JP5200302B2 - ヘリカーゼを使用するｒｎａターゲットの同定 - Google Patents
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Description
増幅方法を使用するＲＮＡターゲットの同定は、ＲＮＡウイルスのようなＲＮＡ主体の病原体の診断；癌遺伝子の調節異常のような遺伝子発現レベルのモニタリングなどの用途で望ましい手法である。発現遺伝子のｍＲＮＡ転写物のコピー数は一般に遺伝子自体よりも多いので、ＲＮＡターゲットの増幅は遺伝子診断の感度を大きく増進させる。これによって、いくつかの増幅反応で適正感度が得られないという理由で生じていた問題が解消する。ＲＮＡ増幅技術は例えば、米国特許５，３２２，７７０、５，６２４，８３３および６，７９４，１７７に記載されている。これらの方法では一般に逆転写酵素および増幅の順次段階が必要である。ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡターゲットの検出については極めて高感度であるが、フォーマットがＰＣＲ反応自体に類似しており、その実施には高価なサーモサイクラー装置が必要である（例えば、米国特許６，７９４，１７７参照）。
また、逆転写（ＲＴ）と等温増幅プラットフォームとを組合せて温度サイクル処理を使用せずに一段階でＲＮＡターゲットの増幅を行うこともできる。一例は、逆転写−鎖置換増幅（ＲＴ−ＳＤＡ）であり、この場合にはＲＮＡターゲットを増幅するために逆転写酵素およびＳＤＡプラットフォームを１つの等温段階で使用する（米国特許５，９１６，７７９）。しかしながら、ＲＴ−ＳＤＡもＳＤＡと同様に、すぐれた性能効率を得るためには修飾核酸と２対以上のプライマーとを必要とする。
本発明の１つの実施態様は、（ａ）ＲＴによってＲＮＡ分子からｃＤＮＡを合成してＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成する段階と、（ｂ）熱安定ヘリカーゼを使用して二本鎖を少なくとも部分的にｃＤＮＡとＲＮＡとに分離する段階と、（ｃ）ｃＤＮＡを増幅する段階と、（ｄ）ＲＮＡ分子のアイデンテティ決定のためにｃＤＮＡを特性決定する段階と、を含むＲＮＡ分子の同定方法を含む。該方法の特定実施例では、ＲＴが逆転写酵素またはＲＴ活性をもつＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。付加的または代替的に、ｃＤＮＡの増幅は、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅、ローリングサイクル増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行うことができる。
本発明の１つの実施態様では、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡをＲＴおよび増幅のために反復サイクルで再使用できる。全方法を単一反応容器を使用し単一バッファ中で行ってもよく、あるいは、いくつかまたは全部の段階を別々のバッファ中で行ってもよい。例えば、段階（ａ）および（ｂ）を単一バッファまたは異なるバッファ中で行うことができ、これらのバッファが段階（ｂ）および（ｃ）に使用した単一または複数のバッファと異なるものでもよい。
方法の１つの実施態様では、米国特許出願２００４−００５８３７８に記載されているような一本鎖結合タンパク質を上記の段階（ｂ）または（ｃ）に添加しない。従って方法には、一本鎖結合タンパク質を本質的に含まない反応混合物中で熱安定ヘリカーゼが使用される。熱安定ヘリカーゼは一本鎖結合タンパク質の非存在下で有効活性を有している。
方法の１つの実施態様では、ターゲット核酸の指数的および選択的増幅方法が提供される。方法は、（ａ）増幅すべきターゲット核酸の一本鎖鋳型を準備する段階と、（ｂ）段階（ａ）の鋳型にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを加える段階と、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成して二本鎖を形成する段階と、（ｄ）段階（ｃ）の二本鎖を熱安定ヘリカーゼに接触させて二本鎖を巻戻す段階とを含み、（ｅ）ターゲット核酸を指数的および選択的に増幅するために段階（ｂ）−（ｄ）を繰り返す。方法の１つの実施例では熱安定ヘリカーゼが一本鎖結合タンパク質の非存在下で使用される。
方法の１つの実施態様では、熱安定ヘリカーゼと、逆転写酵素と、ＤＮＡポリメラーゼと、マグネシウム塩、ナトリウム塩、ｄＮＴＰおよびｄＡＴＰから成るグループから選択された少なくとも３種類の試薬を含有するバッファとを含むキットが提供される。該キットは、一本鎖結合タンパク質を含まない反応物中でＤＮＡを増幅するための使用説明書を含む。バッファは例えばｐＨ８−ｐＨ１０の範囲のｐＨを有している。キットの別の例では、ポリメラーゼがＢｓｔポリメラーゼであり、および／または、熱安定ヘリカーゼがＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼであろう。
本発明の実施態様では、ヘリカーゼによるＲＮＡの逆転写と得られたｃＤＮＡの順次的または同時的増幅段階とを単一反応容器または複数の反応容器で組合せる。増幅段階にはＨＤＡを選択しているが、代替的にポリメラーゼ連鎖反応、ループ介在等温増幅またはローリングサイクル増幅でもよい。ＲＴ−ＨＤＡは約２０℃−７５℃の範囲の温度、例えば６０℃−６５℃の範囲の温度で等温的に行うとよい。本発明の１つの実施態様では、ＲＮＡを検出または定量するために、増幅プロトコルでＰＣＲに代えてリアルタイムＲＴ−ＨＤＡ、相対的ＲＴ−ＨＤＡ、競合的ＲＴ−ＨＤＡおよび比較的ＲＴ−ＨＤＡのようなＨＤＡを用いてＲＴ−ＨＤＡを行う。
ＲＮＡは、ＲＴ、熱安定ヘリカーゼ依存性変性および増幅を含む１つの反応または一連の反応で増幅できる。反応が単一反応容器で生じるときは、単一バッファを使用するのが望ましい。別々の反応容器で生じる一連の反応でＲＮＡを増幅するときはこの制約は適用しない。単一反応容器で複数の反応を行わせる利点は、ＲＴによってＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖から遊離したＲＮＡからより多い量のｃＤＮＡが産生されると同時にＲＮＡターゲット配列のｃＤＮＡコピーがＤＮＡ増幅鋳型として作用することである。
本発明の１つの実施態様では、増幅プロセスがヘリカーゼ依存性増幅である（米国特許出願２００４／００５８３７８参照）。この方法では、増幅が、少なくとも１種類のヘリカーゼとヌクレオチド三リン酸のようなエネルギー源と一本鎖結合タンパク質とを含むヘリカーゼ調製物の存在下で行われるか、または、一本鎖結合タンパク質の非存在下では熱安定ヘリカーゼの存在下で行われる。ヘリカーゼ調製物をＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチドおよびプライマーと混合してＨＤＡを行わせる。熱安定ヘリカーゼを使用する場合にはヘリカーゼ調製物は不要であろう。熱安定ヘリカーゼはおそらく一本鎖結合タンパク質を要せず、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチドおよびプライマーと結合してＨＤＡに影響を及ぼし得る（実施例１−５参照）。
ＲＮＡターゲットの例は、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたは細胞またはウイルス中で生じる他のＲＮＡのような細胞またはウイルス由来のＲＮＡのいずれかを含む。
本発明方法の実施態様に使用するための適当な逆転写酵素は、逆転写に使用される市販酵素のいずれかでよく、Ｍ−ＭｕＬＶ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）逆転写酵素のような熱安定逆転写酵素、または、Ｔｔｈポリメラーゼのような逆転写酵素活性をもつポリメラーゼを含む。
方法の実施態様に使用するためのヘリカーゼは、常温（中温性）または高温（好熱性）下で二本鎖ＤＮＡを巻戻す能力をもつ酵素である。ヘリカーゼは天然に豊富に存在し、それらの特性についても膨大な文献がある。これらは、原核生物、真核生物および古細菌で同定され、他の酵素と同様に、熱安定性（好ましい反応温度は約６０℃超）のものもあり、熱不安定性（好ましい反応温度は約２０℃−３７℃）のものもある。Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼのような熱安定ヘリカーゼの利点は、熱不安定ヘリカーゼには必要な一本鎖結合タンパク質が不要なことである。膨大な数の例を挙げることができるが、Ｔｔｅ−ＵＶｒＤヘリカーゼが一般的に熱安定ヘリカーゼの代表であり、平均的な当業者に本発明の実施方法を教示する。熱安定ヘリカーゼの例として、ＵＶｒＤ様ヘリカーゼ例えば大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼおよびＴ７遺伝子４ヘリカーゼ、および、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（米国特許出願２００４００５８３７８）のような熱安定ヘリカーゼが挙げられる。
適当なＤＮＡポリメラーゼの例は、 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ，ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、ＶｅｎｔＲＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲＴＭ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＬフラグメントおよびＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を含む。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’方向のエキソヌクレアーゼ活性が欠失し、鎖置換活性がある。
逆転写酵素、ヘリカーゼ誘発変性および場合によりＨＤＡは単一反応容器で単一バッファを使用して行うことができる。１つの実施態様で、バッファは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３−８．８を含有し、３−５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＣｌ、２０−４０ｍＭのＮａＣｌ、０．４ｍＭのｄＮＴＰおよび３ｍＭのｄＡＴＰまたはＡＴＰを含有する。
反応の温度は好ましくはヘリカーゼ反応に最適な温度になる方向に導く。しかしながら、逆転写酵素が感熱性であるときはそれに応じて温度を調節できる。
ＲＴ−ＨＤＡは単一反応容器で行うのが好ましい。このような系では、ヘリカーゼ、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡターゲットからのｃＤＮＡコピーの産生および増幅が同時に行われる。ＲＴおよび増幅を単一反応容器で行わせるときは、最初に第一鎖ｃＤＮＡが逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）逆転写酵素によって合成される（図１、段階１および２）。ＲＴから生じたＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖がヘリカーゼによって少なくとも部分的に巻戻されて一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ鋳型を生じる（図１、段階３および４）。本発明の１つの実施態様では、ヘリカーゼがＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の全長を巻戻す。一本鎖ＲＮＡは次回のＲＴ反応サイクルに入り（図１、段階５−１）、より多くの第一鎖ｃＤＮＡを産生する。ｓｓＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡに変換され（図１、段階５−２）、同時にＨＤＡ反応で増幅される（図１、段階６−９）。このプロセスは自発的に繰り返されてＲＮＡターゲット配列の指数的増幅が達成される（図１）。単一反応容器で行われる反応にはＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖およびＤＮＡ二本鎖の双方を巻戻すヘリカーゼが好ましい。このようなヘリカーゼとしては、ＵｖｒＤヘリカーゼまたはそのホモローグ例えば熱安定Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼがある。
あるいは、ＲＴ−ＨＤＡを同一または別々の反応容器で２つの異なる反応として行うこともできる。例えば、選択した逆転写酵素に好ましい温度でＲＴを行わせ、ヘリカーゼ反応に好ましい温度で増幅を行わせてもよい。２相反応の一例では、第一段階でＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を使用し例えば４２℃（ＲＴに適した温度３７℃−５０℃）で約３−１０分、より特定的には５分間でｃＤＮＡコピーを作製し、次いで第二段階で好熱性ＨＤＡ反応を使用しｔＨＤＡに適した約６２℃−６６℃、より特定的には約６５℃で約６０−１２０分間増幅させる。
ＲＴ−ＨＤＡに２つの異なるバッファ系（一方がＲＴ用、他方が増幅段階用）を使用する場合、第一鎖ｃＤＮＡはオリゴ−ｄＴプライマーまたはターゲットＲＮＡ配列に相補的な配列特異的プライマーの存在下で逆転写酵素によって合成される。本発明の１つの実施態様では、２相法のＲＴバッファは、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ．ＡＭＶ：５０ｍＭのトリスアセテート，ｐＨ８．４、７５ｍＭの酢酸カリウム、８ｍＭの酢酸マグネシウム、１０ｍＭのＤＴＴ、ｄＮＴＰおよびターゲットＲＮＡである。ＲＴ反応で得られたｃＤＮＡコピーのアリコートを第二反応バッファに移し、引き続いてヘリカーゼおよびポリメラーゼの存在下で増幅する。
出発ＲＮＡサンプルを同定するためにｃＤＮＡ産物を、配列決定、データベース比較、例えばＮａｎｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからチップに載せて提供されたＤＮＡアレイを用いるハイブリダイゼーションのような当業界で公知の方法、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ ａｎｄ ＴａｑｍａｎＲＴＭテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の使用を含む適当なプローブテクノロジーのいずれかによって特性決定する。
本文中に引用したすべての参考文献および暫定米国出願６０／６４１，４１９は参照によって本発明に組み込まれるものとする。
２反応容器／２バッファＲＴ−ＨＤＡ
この実施例では、ヒト全ＲＮＡを核酸基質として使用し、最初にＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製のＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔＲＴＭキットを使用して一本鎖ｃＤＮＡ産物に変換した。
この実施例では、ヒト全ＲＮＡを核酸基質として使用し、最初にＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製のＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔＲＴＭキットを使用して一本鎖ｃＤＮＡ産物に変換した。
以下の材料：
１μｌのヒト全ＲＮＡ（１μｇ／μｌ）
２μｌのプライマーｄＴ２３ＶＮ（５０μＭ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
４μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）
９μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
を混合して反応物を準備し、最初に７０℃で５分間インキュベートし、次いで氷上に維持した。
１μｌのヒト全ＲＮＡ（１μｇ／μｌ）
２μｌのプライマーｄＴ２３ＶＮ（５０μＭ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
４μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）
９μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
を混合して反応物を準備し、最初に７０℃で５分間インキュベートし、次いで氷上に維持した。
次に反応管に以下の試薬を添加した：
２μｌの１０×ＲＴバッファ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＲＮａｓｅインヒビター（１０単位／μｌ）
１μｌのＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（２５単位／μｌ）。
２μｌの１０×ＲＴバッファ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＲＮａｓｅインヒビター（１０単位／μｌ）
１μｌのＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（２５単位／μｌ）。
ＲＴ反応物を４２℃で１時間、次いで９５℃で５分間インキュベートした。次に１μｌのＲＮａｓｅ Ｈ（２単位／μｌ）を添加し、ＲＴ反応物をさらに３７℃で２０分間、次いで９５℃で５分間インキュベートした。次いでＲＴ産物をｄＨ２Ｏで５０μｌに希釈した。次にこの希釈ＲＴ産物の系列希釈物を調製した。どの場合にも、直前に希釈した５μｌのＲＴ産物をさらにｄＨ２Ｏで５０μｌに希釈した。その後のｔＨＤＡ反応ではＧＡＰＤＨ遺伝子を特異的にターゲットとする一対のプライマーＧＡＰＤＦｌおよびＧＡＰＤＲｌを増幅に使用した。ｔＨＤＡ反応を開始するために、以下の成分を混合することによって全容量２５μｌの反応混合物Ａを調製した：
２．５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ（下記参照＊）
５μｌの系列希釈ＲＴ産物（０．０００１％−１％のＲＴ産物）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１６．５μｌのｄＨ２Ｏ。
２．５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ（下記参照＊）
５μｌの系列希釈ＲＴ産物（０．０００１％−１％のＲＴ産物）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１６．５μｌのｄＨ２Ｏ。
また、以下の成分を混合することによって２５μｌの反応混合物Ｂを調製した：
２．５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
１１．７５μｌのｄＨ２Ｏ。
＊１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファは１００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有している。
２．５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
１１．７５μｌのｄＨ２Ｏ。
＊１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファは１００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有している。
反応混合物Ａを９５℃で２分間、次いで６５℃で３分間加熱した。次に、調製直後の混合物Ｂを混合物Ａに添加し、６５℃で７５分間インキュベートした。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図２）。９６ｂｐという予測サイズに合致する約１００ｂｐのバンドがレーン２（１％または１０ｎｇの出発全ＲＮＡ投入量）およびレーン３（０．１％または１ｎｇの出発全ＲＮＡ投入量）に観察された。
１反応容器／２バッファＲＴ−ＨＤＡ
この実施例では、第一鎖ｃＤＮＡ合成とｔＨＤＡ反応とを合わせて１つの管で２段階インキュベーションを使用して行った。１０ｐｇ−１００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ１とＧＡＰＤＲ１とを増幅に使用した。
この実施例では、第一鎖ｃＤＮＡ合成とｔＨＤＡ反応とを合わせて１つの管で２段階インキュベーションを使用して行った。１０ｐｇ−１００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ１とＧＡＰＤＲ１とを増幅に使用した。
１つの管で以下の材料を混合することによって全量５０μｌの反応物を準備した：
５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ
１μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（１０ｐｇ−１００ｎｇ）
０．５μｌの１０μＭプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
１μｌのＲＮａｓｅインヒビター（１０単位／μｌ）
１μｌのＭ−ＭｕＩＶ逆転写酵素（２５単位／μｌ）
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
３０．２５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ。
５μｌの１０×Ｍｇ非含有ｔＨＤＡバッファ
１μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（１０ｐｇ−１００ｎｇ）
０．５μｌの１０μＭプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
１μｌのＲＮａｓｅインヒビター（１０単位／μｌ）
１μｌのＭ−ＭｕＩＶ逆転写酵素（２５単位／μｌ）
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
３０．２５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ。
ＲＴ−ＨＤＡ反応は４２℃で５分、次いで６５℃で６０分間行った。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図３）。１００ｎｇの出発全ＲＮＡ（レーン３）および１０ｎｇの出発全ＲＮＡ（レーン４）の存在下で約１００ｂｐの濃いバンドがアガロースゲルに観察された。１ｎｇの出発全ＲＮＡの存在下（レーン５）でも約１００ｂｐの淡いバンドがアガロースゲルに観察された。観察されたＤＮＡフラグメントサイズは９６ｂｐという予測ターゲットサイズに合致した。全ＲＮＡの投入量が１ｎｇ未満のときにはプライマー−ダイマー形態の非特異的増幅だけが観察された（レーン６−８）。さらに、逆転写酵素（レーン１）またはヘリカーゼ（レーン２）を反応物から削除すると、増幅は全く観察されなかった。これは、増幅がＲＴおよびＨＤＡの双方の機能に依存したことを示唆する。
１反応容器／１バッファＲＴ−ＨＤＡ
この実施例では、高い熱安定性をもつ逆転写酵素を選択し、第一鎖ｃＤＮＡ合成とヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅反応とを合わせて１つの管で１段階で行った。１００ｐｇ−１００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ１とＧＡＰＤＲ１とを増幅に使用した。
この実施例では、高い熱安定性をもつ逆転写酵素を選択し、第一鎖ｃＤＮＡ合成とヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅反応とを合わせて１つの管で１段階で行った。１００ｐｇ−１００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ１とＧＡＰＤＲ１とを増幅に使用した。
１つの管で以下の材料を混合することによって全量５０μｌの反応物を準備した：
５μｌのＭｇ非含有ｔＨＤＡバッファ
１μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（１００ｐｇ−１００ｎｇ）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ逆転写酵素（２００単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
３１．２５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ。
５μｌのＭｇ非含有ｔＨＤＡバッファ
１μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（１００ｐｇ−１００ｎｇ）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ１（配列：１）
０．５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ１（配列：２）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ逆転写酵素（２００単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１００ｎｇ／μｌ）
３１．２５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ。
１段階のＲＴ−ＨＤＡ反応は６２．５℃で６０分間行った。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図４）。１００ｎｇ（レーン２）または１０ｎｇ（レーン３）の出発全ＲＮＡの存在下で９６ｂｐという予測ターゲットサイズに合致する約１００ｂｐのＤＮＡフラグメントがアガロースゲルに観察された。全ＲＮＡの投入量が１０ｎｇ未満のときにはプライマー−ダイマー形態の非特異的増幅だけが観察された（レーン４−６）。
修正１バッファＲＴ−ＨＤＡ
この実施例では、非特異的増幅を低減するためにＲＮＡ鋳型およびプライマーの変性に関与する独立の変性段階を使用した。６５℃で高い熱安定性をもつ逆転写酵素を選択し、第一鎖ｃＤＮＡ合成およびヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅反応を合わせて１つの管で１段階で行った。２ｐｇ−２００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の異なるエキソンに局在した一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ３とＧＡＰＤＲ３とを増幅に使用した。
この実施例では、非特異的増幅を低減するためにＲＮＡ鋳型およびプライマーの変性に関与する独立の変性段階を使用した。６５℃で高い熱安定性をもつ逆転写酵素を選択し、第一鎖ｃＤＮＡ合成およびヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅反応を合わせて１つの管で１段階で行った。２ｐｇ−２００ｎｇの範囲の種々の量のヒト全ＲＮＡとＧＡＰＤＨ遺伝子の異なるエキソンに局在した一対の特異的プライマーＧＡＰＤＦ３とＧＡＰＤＲ３とを増幅に使用した。
最初にミックスＡとミックスＢとを調製することによって全量５０μｌの反応物を準備した。ミックスＡは１つの滅菌マイクロチューブで以下の材料を混合することによって調製した：
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
２μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（２ｐｇ−２００ｎｇ）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ３（配列：３）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ３（配列：４）
１９．７５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
２μｌの可変量のヒト全ＲＮＡ（２ｐｇ−２００ｎｇ）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＦ３（配列：３）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＧＡＰＤＲ３（配列：４）
１９．７５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
陰性対照反応には、２μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏを全ＲＮＡで置き換えた。
ミックスＢは別の滅菌マイクロチューブで以下の材料を混合することによって調製した：
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
４μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビター（４０単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
０．７μｌのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（１５単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１５０ｎｇ／μｌ）
８．５５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
＊１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファは、１００ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）を含有している。
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
４μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビター（４０単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
０．７μｌのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（１５単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１５０ｎｇ／μｌ）
８．５５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
＊１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファは、１００ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）を含有している。
ミックスＡの変性は９５℃で２分間行った。ミックスＡを氷上で冷却した後、ミックスＢをミックスＡに加えた。１段階のＲＴ−ＨＤＡ反応は６５℃で１２０分間行った。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図５）。最大２００ｎｇから最小２ｐｇまでの出発全ＲＮＡの存在下で（レーン２−７）、９５ｂｐという予測ターゲットサイズに合致する約１００ｂｐの一本鎖ＤＮＡフラグメントがアガロースゲルに観察された。２ｎｇ−２００ｎｇの出発全ＲＮＡ（レーン２−７）からも鋳型非含有対照（レーン８）からも非特異的増幅は全く観察されなかった。これは、ＧＡＰＤＨ遺伝子を検出するための修正１段階ＲＴ−ＨＤＡが少なくとも５ｌｏｇの全ＲＮＡの範囲で十分な機能を発揮することを示す。
エンテロウイルスＲＮＡの検出
この実施例では、実施例４に記載した修正１段階ＲＴ−ＨＤＡ法をＲＮＡウイルスであるエンテロウイルスの検出に応用した。エンテロウイルスＣｌｅａｒ ＱＣパネル（Ａｒｇｅｎｅ，Ｖａｒｉｌｈｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から精製した４０コピーから４０００コピーの範囲のエンテロウイルスＲＮＡを鋳型として使用し、エンテロウイルスの全種に保存された５’−ＵＴＲ配列をターゲットとする一対の特異的プライマーＥＶＦ１ＡおよびＥＶＲ１を増幅用プライマーとして使用した。
この実施例では、実施例４に記載した修正１段階ＲＴ−ＨＤＡ法をＲＮＡウイルスであるエンテロウイルスの検出に応用した。エンテロウイルスＣｌｅａｒ ＱＣパネル（Ａｒｇｅｎｅ，Ｖａｒｉｌｈｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から精製した４０コピーから４０００コピーの範囲のエンテロウイルスＲＮＡを鋳型として使用し、エンテロウイルスの全種に保存された５’−ＵＴＲ配列をターゲットとする一対の特異的プライマーＥＶＦ１ＡおよびＥＶＲ１を増幅用プライマーとして使用した。
ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によってエンテロウイルスＣｌｅａｒ ＱＣパネルの精製を行った。１０コピー／μｌ、１００コピー／μｌおよび１０００コピー／μｌの濃度の１４０μｌの各エンテロウイルス標準サンプルを精製に使用し、７０μｌの溶出バッファに溶出させた。全量５０μｌの修正１段階ＲＴ−ＨＤＡ反応物は、最初にミックスＡとミックスＢとを調製することによって準備した。ミックスＡは１つの滅菌マイクロチューブで以下の材料を混合することによって調製した：
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
２μｌの可変量のエンテロウイルスＲＮＡ（４０−４０００コピー）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＥＶＦ１Ａ（配列：５）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＥＶＲ１（配列：６）
１９．７μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
２μｌの可変量のエンテロウイルスＲＮＡ（４０−４０００コピー）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＥＶＦ１Ａ（配列：５）
０．３７５μｌの１０μＭのプライマーＥＶＲ１（配列：６）
１９．７μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
陰性対照反応には、２μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２ＯをエンテロウイルスＲＮＡで置き換えた。
ミックスＢは別の滅菌マイクロチューブで以下の材料を混合することによって調製した：
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビター（４０単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
０．７μｌのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（１５単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１５０ｎｇ／μｌ）
１０．５５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
＊１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファは、１００ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）を含有している。
２．５μｌの１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファ（下記参照＊）
１．７５μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ４
２μｌの５００ｍＭのＮａＣｌ
２μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ
１．５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ
０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビター（４０単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
０．７μｌのＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（１５単位／μｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，ＬＦ（８単位／μｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）
１μｌのＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ（１５０ｎｇ／μｌ）
１０．５５μｌのヌクレアーゼ非含有Ｈ２Ｏ
全量：２５μｌ。
＊１０×ＲＴ−ＨＤＡバッファは、１００ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）を含有している。
ミックスＡの変性は９５℃で２分間行った。ミックスＡを氷上で冷却した後、ミックスＢをミックスＡに加えた。１段階ＲＴ−ＨＤＡ反応は６５℃で１２０分間行った。増幅産物を２％アガロースゲルで分析した（図６）。４０００コピー（レーン１）および４００コピー（レーン２）の出発エンテロウイルスＲＮＡの存在下で１１６ｂｐという予測ターゲットサイズに合致する約１２０ｂｐの一本鎖ＤＮＡフラグメントがアガロースゲルに観察された。４０コピーの出発エンテロウイルスＲＮＡからは増幅が全く観察されなかった（レーン３）。４０００コピーから４０コピーまでの出発エンテロウイルスＲＮＡ（レーン１−３）からも鋳型非含有対照（レーン４）からも非特異的増幅は全く観察されなかった。
Claims (6)
- ＲＮＡのヘリカーゼ依存性増幅方法であって、
（ａ）ＲＮＡに、逆転写酵素と、ヘリカーゼと、該ヘリカーゼが熱安定ヘリカーゼでない場合一本鎖結合タンパク質と（前記ヘリカーゼが熱安定ヘリカーゼである場合、前記一本鎖結合タンパク質を要さない）、複数のオリゴヌクレオチドプライマーと、１つ又は複数のポリメラーゼとを含む混合物を添加する段階、
（ｂ）混合物中で、ＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを形成し、ヘリカーゼ依存性増幅によって該ｃＤＮＡを増幅させる段階であって、ここで、ゲル電気泳動によって決定されるように、ヘリカーゼの非存在下では増幅が起こらない、段階
を含む方法。 - ヘリカーゼの調製物がＵｖｒＤヘリカーゼを含む請求項１に記載の方法。
- ＵｖｒＤヘリカーゼが熱安定ヘリカーゼである請求項２に記載の方法。
- ヘリカーゼ依存性増幅が等温的である請求項１に記載の方法。
- 等温増幅が２０℃〜７５℃の範囲内の温度で生じる請求項４に記載の方法。
- ポリメラーゼがＢｓｔポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
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