CN102766644A - 一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下：（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物；（2）PCR扩增及重组质粒的构建；（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化。本发明该酶活性最适酶活性为90℃，具有较为宽的酶适应温度，在50-100℃之间具有很高的酶活性；该酶的最适酶活pH为5.4，具有较好的耐酸性，在高温70℃和酸性条件pH为5.0处理36小时，仍保持50%以上的活性。

Description

一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种嗜热酸性普鲁兰酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

嗜热细菌是一类可以在55℃以上环境温度中生长繁殖的微生物，根据其最适生长温度的不同，可以分为嗜热菌（55-80℃）和超嗜热菌（80-110℃）。由于具有良好的热稳定性和嗜热性，来源于嗜热细菌的酶被称为嗜热酶。嗜热酶不仅具有高效的反应催化活性，而且在高温下能够保持很高的稳定性，对有机溶剂及变性剂也有很强的抗性，因此是生物催化领域近年来发现重要的新型生物催化剂，广泛应用于食品工业、环境保护、能源以及石油开采等工业生物技术方面。迄今已有嗜热蛋白酶，淀粉酶，木聚糖酶，纤维素酶等嗜热酶投入工业应用，尤其是来源于水生栖热菌Thermus Aquaticus的DNA聚合酶（Taq酶）在PCR技术中的广泛应用，使得该技术在生物研究和医疗领域都实现了新的飞跃。

普鲁兰酶( EC 3. 2. 1. 41) 属于淀粉水解酶，能够专一性水解普鲁兰多糖、糖原、淀粉、支链淀粉和相应低聚糖中 α-1,6糖苷键的脱枝酶。普鲁兰酶与α-淀粉酶、β-淀粉酶或糖化酶共同作用可将淀粉彻底水解为葡萄糖，因此广泛应用于以淀粉为原料的食品深加工、酿造、医药和新生物质能源等工业部门。根据水解的糖苷键差异分为I型( 专一性水解普鲁兰的α-1，6-糖苷键) 和II型(可水解普鲁兰的α-1，6-糖苷键以及其他多聚糖的α-1，4-糖苷键) 两种。

嗜热细菌（Thermotoga lettingae TMO）是一类嗜高温的、无芽孢的严格厌氧菌，其最适生长温度为65℃， 最适pH在7.0左右。T. lettingae能够分解和利用淀粉、纤维素和半纤维素等多聚糖，是嗜热淀粉酶和纤维素酶的理想来源。目前已经有一些嗜热酶从该菌中分离得到，比如：葡聚糖酶，乙醇脱氢酶，肽酶等。这些酶在工业，纺织，食品以及生物工程领域都具有很好的应用前景。

到目前为止，全世界上只有丹麦NOVO和美国杰能科两家公司具备普鲁兰酶工业化生产能力，生产水平在100-400 U/mL（发酵液）。普鲁兰酶对于淀粉支链的水解具有重要作用，然而由于其特殊定位以及复杂的分泌系统，为工业化生产带来障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜热温酸性普鲁兰酶及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是：一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下：

（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下：

上游引物 P1：5′- GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3′；

下游引物 P2：5′- GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3′；

（2）PCR扩增及重组质粒的构建： 

以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下：94℃ 预变性5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证；

（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入0.5-1 mol/L IPTG于37℃继续培养3-5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。

嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备麦芽三糖中的应用。

嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备单糖葡萄糖中的应用。

本发明的有益效果是：该酶活性最适酶活性为90℃，具有较为宽的酶适应温度，在50-100℃之间具有很高的酶活性；该酶的最适酶活pH为5.4，具有较好的耐酸性，在高温70℃和酸性条件pH为5.0处理36小时，仍保持50%以上的活性。将该酶基因片段构建工程菌，优化发酵条件后，工程菌表达的普鲁兰酶活力达到150 U/mL以上。该酶的制备方法，包括质粒、菌株与培养基的选择，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，工程菌表达条件的优化。该酶具有良好的热稳定性和耐酸性，适合用于以淀粉为原料的食品深加工、酿造、医药和新生物质能源等领域。耐高温酸性普鲁兰酶应用于淀粉质原料水解，简化了淀粉加工工艺，节约酸碱化学试剂的消耗，减少工业生产对环境的污染。本发明得到了嗜热耐高温酸性普鲁兰酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在Thermotoga lettingae TMO中发现并制备获得的第一个普鲁兰酶；本发明获得了一种不同于已发现普鲁兰酶的新型酶资源。该嗜热普鲁兰酶具有不同的氨基酸序列和酶学特性；本发明获得了目前已发现的耐酸性最强的嗜热普鲁兰酶。

附图说明

图1是蛋白质表达的电泳照片，其中： 1. 标准蛋白质分子量；2. 细胞总提取物；3.经热处理以后的粗酶提取液；4. 经镍柱亲和层析纯化的酶蛋白；

图2是该酶的酶活与温度变化关系曲线；

图3是该酶的酶活与最适pH变化关系曲线；

图4 是该酶的酶活与耐酸性变化关系曲线。

具体实施方式

一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下：

（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下：

上游引物 P1：5′- GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3′；

下游引物 P2：5′- GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3′；

（2）PCR扩增及重组质粒的构建： 

以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下：94℃ 预变性5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证；

（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入0.5-1 mol/L IPTG于37℃继续培养3-5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。

嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备麦芽三糖中的应用。

嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备单糖葡萄糖中的应用。

一种嗜热酸性普鲁兰酶，它的核苷酸序列如下（ORF：Tlet_1262，基因序列号 NC_009828）：

tcattccctg tacatcacca ttgcagatat tggcggaatt tctattgtcc cactgagttt    60

gtagagaaga tctacaccag ctctttcttt atcaacgaca acattccatt cgccatcggg   120

caaaatcaat tcatgttcaa cgatatctcc attgaagatc accaagatcc cttcccaggg   180

gtcattgtta acatgttcat ttattaaaaa agcaacaacc ttcttcggtg attccaggaa   240

agttatgtgt tttcttatat catctgccgt cctcaatcta aatgcagggt gtgattttct   300

gagctttatc aatcctttgt ggtattcgaa aacatctatg aactgcgcct tcctttcata   360

gtcgagcgca tttatagaaa ttggtgcatt gtacgaattt tcattgaact gtttggtcct   420

gcaaaaatcc tggcctgcgt gaaagaaagg aacaccctgt gaagtgagta atatagctgc   480

tgcaagtttt tgagctgact ttaattcttc ttcactccat tcccttctgt cagattttgc   540

cgccagaaca tttttatccc agagtgtgtg attatcatga catgcaacat agttgatagt   600

ttgttctgga ctgtaagcaa aatcagcaat caacttgttg tcatagttaa tactcccaac   660

cactcctctt ttgatcttga tttctttccc cacagagccc ataacaaacc cttttgcttt   720

tggatcaaaa acagagcccc ttataccgtc tcttattcca tcgttgaata cagctattct   780

caaatcgaga agttgtgatt ttccaaacct tggttgaacc ccccagcctc cccacggttc   840

gccatatata atcacgcttg gattaatctg tcttaaagtc ttttcaacca ttgccatggt   900

ttttcggtct ataagtccca tctgatcaaa cctaaatcca tctacatgat attctttagc   960

ccagtgaacg actgtatcaa gaatatatct tctcatcatg agcctttcgc tgtttgttgt  1020

attgccacaa ctactttcat tcaggtattg ccccattttt ccaagcctgt aatagtaata  1080

tgggactgcc tgatcaaaaa cagaaaattc tcccacacca taagtgtgtg gaaaaactac  1140

atccattatc acacctatac catttttgtg aaatgtctga accattttct ttacttcata  1200

gattcttgtc tttggatttg atggatctga gctgtagcag ccttctggta ccatgtaatg  1260

ataaggatca tacccccagt tgtactgatt ttcgaagtct cttttcactt catcaccagt  1320

gtaaaaatcg tagattggca aaatatgtac atgtgttaca ccaagttctt ttatatgttc  1380

aagccctgtt gtaacgccat ttggaccgat tgtgccttct tctatcaaac caagataaga  1440

cgatttgttt ttcacattac tcgtccagga gcctgtcata tctgctatgt gtatttcata  1500

gattattgca tcaacataag aatcaagttt tacgtaacta tcctgttgcc aatcttctgg  1560

atctgccttt ctcatgtcga cgatcgcgcc gaattttccc tgtaaagaca gcgccttggc  1620

atatgggtct accccttctc tgattttgcc gtaactttcg tatcgatatc tgtaaaacca  1680

tccatctaaa tctttatcaa gtcttgtata ccaaacacct ttttcatttc tttgcatatc  1740

aacaacaaat gctggctgat cctgctcact tgtctgatac aatagcaact tgacagattt  1800

gctgaccgga gtccatacat aaaactctgt gtattgcggt gtataaaaag ttcccagagg  1860

gccatcgtag taaagctcgt ccaaaacttc taccgcataa acccttgatt tcttaaaacc  1920

atctatctgt agaaaaatat ctcttgagag gtcttcttcc ttcaaaggtt gggaaagttt  1980

tattctgaag taatttgtcc tggttatatc tgttgggtcg actttttcca gactgctaat  2040

ggatactgtc tgctcatcta tgccgacaac tattttgtca agataagtat tcagatcaat  2100

tgcatctgtt gtgtaaacct ctattgttga aaaatctacc aattttgcaa aaaatactct  2160

tgggcttgtg tctggtttgc tggtgtatat ttcttcaaca ttctggagaa tccaaacttc  2220

ttcctcgtta tcttttatat ttataaatct atcttttgcc acatctttct cctcccactc  2280

tcttaaccta atgattatac caacttttgt cgaattcatg ggtagagtaa taacagcttt  2340

cagaccaaaa tcatcttttt cggtgaaatt ataagctctg ccttcctgga aaattggctc  2400

aacaggccat atccacaaat tccagccttc gtagttaccg tcaaacctgt ggtaatgcac  2460

aataactgtt gtagaagcaa aaattacagc agaaagaatt acaatgatga aaaataaaga  2520

tttcttcat                                                          2529

嗜热酸性普鲁兰酶，具有氨基酸序列如下（序列由NCBI中GenBank获得，序列号：YP_00147088）：

MKKSLFFIIV ILSAVIFAST TVIVHYHRFD GNYEGWNLWI WPVEPIFQEG RAYNFTEKDD        60

FGLKAVITLP MNSTKVGIII RLREWEEKDV AKDRFINIKD NEEEVWILQN VEEIYTSKPD       120

TSPRVFFAKL VDFSTIEVYT TDAIDLNTYL DKIVVGIDEQ TVSISSLEKV DPTDITRTNY       180

FRIKLSQPLK EEDLSRDIFL QIDGFKKSRV YAVEVLDELY YDGPLGTFYT PQYTEFYVWT       240

PVSKSVKLLL YQTSEQDQPA FVVDMQRNEK GVWYTRLDKD LDGWFYRYRY ESYGKIREGV       300

DPYAKALSLQ GKFGAIVDMR KADPEDWQQD SYVKLDSYVD AIIYEIHIAD MTGSWTSNVK       360

NKSSYLGLIE EGTIGPNGVT TGLEHIKELG VTHVHILPIY DFYTGDEVKR DFENQYNWGY       420

DPYHYMVPEG CYSSDPSNPK TRIYEVKKMV QTFHKNGIGV IMDVVFPHTY GVGEFSVFDQ       480

AVPYYYYRLG KMGQYLNESS CGNTTNSERL MMRRYILDTV VHWAKEYHVD GFRFDQMGLI       540

DRKTMAMVEK TLRQINPSVI IYGEPWGGWG VQPRFGKSQL LDLRIAVFND GIRDGIRGSV       600

FDPKAKGFVM GSVGKEIKIK RGVVGSINYD NKLIADFAYS PEQTINYVAC HDNHTLWDKN       660

VLAAKSDRRE WSEEELKSAQ KLAAAILLTS QGVPFFHAGQ DFCRTKQFNE NSYNAPISIN       720

ALDYERKAQF IDVFEYHKGL IKLRKSHPAF RLRTADDIRK HITFLESPKK VVAFLINEHV       780

NNDPWEGILV IFNGDIVEHE LILPDGEWNV VVDKERAGVD LLYKLSGTIE IPPISAMVMY       840

RE                                                                     842

该酶的最适酶活温度为90℃，最适酶活pH为5.4。该酶具有具有较好的嗜热性和耐酸性，是目前已发现的耐酸性最强的嗜热普鲁兰酶。该酶水解产物为麦芽三糖，属于I型普鲁兰酶。

嗜热酸性普鲁兰酶的酶学性质分析鉴定

嗜热酸性普鲁兰酶的活性检测：普鲁兰酶水解普鲁兰糖底物生成低聚糖时，产生大量还原糖，以还原糖的增加量指示酶活力的大小。0.5 ml 反应体系中含普鲁兰糖1%（Sigma 公司产品）；CH₃COONa/CH₃COOH缓冲液50 mM （pH 5.4）；纯化的酶10 μL。反应温度为70 ℃,反应时间为20 min。加入DNS试剂0.5 ml摇匀，沸水中煮5 min，取出后流动水冷却，于540 nm波长下，测定出反应液的吸光度值。酶活定义：在上述条件下，每分钟从普鲁兰底物释放1μmol 还原糖所需要的酶量作为1个酶活单位，以U/mL表示。

通过对嗜热酸性普鲁兰酶进行分析鉴定，得到该酶的主要以下酶学性质如下：

（1）得到编码普鲁兰酶的核苷酸序列（ORF：Tlet_1262，基因序列号 NC_009828）：基因序列如上所述。

（2）得到编码普鲁兰酶的氨基酸序列：氨基酸序列如上所述。

（3）得到的纯化的普鲁兰酶蛋白电泳图如图1所示。

（4）该酶能够催化普鲁兰糖中的α-1,6-糖苷键生产麦芽三糖，因此鉴定为I型普鲁兰酶。

（5）该酶具有较为宽的酶适应温度，在100 ℃沸水中仍具有很高的酶活，达到最高酶活的80%左右，该酶的最适酶活温度为90℃（如图2所示）。

（6）该酶是一种酸性普鲁兰酶，在pH 4.8-6.2的范围内具有很高的酶活，最适酶活pH为5.4（见图3）。

（7）该酶具有极高的热稳定性和耐酸性，在高温70℃和酸性条件pH为5.0处理36小时，仍保持50%以上的活性（如图4所示）。

（8）该酶在实验条件下，以可溶性淀粉为底物的动力学常数：Km 为3.2 mg/mL，K _cat 为168.2^s-1; 以普鲁兰糖为底物的动力学常数Km 为12.8 mg/mL，K _cat 为898.2^s-1。

（9） 普鲁兰酶工程菌发酵条件的优化，最佳发酵培养基为：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L, MgSO₄· 7H₂0 0.5 g/L, MgSO₄· 7H₂0与K₂HPO₄的质量比为6:1。最佳发酵条件为：100 mL/250 mL, 转速180r/min，接种量5%，培养温度37℃，诱导阶段OD₆₀₀为0.8，诱导温度37℃，诱导时间4h，诱导剂乳糖浓度8 g/L。经优化，工程菌表达重组普鲁兰酶的酶活力达到150 U/mL。

嗜热耐酸性的普鲁兰酶的制备

嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，工程菌表达条件的优化。具体步骤如下：

（1）菌株、质粒、酶与培养基：

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、限制性内切酶、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接kit ver.2.1购自TakaRa公司；克隆与表达质粒载体pET15b、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21-codonPlus(DE3)-RIL购自Novagen公司；LB培养基：每升含Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g； 氨苄青霉素浓度为100 mg/L, 氯霉素浓度为34 mg。

（2）PCR扩增及重组质粒的构建

设计一对引物：上游[5’ GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC3’]，下游[5’GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC 3’]，其中，下划线部分为上游引物NdeⅠ酶切位点及下游引物SalⅠ酶切位点。以Thermotoga lettingae TMO全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。

（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入0.5-1 mol/L IPTG于37 ℃继续培养3-5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白，即本发明的产物嗜热酸性普鲁兰酶。

5、嗜热酸性普鲁兰酶的应用

本发明的普鲁兰酶可用于医药、生物工程领域麦芽三糖及麦芽寡糖的制备，也可以与糖化酶、α-淀粉酶协同作用由可溶性淀粉生产葡萄糖。

（1）利用本发明的普鲁兰酶（生成麦芽三糖），可以用普鲁兰糖来生产麦芽三糖，由于该酶所具有的独特的嗜热及热稳定性，可以提高反应速率并消除反应可能带来的污染物等负面影响；

（2）可以利用普鲁兰酶与糖化酶、α-淀粉酶协同作用，将可溶性淀粉彻底水解，制备单糖葡萄糖，后者在食品，制药及化妆品领域都有重要的应用价值；

（3）该酶的耐酸特性与宿主菌Thermotoga lettingae TMO的生长pH 6-8 范围不一致，说明该酶可能具有独特生理学性质，这对于该菌代谢途径等理论研究也具有一定的参考价值。

Claims (3)

1.一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：

（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下：

上游引物 P1：5′- GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3′；

下游引物 P2：5′- GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3′；

（2）PCR扩增及重组质粒的构建： 

以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下：94℃ 预变性5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证；

（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入0.5-1 mol/L IPTG于37℃继续培养3-5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。

2.嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备麦芽三糖中的应用。

3.嗜热酸性普鲁兰酶酶在制备单糖葡萄糖中的应用。

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