가용 효소로 그 가치가 높다.

최근 선진국뿐만 아니라 생활환경과 소득이 개선된 많은 국가에서 육류의 소비기 늘고 있어 가축 사육을 위한 사료자원의 다양화와 사료효율의 개선은 매우 중요하게 다루어지고 있다. 돼지나 닭 같은 단위(單胃, non-ruminant) 동물은 이러한 식물 세포벽을 분해할 수 있는 효소가 없어서 세포벽 내에 들어있는 곡물의 전분이나 단백질 이용 효율이 매우 떨어지게 된다. 특히 밀과 호밀의 세포벽에 다량 함유되어 있는 수용성 자일란은 소화관 내에서 수분을 빨아들여 끈적끈적한 상태가 만들어지면서 소화 효소가 영양소로 접근하는 것을 방해하고, 소화관 내 소화물의 흐름을 늦게 하여 사료섭취가 줄어들게 되며, 미생물이 소화물에 부착하여 장내 이상발효를 일으키게 된다. 또한 가축이 자주 물을 마시게 되어 분변 중 수분함량이 높아져 결국 연변과 하리의 원인이 되기도 한다. 이러한 이유로 사료적 가치가 매우 높음에도 사용이 어려웠던 밀 원료에, 자일라나제를 첨가함으로써 소화관 내 점도를 낮추어 주고 곡물 중의 영양소 이용성을 증진시켜 사료의 효율을 증진시킬 수 있게 되었다.

지금까지 보고된 사료용 자일라나제의 생산에 사용되는 미생물의 대부분은 곰팡이를 들 수 있으며, 이 중에서도 트리코더마(Trichoderma) 속 균주들이 주로 이용되고 있다. 트리코더마 속 곰팡이는 생장이 늦어 배양시간이 길어지며 유전적 이용 및 변이의 어려움이 있다. 이에 반해 세균 등의 미생물을 이용할 경우 증식이 빠르고 유전적 변이가 용이하여 산업적인 이용이 높다. 산업적 이용을 위해서는 자일라나제를 생산할 수 있는 세균류 미생물의 선발이 시급하다. 또한, 트리코더마 속 균주에서 생산하는 자일라나제는 pH 5.0 부근의 산성 조건에서 최대 활성을 나타낸다. 그러나 돼지나 닭의 소화기관의 생리적 조건은 부위별로 다르지만 자일라나제가 작용하여야 할 소장 이후의 pH 조건은 6.5 부근이므로 곰팡이 유래의 자일라나제는 실험적 효소 활성이 높아도, 필드 적용 시 활성발휘에 제한이 있다. 따라서 최적 효소 활성이 가축의 장내 pH 조건과 부합하는 특성을 지닌 효소로서 자일라나제가 사료 첨가용 효소로 요구되고 있다.

곤충을 포함한 무척추동물은 지구상에서 가장 번성한 생물군으로서 다양한 먹이습성과 높은 생물학적 다양성을 나타내고 있다. 최근 들어 이러한 무척추동물의 생활특성을 고려하여 이의 공생미생물을 유용생물자원으로 활용하고자 하는 연구가 증가하고 있으며, 특히 무척추동물의 생육과 밀접한 관련이 있는 장내미생물 에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그 예로서 흰개미의 장내에는 흰개미의 주요 먹이인 목재의 분해에 관련된 미생물들이 군집을 이루어 흰개미의 소화 및 영양에 관여하고 있다는 연구와 동물성 먹이를 포식하는 무당거미로부터 고효율의 단백질 분해효소 생산 균주를 분리하여 산업적으로 응용하고 있는 사례, 및 나비목, 딱정벌레목을 포함하는 여러 가지 무척추동물에서 분자생물학적 기법을 활용한 장내미생물의 생태적 연구들이 발표되고 있다.

이에, 본 발명자들은 토양의 식물성 잔해물 등을 먹이로 하는 지렁이 등의 다수의 무척추동물의 장을 대상으로 하여 신규한 자일라나제를 생산하는 고효율의 자일라나제 생산 균주를 선별하였으며, 상기 생산 균주의 특성 및 이로부터 분리된 자일라나제의 특성을 규명하여 사료효율 개선제로의 가능성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 자일라나제를 생산하는 미생물 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주로부터 생산된 신규한 자일라나제 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배양하여 자일라나제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 자일라나제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화를 위한 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화도가 증가된 사료를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자일라나제를 생산하는 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13) 균주(KCTC 11302BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산된 신규한 자일라나제 효소를 제공한다.

또한, 본 발명은 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주를 배양하여 자일 라나제를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 자일라나제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화를 위한 사료첨가제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화도가 증가된 식물성 사료를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 자일라나제를 생산하는 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13) 균주(KCTC 11302BP)를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 무척추동물의 장추출물을 0.5% 버치우드 자일란(birchwood xylan)이 함유된 세균 분리용 배지에 도말하여 형성된 세균 콜로니를 0.5% 버치우드 자일란을 포함하는 배양액에서 25℃에서 2일간 배양한 후 배양상등액을 조효소액으로 사용하여 자일란의 분해능이 우수한 균주들을 선별하여 자일라나제를 생산하는 미생물을 분리하였다. 상기 분리된 균주는 체외공생군이며, 그람 양성 세균이었고, 16S rDNA 염기서열을 대상으로 상동성 조사를 한 결과, 셀룰로시마이크로비움 펀케이 ATCC BAA-886균주와 99.8% 이상의 높은 상동성을 나타내어(도 1 참조), 본 균주를 셀룰로시마이크로비움 펀케이로 동정하였으며 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13)으로 명명하였다. 상기 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주는 2008년 3월 12일자로 국제기탁기 관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11302BP)

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 균주를 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 상층액으로부터 자일라나제를 정제한 후, 그 특성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 자일라나제는 약 36.0 kDa의 분자량을 지닌 것으로 나타났다(도 2 참조). 또한, 서열번호 4(APSTLEAAAE)로 기재되는 N-말단 아미노산 서열을 수득하여, 이를 기존에 보고된 자일라나제들과 상동성을 확인한 결과, 낮은 상동성를 보임으로써, 본 발명의 자일라나제가 신규한 것을 확인하였다. 또한, pH 5.0 ~ 7.0 범위에서는 80%이상의 활성을 보였으나, pH 4.5 이하와 pH 9.0 이상에서는 50% 이상의 급격한 활성 저하 현상이 나타났다(도 3a 참조). 또한, 55℃ ~ 65℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 특히 60℃에서 최대 활성을 보였으며 65℃ 이후 급격히 저하되었다(도 3b 참조). 또한, 효소의 열 안정성은 30분 처리 시 55℃에서 30%, 50℃에서 60% 및 45℃에서 70%까지 안정적이었으며, 동물의 체온인 37℃에서는 100% 안정적이었다(도 4 참조). 또한, Hg² ⁺을 제외하고는 모든 금속이온에 안정적이었으며 특히 Co² ⁺, Fe² ⁺ 및 Ca² ⁺ 이온에 대해서는 1.3배의 상대적인 자일라나제 활성이 증가하였다(표 1 참조). 아울러, 화학적 시약에 대한 반응은 N-브로모숙신아마이드에 대해서만 저해었으며, EDTA에서 55% 및 대부분의 화학적 시약에 대해서 80% 이상의 안정성을 보였다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 효소는 자일란에 대한 분해능이 높았으며, 특히 귀리 스펠트 자일란(자일로스 70% 이상, 글루코스 15% 이하, 아라비노스 10% 이하의 조성)이 가장 높은 분해능 1,092 IU/㎎을 나타내었다(표 2 참조). 이에, 본 발명의 자일라나제는 귀리 스펠트 자일란에 특이적인 엔도-β-1,4-자일라나제의 특성을 나타내는 것으로 예측되며, 복합 자일란중합체를 효과적으로 분해하는 광범위한 기질선택성을 나타내었다. 한편, 비자일란 당화물(non-xylan carbohydrate)인 CMC, 수용성 전분, 아비셀 등은 전혀 분해하지 못하였으며, PNP-당 합성물에 대해서는 낮은 분해능을 나타내었다. 이에, 본 발명의 자일라나제는 특이성을 갖고 효율적으로 자일란을 분해하는 것을 확인할 수 있었다.

아울러, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 자일라나제가 자일란을 분해하는 최종 산물을 너도밤나무 자일란의 기질에 대해서 질량분석법으로 분석하였다. 그 결과, m/z 327 및 459에 해당하는, 자일로비오스(xylobiose) 및 자일로트리오스(xylotriose)의 포름산 부가 피크로부터 본 발명의 자일라나제가 너도밤나무 자일란을 자일로비오스 및 자일로트리오스로 분해하는 특성을 보이는 것을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명은

1) 자일란을 포함하는 배지에서 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주를 배양한 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 자일라나제 생산방법을 제공한다.

상기 방법에서, 단계 2)의 침전제로는 황산 암모늄, 아세톤, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 상기 침전은 다양한 구멍의 크기(pore size)를 가지는 막을 이용한 한외여과법으로 대체하여 농축하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 방법에서, 단계 4)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 자일라나제는 pH 5.0 ~ 7.0 범위에서는 80%이상의 활성을 보였으나, pH 4.5 이하와 pH 9.0 이상에서는 50% 이상의 급격한 활성 저하 현상이 나타났다(도 3a 참조). 곰팡이 유래 자일라나제는 산성 자일라나제로서 중성 pH에서 그 활성이 낮다는 점을 고려할 때, 본 발명의 자일라나제는 중성 pH에서도 그 활성이 높으므로, 사료첨가용 효소제로서 그 활용도가 높을 것으로 사료된다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 효소는 자일란에 대한 분해능이 높았으며, 특히 귀리 스펠트 자일란 가장 높은 분해능 1,092 IU/㎎을 나타내었다(표 2 참조). 이때, 가장 높은 분해능을 보인 귀리 스펠트 자일란은 70% 이상의 자일로스, 15% 이하의 글루코스, 10% 이하의 아라비노스를 함유하고 있으며, 너도밤나무 자일란과 버치우드 자일란은 90% 이상의 자일로스를 함유하고 있다. 이에, 본 발명의 자일라나제는 특이성을 갖고 효율적으로 자일란을 분해하는 것을 확인할 수 있었으며, 동물에 가장 많이 사용하는 식물성 곡물 사료에 자일란 함유가 높은 것을 고려할 경우 동물성 사료에 효율적이라고 사료된다. 이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명의 자일라나제는 식물성 사료의 자일란 분해 증진을 목적으로 하는 사료 첨가제로 적합한 것을 알 수 있었다.

이에, 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제는 자일란 당화를 위한 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 사료첨가제는 식물 세포벽을 분해할 수 있는 효소가 없어서 세포벽 내에 들어있는 곡물의 전분이나 단백질 이용 효율이 매우 떨어지는, 돼지나 닭 같은 단위동물(non-ruminant)의 사료에 첨가되어 세포벽의 주요 성분인 자일란을 당화함으로써 사료의 가치를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 사료첨가제의 유효성분인 자일라나제가 첨가될 사료에 대해 0.01 내지 10 중량부로 구성되는 것이 바람직하며, 자일라나제가 0.05 내지 5 중량부로 구성되는 것이 더욱 바람직하며, 자일라나제가 0.12 중량부로 구성되는 것이 가장 바람직하다.

또한 상기 사료첨가제는 추가적으로 단위동물에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 단위동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

본 발명의 자일라나제를 생산하는 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주 및 이로부터 생산된 자일라나제는 다양한 식물성 사료 원료에 첨가하여 사료 가치를 대폭 향상시키는데 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 무척추동물로부터 자일라나제 생산 균주 분리 및 선별

본 발명자들은 자일라나제(xylanase) 생산 활성을 가지는 미생물의 탐색에 이용된 무척추동물인 지렁이(Eisenia fetida)를 대전 인근에서 채집하여 살아있는 상태로 연구실로 운반하여 분류한 후 사용하였다. 자일라나제를 생산하는 세균의 분리를 위해 상기 지렁이 표면을 70%(w/w) 에탄올로 한번 세척하고 다시 멸균된 증류수로 3번 세척하였다. 세척한 시료를 해부하여 내장을 분리한 다음 PBS 완충액(0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.144% Na₂HPO₄, 0.024% KH₂PO₄)에 넣고 분쇄하였으며, 상기 추출물을 단계적으로 희석하여 0.5% 버치우드 자일란(birchwood xylan)을 첨가한 고체배지에 도말한 다음 25℃에서 2일간 배양한 후, Congo-red 염색법(Theater RM & Wood PJ, Appl . Environ . Microbiol. 43:777-780, 1982)을 통해 미생물이 자라난 콜로니 주변에 투명환을 형성하는 균주를 1차적으로 선별하였다. 상기의 방법으로 선별된 균주들을 0.5% 버치우드 자일란이 함유된 제한 배지(K₂HPO₄ 7 g/L, KH₂PO₄ 2 g/L, (NH₄)₂SO₄ 1 g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 1.1 g/L, 효모 추출물 0.6 g/L) 3 ㎖에 접종하여 25℃의 진탕 배양기에서 48시간 배양한 후, 원심분리로 상등액을 회수하여 자일라나제 활성을 측정하였고, 그 중 자일라나제 활성이 우수한 균주를 최종적으로 선별하였다. 이때, 상기 효소 활성은 DNS(Dinitrosalicylic acid) 정량 법(Miller GL, Anal . Chem., 55:952-959, 1959)을 사용하였다. 구체적으로, 일정비율로 희석한 100 ㎕의 효소용액에 100 ㎕의 기질용액(1% 버치우드가 포함된 50 mM 인산나트륨, pH 6.0)을 넣고 55℃에서 15분간 반응시킨 후 700 ㎕의 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) 용액을 첨가한 다음 100℃에서 5분간 방치한 후 흡광도 540 ㎚에서 측정하였다. 효소의 1 유닛(unit)은 1분 동안에 1 μ㏖의 환원당을 방출시키는 효소양으로 정하였다.

< 실시예 2> 분리된 균주의 동정

상기 실시예 1에서 지렁이의 장으로부터 분리하여 선발된 균주를 동정하였다.

분리된 균주는 장 점막에 존재하는 체외공생군이며, 그람 양성 세균이었다.

또한, 미생물의 16S rDNA 염기서열 결정을 위하여 균주의 게놈 DNA를 분리하였으며, 다음과 같은 조성으로 PCR 반응을 하였다. 구체적으로, 1 ㎕의 게놈 DNA(50-100 ng/㎕)에 10배의 Tag DNA 중합효소 완충액(MgCl₂ 첨가) 2 ㎕, 2.5 mM dNTPs 2 ㎕, 10 p㏖의 정방향 프라이머(27F: 5'-agagtttgatcmtggctcag-3', 서열번호 1)와 역방향 프라이머(1492R: 5'-ggttaccttgttacgactt-3', 서열번호 2)를 각각 1 ㎕, 1 ~ 2 단위의 Tag DNA 중합효소(Promega, USA)를 첨가하여 최종 50 ㎕ 반응액이 되도록 증류수를 첨가하였다. 이때, 프라이머쌍은 진핵세균의 16S rDNA 부위에 해당하는 1373 bp의 뉴클레오티드 증폭하도록 제작하였다. PCR 반응은 94℃에 서 5분간 변성(denaturation)한 후 94℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 3분 연장(extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 연장으로 마무리하였고 4℃에서 유지되었다.

상기 PCR 산물의 염기서열을 결정한 후(서열번호 3), 상동성 조사를 한 결과, 셀룰로시마이크로비움 펀케이 ATCC BAA-886균주와 99.8% 이상의 높은 상동성을 나타내어(도 1), 본 균주를 셀룰로시마이크로비움 펀케이로 동정하였으며 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13으로 명명하였다. 상기 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주는 2008년 3월 12일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11302BP).

< 실시예 3> 자일라나제의 분리 및 정제

셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주가 생산하는 자일라나제를 하기와 같이 순수 분리하였다. 구체적으로, M9(Na₂HPO₄ 0.6%, KH₂PO₄ 0.3%, NaCl 0.05%, NH₄Cl 0.1%) 배지에 0.5% 효모 추출물과 0.5% 버치우드 자일란으로 구성되는 액체 배지에서 37℃에서 48시간 배양한 후 원심분리하여 회수한 상층액에 황산암모늄 분말을 40% 정도 포화하게 첨가한 다음, 원심분리를 통해 수득한 상층액에 다시 황산암모늄분말을 80% 정도 포화하게 첨가한 후, 다시 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 상기의 침전물에 20 mM Tris-HCl(pH 7.6) 완충액을 첨가하여 침전물을 용해시켰고, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 불용성 침전을 제거한 다음, HiPrep 26/10 탈염 컬럼(GE Healthcare, USA)을 이용하여 20 mM 인산염 완충액(pH 7.0)로 4℃에서 12시간 동안 투석을 수행하여 조효소액을 얻었다. 투석한 다음 상기 용액을 원심분리 하였고, 상등액을 수득하여 20 mM 인산염 완충액으로 평형화된 HiPrep 16/10 DEAE FF(GE Healthcare, USA) 컬럼에 샘플을 로딩(loading) 후 0 ~ 0.5M NaCl 선형 농도구배로서 5 ㎖/분의 유속으로 용출하였다. 이때 약 0.35 ~ 0.4 M의 NaCl 농도에서 용출되는 효소활성 분획만을 취하여 HiLoad 26/60 Superdex 200 pg(GE Healthcare, USA) 컬럼에서 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.6)을 이용하여 2 ㎖/분의 유속으로 용출함으로써 자일라나제를 분리한 후, 동결건조하여 -20℃에 보관하였다.

< 실시예 4> 자일라나제의 특성

곰팡이 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum)이 생산하는 대표적인 자일라나제는 2가지로 pH 5.0에서 최적활성을 보이는 20 kDa의 효소와 pH 4.0에서 최적활성을 보이는 60 kDa의 효소가 있다(Tan LUL et al ., Enz . Microb . Technol . 7:425-430, 1985).

<4-1> 분자량

상기 실시예 3에서 순수 분리된 자일라나제를 SDS-PAGE로 분자량을 확인하였다. 도 2에서 레인 1(S)은 크기를 알고 있는 마커 단백질이고, 레인 2(1)는 최종적으로 정제된, 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13이 생산하는 자일라나제 단백질을 나타낸 것이다. SDS-PAGE에 의한 분자량을 측정한 결과, 본 발명의 자일라나제 는 약 36.0 kDa의 분자량을 지닌 것으로 나타났다(도 2 참조). 곰팡이 유래 자일라나제는 분자량이 약 20 또는 60 kDa으로, 본 발명의 자일라나제와 차이점이 있다.

<4-2> N-말단 서열

상기 단계 4-1에서 분리된 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 질량분석기로 분석한 결과, 서열번호 4(APSTLEAAAE)로 기재되는 N-말단 아미노산 서열을 수득하였고, 이를 기존에 보고된 자일라나제들과 상동성을 확인한 결과, 낮은 상동성를 보임으로써, 본 발명의 자일라나제가 신규한 것을 확인하였다.

<4-3> 생화학적 특성

자일라나제의 최적 반응조건을 조사하기 위하여 반응 pH, 온도, 금속이온의 영향을 알아보았다.

효소활성 최적 pH는 50 mM 나트륨 시트레이트 완충용액(Sodium citrate buffer)(pH 3.0-6.0), 50 mM 나트륨 인산염 완충용액(pH 6.0-7.0), 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.0-8.0) 및 50 mM 붕산 완충용액(boric acid buffer)(pH 8.0-10.0)을 사용하여 결정하였다. 그 결과, pH 5.0 ~ 7.0 범위에서는 80%이상의 활성을 보였으나, pH 4.5 이하와 pH 9.0 이상에서는 50% 이상의 급격한 활성 저하 현상이 나타났다(도 3a). 곰팡이 유래 자일라나제는 산성 자일라나제로서 중성 pH에서 그 활성이 낮다는 점을 고려할 때, 본 발명의 자일라나제는 중성 pH에서도 그 활성이 높으므로, 사료첨가용 효소제로서 그 활용도가 높을 것으로 사료된다.

효소활성 최적온도는 30 ~ 70℃범위에서 5℃ 간격으로 효소활성을 측정한 결 과, 55℃ ~ 65℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 특히 60℃에서 최대 활성을 보였으며 65℃ 이후 급격히 저하되었다(도 3b). 시간에 따른 효소의 열 안정성은 30분 처리 시 55℃에서 30%, 50℃에서 60% 및 45℃에서 70%까지 안정적이었으며, 동물의 체온인 37℃에서는 100% 안정적이었다(도 4).

또한, Hg² ⁺ 이온 등 총 11 종류의 금속이온(Sigma Chem. Co.)(1 mM), 시약(5 mM) 및 계면활성제(0.5%)를 첨가하여 반응시켰을 때, 자일라나제에 대한 금속이온의 영향을 조사한 결과, Hg² ⁺을 제외하고는 모든 금속이온에 안정적이었으며 특히 Co² ⁺, Fe² ⁺ 및 Ca² ⁺ 이온에 대해서는 1.3배의 상대적인 자일라나제 활성이 증가하였다(표 1). 또한, 화학적 시약에 대한 반응은 N-브로모숙신아마이드에 대해서만 저해었으며, EDTA에서 55% 및 대부분의 화학적 시약에 대해서 80% 이상의 안정성을 보였다.

시약	상대적 활성(%)
None	100
HgCl₂	<1
CaCl₂	135
NiSO₄	106
CuCl₂	75
ZnSO₄	92
MgSO₄	92
MnCl₂	122
SnCl₂	117
BaCl₂	102
CoCl₂	135
FeSO₄	139
N-Bromosuccinimide	<1
Iodoacetamide	97
Sodium azide	99
EDTA	57
Tween 80(0.5%)	92
Triton X-100(0.5%)	81

<4-4> 기질 특이성

본 발명의 자일라나제의 다양한 자일란 및 당 기질에 대한 분해능을 확인하기 위해, 표 2의 다양한 자일란 및 당 기질에 대한 분해능을 실시예 1의 방법으로 확인하였다. 그 결과, 상기 효소는 자일란에 대한 분해능이 높았으며, 특히 귀리 스펠트 자일란(자일로스 70% 이상, 글루코스 15% 이하, 아라비노스 10% 이하의 조성)이 가장 높은 분해능 1,092 IU/㎎을 나타내었다. 이에, 본 발명의 자일라나제는 귀리 스펠트 자일란에 특이적인 엔도-β-1,4-자일라나제의 특성을 나타내는 것으로 예측되며, 복합 자일란중합체를 효과적으로 분해하는 광범위한 기질선택성을 나타내었다. 한편, 비자일란 당화물(non-xylan carbohydrate)인 CMC, 수용성 전분, 아비셀 등은 전혀 분해하지 못하였으며, PNP-당 합성물에 대해서는 낮은 분해능을 나타내었다.

이때, 가장 높은 분해능을 보인 귀리 스펠트 자일란은 70% 이상의 자일로스, 15% 이하의 글루코스, 10% 이하의 아라비노스를 함유하고 있으며, 너도밤나무 자일란과 버치우드 자일란은 90% 이상의 자일로스를 함유하고 있다. 이에, 본 발명의 자일라나제는 특이성을 갖고 효율적으로 자일란을 분해하는 것을 확인할 수 있었으며, 동물에 가장 많이 사용하는 식물성 곡물 사료에 자일란 함유가 높은 것을 고려할 경우 동물성 사료에 효율적이라고 사료된다.

이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명의 자일라나제는 식물성 사료의 자일란 분해 증진을 목적으로 하는 사료 첨가제로 적합한 것을 알 수 있었다.

기질	특이적 활성(IU/mg) ^a
버치우드 자일란(Birchwood xylan)	776.7 ± 8.6
너도밤나무 자일란(Beechwood xylan)	808.4 ±5.2
귀리 스펠트 자일란(Oat spelt xylan)	1092.0 ± 7.8
수용성 선분(Soluble starch)	ND ^b
아비셀(Avicel)	ND
카르복시메틸셀룰로오스(Carboxymethylcellulose: CMC)	ND
PNP-셀룰로비오시드(PNP-cellobioside)	<3.0
PNP-글루코피라노사이드(PNP-glucopyranoside)	<3.0
PNP-자일로피라노사이드(PNP-xylopyranoside)	5.6 ± 0.3

^a 3 반복 통계치; ^b 미검출

<4-5> 너도밤나무 자일란 분해산물의 특성

본 발명의 자일라나제가 자일란을 분해하는 최종 산물을 너도밤나무 자일란의 기질에 대해서 질량분석법으로 분석하였다.

구체적으로, 너도밤나무 자일란 10 ㎎을 정제한 1 ㎍의 자일라나제를 이용하여 0.5 ㎖의 50 mM 나트륨 인산 완충용액에서 37℃에서 12시간 동안 가수분해하였으며, 효소반응의 중지는 100℃에서 5분간 열을 가하여 수행하였다. 생성된 가수분해산물의 분석은 용출용액 A(0.05% 포말산/멸균수) 용출용액 B(0.05% 포말산/멸균수: 아세토니트릴/메탄올 = 6:4)의 이동상을 이용하여 LC-MS/MS에 의해 수행하였다.

그 결과, m/z 327 및 459에 해당하는, 자일로비오스(xylobiose) 및 자일로트리오스(xylotriose)의 포름산 부가 피크로부터 본 발명의 자일라나제가 너도밤나무 자일란을 자일로비오스 및 자일로트리오스로 분해하는 특성을 보이는 것을 확인하였다(도 5).

도 1은 본 발명에서 분리한 미생물의 16s rDNA를 대상으로 상동성 조사를 수행한 결과를 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명의 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 유래 자일라나제를 ㅈ정제한 후, 12% SDS-PAGE으로 전기영동하여 분자량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명의 자일라나제의 pH 및 온도에 대한 활성을 나타낸 그래프이다:

a: pH; 및,

b: 온도.

도 4는 본 발명의 자일라나제의 온도 안정성 그래프를 나타낸 도이다.

도 5는 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 유래 자일라나제에 의한 너도밤나무 자일란 기질의 분해 산물의 분석결과를 나타낸 도이다:

a-1) 가수분해 산물의 전체 이온 크로마토그램;

a-2) m/z 195의 추출된 질량 분석 크로마토그램;

a-3) m/z 327의 추출된 질량 분석 크로마토그램;

a-4) m/z 459의 추출된 질량 분석 크로마토그램; 및,

a-5) m/z 591의 추출된 질량 분석 크로마토그램;

b-1) 지속시간 3.06분 피크의 질량 스펙트럼;

b-2) 지속시간 3.42분 피크의 질량 스펙트럼;

b-3) 지속시간 4.11분 피크의 질량 스펙트럼; 및,

b-4) 지속시간 5.01분 피크의 질량 스펙트럼;

c-1) 지속시간 3.06분 피크의 탠덤 질량 스펙트럼;

c-2) 지속시간 3.42분 피크의 탠덤 질량 스펙트럼;

c-3) 지속시간 4.11분 피크의 탠덤 질량 스펙트럼; 및,

c-4) 지속시간 5.01분 피크의 탠덤 질량 스펙트럼.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Cellulosimicrobium funkei HY-13 strain and xylanase produced from it <130> 9P-03-11 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1385 <212> DNA <213> Cellulosimicrobium funkei HY-13's 16S rDNA <400> 3 tgcaagtcga acgatgatgc ccagcttgct gggtggatta gtggcgaacg ggtgagtaac 60 acgtgagtaa cctgcccttg acttcgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120 atgagccgtc ctcgcatggg ggtggttgga aagtttttcg gtcagggatg ggctcgcggc 180 ctatcagctt gttggtgggg tgatggccta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga 240 gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300 ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgaaggcct 360 tcgggttgta aacctctttc agcagggaag aagcgcaagt gacggtacct gcagaagaag 420 cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttgtccggaa 480 ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtc tgtcgcgtct ggtgtgaaaa ctcgaggctc 540 aacctcgagc ttgcatcggg tacgggcaga ctagagtgcg gtaggggaga ctggaattcc 600 tggtgtagcg gtggaatgcg cagatatcag gaggaacacc gatggcgaag gcaggtctct 660 gggccgcaac tgacgctgag gagcgaaagc atggggagcg aacaggatta gataccctgg 720 tagtccatgc cgtaaacgtt gggcactagg tgtggggctc attccacgag ttccgtgccg 780 cagcaaacgc attaagtgcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga 840 attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa 900 ccttaccaag gcttgacatg cacgggaagc caccagagat ggtggtctct ttggacactc 960 gtgcacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1020 caacgagcgc aaccctcgtc ccatgttgcc agcgggttat gccggggact catgggagac 1080 tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtct 1140 tgggcttcac gcatgctaca atggccggta caaagggctg cgataccgta aggtggagcg 1200 aatcccaaaa agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg 1260 agtcgctagt aatcgcagat cagcaacgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1320 accgcccgtc aagtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc catggcccaa ccgttcgcgg 1380 gggga 1385 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> N-terminal of Cellulosimicrobium funkei HY-13's xylanase <400> 4 Ala Pro Ser Thr Leu Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10

Claims

자일라나제를 생산하는 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13) 균주(KCTC 11302BP).
제 1항의 균주로부터 생산된 서열번호 4(APSTLEAAAE)로 기재되는 N-말단 아미노산 서열로 구성되고, 분자량이 36.0 kDa인 자일라나제(xylanase).
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제 2항에 있어서, pH 5.0 ~ 7.0에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항에 있어서, 55℃ ~ 65℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항에 있어서, Ca, Ni, Cu, Zn, Mg, Mn, Sn, Ba, Co 및 Fe 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 금속이온에 대해 효소활성이 안정적인 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항에 있어서, Co, Fe 및 Ca 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 금속이온 첨가 시 효소활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항에 있어서, 엔도-β-1,4-자일라나제 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
1) 자일란을 포함하는 배지에서 제 1항의 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주를 배양한 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 서열번호 4(APSTLEAAAE)로 기재되는 N-말단 아미노산 서열로 구성되고, 분자량이 36.0 kDa인 자일라나제 생산 방법.
제 10항에 있어서, 상기 단계 2)의 침전제는 황산암모늄, 아세톤, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄올 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 서열번호 4(APSTLEAAAE)로 기재되는 N-말단 아미노산 서열로 구성되고, 분자량이 36.0 kDa인 자일라나제 생산 방법.
제 10항의 방법으로 생산된 서열번호 4(APSTLEAAAE)로 기재되는 N-말단 아미노산 서열로 구성되고, 분자량이 36.0 kDa인 자일라나제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화를 위한 사료첨가제.
제 12항에 있어서, 단위동물(non-ruminant)의 사료에 첨가되는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 12항의 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화도가 증가된 식물성 사료.