CN108624640B

CN108624640B - 一种利用嗜热引发酶扩增dna的方法

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Publication number: CN108624640B
Application number: CN201710153877.8A
Authority: CN
Inventors: 付钰; 赵德
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2037-03-15
Also published as: CN108624640A

Abstract

本发明涉及一种利用嗜热引发酶扩增DNA的方法，属于分子生物学技术领域。本发明的方法首先在反应体系中加入嗜热引发酶A，所述嗜热引发酶A为TtDnaG2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。高温状态下使双链DNA分子变性，之后降低温度合成RNA引物，再高温，然后降至0℃静置后，加入DNA聚合酶，一定温度下延伸，可实现对长片段DNA的扩增，尤其适合全基因组DNA的扩增。本发明方法操作简单，成本低，适用于扩增大片段或不规则DNA分子，进而用于全基因组测序，应用前景良好。

Description

一种利用嗜热引发酶扩增DNA的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及利用嗜热引发酶扩增DNA的方法。

背景技术

DNA扩增技术在现在的生物学研究中应用非常广泛，PCR技术是利用嗜热的DNA聚合酶，通过加入人工合成的DNA引物，经高温退火，低温变性，适温延伸三个过程，完成对特定DNA片段的扩增。PCR技术目前已经得到了较大的发展，但由于目前技术的限制，对特定的DNA片段进行扩增，要得到扩增产物为特定长度和序列的DNA片段，最多只能做到对20kbp的片段进行扩增。对于一些长度更大的DNA片段(通常是全基因组DNA)进行扩增，目前常用的有MDA、MALBAC、DOP-PCR等方法，这些方法都通过加入人工合成的随机DNA引物，以结合模板的任意部位，来实现对长度较长的模板DNA的整体扩增。扩增产物为大片段的不规则的DNA分子或者是不同长度DNA分子的混合物，这种产物通常用于全基因组测序。

传统的全基因组扩增方法需要人工合成DNA引物加入到反应体系中。由于随机引物本身存在的缺陷，传统的扩增方法本身也存在一定的扩增偏好性，并会随着扩增次数的增加，这种偏好性会积累，最终使扩增产物不均一，某些DNA片段被扩增的次数多，有些则可能较少。由于有多种DNA聚合酶也可以利用RNA作为引物来进行DNA的扩增，目前己经有报道用引发酶来合成RNA，DNA聚合酶以RNA作为引物，以代替随机引物进行全基因组扩增的方法(pWGA)：T7pWGA利用T7噬菌体的gp4蛋白，在常温下同时完成解旋和引发两个过程，并通过加入DNA聚合酶和单链结合蛋白，常温下完成对DNA分子的扩增，但是该方法操作复杂，需要加入gp4、单链结合蛋白gp2.5、T7DNA聚合酶等多种蛋白，且gp4只在特定的DNA序列(3’-CTGG(G/T)-5’或3’-CTGTG-5’)处合成RNA引物，因此实用性相对较低，且序列特异性较高；T4pWGA是另外一种利用引发酶来进行DNA扩增的方法，此方法通过构建T4噬菌体复制子，体外纯化了T4噬菌体复制子的全部8种蛋白，来实现对DNA的复制，但该方法需要使用的蛋白太多，因此只具有理论意义；近来也有报道用一种可以用DNA作为底物、同时具有较低的序列特异性的引发酶TthPrimPol进行扩增的方法，也获得了较好的效果，但该方法使用的引发酶仍具有一定的序列特异性。

若能降低扩增引发序列的特异性，则能够极大地扩大引发酶在DNA扩增领域的应用空间，但目前未见有使用引发酶非特异且高效扩增DNA的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种利用嗜热引发酶高效、低特异性地扩增DNA的方法。

为了达到这一目的，本发明提供的利用嗜热引发酶扩增DNA的方法包括：(1)在反应体系中加入嗜热引发酶，高温状态下使双链DNA分子变性，

(2)降低温度合成RNA引物，再高温，

(3)然后降温静置后，加入DNA聚合酶，

(4)一定温度下延伸，可实现DNA的扩增。

优选地，本发明所述嗜热引发酶为嗜热引发酶A，其为TtDnaG2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(1)所述反应体系，其50μL反应体系中，样品模板2.5pg～5ng，50mM pH7.5的HEPES，10mM DTT，100mM谷氨酸钾，5mM 乙酸镁，100μM NTP,500μM dNTP,1μM嗜热引发酶A。

步骤(1)所述高温状态是指85～98℃，15s～5min。

优选地，步骤(1)所述高温状态是指95℃，30s。

步骤(2)降低温度至65～75℃，5～30min合成RNA引物。

优选地，步骤(2)降低温度至70℃，30min合成RNA引物。

步骤(2)所述再高温是指升温至90～95℃，保持30s～3min。

优选地，步骤(2)所述再高温是指升温至95℃，保持3min。

步骤(3)降温静置是指降温至0℃静置1min以上。

优选地，步骤(3)降温静置是指降温至0℃静置10min。

步骤(4)所述一定温度下延伸是指65℃，3小时。

优选延伸条件是65℃，3小时。

本发明利用嗜热引发酶A扩增DNA的方法流程图见图1。

本发明提供了上述方法在全基因组测序中的应用。

本发明提供了嗜热引发酶A在扩增长片段DNA中的应用，所述嗜热引发酶A，其为TtDnaG2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的利用嗜热引发酶扩增DNA的方法可实现对长片段DNA的扩增，尤其适合全基因组DNA的扩增，引发的序列特异性较低。本发明以合成的RNA为引物进行DNA分子的扩增经单轮扩增，可将纳克级的质粒DNA模板扩增至微克级，经两轮扩增，可将匹克级的质粒DNA模板扩增至微克级，具有较高的扩增效率。本发明方法操作简单，成本低，适用于扩增大片段或不规则DNA分子，进而用于全基因组测序，应用前景良好。

附图说明

图1为本发明方法的流程示意图，操作顺序由①-⑥。

图2为实施例1扩增产物的电泳图。

图3为实施例1扩增倍数的统计图。

图4为实施例2扩增产物的电泳图。

图5为实施例3扩增产物的电泳图。

图6为实施例3扩增倍数的统计图。

图7为实施例3扩增产物PCR检测的电泳图。

图8为实施例4扩增产物电泳图。

图9位实施例5扩增产物电泳图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例所述嗜热引发酶A为TtDnaG2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例1

5ng质粒pET28a，50mM HEPES(pH7.5)，10mM DTT，100mM谷氨酸钾，5mM乙酸镁，100μM NTP,500μM dNTP,1μM嗜热引发酶A。配成50μL混匀后，95℃高温30秒，70℃保持30秒，95℃高温3分钟，冰上放置10分钟，加入聚合酶BST3.016u，65℃3小时。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图2，产物分子为较大的DNA分子。分光光度计检测DNA产物的总量，计算扩增倍数，结果显示本实施例的方法可将纳克级模板扩增超过10000倍，见图3。

实施例2

5ng某病毒基因组环形DNA，50mM HEPES(pH7.5)，10mM DTT，100mM谷氨酸钾，5mM乙酸镁，100μM NTP,500μM dNTP,1μM嗜热引发酶A。配成50μL混匀后，95℃高温30秒，70℃保持30秒，95℃高温3分钟，冰上放置10分钟，加入聚合酶BST3.016u，65℃3小时。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图4，扩增产物为较大的DNA分子。

实施例3

2.5pg pET28a质粒DNA，50mM HEPES(pH7.5)，10mM DTT，100mM谷氨酸钾，5mM乙酸镁，100μM NTP,500μM dNTP,1μM嗜热引发酶A。配成20μL混匀后，95℃高温30秒，70℃保持30秒，95℃高温3分钟，冰上放置10分钟，加入聚合酶16u，65℃3小时。将该体系扩大至50μL，95℃高温30秒，70℃保持30秒，95℃高温3分钟，冰上放置10分钟，加入聚合酶BST3.016u，65℃3小时，扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图5，结果为较大的条带并带有不规则的弥散。分光光度计按检测并计算产物的含量，扩增倍数超过5千万，见图6。

根据pET28a的序列，分别设计了三对检测引物：

引物1(正向)：GGTCAGACTAAACTGG

引物1(反向)：GGAGAAAACTCACCGA

引物2(正向)：GTAGTGGGATACGACG

引物2(反向)：GCGTTTCCAGACTTTAC

引物3(正向)：GGTTGCATTCGATTCC

引物3(反向)：CCCTGATAGACGGTTT

PCR扩增，扩增产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图7，三对引物得到的条带大小分别约为700bp，500bp，600bp。对三个条带的扩增产物回收测序，结果显示三个扩增产物均来自质粒pET28a，说明本实施例方法经历了两轮扩增反应，虽然扩增产物的电泳条带有不规则的弥散，得到的扩增产物仍然是相同的，并非不同DNA分子的混合物。本实施例证实，对于皮克级别的DNA模板，使用本发明的方法仍然能够获得大片段、单一的DNA扩增产物，扩增倍数超过5千万倍。

实施例4对比例

5ng质粒pET28a，50mM HEPES(pH7.5)，10mM DTT，100mM谷氨酸钾，5mM乙酸镁，100μM NTP,500μM dNTP，1μM嗜热引发酶A。配成50μL混匀后，95℃高温30分钟，70℃保持30秒，95℃高温3分钟，冰上放置10分钟，加入聚合酶BST3.0 16u，65℃3小时。1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳未看到有明显扩增产物，见图8。本实施例除95℃高温30分钟与实施例1不同外，其他条件参数均相同，但无法扩增DNA片段。

实施例5对比例

5ng质粒pET28a，50mM Tris(pH7.5)，10mM DTT，100mM谷氨酸钾，5mM乙酸镁，100μMNTP,500μM dNTP,1μM嗜热引发酶A。配成50μL混匀后，95℃高温30秒，70℃保持30秒，95℃高温3分钟，冰上放置10分钟，加入聚合酶BST3.016u，65℃3小时。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果未看到明显条带，见图9。本实施例除50mM Tris与实施例1不同外，，其他条件参数均相同，但无法实现DNA片段的有效扩增。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种利用嗜热引发酶扩增DNA的方法

<130> KHP171111129.4TQ

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 415

<212> PRT

<213> TtDnaG2

<400> 1

Met His Arg Asp Leu Asp Ile Leu Asp Val Ala Lys Arg Leu Gly Ile

1 5 10 15

Arg Ile Leu Arg Arg Ala Ser Asn Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Cys Pro

20 25 30

Phe Cys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Pro Glu His Gly His Leu Tyr Leu

35 40 45

Asn Val Ser Lys Asn Val Tyr Tyr Cys Val Arg Cys Gly Glu Gly Gly

50 55 60

Asp Ala Val Asp Leu Tyr Ala Lys Leu Glu Asn Ile Ser Arg Lys Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Lys Arg Ile Lys Glu Glu Asn Tyr Pro Thr Asn Pro Ala Ala

85 90 95

Lys Glu Arg Ala Asp Lys Arg Ile Lys Tyr Asn Ser Val Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Thr Arg Asp Lys Val Tyr Arg Ala Phe Leu Asp Lys Leu Val Leu

115 120 125

Glu Pro Glu His Arg Lys Lys Leu Leu Lys Arg Gly Leu Ser Trp Glu

130 135 140

Glu Thr Val Lys Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Pro Glu Glu Pro Gln Gln

145 150 155 160

Trp Glu Ile Cys Lys Glu Leu Ile Lys Glu Gly Tyr Asn Leu Lys Gly

165 170 175

Ile Pro Gly Phe Tyr Gln Arg Glu Lys Asp Gly Glu Arg Tyr Trp Asp

180 185 190

Phe Val Asp Tyr Lys Gly Phe Leu Ile Pro Val Lys Asp Val Gln Gly

195 200 205

Arg Ile Gln Gly Phe Gln Ile Arg Leu Asp Glu Glu Glu Phe Gly Lys

210 215 220

Tyr Val Trp Phe Ser Ser Arg Asn Lys Leu Asn Gly Thr Pro Ala His

225 230 235 240

Ala Trp Gln Gly Val His Gly Glu Pro Ser Lys Val Val Ile Val Thr

245 250 255

Glu Gly Pro Leu Lys Ala Asp Val Ala His Tyr Leu Ser Arg Phe Thr

260 265 270

Phe Val Ser Val Pro Gly Val Thr Ala Ile Lys Gly Ile Glu Val Val

275 280 285

Leu Lys Gln Leu Gly Ala Glu Lys Ile Tyr Ile Ala Phe Asp Met Asp

290 295 300

Ser Leu Thr Asn Lys Ala Val Gln Lys Ala Lys Glu Lys Leu Glu Lys

305 310 315 320

Lys Leu Thr Glu Ala Gly Phe Val Val Lys Thr Lys Thr Val Pro Gly

325 330 335

Val Thr Ala Ile Lys Gly Ile Glu Val Val Leu Lys Gln Leu Gly Ala

340 345 350

Glu Lys Ile Tyr Ile Ala Phe Asp Met Asp Ser Leu Thr Asn Lys Ala

355 360 365

Val Gln Lys Ala Lys Glu Lys Leu Glu Lys Lys Leu Thr Glu Ala Gly

370 375 380

Phe Val Val Lys Thr Lys Thr Trp Asp Ser Arg Tyr Lys Gly Ile Asp

385 390 395 400

Asp Tyr Leu Leu Ala Gln Arg Lys Gln Lys Gln Lys Glu Val Val

405 410 415

<210> 2

<211> 1074

<212> DNA

<213> TtDnaG2

<400> 2

tcacacaact tccttttgtt tttgctttct ctgcgctaga aggtagtcat caataccttt 60

atacctgctg tcccatgttt ttgttttaac tacaaagcct gcttcagtaa gcttcttttc 120

cagcttttct tttgcctttt gcactgcttt gtttgttaaa ctgtccatgt caaatgcaat 180

gtagattttt tctgctccca actgctttag cacaacctct atacctttta tcgctgtaac 240

tccgggtacg gacacaaacg taaaacgtga cagataatgc gccacatcag cttttaaagg 300

gccttcagta acaataacaa ctttagaagg ctctccatgt acgccctgcc acgcatgagc 360

aggtgtgccg tttaatttat ttctggacga gaaccagaca tattttccga actcttcttc 420

gtccagtctt atttgaaagc cctgtattcg tccctgtacg tcttttacag ggattaaaaa 480

tcctttataa tctacaaagt cccagtacct ttccccatcc ttttctctct ggtaaaagcc 540

cggaatgcct tttaggttat acccttcttt gataagttcc ttacatattt cccaccgttg 600

ctgcggttct tccggtaggg acttataaag gtttttgact gtttcttccc aggataggcc 660

ccttttaaga agtttttttc ggtgttctgg ttccaagaca agtttatcta aaaaggccct 720

gtatacttta tctctggttt ctataggtgc gactgagtta tattttatcc ttttgtcagc 780

tctttccttg gcagcaggat ttgtagggta attttcttct tttattcttt tgtatgcctc 840

ttttctactt atattttcaa gtttcgcata caggtctact gcatccccgc cttccccgca 900

gcgtacacag tagtagacat tttttgatac atttaaataa aggtgtccgt gttcagggtc 960

cttttttgaa tctccgcaga acggacacct cgcaatgtat tcttcatttg atgctcttct 1020

tagaattctt atccccaacc tttttgcaac gtccaaaatg tccaaatctc tgtg 1074

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtcagacta aactgg 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagaaaact caccga 16

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtagtgggat acgacg 16

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgtttccag actttac 17

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggttgcattc gattcc 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccctgataga cggttt 16

Claims

1.一种利用嗜热引发酶扩增长片段DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)在反应体系中加入嗜热引发酶，高温状态下使双链DNA分子变性，所述嗜热引发酶A为TtDnaG2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述高温状态是指95℃，30s；

(2)降低温度至70℃保持30s，再升温至95℃，保持3min，

(3)然后降温至0℃静置后，加入DNA聚合酶，所述DNA聚合酶为BST3.0；

(4)65℃温度下延伸3小时，可实现DNA的扩增；

步骤(1)所述反应体系，其50μL反应体系中，样品模板2.5pg～5ng，50mM pH7.5的HEPES，10mM DTT，100mM谷氨酸钾，5mM乙酸镁，100μM NTP,500μM dNTP,1μM嗜热引发酶A。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)降温静置是指降温至0℃静置1min以上。

3.权利要求1-2任一所述的方法在全基因组测序中的应用。