CN103103206B

CN103103206B - 一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用

Info

Publication number: CN103103206B
Application number: CN201310043628.5A
Authority: CN
Inventors: 崔中利; 李周坤; 黄彦
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-02-04
Filing date: 2013-02-04
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2033-02-04
Also published as: CN103103206A; WO2014117472A1

Abstract

本发明属于应用工业微生物领域，公开了一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用。本发明提供了淀粉水解酶系中关键酶之一的α-1,4淀粉糖内切酶基因，该基因全长为1569bp，G+C含量为67％，编码522个氨基酸，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1所编码的内切酶蛋白质氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。利用该基因构建的工程菌株能高效表达α-1,4淀粉糖内切酶，该酶在以可溶性淀粉为底物时比活力高达10013u/mg。利用基因生产的酶制剂可用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织工业和医药等工业，在解决实际问题的同时还可以取得可观的经济效益。

Description

一种α-淀粉酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用

技术领域

本发明属于应用工业微生物领域，公开了一种α-淀粉及其酶基因、含有该基因的工程菌及其应用。

背景技术

近年来，由于国内外淀粉质原料的深加工业工业的迅猛发展，α-淀粉酶的应用领域不断地扩大，因此，筛选具有不同特性的α-淀粉酶已成为目前酶制剂研究领域的一个热点方向。我国是一个农业大国，淀粉质原料深加工业是一个庞大的体系，酶制剂的不断更新和完善，也为淀粉质原料的深加工提供了良好的条件，同时也为开创新的酶工艺提供了基础，既提高了效率、降低了消耗，也为节约工业用粮起到至关重要的作用。

淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，它占了整个酶制剂市场的25％左右，几乎完全替代了化合试剂在淀粉工业中的使用。自1833年pαyen从麦芽抽取液中用酒精沉淀出的白色沉淀并成功应用于棉布的退浆以来，α-淀粉酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，已发现的α-淀粉酶分布广泛，其中主要以微生物来源的淀粉酶用于大规模的发酵生产。α-淀粉酶广泛的用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织工业和医药工业，不仅解决了淀粉质原料的再处理问题还取得了很可观的经济效益。

α-淀粉酶可从淀粉分子内部切开α-1,4糖苷键，最终生成麦芽寡糖，主要来源于动物，植物，微生物。淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的α-1,4链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖，其中真菌α-淀粉酶水解淀粉的终产物主要以麦芽糖为主且不含大分子极限糊精，在烘焙业和麦芽糖制造业具有广泛的应用。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖外，还生成分支部分具有α-1,6键的α-极限糊精（又称α-糊精）。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。采用基因工程手段构建高效表达菌株可以实现淀粉酶的大量表达，目前比活最高的淀粉酶约为5000u/mg。淀粉酶基因的获得在淀粉质原料利用领域有巨大的应用潜力，同时可通过基因改造提高淀粉酶的作用能力，并通过基因工程实现各淀粉水解酶基因的协同作用，以期更好得开发利用淀粉质原料资源，实现生物量的转化利用，这对人类的可持续发展具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的α-淀粉酶基因，及其编码的蛋白质。

本发明的另一目的是提供含有该α-淀粉酶基因的基因工程菌。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。

α-1,4淀粉酶内切酶基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，该基因全长（从起始密码子到终止密码子）为1569bp，G+C含量为67％，编码522个氨基酸。

本发明所述的α-1,4淀粉酶内切酶基因编码的α-1,4淀粉酶内切酶蛋白质，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。所述的α-1,4淀粉酶最适反应pH为7.0，最适反应温度为50℃，并在20℃-50℃（1h）和pH5.0-10.0（24h）之间保持活性稳定，同时该酶能在4mol/L的NaCl和KCl中保持活性稳定（15d）。

本发明所述的α-1,4淀粉酶内切酶起始端的23个氨基酸为一典型信号肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4

含本发明所述α-1,4淀粉酶内切酶基因的重组质粒。

所述的重组质粒优选将所述α-1,4淀粉酶内切酶基因克隆到pET-29α(+)中所得。

含本发明所述的重组质粒的重组微生物。

所述的重组微生物，优选以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。

本发明所述α-1,4淀粉酶内切酶基因在淀粉水解方面的基因工程应用。

本发明所述α-1,4淀粉酶内切酶蛋白质在淀粉水解或工业生产方面的应用。

有益效果

1．本发明以从山东东营土样中筛选出的粘细菌菌株EGB为材料，从该菌的发酵上清中纯化出一个高活性α-淀粉酶，通过蛋白质氨基酸测序结合PCR扩增，成功获得α-1,4淀粉酶内切酶基因序列，该酶对以可溶性淀粉为底物测活时，酶活高达10013u/mg。

2.该基因全长（从起始密码子到终止密码子）为1569bp，G+C含量为67％，编码522个氨基酸。

3.通过PCR技术扩增末端含Ndel和Xhol酶切位点的完整的α-1,4淀粉酶内切酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高表达载体pET-29α(+)（购自Novegen公司）的Ndel和Xhol酶切位点上，转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)（购自Invitrogen公司），进行IPTG诱导表达。

4.本发明对α-1,4淀粉酶内切酶基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的水解可溶性淀粉，在以可溶性淀粉为底物时的的比活力高达10013u/mg。

5.利用该基因构建的工程菌株能高效表达α-1,4淀粉酶内切酶，生产的酶制剂可用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织工业和医药等工业。

附图说明

图1.纯化后SDS-PAGE蛋白电泳图以及淀粉酶酶谱分析图。

其中1：Marker 2：纯化后蛋白 3：淀粉平板变性酶谱分析

图2α-1,4淀粉酶内切酶基因克隆的策略图

图3α-1,4淀粉酶内切酶基因在E.coli BL21（pET-29a(+)）中高效表达实验方案图

图4温度对酶活力的影响

A图为最适反应温度的考察；B图为热稳定性考察。

图5pH对酶活力的影响

A图为最适反应pH的测定，B图为pH稳定性的测定。

图6α-淀粉酶耐盐性质

A图为盐对酶活性的影响，B图为NaCl对酶稳定性的影响，C图为KCl对酶稳定性的影响。

生物材料保藏信息

Corαllococcus coralloldes EGB,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏日期为2012年12月17日，保藏号为CCTCC NO：M2012528。

具体实施方式

实施例1α-1,4淀粉酶内切酶基因的克隆

1.1α-1,4淀粉酶的分离纯化

以VY/4液体培养基（安琪酵母0.5％，CaCl₂·2H₂O0.1％，维生素B₁₂0.5μg/mL，0.1％的结晶紫；pH7.2；）培养Corαllococcus coralloldes EGB(CCTCC NO：M2012528），收集发酵上清液，40％-80％硫酸铵梯度沉淀对上清液进行浓缩，通过DEAE弱阴离子交换柱，疏水柱，sephardexG200分子筛以及糖原-淀粉酶-40％乙醇复合物吸附解析等手段，结合酶谱分析（如图1），确定SDS-PAGE蛋白电泳上分子量约为43KD的条带为目的条带。

1.2α-1,4淀粉酶氨基酸测序

将所纯化出的α-1,4淀粉酶SDS-PAGE蛋白电泳之后，确定条带大小，然后通过切胶回收，由上海薄苑科技公司进行肽指纹图谱测序比对，结合肽段碎片质谱信息以及数据库检索比对，结果比对出三条肽段。分别为

1.DKLWFFAGFAPSFQR

2.DDGNTYFLGNPGSGFAK

3.DDGNTYFLGNPGSGFAK

1.3α-1，4淀粉酶基因的克隆

通过已比对出的三个肽段设计兼并引物，成功扩增出该酶的中间片段基因。再以该片段基因为基础，设计引物通过SEFA PCR向正反两方向延伸以扩增侧翼序列。

正向引物：

SP3正向引物：5-GGCTACGCCTACGTGCTCNNNNNNNNGGGCA T-3（SEQ ID NO.5）；

SP2正向引物:5-GTCGTGCGGCAACGGGCAGAAC-3（SEQ ID NO.6）

SP1正向引物:5-GCCAGCCGCCACGTCACCTT-3（SEQ ID NO.7）

反向引物：

SP3反向引物：5-GGCAGCCAGATCATCGTGNNNNNNNNNGCCTTC-3（SEQ ID NO.8）

SP2反向引物：5-AGCACGTTGAGCTGCCGGGG-3（SEQ ID NO.9）

SP1反向引物:5-TGATGCCCTGCGCGTTGAGC-3（SEQ ID NO.10）

PCR反应分为两个循环进行

循环1.

反应体系

反应条件：

（1）94°C，4min

（2）2×(94°C，30s；35°C，3min；70°C，5min)

加入SP1（SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8）1μl

（3）25×(94°C，30s；70°C，5min30s)

（4）2×(94°C，30s；70°C，5min30s)

（5）8×(94°C，30s；70°C，5min30s；94°C，30s；50°C，30s；70°C，5min)

（6）70°C，10min

（7）10°C，10min

循环2.

反应体系

反应条件

（1）30×（94°C，30s；68°C，30s；70°C，5min）

通过对SEFA PCR扩增出来的侧翼序列（循环1和循环2产物）进行ORF预测结合功能验证，得到淀粉酶基因的全长序列，以全长序列设计淀粉酶基因引物F和R，以EGB菌的基因组cDNA为模板，进行淀粉酶基因全长的PCR扩增。

F：CATATGACGTTGAAGACCCGCC（SEQ ID NO.11）

R：CTCGAGGAAGCTGGCGGTGGC（SEQ ID NO.12）

1.4E.coli DH10B电转感受态的制备

从-70℃冰箱中取菌种E.coli DH10B划线于新鲜的LB平板上，培养过夜，挑取直径约2mm菌落接入没有添加Mg²⁺的SOB试管，37℃培养至OD600到达1.0后，以1/100的接种量接入装有100ml SOB培养基的0.5L摇瓶，18℃，220rpm培养至OD600到达0.7～0.8之间；将摇瓶置于冰浴中，冷却10min之后，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；等体积的灭菌超纯水重悬、洗涤菌体后，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；重复洗涤一次；100ml10％甘油重悬菌体，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；重复洗涤一次；小心弃上清，倒置离心瓶于灭菌吸水纸上沥干约1min。每1000ml培养物用2ml10％甘油小心重悬，每管100μl分装于离心管后迅速放入-70℃冰箱保存备用。

1.5酶连转化

经PCR产生的α-淀粉酶DNΑ片段与pMD19-T Vector（TaKaRaCode：D102Α）按摩尔比3:1混合，在连接液作用下，16℃水浴过夜。酶连体系如下：

将10μl酶连产物加入到200μl在冰上融化后的E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s后。快速转移到冰浴中冷却1~2min，向每管中加入800μl液体LB培养基，37℃摇床80-90rpm温育45min，复苏细胞。4000rpm离心3min，剩余200μl感受态细胞涂布于含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上，平板倒置于37℃培养箱培养。

1.6目的基因质粒的提取与测序

挑取1.5中的单菌落在含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，12000rpm离心10min收集菌体，利用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海英潍捷基生物有限公司测序。结果该基因全长（从起始密码子到终止密码子）为1569bp，G+C含量为67％，序列为SEQ ID NO.1；该基因编码522个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。通过对该基因所编码的氨基酸序列进行分析，其起始端开始后的前23个氨基酸为一个典型的信号肽，基因全长69bp，G+C含量为72％，序列为SEQ ID NO.3；该基因编码的23个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

实施例2.α-淀粉酶基因在E.coli BL21(pET-29a(+))中的高效表达

2.1将1.6中提取的重组质粒用Ndel和Xhol双酶切

酶切体系：

在37℃水浴中，反应3h以上。酶切产物进行0.75％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

2.2pET-29a(+)（Merck-Novαgen，Cat NO.69871）用Ndel和Xhol双酶切（参考2.1）。

2.3转化和表达

2.1中的回收片段和2.2中酶切好的pET-29a(+)进行酶连得到含α-淀粉酶的pET-29a(+)重组质粒。

酶连好的含α-淀粉酶的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)（NBE，CatNO.C2527H）获得重组微生物E.coli BL21(DE3)，涂布含有50mg/L卡那霉素的LB平板，挑取单菌落提取质粒经测序验证基因序列无误。

2.4验证目的基因表达的酶对可溶性淀粉的水解功能

2.3中经测序后接单菌至LB培养基中37℃培养至OD_600nm在0.5-0.6之间，加IPTG至浓度0.2mM，18℃继续培养24h。收集菌体用Tris-HCl（pH7.0）重悬后，用超声处理破碎菌体细胞，20000g离心15min，所得上清即为α-淀粉酶粗酶液。取适量α-淀粉酶粗酶液加至1ml含有0.5％的可溶性淀粉的Tris-HCl缓冲液中，于50℃反应10min后，通过DNS检测还原糖的生成情况。酶活单位定义为每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量即为一个活力单位，测得粗酶的比活力为112.83u/mg。后将该酶通过Ni-NTA亲和层析纯化并经超滤浓缩后测得该酶在以可溶性淀粉为底物时的比活力为10013u/mg，该结果表明纯化浓缩后的比酶活力约为粗酶的100倍。生产的酶制剂可用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织工业和医药等工业。

实施例3.α-淀粉酶基因酶学性质的研究

3.1温度对酶活力的影响

最适反应温度的测定：在不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃），pH7.0

的条件下测定重组酶纯化酶的活性，将最高酶活力设定为100％（图4a）。

热稳定性的测定：将重组酶纯化酶液在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，

pH7.0下保温1h,每隔10min取样，于冰上迅速冷却，各自测定残余酶活力，以未保温的

酶活力为100%（图4b）。

经测定该淀粉酶最适反应温度为50℃，并在20℃-50℃之间保持稳定。

3.2pH对酶活力的影响

最适反应pH的测定：在不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），50℃

下测定重组酶纯化酶液的活性，将最高活力设定为100％（图5a）。

pH稳定性的测定：将重组酶纯化酶液在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0

下，4℃保持24h，后各自测定其残余活力，以pH7.0的酶活力为100%（图5b）。

经测定该淀粉酶最适反应pH为7.0，并在pH5.0-10.0保持稳定。

3.3α-淀粉酶耐盐性质

盐对酶活性的影响：将重组酶纯化酶液的测活体系中添加NaCl和KCl，终浓度分别为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L。测定酶的活性，以不添加盐的活力设为100％（图6a）。

盐对酶稳定性的影响：将重组酶纯化酶液分别在1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/LNaCl（图6b）和KCl（图6c）下，4℃保持15d,每隔1d测定酶的活性，以不加盐的酶活力设为100%。

经测定该淀粉酶在1mol/L的NaCl和KCl存在时活性残留约80％，并在最高为4mol/LNaCl和KCl存在时仍能保持活性稳定。

Claims

1.α-淀粉酶基因，其特征在于核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的α-淀粉酶基因编码的α-淀粉酶,其特征在于氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

3.权利要求1所述的α-淀粉酶基因起始端的69个碱基，其编码一个典型的信号肽序列，其特征在于核苷酸序列为：SEQ ID NO.3。

4.权利要求3所述的α-淀粉酶基因起始端69个碱基所编码的信号肽，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

5.含权利要求1所述α-淀粉酶基因的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒是将权利要求1所述α-淀粉酶基因克隆到pET-29α(+)中所得。

7.含权利要求6所述的重组质粒的重组微生物。

8.根据权利要求7所述的重组微生物，其特征在于以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。

9.权利要求1所述α-淀粉酶基因在淀粉水解方面的基因工程应用。

10.权利要求2所述α-淀粉酶在淀粉水解方面的应用。