JP6967214B2 - 新規核酸合成法 - Google Patents

Description

本発明は、新規な核酸合成法（特に、ｃＤＮＡ合成法及びＮＡＳＢＡ法によるＤＮＡ合成法）に関する。本明細書に示される全ての文献（特にＷＯ２０１２／０２０７５９号及びＷＯ２０１０／０５０４１８号）の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

現在のｃＤＮＡ合成には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素やトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素に代表されるレトロウイルス由来の逆転写酵素が用いられているが、感度および正確性がＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ合成に及ばない。これは、鋳型ＲＮＡがつくる二次構造や、逆転写酵素の耐熱性が低いこと、校正活性をもたないこと、が原因である。これまでに、アミノ酸変異導入により、野生型逆転写酵素よりも耐熱性が高い逆転写酵素（耐熱型逆転写酵素）が報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１及び２）。しかし、それらの耐熱性は、野生型逆転写酵素よりは高いが、耐熱型ＤＮＡポリメラーゼと比較すると著しく低い。

耐熱型ＤＮＡポリメラーゼにアミノ酸変異を導入することより、逆転写活性を有する耐熱型ＤＮＡポリメラーゼが報告されている（例えば特許文献２）。これらは校正活性を有するので高い正確性が期待される。しかし、その逆転写活性は逆転写酵素と比較すると弱く（例えば非特許文献４）、実用化には至っていない。

ＲＮＡ・ＤＮＡヘリカーゼ（単にＲＮＡヘリカーゼ又はヘリカーゼともよばれる）は、核酸のミスアニーリングを解消することが報告されている。従って、ｃＤＮＡ合成でしばしば問題となる非特異的増幅の解消が期待できる（例えば非特許文献５）。しかし、ＲＮＡ・ＤＮＡヘリカーゼは本来のアニーリングを弱めることもある。逆転写酵素の作用を十分保持させた反応条件において、ＲＮＡ・ＤＮＡヘリカーゼの作用によりミスアニーリングを解消させることは困難と考えられており、実用化には至っていない。

Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）は一定温度のＲＮＡ増幅法である（例えば非特許文献６）。ＲＴ−ＰＣＲのように温度の上げ下げが不要なため、ＲＴ−ＰＣＲよりも広い用途が期待される。ＮＡＳＢＡ以外で温度の上げ下げが不要なＲＮＡ増幅法としては、標的ＲＮＡにＭＭＬＶ逆転写酵素あるいはＡＭＶ逆転写酵素で代表される逆転写酵素を作用させて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、これにＴｔＥ−ＵｖｒＤで代表される耐熱型ヘリカーゼおよびＢｓｔポリメラーゼで代表される耐熱型鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを作用させて一定温度でＤＮＡを増幅させる方法（特許文献３）、および標的ＲＮＡに、ＰＹＲＯＰＨＡＧＥ ３１７３で代表される、逆転写活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有するＤＮＡポリメラーゼ（以下「逆転写ＤＮＡポリメラーゼ」）を作用させて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、これにＲｅｃＱヘリカーゼあるいはＴ．テングコンジェンシスおよびＴ．アクチアシス由来ヘリカーゼで代表される耐熱型ヘリカーゼおよび上記逆転写ＤＮＡポリメラーゼを作用させて一定温度でＤＮＡを増幅させる方法（特許公報４）が報告されている。しかし、それらの増幅効率はＮＡＳＢＡやＰＣＲより低く、ほとんど実用化されていない。

ところで、ＮＡＳＢＡ法は、通常標的核酸がＲＮＡの場合に用いられる手法であるが、標的核酸がＤＮＡの場合であっても、これを増幅させることができる（例えば非特許文献７）。しかし、標的核酸がＤＮＡである場合のＮＡＳＢＡ法の増幅効率は低く、これを微生物存在の検査等に応用しようとしても検出感度が低いため、実現は難しかった。その結果、ＮＡＳＢＡ法の実用化は、標的核酸がＲＮＡであるに限定されている。

国際公開第２０１２／０２０７５９号 国際公開第２０１０／０５０４１８号 特表２００８−５２６２３１号公報 特表２０１３−５１６１９２号公報

Ｋ． Ｙａｓｕｋａｗａら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｂｙ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０１０年発行、第１５０巻、ｐｐ．２９９−３０６ Ｂ． Ａｒｅｚｉら、「モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素の新たな変異は、テンプレート−プライマーへの強力な結合を介して熱安定性を増加させる（Ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｉｇｈｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｐｒｉｍｅｒ）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００９年発行、第３７巻、ｐｐ．４７３−４８１） Ｓ． Ｓａｎｏら、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆａｍｉｌｙ Ａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ Ｋ４」、ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２０１２年発行、第１３巻、ｐｐ．３１５−３２１ Ｋ． Ｙａｓｕｋａｗａら、「Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆａｍｉｌｙ Ａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ」バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、２０１２年発行、第４２７巻、ｐｐ．６５４−６５８ Ｙ． Ｓｈｉｍａｄａら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ｃｏｌｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＤＥＡＤ−ｂｏｘ ＲＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ ｉｎ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅａ」、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、２００９年発行、第３８９巻、ｐｐ．６２２−６２６ Ｔ．Ｈａｙａｓｈｉら、「Ａ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＤＲ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ」、クリニカル・ケミカル・アクタ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｃｔａ）、２００４年発行、第３４２巻、ｐｐ．１１５−１２６ Ｃ．Ｖｏｉｓｓｅｔら、「ＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ＮＡＳＢＡ，ａｌｓｏ ａｍｐｌｉｆｉｅｓ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｎ ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」バイオテクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）２０００年発行、第２９巻、ｐｐ．２３６−２４０

本発明は、高い正確性及び高い逆転写活性を維持したｃＤＮＡ合成方法を見いだすことを課題とする。また、本発明は、ＮＡＳＢＡ法を用いて標的ＤＮＡを効率よく合成する方法を見出すことも課題とする。

本発明は、（α）特定の３種の酵素を組み合わせて用いることにより効率よくｃＤＮＡを合成する方法、及び（β）ＮＡＳＢＡ法においてヘリカーゼを用いることにより標的核酸がＤＮＡの場合にも合成効率を向上させる方法、を包含する。

本発明者らは、特定の（ｉ）逆転写酵素、特定の（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び特定の（ｉｉｉ）ヘリカーゼの、特定の３種の酵素を組み合わせて用いることにより、効率よくｃＤＮＡを合成できることを見いだし、さらに改良を重ねて上記（α）の発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
以下の（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉｉ）ヘリカーゼを含有する溶液中で、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法。
（ｉ）以下の（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載の逆転写酵素；
（ｉ−１）：配列番号１のアミノ酸配列において、６９位のグルタミン酸、１０８位のアスパラギン酸、１１７位のグルタミン酸、１２４位のアスパラギン酸、２８６位のグルタミン酸、３０２位のグルタミン酸、３１３位のトリプトファン、４３５位のロイシン及び４５４位のアスパラギンからなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸が、正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写酵素
（ｉ−２）：（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有する、逆転写酵素
（ｉｉ）以下の（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載の逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｉｉ−１）：配列番号２のアミノ酸配列において、３２６番目、３２９番目、３８４番目、３８８番目、４０８番目、及び４３８番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉ−２）：（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有する、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）以下の（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載のヘリカーゼ；
（ｉｉｉ−１）：配列番号３のアミノ酸配列からなる、ヘリカーゼ
（ｉｉｉ−２）：（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼ
項２．
項１に記載の方法で得られうるｃＤＮＡに対して核酸増幅反応を行う工程を含む、鋳型ＲＮＡの存在を確認する方法。
項３．
さらに、前記核酸増幅反応で得られうる増幅された核酸の検出工程を含む、項２に記載の方法。
項４．
前記核酸増幅反応が、ＲＴ−ＰＣＲ又はＮＡＳＢＡである、項２又は３に記載の方法。
項５．
以下の（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉｉ）ヘリカーゼを備える、ｃＤＮＡ合成キット。
（ｉ）以下の（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載の逆転写酵素；
（ｉ−１）：配列番号１のアミノ酸配列において、６９位のグルタミン酸、１０８位のアスパラギン酸、１１７位のグルタミン酸、１２４位のアスパラギン酸、２８６位のグルタミン酸、３０２位のグルタミン酸、３１３位のトリプトファン、４３５位のロイシン及び４５４位のアスパラギンからなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸が、正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写酵素
（ｉ−２）：（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有する、逆転写酵素
（ｉｉ）以下の（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載の逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｉｉ−１）：配列番号２のアミノ酸配列において、３２６番目、３２９番目、３８４番目、３８８番目、４０８番目、及び４３８番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉ−２）：（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有する、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）以下の（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載のヘリカーゼ；
（ｉｉｉ−１）：配列番号３のアミノ酸配列からなる、ヘリカーゼ
（ｉｉｉ−２）：（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼ

また本発明者らは、ＮＡＳＢＡ法においてヘリカーゼを用いることにより標的核酸がＤＮＡの場合にも合成効率を向上させ得ることを見いだし、さらに改良を重ねて上記（β）の発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題をも包含する。
項Ａ．
逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、及びヘリカーゼを含む、標的ＤＮＡを鋳型として核酸を増幅させるためのミックス。
項Ｂ．
逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰ、及びｄＮＴＰからなる群より選択される少なくとも１種、ならびにヘリカーゼを備える、標的ＤＮＡを鋳型として核酸を増幅させるためのキット。
項Ｃ．
逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰ、ｄＮＴＰ、及びヘリカーゼを含む溶液（好ましくは、ヘリカーゼの濃度が１００ｎＭ以下である）中で、標的ＤＮＡを鋳型として核酸を増幅させる方法。
項Ｄ．
鋳型ＤＮＡの一部とアニールする塩基配列（好ましくは鋳型ＤＮＡの一部の相補配列）からなるＤＮＡの５’端に、さらにＴ７プロモーター配列からなるＤＮＡが結合した構造を有するプライマーを、さらに含む、項Ａに記載のミックスもしくは項Ｂに記載のキット、あるいは当該プライマーを前記溶液中にさらに含む、項Ｃに記載の方法。
項Ｅ．
ヘリカーゼが、３５〜４５℃でヘリカーゼ活性を有するヘリカーゼである、項Ａに記載のミックスもしくは項Ｂに記載のキット、又は項Ｃに記載の方法。
項Ｆ．
核酸増幅がＮＡＳＢＡ法によるものである、項Ａ、Ｄ若しくはＥに記載のミックスもしくは項Ｂ、Ｄ若しくはＥに記載のキット、又は項Ｃ、Ｄ若しくはＥに記載の方法。

本発明に係るｃＤＮＡ合成方法（上記（α））によれば、高い逆転写活性により非常に効率よく、ｃＤＮＡを合成することができる。しかも、高い正確性をもってｃＤＮＡが合成される。このため、非常に少数のテンプレートＲＮＡ分子からも正確かつ大量にｃＤＮＡを合成することができる。従って、本発明に係るｃＤＮＡ合成方法により、ＲＮＡ分子を非常に高感度かつ正確に検出することができる。

また、本発明に係るヘリカーゼを用いるＮＡＳＢＡ法（上記（β））によれば、ＮＡＳＢＡ法を用いて標的ＤＮＡを効率よく合成することができる。従って、標的ＤＮＡ分子をＮＡＳＢＡ法によって非常に高感度かつ正確に検出することができる。

精製タンパク質（ヘリカーゼ）の巻き戻し活性測定実験のうち、両末端突出タイプの系を用いた際の結果を示す。 精製タンパク質（ヘリカーゼ）の巻き戻し活性測定実験のうち、５’突出タイプの系を用いた際の結果を示す。 精製タンパク質（ヘリカーゼ）の巻き戻し活性測定実験のうち、３’突出タイプの系を用いた際の結果を示す。 精製タンパク質（ヘリカーゼ）の巻き戻し活性測定実験のうち、平滑末端タイプの系を用いた際の結果を示す。 図１ａ〜図１ｄの結果をまとめたグラフを示す。 巻き戻し活性測定実験の結果から算出した、二本鎖ＤＮＡの各タイプの末端からの巻き戻し活性を示す。 実施例（ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出１）で用いたテンプレートＲＮＡおよびプライマーの配列を示す。 実施例（ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出１）に示す方法でｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＰＣＲの増幅産物を２％アガロース電気泳動にかけた後、エチジウムブロミドで染色し、トランスイルミネータでＤＮＡのバンドを解析した結果を示す。 実施例（ｃＤＮＡ合成産物のＮＡＳＢＡによる検出）に示す方法でＰＣＲおよびＮＡＳＢＡ−核酸クロマトを行った結果を示す。 実施例（ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出２）で用いたテンプレートＲＮＡおよびプライマーの配列を示す。 実施例（ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出２）に示す方法でｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＰＣＲの増幅産物を１％アガロース電気泳動にかけた後、エチジウムブロミドで染色し、トランスイルミネータでＤＮＡのバンドを解析した結果を示す。矢印は目的の増幅産物のバンドを示す。 実施例（ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出３）に示す方法でｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＰＣＲの増幅産物を２％アガロース電気泳動にかけた後、エチジウムブロミドで染色し、トランスイルミネータでＤＮＡのバンドを解析した結果を示す。矢印は目的の増幅産物のバンドを示す。 ｃｅｓＤ配列を含んだプラスミドＤＮＡを、ｃｅｓＤ配列増幅のためのフォワードプライマー側又はリバースプライマー側のいずれか１カ所を制限酵素（ＥｃｏＲＩ又はＰｓｔＩ）で消化した時の概要図を示す。

以下、本発明について、さらに詳細に説明する。まず、上記（α）について説明する。

本発明に包含されるｃＤＮＡ合成方法では、特定の（ｉ）逆転写酵素、特定の（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び特定の（ｉｉｉ）ヘリカーゼの、特定の３種の酵素を組み合わせて用いる。これら特定の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の酵素について、次に詳説する。

本発明に用いる（ｉ）逆転写酵素は、以下の（ｉ−１）又は（ｉ−２）の逆転写酵素である。
（ｉ−１）：配列番号１のアミノ酸配列において、６９位のグルタミン酸、１０８位のアスパラギン酸、１１７位のグルタミン酸、１２４位のアスパラギン酸、２８６位のグルタミン酸、３０２位のグルタミン酸、３１３位のトリプトファン、４３５位のロイシンおよび４５４位のアスパラギンからなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸が、
正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写酵素。
（ｉ−２）：（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有する、逆転写酵素。

正電荷アミノ酸としては、ｐＨ７．０において正に荷電しているアミノ酸が好ましく、ｐＨ８．０において正に荷電しているアミノ酸がより好ましく、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（ｐＨ８．３）において、正に荷電しているアミノ酸がさらに好ましい。なかでも、特にアルギニン及びリジンが好ましい。

なお、「（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列」とは、「配列番号１のアミノ酸配列において、６９位のグルタミン酸、１０８位のアスパラギン酸、１１７位のグルタミン酸、１２４位のアスパラギン酸、２８６位のグルタミン酸、３０２位のグルタミン酸、３１３位のトリプトファン、４３５位のロイシンおよび４５４位のアスパラギンからなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸が、正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列」のことである。

また、（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列においては、３０２位のグルタミン酸がアルギニンへの置換された配列は除かれることが好ましい。

また、配列番号１は、野生型モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素のアミノ酸配列と同一である。

本発明に用いる（ｉ）逆転写酵素は、高い熱安定性を有し、比較的高温度（例えば５０℃〜６０℃）条件下で好ましく逆転写活性を示す。

（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列は、高い熱安定性を確保する観点から、配列番号１のアミノ酸配列において、
（ｉ−１ａ）６９位のグルタミン酸のアルギニン又はリジンへの置換、
（ｉ−１ｂ）１０８位のアスパラギン酸のアルギニン又はリジンへの置換、
（ｉ−１ｃ）１１７位のグルタミン酸のアルギニン又はリジンへの置換、
（ｉ−１ｄ）１２４位のアスパラギン酸のアルギニン又はリジンへの置換、
（ｉ−１ｅ）２８６位のグルタミン酸のアルギニン又はリジンへの置換、
（ｉ−１ｆ）３０２位のグルタミン酸のリジンへの置換、
（ｉ−１ｇ）３１３位のトリプトファンのアルギニン又はリジンへの置換、
（ｉ−１ｈ）４３５位のロイシンのアルギニン又はリジンへの置換、及び
（ｉ−１ｉ）４５４位のアスパラギンのアルギニン又はリジンへの置換
からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされた配列であることが好ましく、（ｉ−１ｄ）、（ｉ−１ｅ）、（ｉ−１ｆ）、及び（ｉ−１ｈ）からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされた配列であることがより好ましく、（ｉ−１ｅ）、（ｉ−１ｆ）、及び（ｉ−１ｈ）からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされた配列であることがさらに好ましく、（ｉ−１ｅ）、（ｉ−１ｆ）、及び（ｉ−１ｈ）の置換がなされた配列であることがよりさらに好ましい。中でも、配列番号１のアミノ酸配列において、２８６位のグルタミン酸のアルギニンへの置換（Ｅ２８６Ｒ）、３０２位のグルタミン酸のリジンへの置換（Ｅ３０２Ｋ）、及び４３５位のロイシンのアルギニン（Ｌ４３５Ｒ）への置換がなされた配列であることが特に好ましい。

また、（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列は、さらに、５２４位のアスパラギン酸が非極性アミノ酸に置換された配列であることが好ましい。非極性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン等が好ましく例示でき、特にアラニンが好ましい。

最も好ましい本発明に用いる（ｉ）逆転写酵素の一つは、配列番号１のアミノ酸配列において、２８６位のグルタミン酸のアルギニンへの置換、３０２位のグルタミン酸のリジンへの置換、４３５位のロイシンのアルギニンへの置換、及び５２４位のアスパラギン酸のアラニンへの置換がなされた配列（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）からなる逆転写酵素である。

また、（ｉ−２）の「１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加」における「１又は２以上」とは、好ましくは１〜３０（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）、より好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、よりさらに好ましくは１〜５、特に好ましくは１、２又は３をいう。

（ｉ−２）の逆転写酵素のアミノ酸配列は、（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列と高い同一性を有することが好ましい。より具体的には、同一性が８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。

なお、本明細書において、アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって２つのアミノ酸を比較した際の同一性をいう。

なお、（ｉ−２）の逆転写酵素のアミノ酸配が、配列番号１のアミノ酸配列とはならないことが好ましい。つまり、配列番号１のアミノ酸配列からなる逆転写酵素は、（ｉ−２）の逆転写酵素には含まれないことが好ましい。 （ｉ−１）及び（ｉ−２）の逆転写酵素は、例えば公知の遺伝工学的手法を用いることにより製造することができる。例えば、ＷＯ２０１２／０２０７５９パンフレットに記載される方法に基づいて、容易に製造することができる。

本明細書において「逆転写活性」とは、ＲＮＡを鋳型としてそれと相補的なＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ；ｃＤＮＡ）を合成する反応（逆転写反応）を触媒する活性をいう。本明細書において、逆転写活性を有するという場合における逆転写活性の程度は、特に限定されないが、例えば常法に従い逆転写反応を行わせた場合に、レトロウイルス由来の逆転写酵素として知られる種々の酵素と同等又はそれ以上のｃＤＮＡを生成する程度であれば好ましい。

逆転写活性は、公知の方法又は公知の方法から容易に得られる方法により、測定することができる。例えば、以下のステップ１）〜６）：
１）反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）_１５（ｐ（ｄＴ）_１５換算濃度）、および０．２ｍＭ ［メチル−^３Ｈ］ｄＴＴＰ〕中で逆転写酵素を３７℃でインキュベーションするステップ、
２）前記ステップ１）で得られた産物２０μＬを採取し、ガラスフィルターにスポットするステップ、
３）前記ステップ２）後のガラスフィルターを、冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄して、前記ガラスフィルター上の産物からポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）_１５に取り込まれていない［^３Ｈ］ｄＴＴＰを除去するステップ、
４）前記ステップ３）後のガラスフィルターを乾燥させた後、前記ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントするステップ、
５）前記ステップ４）で得られた放射活性に基づき、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）_１５に取り込まれた［^３Ｈ］ｄＴＴＰの量（以下、「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出するステップ、および
６）前記ステップ５）で算出されたｄＴＴＰ取り込み量に基づき、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）_１５に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量を求めるステップ
を行なうことによって測定することができる。

本発明に用いる（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼは、以下の（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼである。
（ｉｉ−１）：配列番号２のアミノ酸配列において、３２６番目、３２９番目、３８４番目、３８８番目、４０８番目、及び４３８番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ。
（ｉｉ−２）：（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ逆転写活性を有する、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ。

配列番号２は、嫌気性好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． Ｋ４から単離されたＤＮＡポリメラーゼ（以下、「Ｋ４ ＤＮＡポリメラーゼ」という）のアミノ酸配列である。Ｋ４ ＤＮＡポリメラーゼは逆転写活性を有さないが、３２６番目、３２９番目、３８４番目、３８８番目、４０８番目及び、４３８番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸をアラニンに置換することによって、逆転写活性を獲得する（ＷＯ２０１０／０５０４１８パンフレット）。

（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば次の逆転写ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる：
配列番号２のアミノ酸配列において、３２６番目のトレオニン（Ｔ３２６）がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ３２６Ａ）；
配列番号２のアミノ酸配列において、３２９番目のロイシン（Ｌ３２９）がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ３２９Ａ）；
配列番号２のアミノ酸配列において、３８４番目のグルタミン（Ｑ３８４）がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ３８４Ａ）；
配列番号２のアミノ酸配列において、３８８番目のフェニルアラニン（Ｆ３８８）がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆ３８８Ａ）；
配列番号２のアミノ酸配列において、４０８番目のメチオニン（Ｍ４０８）がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍ４０８Ａ）； 及び
配列番号２のアミノ酸配列において、４３８番目のチロシン（Ｙ４３８）がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ４３８Ａ）。

これらの（ｉｉ−１）逆転写ＤＮＡポリメラーゼの中では、例えば、Ｔ３２６Ａ、Ｆ３８８Ａ、Ｍ４０８Ａ、及びＹ４３８Ａからなる群より選択される１つが好ましく、Ｔ３２６Ａ、Ｆ３８８Ａ、Ｍ４０８Ａ、及びＹ４３８Ａからなる群より選択される１つがより好ましい。特に、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に優れるという点では、Ｔ３２６Ａ及びＭ４０８Ａからなる群より選択される１つが好ましい。

また（ｉｉ−１）逆転写ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写活性を有する限り、上記アミノ酸置換が単独でなされていてもよく、また複数組み合わせてなされていてもよい。後述するように、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｔ３２６、Ｌ３２９、Ｑ３８４、Ｆ３８８、Ｍ４０８、及びＹ４３８からなる群より選択される１つをアラニンに置換した各逆転写ＤＮＡポリメラーゼはいずれも耐熱性を維持しつつ逆転写活性を獲得することができるので、これら置換箇所のうち任意の複数箇所を同時にアラニンに置換した逆転写ＤＮＡポリメラーゼも、同様に耐熱性を維持しつつ逆転写活性を獲得することができる。

アミノ酸置換が複数組み合わせてなされている（ｉｉ−１）逆転写ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｌ３２９及び／又はＱ３８４がアラニンに置換されており、かつＴ３２６、Ｆ３８８、Ｍ４０８、及びＹ４３８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。

そのような（ｉｉ−１）逆転写ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば具体的には、次の逆転写ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる：
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｌ３２９がアラニンに置換されており、かつＴ３２６がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｌ３２９がアラニンに置換されており、かつＦ３８８がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｌ３２９がアラニンに置換されており、かつＭ４０８がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｌ３２９がアラニンに置換されており、かつＹ４３８がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｑ３８４がアラニンに置換されており、かつＴ３２６がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｑ３８４がアラニンに置換されており、かつＦ３８８がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；及び
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｑ３８４がアラニンに置換されており、かつＭ４０８がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
配列番号２のアミノ酸配列において、Ｑ３８４がアラニンに置換されており、かつＹ４３８がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼ。

アミノ酸置換が複数組み合わせてなされている（ｉｉ−１）逆転写ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｌ３２９及び／又はＱ３８４がアラニンに置換されており、かつＬ３２９、Ｆ３８８、Ｍ４０８、Ｙ４３８らなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼがより好ましく、Ｌ３２９及び／又はＱ３８４がアラニンに置換されており、かつＦ３８８、Ｍ４０８、及びＹ４３８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼがさらに好ましい。

（ｉｉ−１）逆転写ＤＮＡポリメラーゼとして、中でも好ましい逆転写ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２の３２６番目、３２９番目、３８４番目、３８８番目、４０８番目及び、４３８番目のアミノ酸からなる群より選択される１つのアミノ酸がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼであり、特に好ましくは３２９番目のアミノ酸（ロイシン）がアラニンに置換されている逆転写ＤＮＡポリメラーゼである。

また、（ｉｉ−２）の「１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加」における「１又は２以上」とは、好ましくは１〜３０（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）、より好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、よりさらに好ましくは１〜５、特に好ましくは１、２又は３をいう。

（ｉｉ−２）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は、（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と高い同一性を有することが好ましい。より具体的には、同一性が８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。

なお、（ｉｉ−２）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配が、配列番号２のアミノ酸配列とはならないことが好ましい。つまり、配列番号２のアミノ酸配列からなる逆転写ＤＮＡポリメラーゼは、（ｉｉ−２）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼには含まれないことが好ましい。 （ｉｉ−１）及び（ｉｉ−２）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼは、例えば公知の遺伝工学的手法を用いることにより製造することができる。例えば、ＷＯ２０１０／０５０４１８パンフレットに記載される方法に基づいて、容易に製造することができる。

本発明に用いる（ｉｉｉ）ヘリカーゼは、以下の（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）のヘリカーゼである。
（ｉｉｉ−１）：配列番号３のアミノ酸配列からなる、ヘリカーゼ
（ｉｉｉ−２）：（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼ

配列番号３は、サーモコッカス属に属する超好熱性アーキア、サーモコッカス・コダカレンシス由来のへリカーゼ、ＴＫ０５６６のアミノ酸配列である。

また、（ｉｉｉ−２）の「１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加」における「１又は２以上」とは、好ましくは１〜３０（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）、より好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、よりさらに好ましくは１〜５、特に好ましくは１、２又は３をいう。

（ｉｉｉ−２）のへリカーゼのアミノ酸配列は、（ｉｉｉ−１）のへリカーゼのアミノ酸配列と比べて、高い同一性を有することが好ましい。より具体的には、同一性が８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。 なお、本明細書において、ヘリカーゼ活性を有するとは、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いて二本鎖核酸のらせんを不安定にし、二本鎖核酸を一本鎖核酸に巻き戻す活性を示すことをいう。

二本鎖核酸を一本鎖核酸に巻き戻す活性（二本鎖核酸巻き戻し活性）は、次のようにして測定する。

巻き戻し活性測定は、二本鎖ＤＮＡを基質として用いる。当該二本鎖の一方のＤＮＡ鎖のみを蛍光標識しておく。また、当該基質以外に、二本鎖ＤＮＡをヘリカーゼが巻き戻し（アンワイド）して遊離した一本鎖をトラップするための一本鎖ＤＮＡ（トラップＤＮＡ）を測定系に加えておく。具体的には、以下の４つのタイプの基質及びトラップＤＮＡの組み合わせでの測定を行う（各タイプにおいて、トラップＤＮＡ以外の二本のＤＮＡが形成する二本鎖ＤＮＡを基質として用いる）。これにより、測定対象となるヘリカーゼが３’末端側及び／又は５’末端側から二本鎖ＤＮＡを巻き戻すかも検討できる。

両末端突出タイプ
（ＩＲＤ７００で蛍光標識した５４−ｍｅｒ）
５’−ｄ／ＩＲＤ７００／ＴＣＡＣＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣ−３’
（７０−ｍｅｒ）
５’−ｄＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＧＣＧＡＧＧＣＣＧＴＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’
（３４−ｍｅｒ （ ｔｒａｐ ＤＮＡ ））
５’−ｄＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’
５’突出タイプ
（ＩＲＤ７００で蛍光標識した３４−ｍｅｒ）
５’−ｄ／ＩＲＤ７００／ＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’
（５４−ｍｅｒ）
５’−ｄＴＣＡＣＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣ−３’
（３４−ｍｅｒ （ ｔｒａｐ ＤＮＡ ））
５’−ｄＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣ−３’
３’突出タイプ
（ＩＲＤ７００で蛍光標識した５４−ｍｅｒ）
５’−ｄ／ＩＲＤ７００／ＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣＴＴＡＧＣＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＣＡＣＴ−３’
（３４−ｍｅｒ）
５’−ｄＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’
ｔｒａｐ ＤＮＡは５’突出と同様
平滑末端タイプ
（ＩＲＤ７００で蛍光標識した５４−ｍｅｒ）
５’−ｄ／ＩＲＤ７００／ＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＧＴＧＡ−３ ’
（５４−ｍｅｒ （ ｔｒａｐ ＤＮＡ ））
５’−ｄＴＣＡＣＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣ−３’
なお、ＩＲＤ７００の励起波長は６８５ｎｍ、蛍光波長は７１２ｎｍである。

具体的な手順は次の通りである。まず、基質作製のための反応液の組成を表１に示す。表１の反応組成で９５℃、３分処理後、室温となるまで静置し、その後２５℃で１時間処理する。作製した基質を１０倍希釈し、２μＭの二本鎖ＤＮＡを用意する。そして表２の組成で測定対象ヘリカーゼと５０℃で４０分間反応させる。そして氷上で急冷することで反応を停止させる。サンプルを３倍希釈し、そのうちの２μＬと１０×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １μＬ、水７μＬを混ぜ、１３％ アクリルアミドゲルにアプライし、遮光しながら１５ｍＡ、５０分間Ｎａｔｉｖｅ Ｐａｇｅを行う。そしてオデッセイ（Odyssey infrared imaging system (LI-COR, Nebraska, USA)）を用いて蛍光を検出する。測定対象ヘリカーゼが巻き戻し活性を有するのであれば、ヘリカーゼにより（より特徴的には、ヘリカーゼ添加量を増やすにつれ）、基質二本鎖ＤＮＡ量が減少することになる。

また、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いて二本鎖核酸のらせんを不安定にしているかどうかについては、二本鎖核酸の存在下におけるＡＴＰａｓｅ活性を測定し、当該活性を有していれば、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いて二本鎖核酸のらせんを不安定にしていると判断できる。ＡＴＰａｓｅ活性は次のようにして測定する。

ＡＴＰａｓｅ活性はＡＴＰがＡＤＰに変換される際に放出される遊離リン酸量を測ることにより測定する。まず核酸依存性について調べるため、基質としてｓｓＲＮＡである６３ｍｅｒＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ６３（配列番号４））を用いる。反応液の総量は１０μＬとし、５ｎＭの核酸基質、０．２μＭの精製タンパク質、１ｍＭＡＴＰ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＤＴＴ、４ｕｎｉｔのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）を含む。これを９０℃で３０分反応させ、反応停止のために直ちに氷上へ移す。反応液の遊離リン酸量をＢＩＯＭＯＬＧＲＥＥＮ^ＴＭ（ＢＩＯＭＯＬ）を用いて測定し、Ａｂ_５３０をＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定する。

本発明は、上述の（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉｉ）ヘリカーゼを含有する溶液中で、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法も包含する。

本発明に係るｃＤＮＡ合成法では、ＲＮＡ分子を鋳型として（ｉ）逆転写酵素及び（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡを合成する。また、（ｉｉｉ）ヘリカーゼが、ＲＮＡ分子の二次構造（例えばヘアピン構造）を解消し、反応効率を上げる。

これら（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の酵素は、同一溶液内に含有され、用いられる。当該溶液内には、これら３種の酵素及び鋳型となるＲＮＡに加え、ｄＮＴＰ（各種デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート；ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰのミックス）、ＡＴＰ、プライマー等が含有される。他に、酵素の反応を効率的にするため、各種塩（例えばＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２等）、緩衝剤（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、Ｍｎ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２、ＣＨ_３ＣＯＯＫ等）、Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡ、グリセロール等が含まれ得る。これら他に用いる成分の種類や量については、特に制限されないが、本発明に係るｃＤＮＡ合成法の利用方法（例えばＲＴ−ＰＣＲやＮＡＳＢＡ等）も考慮して、適宜設定することが出来る。

例えば、ｄＮＴＰ濃度は、０．０１〜０．５ｍＭ程度が好ましく、０．０５〜０．３ｍＭ程度がより好ましく、０．１〜０．２ｍＭ程度がさらに好ましい。

緩衝剤については、ｐＨが７．５〜９程度に設定されるよう含有されることが好ましく、ｐＨ８〜８．５程度がより好ましく、ｐＨ８．１〜８．４程度がさらに好ましく、ｐＨ８．２〜８．３程度がよりさらに好ましい。

例えば、ＫＣｌ濃度は、１０〜１００ｍＭ程度が好ましく、２５〜７５ｍＭ程度がより好ましく、４０〜６０ｍＭ程度がさらに好ましい。例えば、ＭｇＣｌ_２濃度は、１〜１０ｍＭ程度が好ましく、２．５〜７．５ｍＭ程度がより好ましく、４〜６ｍＭ程度がさらに好ましい。

トレハロースが溶液に含有される場合は、その濃度は、０．０１〜０．５Ｍ程度が好ましく、０．０５〜２．５Ｍ程度がより好ましく、０．０８〜１．５Ｍ程度がさらに好ましく、０．１Ｍ程度がよりさらに好ましい。

ＡＴＰ濃度は、０．１〜５ｍＭ程度が好ましく、０．５〜２．５ｍＭ程度がより好ましく、０．８〜１．５ｍＭ程度がさらに好ましく、１ｍＭ程度がよりさらに好ましい。

Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡが溶液に含有される場合は、その濃度は、０．０１〜０．５Ｍ程度が好ましく、０．０５〜０．２５Ｍ程度がより好ましく、０．０８〜０．１５Ｍ程度がさらに好ましく、０．１Ｍ程度がよりさらに好ましい。

プライマー濃度としては、例えば、０．１〜５μＭが好ましく、０．５〜２．５μＭがより好ましく、０．８〜１．５μＭがさらに好ましく、１μＭ程度がよりさらに好ましい。

また、反応温度や反応時間についても、各酵素の反応効率等に基づいて検討し決定し得る。例えば、反応温度は４５〜６５℃が好ましく、５０〜６０℃がより好ましい。また、反応時間は、例えば１０〜６０分が好ましく、２０〜４０分がより好ましく、３０分程度がさらに好ましい。

なお、最も良好な反応条件の一つは、以下の条件である。この条件は各種要因について要因解析を繰り返して得られたものであり、反応溶液における各成分の濃度が最適化されている。

（ｉ）逆転写酵素 １０ｎＭ
（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ ５０ｎＭ
（ｉｉｉ）ヘリカーゼ ２０ｎＭ
ｄＮＴＰ （ｅａｃｈ） ０．２ｍＭ
ＫＣｌ ５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．３）： ２５ｍＭ
Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．２）： ５０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２： ５ｍＭ
Ｍｎ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２ １ｍＭ
ＣＨ_３ＣＯＯＫ ３０ｍＭ
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ０．１Ｍ
ＡＴＰ １ｍＭ
Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡ １０μｇ／ｍｌ
温度 ５０℃
反応時間 ３０分
ＲＮＡ １００〜１００万分子
プライマー １μＭ
反応液容量 １０μｌ

また、本発明に係るｃＤＮＡ合成法を利用することで、様々な応用が可能である。特に、得られうるｃＤＮＡに対して核酸増幅反応を行うことができる。例えばＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）を行い、ｃＤＮＡを大量に合成することができる。つまり、本発明に係るｃＤＮＡ合成法によりｃＤＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡに対してＰＣＲを行うことができる。また例えば、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により、鋳型ＲＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）を増幅することができる。

またさらに、このようにして得られうる増幅した核酸を検出することで、鋳型ＲＮＡの存在を検出することができる。つまり、核酸が増幅している場合には、それを検出することが可能であり、検出されたということは鋳型ＲＮＡが存在していたことを意味する。逆に、核酸が増幅していない場合には、それを検出することは不可能であり、検出できないということは鋳型ＲＮＡが存在していない又はごく微量しか存在していないことを意味する。

これを利用すれば、例えば、ウイルスや細菌に特有のＲＮＡや、疾患に特有のＲＮＡを検出することが可能であり、ひいてはウイルスや細菌の感染検査や、特定の疾患の検査（特に診断検査）に用いることが可能である。特に、本願発明に係るｃＤＮＡ合成法を利用することで、極めて高感度且つ正確に検査に行うことができる。標的ＲＮＡの種類や反応条件にもよるが、標的ＲＮＡ分子が例えば、１０〜１０００分子（あるいは、１０〜５００分子、１０〜３００分子、１０〜１００分子）程度しか存在していなくとも、検出可能であり得る。

なお、増幅した核酸の検出方法は特に制限されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動をして核酸染色試薬（例えばエチジウムブロマイド）で染色する、あるいは核酸クロマトグラフィーを用いるなどの方法が例示される。またあるいは、増幅された核酸に相補的であり、かつ蛍光物質または放射性物質が結合したプローブを、増幅核酸とハイブリダイゼーションさせる、といった方法も例示される。

これら以外の様々な反応にも本発明に係るｃＤＮＡ合成法は利用することが可能であり、利用形態は特に制限されない。

また、本発明は、上記ｃＤＮＡ合成法に用いるキットも包含する。当該キットには、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の酵素が含まれる。それ以外に、例えば、ｃＤＮＡ合成に用いる各種塩、緩衝材、ＡＴＰなど上述した成分が備わっていてもよい。また例えば、逆転写反応のテンプレートとして用いられるＲＮＡ、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒などが備わっていてもよい。（ｉ）〜（ｉｉｉ）の酵素がキットに含まれる形態は特に制限されず、例えば、同一溶液内に含まれていてもよいし、別々の溶液に含まれており、用いる際に全てを混ぜ合わせることであってもよい。また、酵素以外の成分についても、酵素と同様の溶液中に含まれていてもよいし、別の溶液に含まれていてもよい。また、固体や粉体の状態で含まれていてもよい。

当該キットは、例えば、生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するために好ましく用いることができる。つまり、検出キットとして好ましく用いることができる。本発明に係るｃＤＮＡ合成法は、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の酵素を用いることにより、高い正確性及び高い逆転写活性を維持した状態でｃＤＮＡを合成できるため、当該検出キットは、種々の試料に対して用いることができ、汎用性が高い。ＲＮＡ検出対象試料としては、例えば、食品（飲料含む）、海水、水、排水、土壌、植物や動物の一部（組織等）、大気等が挙げられるが、特に制限されない。

前記マーカーとしては、生体中に含まれるウイルスまたは細菌に特有の塩基配列、疾患に特有の塩基配列を有するＲＮＡなどが挙げられる。なお、本明細書において、「ウイルスまたは細菌に特有の塩基配列」とは、ウイルスまたは細菌には存在するが、生体には存在しない塩基配列、あるいはウイルスまたは細菌に感染した生体と感染していない生体での発現量に有意に差異のある塩基配列をいう。また、「疾患に特有の塩基配列」とは、疾患に罹患した生体には存在するが、疾患に罹患していない正常な生体には存在しない塩基配列、あるいは疾患に罹患した生体と罹患していない正常な生体での発現量において有意に差異のある塩基配列をいう。

前記ウイルスとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＰＶ、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ノロウイルス、ウエストナイルウイルスなどが挙げられる。また、前記細菌としては、例えば、食中毒の原因となるバチルス・セレウス、サルモネラ、腸管出血性大腸菌、ビブリオ、カンピロバクター、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などが挙げられる。前記疾患としては、例えば、癌、糖尿病、心臓病、高血圧、感染症、遺伝性疾患、先天性疾患などが挙げられる。

前記マーカーの検出用試薬としては、例えば、前記マーカーとなるＲＮＡに相補的であり、かつ蛍光物質または放射性物質が結合したプローブ、二本鎖核酸に特異的にインターカレートする蛍光物質（例えば、エチジウムブロマイドなど）などが挙げられる。

以上のように、当該検出キットを用いることで、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができるため、汎用性が高く、被験試料として用いられるＲＮＡの種類を問わず、ウイルスもしくは細菌に特有の塩基配列または疾患に特有の塩基配列を高い精度で検出することができる。

次に、上記（β）について説明する。

本発明に包含される、ヘリカーゼを用いるＮＡＳＢＡ法では、増幅対象となる標的核酸分子がＤＮＡである。よって、当該発明は、ＮＡＳＢＡ法に用いられる成分及びヘリカーゼを含む、標的ＤＮＡを鋳型として核酸を増幅させるためのキット、若しくは増幅させる方法を包含する。さらに、当該発明は、ＮＡＳＢＡ法に用いられる成分の少なくとも１種とヘリカーゼとを備えた、標的ＤＮＡを鋳型として核酸を増幅させるためのキットも包含する。

ＮＡＳＢＡ法は、逆転写酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰ、及びｄＮＴＰに、さらに基質となる標的核酸及びプライマーセットを加えた溶液中で反応が進行する。よって、本発明においても、ＮＡＳＢＡ法に用いられる成分としては、逆転写酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）、ＮＴＰ、及びｄＮＴＰが挙げられる。なお、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性とを併せ持つ逆転写酵素（すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）も知られており、当該逆転写酵素も好ましく本発明に用いることができる。当該逆転写酵素を用いる場合、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは用いなくてもよい。

逆転写酵素としては、特に制限されず、公知の逆転写酵素を用いることができる。４０〜４５℃程度で逆転写活性を有する逆転写酵素が好ましく、至適温度が４０〜４５℃程度の逆転写酵素がより好ましい。逆転写酵素としては、市販品を購入して用いることもできる。特に好ましい逆転写酵素の一例として、ＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＡＭＶ−ＲＴ）を挙げることができる。ＡＭＶ−ＲＴはＤＮＡ及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。なお、ＡＭＶはＡｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓの略である。

ＲＮａｓｅＨとしては、特に制限されず、公知のＲＮａｓｅＨを用いることができる。４０〜４５℃程度でＲＮａｓｅ活性を有するＲＮａｓｅＨが好ましく、至適温度が４０〜４５℃程度のＲＮａｓｅＨがより好ましい。例えば、大腸菌由来ＲＮａｓｅＨを挙げることができる。ＲＮａｓｅＨとしては、市販品を購入して用いることもできる。

ＲＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有していれば、特に制限されず、公知のＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。４０〜４５℃程度でＲＮＡポリメラーゼ活性を有するＲＮＡポリメラーゼが好ましく、至適温度が４０〜４５℃程度のＲＮＡポリメラーゼがより好ましい。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを好ましく挙げることができる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、市販品を購入して用いることもできる。

ＮＴＰはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰのミックスであることが好ましい。また、ｄＮＴＰはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのミックスであることが好ましい。

なお、以上の酵素の市販品の購入先としては、例えばタカラバイオ株式会社、ＮＥＢ、プロメガ株式会社等が挙げられる。

特に好ましいＮＡＳＢＡ法に用いられる成分の組み合わせとしては、ＤＮＡ及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰ、並びにｄＮＴＰが挙げられる。

標的ＤＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖の場合は反応開始時に一本鎖に解く操作を行うことが好ましい。当該操作としては、加熱（例えば９０〜９８℃で１〜１０分間程度）が例示できる。

標的ＤＮＡの増幅に用いるプライマーセットの構造としては、フォワードプライマーは標的ＤＮＡにアニールする配列からなるＤＮＡであり、リバースプライマーは標的ＤＮＡにアニールする配列からなるＤＮＡの５’端に、さらにＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列からなるＤＮＡが結合して含まれる構造を有する。

標的ＤＮＡを増幅するにあたり、一本鎖ＤＮＡ（センス鎖）に相補的なリバースプライマーがアニールする。フォワードプライマーは、リバースプライマーが伸張して生じるＤＮＡ（アンチセンス鎖）に相補的な配列を有する。そして、フォワードプライマーは当該ＤＮＡ（アンチセンス鎖）にアニールしてＤＮＡ（センス鎖）を伸張させる。

リバースプライマーが有するＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、用いるＲＮＡポリメラーゼが認識しできるものが好ましい。例えば、用いるＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである場合には、リバースプライマーが有するＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であることが好ましい。

また、標的ＤＮＡにアニールする配列とは、相補配列であるか、又は相補配列において１〜複数個（例えば２、３、４又は５個）の塩基が欠失、置換及び／又は付加している配列であることが好ましい。なお、フォワードプライマー及びリバースプライマーとも、３’末端の塩基はそれぞれがアニールする一本鎖ＤＮＡの塩基の相補塩基であることが好ましい。

ヘリカーゼとしては、公知のヘリカーゼを用いることができる。特に制限はされないが、４０〜４５℃程度でヘリカーゼ活性を有するヘリカーゼが好ましく、至適温度が４０〜４５℃程度のヘリカーゼがより好ましい。また、好ましいヘリカーゼの例として、例えば、高熱性アーキア由来ＤＥＡＤ−ｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼ及びその改変体を用いることができる。より具体的には例えば、国際公開第２０１６／０１３６２０号に記載の高熱性アーキア由来ＤＥＡＤ−ｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼ及びその改変体を用いることができる。また、上記（ｉｉｉ）のヘリカーゼを用いることもできる。またさらに、本発明（β）に用いるのに好ましいヘリカーゼの例として、ＴＫ０４６０及びその改変体を挙げることができる。ＴＫ０４６０及びその改変体を用いることで、標的ＤＮＡ分子をＮＡＳＢＡ法によって特に高感度かつ正確に検出することができる。

ＴＫ０４６０は、サーモコッカス属に属する超好熱性アーキア、サーモコッカス・コダカレンシス由来のへリカーゼである。ＴＫ０４６０のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。また、ここでの改変体とは、アミノ酸配列は同一ではないが、同一性が高く、且つヘリカーゼ活性を有するものをいう。ＴＫ０４６０の改変体は、ＴＫ０４６０のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼである。ここで、「１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加」における「１又は２以上」とは、好ましくは１〜３０（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）、より好ましくは１〜２０、さらに好ましくは１〜１０、よりさらに好ましくは１〜５、特に好ましくは１、２又は３をいう。ＴＫ０４６０の改変体のアミノ酸配列は、ＴＫ０４６０のアミノ酸配列と、同一性が８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。なお、ヘリカーゼ活性の測定方法は、上記（α）の説明で述べた通りである。

ヘリカーゼ含有ＮＡＳＢＡミックスにおけるヘリカーゼの含有割合（濃度）は、適宜設定することができ、通常１００ｎＭ以下であり、例えば１００ａＭ〜１００ｎＭが好ましく、１ｆＭ〜７５ｎＭがより好ましく、１ｐＭ〜５０ｎＭがさらに好ましく、１ｎＭ〜３０ｎＭがよりさらに好ましい。またあるいは、ヘリカーゼ濃度は比較的低濃度であってもＮＡＳＢＡ増幅効率は良好であり得ることから、例えば、２００ａＭ〜２０ｎＭ、２０ａＭ〜２ｎＭ、２ａＭ〜２００ｐＭ、又は２００ｆＭ〜２０ｐＭ程度であってもよい。

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。

以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。まず、（α）：特定の３種の酵素を組み合わせて用いることにより効率よくｃＤＮＡを合成する方法、について具体的に説明し、次に（β）：ＮＡＳＢＡ法においてヘリカーゼを用いることにより標的核酸がＤＮＡの場合にも合成効率を向上させる方法、について具体的に説明する。
＜（α）について＞
（ｉ）逆転写酵素の製造
ＷＯ２０１２／０２０７５９パンフレットの「実施例」欄の記載（特に実施例４の記載）に従い、ＭＭＬＶ逆転写酵素（配列番号１のアミノ酸配列からなる）の多重変異逆転写酵素（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。当該多重変異逆転写酵素を逆転写酵素ＭＭ４とよぶことがある。当該酵素を、（ｉ）逆転写酵素として以下の検討に用いた。

（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼの製造
ＷＯ２０１０／０５０４１８パンフレットの「実施例」欄の記載（特に実施例１及び実施例３の記載）に従い、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｓｐ． Ｋ４株由来のＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２のアミノ酸配列からなる）の３２９番目のロイシンがアラニンに置換された変異逆転写ＤＮＡポリメラーゼを得、さらに当該逆転写ＤＮＡポリメラーゼが逆転写活性を有することをＲＴ−ＰＣＲにより確認した。当該変異逆転写ＤＮＡポリメラーゼを、（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼとして、以下の検討に用いた。

（ｉｉｉ）ヘリカーゼの製造
Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓの総ＤＮＡを鋳型にし、プライマー（ＴＫ０５６６ＥＸ−Ｆ（配列番号５）、ＴＫ０５６６ＥＸ−Ｒ（配列番号６））を用いてＴＫ０５６６遺伝子を増幅した。得られたＴＫ０５６６遺伝子を含むＤＮＡ断片はＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩを用いて切断しｐＥＴ２８ａに挿入した。そして構築された ｐＥＴ−ＴＫ０５６６プラスミドを用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１−Ｃｏｄｏｎ−Ｐｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ を形質転換した。５ｍＬのＬＢ培地（１％ ｔｒｙｐｔｏｎｅ， ０．５％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ， １％ ＮａＣｌ； ａｄｊｕｓｔｅｄ ｔｏ ｐＨ ７．３ ｗｉｔｈ ＮａＯＨ）で３７℃、６時間前々培養を行い、２０ｍＬのＬＢ培地で前培養 （１％植菌、３７℃、１０時間） を行った。さらにジャーファーメンターを用いて、３７℃で１Ｌ培養を行い、ＯＤ_６６０が０．４付近でβ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ （ＩＰＴＧ） （終濃度１ｍＭ）を添加し、誘導した。誘導４時間後に集菌し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＴＫ０５６６の発現を確認した。ＬＢ培地には２０μｇ／ｍＬカナマイシン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールが含まれている。培養菌体を回収し、１０ｍＬのバッファーＤ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、 ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、 ｐＨ ７．９で懸濁後、超音波破砕した。破砕液を８０００ｇ １０分間遠心し、上清を８０℃で１５分間熱処理した。そして再び８０００ｇ、１０分間遠心して上清を回収した。発現したＴＫ０５６６のＮ末端側にはＨｉｓ６ｔａｇが付加されているため、Ｎｉカラムを使用して精製した。バッファーＤでカラムを平衡化し、そこに上清をアプライした。そしてバッファーＥ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．９で洗浄した後、バッファーＦ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．９で溶出させた。溶出画分はバッファーＤで透析した。

ＡＴＰａｓｅ 活性測定
ＡＴＰａｓｅ活性はＡＴＰがＡＤＰに変換される際に放出される遊離リン酸量を測ることにより測定した。まず核酸依存性について調べるため、基質としてｓｓＲＮＡである６３ｍｅｒ ＲＮＡ （ｓｓＲＮＡ６３）を用いた。反応液の総量は１０μＬとし、５ｎＭの核酸基質、０．２μＭの精製タンパク質、１ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＤＴＴ、４ｕｎｉｔのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （Ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａ） （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．６） を含む。これを５０℃から１１０℃で３０分反応させ、反応停止のために直ちに氷上へ移した。反応液の遊離リン酸量をＢＩＯＭＯＬ ＧＲＥＥＮ^ＴＭ（ＢＩＯＭＯＬ）を用いて測定し、Ａｂ_５３０をＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＬａｂ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。これにより、得られた精製タンパク質（ヘリカーゼ）がＡＴＰａｓｅ活性を有することを確認した。

巻き戻し活性測定
巻き戻し活性測定は、二本鎖ＤＮＡを基質として用いた。当該二本鎖の一方のＤＮＡ鎖には蛍光標識したものを用いた。また、当該基質以外に、二本鎖ＤＮＡをヘリカーゼが巻き戻し（アンワイド）して遊離した一本鎖をトラップするための一本鎖ＤＮＡ（トラップＤＮＡ）を測定系に加えた。具体的には、以下の３つのタイプの基質及びトラップＤＮＡの組み合わせでの測定を行った（各タイプにおいて、トラップＤＮＡ以外の二本のＤＮＡが形成する二本鎖ＤＮＡを基質として用いた）。

両末端突出タイプ
（ＩＲＤ７００で蛍光標識した５４−ｍｅｒ）
５’−ｄ／ＩＲＤ７００／ＴＣＡＣＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣ−３’
（７０−ｍｅｒ）
５’−ｄＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＧＣＧＡＧＧＣＣＧＴＣＣＴＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧ−３’
（３４−ｍｅｒ （ ｔｒａｐ ＤＮＡ ））
５’−ｄＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’
５’突出タイプ
（ＩＲＤ７００で蛍光標識した３４−ｍｅｒ）
５’−ｄ／ＩＲＤ７００／ＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’
（５４−ｍｅｒ）
５’−ｄＴＣＡＣＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣ−３’
（３４−ｍｅｒ （ ｔｒａｐ ＤＮＡ ））
５’−ｄＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣ−３’
３’突出タイプ
（ＩＲＤ７００で蛍光標識した５４−ｍｅｒ）
５’−ｄ／ＩＲＤ７００／ＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣＴＴＡＧＣＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＣＡＣＴ−３’
（３４−ｍｅｒ）
５’−ｄＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’
ｔｒａｐ ＤＮＡは５’突出と同様
平滑末端タイプ
（ＩＲＤ７００で蛍光標識した５４−ｍｅｒ）
５’−ｄ／ＩＲＤ７００／ＧＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＧＴＧＡ−３ ’
（５４−ｍｅｒ （ ｔｒａｐ ＤＮＡ ））
５’−ｄＴＣＡＣＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣ−３’

なお、ＩＲＤ７００の励起波長は６８５ｎｍ、蛍光波長は７１２ｎｍである。

具体的には次のようにして行った。基質作製のための反応液の組成を表７に示す。表７の反応組成で９５℃、３分処理後、室温となるまで静置し、その後２５℃で１時間処理した。作製した基質を１０倍希釈し、２μＭの二本鎖ＤＮＡ溶液を用意した。そして表８の組成で測定対象ヘリカーゼと５０℃で４０分間反応させた。そして氷上で急冷することで反応を停止させた。サンプルを３倍希釈し、そのうちの２μＬと１０×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １μＬ、水７μＬを混ぜ、１３％ アクリルアミドゲルにアプライし、遮光しながら１５ｍＡ、５０分間Ｎａｔｉｖｅ Ｐａｇｅを行った。そしてオデッセイ（Odyssey infrared imaging system (LI-COR, Nebraska, USA)）を用いて蛍光を検出した。ヘリカーゼ添加量を増やすにつれ、基質二本鎖ＤＮＡ量が減少したことから（図１ａ〜図１ｆ）、測定対象とした精製タンパク質（ヘリカーゼ）が巻き戻し活性を有することが確認できた。またさらに、当該精製タンパク質（ヘリカーゼ）は、３’末端側から二本鎖ＤＮＡを巻き戻すこともわかった。

当該精製タンパク質を、（ｉｉｉ）ヘリカーゼとして、以下の検討に用いた。

ｃＤＮＡ合成反応条件の検討
三種の酵素、すなわち上記（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉｉ）ヘリカーゼの全てを含有した系において良好に機能させ得る条件を見いだすことは難しい。それぞれの酵素が働く最適条件が異なるためである。

特に、ヘリカーゼは、ｃＤＮＡ合成反応においては、核酸のミスアニーリングを減少させ非特異的増幅を抑制することを期待して用いられるところ、逆転写酵素の作用を十分保持させた反応条件において、ヘリカーゼの作用によりミスアニーリングを解消させることは極めて困難とされている。逆転写酵素の最適条件とヘリカーゼの最適条件が大きく異なるためである。

そこで、三種酵素含有ｃＤＮＡ合成系において、反応に影響を与える可能性がある各要因を以下の手法を用いて出来る限り最適化した。
１）反応に影響を与える可能性がある要因を１３個あげ、各要因に対し、３個の水準（それぞれ水準１、水準２、水準３）を設定した。一例を表１３にあげる。表１３では、要因Ａ〜Ｎが条件検討要因であり、各要因の濃度を３個の水準に分けて検討している。
２）各要因から１個の水準を選び、２７個の異なる反応条件を決定した。一例を表１４にあげる。表１４から明らかなように、各要因の１個の水準は９個の反応条件に使われている。
３）２７個の反応条件に対してそれぞれ、初期コピー数が異なる（１００個〜１００万個）条件でｃＤＮＡ合成を行い、各反応条件に対して、検出感度が高いものほど高くなるスコアを与えた。さらに、各要因の各水準について、その水準が使われている反応条件のスコアを合計した。一例を表１５にあげる。各要因に対して、最もスコアが高い水準が好ましいといえる。
４）さらに、全体を１００％にしたときの、スコアに対する各要因の寄与率を求めた。一例を表１５にあげる。
５）寄与率の大きい要因は、次の要因解析においては、水準をせまい範囲でとり、さらに詳細な条件を検討した。

表１５の結果に基づいた、新たな要因と水準を表１６にあげる。例えば、ＭＭ４については、寄与率が２番目に高く、且つ水準３（１ｎＭ）が最もスコアが高いことから、ＭＭ４は寄与率が高く且つ濃度が高い方がスコアがよくなると考えられたため、次の検討（表１６）においては、１ｎＭよりも更に濃度を濃くした場合にどのようになるかを検討できるよう条件を設定している。逆に、Ｄ４Ｒ４濃度（プライマー濃度）については、寄与率が極めて低いため、重要な要因では無いと判断し、次の検討（表１６）では条件検討要因から外して、新たにＡＴＰ濃度を条件検討要因として加えている。

なお、表１３、表１５、表１６における各要因の記載では、ＭＭ４は逆転写酵素ＭＭ４を、Ｌ３９２Ａは逆転写ＤＮＡポリメラーゼを、ＴＫ０５５６はヘリカーゼを、Ｄ４Ｒ４はプライマーＤＲ４−４を、それぞれ示している。

上記のサイクルで検討を繰り返し、三種酵素含有ｃＤＮＡ合成系における最適条件を探索した。

ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出１
以下の反応条件でｃＤＮＡ合成反応を行った。なお、以下の条件は、上記のようにして三種酵素含有ｃＤＮＡ合成系における最適条件を探索した結果、得られた最適条件である。

逆転写酵素ＭＭ４ １０ｎＭ
逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ３２９Ａ） ５０ｎＭ
へリカーゼ（ＴＫ０５６６） ２０ｎＭ
ｄＮＴＰ （ｅａｃｈ） ０．２ｍＭ
ＫＣｌ ５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．３）： ２５ｍＭ
Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．２）： ５０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２： ５ｍＭ
Ｍｎ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２ １ｍＭ
ＣＨ_３ＣＯＯＫ ３０ｍＭ
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ０．１Ｍ
ＡＴＰ １ｍＭ
Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡ １０μｇ／ｍｌ
温度 ５０℃
反応時間 ３０分
ＲＮＡ（配列を図２に示す） １００、１０００、１万、１０万、１００万分子
プライマーＤＲ４−４（配列を図２に示す） １μＭ
反応液容量 １０μｌ

次に、以下の反応条件でｃＤＮＡ合成反応を行った。

プライマーＤＲ４−４（配列を図２に示す） １μＭ
プライマーＤＦ２−２（配列を図２に示す） １μＭ
上記反応液１．５μｌ
ｄＮＴＰ （ｅａｃｈ） ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ_４ １ｍＭ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡）に添付の１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ
１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡） ０．５μｌ
温度条件 ９５℃ ３０秒、５９℃ ３０秒、７２℃ ３０秒、３０サイクル

上記反応物を２％アガロース電気泳動にかけた結果を図３に示す。図３において、レーン１は１００万分子のＲＮＡを含む上記条件、レーン２は１０万分子のＲＮＡを含む上記条件、レーン３は１万分子のＲＮＡを含む上記条件、レーン４は１０００分子のＲＮＡを含む上記条件、レーン５は１００分子のＲＮＡを含む上記条件、レーン６は１００万分子のＲＮＡを含み、逆転写酵素ＭＭ４、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ３２９Ａ）及びヘリカーゼのいずれも含まない上記条件で、ｃＤＮＡ合成をそれぞれ行ったときの結果を示す。

レーン５で薄いながらもバンドが見られたことから、標的ＲＮＡ１００分子を含む試料１０μｌで３酵素によるｃＤＮＡ合成を行った後、試料１．５μｌ（標的ＲＮＡ１５分子相当）に対して行ったＰＣＲで、増幅ＤＮＡが検出されたことが示された。

ｃＤＮＡ合成産物のＮＡＳＢＡによる検出
上記「ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出」に示す条件（ＲＮＡは１００万分子、容量２０μｌ）で、ｃＤＮＡ合成を行った。

次に、反応物を１０の９乗倍、１０の１０乗倍、１０の１１乗倍に水で希釈したものを作製し、それぞれ２．５μｌをセレウス用ＮＡＳＢＡ−核酸クロマト検出試薬キット（株式会社カイノス：スイフトジーン（登録商標）セレウリド産生セレウス「カイノス」）に供与した。結果を図４に示す。図４において、ＩＣは増幅阻害が起きていないことを確認するためのＩｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌのライン、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅは核酸クロマトにおいて正常に展開されていることを確認するためのライン、ｃｅｓは標的であるセレウスＲＮＡが検出されたときのラインを示す。Ａは１０分子のｃｅｓＤ ＲＮＡ、Ｂは水、ＣはｃＤＮＡ合成の反応物を１０の９乗倍に希釈したもの、ＤはｃＤＮＡ合成の反応物を１０の１０乗倍に希釈したもの、ＥはｃＤＮＡ合成の反応物を１０の１１乗倍に希釈したものを、それぞれＮＡＳＢＡ−核酸クロマトにかけた結果を示す。

レーンＣとＤでｃｅｓの位置にバンドが検出されたことから、標的ＲＮＡ１００万分子を含む試料２０μｌで３酵素によるｃＤＮＡ合成を行った後、反応液の１０の１０乗倍希釈液２．５μｌに対して行ったＮＡＳＢＡで、増幅ＲＮＡが検出されたことが示された。

ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出２
二次構造をとりやすいことが知られている１６Ｓ ｒＲＮＡおよび５塩基のミスマッチを有するプライマーである１６Ｓ ｍｉｓｓ Ｒｖ２ ２５−５−５’を用いて、以下の反応条件でｃＤＮＡ合成反応を行った。

逆転写酵素ＭＭ４ １０ｎＭ
逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ３２９Ａ） ５０ｎＭ
へリカーゼ（ＴＫ０５６６） ０，２，４０，又は１３０ｎＭ
ｄＮＴＰ （ｅａｃｈ） ０．２ｍＭ
ＫＣｌ ５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．３）： ２５ｍＭ
Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．２）： ５０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２： ５ｍＭ
Ｍｎ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２ １ｍＭ
ＣＨ_３ＣＯＯＫ ３０ｍＭ
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ０．１Ｍ
ＡＴＰ １ｍＭ
Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡ １０μｇ／ｍｌ

Ｔ．Ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ １６Ｓ ｒＲＮＡ （配列は図５に示す）１００ｎｇ／ｍｌ；
プライマー１６ＳＲｖ（配列は図５に示す） １．２μＭ；
プライマー１６Ｓ ｍｉｓｓ Ｒｖ２ ２５−５−５’（配列は図５に示す）１．２μＭ；
反応液容量 ２０μｌ
温度 ４５℃
反応時間 ３０分

次に、以下の反応条件でＰＣＲを行った。
プライマー１６Ｓ Ｆｗ（配列は図５に示す） １.２μＭ
プライマー１６Ｓ Ｒｖ（配列は図５に示す） １.２μＭ
上記反応液２．０μｌ
ｄＮＴＰ （ｅａｃｈ） ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ １ｍＭ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡）に添付の１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ
１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡） ０．５μｌ
温度条件 ９４℃ ３分
９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １２０秒、３０サイクル
６８℃ ５分

上記反応物を１％アガロース電気泳動にかけた結果を図６に示す。逆転写酵素ＭＭ４および逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ３２９Ａ）存在下、且つへリカーゼ（ＴＫ０５６６）非存在下でｃＤＮＡ合成反応を行うと、１５００塩基対のバンドが見られなかった（レーン１）。一方、ＭＭ４およびＬ３２９Ａ存在下、且つＴＫ０５６６ ２ｎＭ（レーン２）又は４０ｎＭ存在下（レーン３）では１５００塩基対のバンドが見られたことから、ＴＫ０５６６がｃＤＮＡ合成反応の効率を上げることが示された。しかし、ＭＭ４およびＬ３２９Ａ存在下、且つＴＫ０５６６ １３０ｎＭ存在下では１５００塩基対のバンドが見られなかった（レーン４）。このことから、ＴＫ０５６６が過剰濃度で存在するとｃＤＮＡ合成反応の効率を下げる可能性があることが示唆された。

ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出３
以下の反応条件でｃＤＮＡ合成反応を行った。

逆転写酵素ＭＭ４ ０又は１０ｎＭ
逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ３２９Ａ） ０又は１０００ｎＭ
へリカーゼ（ＴＫ０５６６） ０又は２０ｎＭ
ｄＮＴＰ （ｅａｃｈ） ０．２ｍＭ
ＫＣｌ ５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．３）： ２５ｍＭ
Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．２）： ５０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２： ５ｍＭ
Ｍｎ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２ １ｍＭ
ＣＨ_３ＣＯＯＫ ３０ｍＭ
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ０．１Ｍ
ＡＴＰ １ｍＭ
Ｅ． ｃｏｌｉ ＲＮＡ １０μｇ／ｍｌ
温度 ５０℃
反応時間 ３０分
ＲＮＡ（ｃＤＮＡ合成産物のＰＣＲによる検出１で用いたものと同じ） １００万分子
プライマーＤＲ４−４ ０．５μＭ
反応液容量 １０μｌ

次に、以下の反応条件でｃＤＮＡ合成反応を行った。

プライマーＤＲ４−４ ０．４μＭ
プライマーＤＦ２−２ ０．４μＭ
上記反応液４．０μｌ
ｄＮＴＰ （ｅａｃｈ） ０．１２ｍＭ
Ｂｉｃｉｎｅ （ｐＨ ８．２） ５０ｍＭ
Ｍｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２ １ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ １１０ｍＭ
Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ８％
温度条件 ９５℃ ３０秒、５９℃ ３０秒、７２℃ ３０秒、３０サイクル

上記反応物を２％アガロース電気泳動にかけた結果を図７に示す。レーン１は、逆転写酵素ＭＭ４、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌ３２９Ａ）及びへリカーゼ（ＴＫ０５６６）非存在下、レーン２はＭＭ４存在下且つＬ３２９Ａ及びＴＫ０５６６非存在下、レーン３はＬ３２９Ａ存在下且つＭＭ４およびＴＫ０５６６非存在下、レーン４はＴＫ０５６６存在下且つＭＭ４およびＬ３２９Ａ非存在下、レーン５はＭＭ４及びＬ３２９Ａ存在下且つＴＫ０５６６非存在下、レーン６はＭＭ４及びＴＫ０５６６存在下且つＬ３２９Ａ非存在下、レーン７はＬ３２９Ａ及びＴＫ０５６６存在下且つＭＭ４非存在下、レーン８はＭＭ４、Ｌ３２９ＡおよびＴＫ０５６６存在下で、ｃＤＮＡ合成をそれぞれ行ったときの結果を示す。

レーン５と８で目的のバンドが検出され、さらにレーン５よりも８のバンドの方が濃く検出された。このことから、ＭＭ４およびＬ３２９Ａが存在すればＰＣＲ工程で新たに酵素を加えなくても増幅反応が起きること、また、これらにさらにＴＫ０５６６を加えることでより効率よくｃＤＮＡが合成できること、が分かった。

＜（β）について＞
ヘリカーゼＴＫ０４６０の調製
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株（Ａｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈａｅａ． ２００４， １（４）：２６３−７．）を２０ｍｌのＡＳＷ−ＹＴ−Ｓ^０培地（Ａｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈａｅａ． ２００４， １（４）：２６３−７．）で８５℃、１２時間液体培養した。生育した菌体を１００００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。得られた菌体からフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（ニッポンジーン， Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ３１１−９０１５１）処理及びエタノール沈殿処理でゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡとプライマーセットｔｋ−０４６０−Ｆｗ（配列番号２０）、ｔｋ０４６０−Ｒｖ（配列番号２１）及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡， Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ＫＯＤ−２０１Ｘ１０）を用いてＰＣＲを行い、ＴＫ０４６０遺伝子を増幅した。増幅したＴＫ０４６０遺伝子をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ， Ｃｏｄｅ Ｎｏ． Ａ９２８１）で精製した後、ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩ（タカラバイオ）で制限酵素処理を行った。得られた制限酵素処理断片をｐＥＴ−２８ａ（メルクミリポア， Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ６９８６４−３ＣＮ）のＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ部位に導入した。遺伝子導入により得られたＴＫ０４６０発現ベクターをｐＥＴ２８ａ−ＴＫ０４６０とした。

ｐＥＴ２８ａ−ＴＫ０４６０をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）（アジレントテクノロジー， Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ２３０２８０）に導入した。ＬＢ寒天培地上の形質転換体のコロニーを、１５ｍｌの２０μｇ／ｍｌカナマイシン及び２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有ＬＢ液体培地に植菌し、３７℃、１２時間振盪培養し、前培養液とした。１．５ｌの２０μｇ／ｍｌカナマイシン及び２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有ＬＢ液体培地に前培養液１５ｍｌを植菌し、３７℃で振盪培養した。培養液のＯＤ_６６０が０．５に達したところで、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭになるよう培養液に添加し、４時間、３７℃で振盪培養し、組換えＴＫ０４６０を発現した。次に１００００×ｇ、４℃で２０分間遠心し、増殖した菌体を集菌した。回収した菌体に１５ｍｌの破砕バッファー（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、４００ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、５０％ グリセロール、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム）を加え、出力３０Ｗで１５分間超音波破砕した。得られた無細胞抽出液を１００００×ｇ、４℃で１０分間遠心した。上清を回収し、６０℃で３０分間熱処理した。熱処理した溶液を２１０００×ｇ、４℃で１時間遠心し、上清を回収した。次に破砕バッファーで平衡化した２ｍｌのＮｉ^２＋−ＮＴＡ−アガロースカラム（キアゲン， Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ３０２１０）に上清を加え、イミダゾールをそれぞれ１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭを含む溶出バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、４００ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、５０％グリセロール、０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム）で段階溶出した。Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でＴＫ０４６０の存在する画分を確認した。ＴＫ０４６０が存在する画分を溶出バッファーで置換したＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｃｏｄｅ Ｎｏ． １７０８５１０１）に供し、酵素溶液中のイミダゾールを除いた。得られた精製酵素溶液をヘリカーゼＴＫ０４６０として使用した。また、保存には−２０℃フリーザーを用いた。なお、ヘリカーゼＴＫ０４６０のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。

ヘリカーゼ添加ＮＡＳＢＡ法によるＤＮＡ増幅の検討
ヘリカーゼ添加ＮＡＳＢＡ法によるＤＮＡ増幅の検討には、セレウス用ＮＡＳＢＡ−核酸クロマト検出試薬キット（株式会社カイノス：スイフトジーン（登録商標）セレウリド産生セレウス「カイノス」）を用いた。当該キットは、ＮＡＳＢＡ法により、セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）のセレウリド合成酵素遺伝子のｃｅｓオペロンのｃｅｓＤ配列を増幅し、セレウスの存在の有無を確認するためのものである。当該キットの説明書に記載された「試薬の調製方法」の指示に従って、ｄＮＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｃｅｓＤ増幅用プライマーセットが含まれた試薬溶液を調製した。フォワードプライマーの塩基配列を配列番号２３に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号２４に示す。リバースプライマーは、ｃｅｓＤ配列ＤＮＡにアニールする配列からなるＤＮＡの５’端に、さらにＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列からなるＤＮＡが結合した構造を有する。

当該試薬溶液に、ｃｅｓＤ配列を含んだプラスミドＤＮＡ（ｐＣＥＤ−１、約３５００ｂｐ）を熱変性処理（９５℃５分処理後氷冷）してから加え、さらに酵素溶液（ＡＭＶ−ＲＴ、ＲＮａｓｅＨ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む）を加えて反応をスタートさせ、その５分後にヘリカーゼＴＫ０４６０を終濃度２０ｎＭで加え（又は加えず）、ＮＡＳＢＡ法により２５分間ｃｅｓＤ配列ＤＮＡを増幅させた（反応時間３０分）。反応後、上記キットの説明書の指示に従い、展開液を加えたうえで、当該キットに含まれる核酸クロマトグラフィーに反応溶液を供し、ｃｅｓＤ配列ＤＮＡが検出されるかを検討した。なお、加えたｃｅｓＤ配列を含んだプラスミドＤＮＡの量については、ヘリカーゼ無しで増幅時間３０分で増幅可能なプラスミド量を１とし、その１／１０、１／１００、又は１／１０００の量を検討に用いた（表１８）。

また、ＮＡＳＢＡ法による反応時間を１２０分（ヘリカーゼ添加はスタートから５分で変わらず）にした以外は上記と同様にしてｃｅｓＤ配列ＤＮＡが検出されるかを検討した。また、上記ｃｅｓＤ配列を含んだプラスミドＤＮＡを、フォワードプライマー側又はリバースプライマー側のいずれか１カ所を制限酵素（ＥｃｏＲＩ又はＰｓｔＩ）で消化して（図８参照）、熱変性処理してから加えた以外は、上記と同様にしてｃｅｓＤ配列ＤＮＡが検出されるかを検討した。

結果を以下の表１８に示す。表中、「○」は検出できたことを、「−」は検出できなかったことを、「Ｎ．Ｔ」は検討していないことを、それぞれ示す。

なお、用いるヘリカーゼをＴＫ０５６６もしくはＰＦ００５３に変更した以外は、上記と同様にしてＮＡＳＢＡ法によりｃｅｓＤ配列ＤＮＡが増幅（検出）されるかを検討した結果、いずれのヘリカーゼを用いた場合においても、ヘリカーゼを用いない場合よりも検出感度が向上した。

Claims (5)

1. 以下の（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉｉ）ヘリカーゼを含有する溶液中で、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法。
   （ｉ）以下の（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載の逆転写酵素；
   （ｉ−１）：配列番号１のアミノ酸配列において、６９位のグルタミン酸、１０８位のアスパラギン酸、１１７位のグルタミン酸、１２４位のアスパラギン酸、２８６位のグルタミン酸、３０２位のグルタミン酸、３１３位のトリプトファン、４３５位のロイシン及び４５４位のアスパラギンからなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸が、正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写酵素
   （ｉ−２）：（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつ逆転写活性を有する、逆転写酵素
   （ｉｉ）以下の（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載の逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
   （ｉｉ−１）：配列番号２のアミノ酸配列において、３２６番目、３２９番目、３８４番目、３８８番目、４０８番目、及び４３８番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
   （ｉｉ−２）：（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつ逆転写活性を有する、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
   （ｉｉｉ）以下の（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載のヘリカーゼ；
   （ｉｉｉ−１）：配列番号３のアミノ酸配列からなる、ヘリカーゼ
   （ｉｉｉ−２）：（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼ
2. 以下の（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉｉ）ヘリカーゼを含有する溶液中で、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、並びに
   当該ｃＤＮＡに対して核酸増幅反応を行う工程
   を含む、鋳型ＲＮＡの存在を確認する方法。
   （ｉ）以下の（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載の逆転写酵素；
   （ｉ−１）：配列番号１のアミノ酸配列において、６９位のグルタミン酸、１０８位のアスパラギン酸、１１７位のグルタミン酸、１２４位のアスパラギン酸、２８６位のグルタミン酸、３０２位のグルタミン酸、３１３位のトリプトファン、４３５位のロイシン及び４５４位のアスパラギンからなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸が、正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写酵素
   （ｉ−２）：（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつ逆転写活性を有する、逆転写酵素
   （ｉｉ）以下の（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載の逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
   （ｉｉ−１）：配列番号２のアミノ酸配列において、３２６番目、３２９番目、３８４番目、３８８番目、４０８番目、及び４３８番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
   （ｉｉ−２）：（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつ逆転写活性を有する、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
   （ｉｉｉ）以下の（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載のヘリカーゼ；
   （ｉｉｉ−１）：配列番号３のアミノ酸配列からなる、ヘリカーゼ
   （ｉｉｉ−２）：（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼ
3. さらに、前記核酸増幅反応で得られうる増幅された核酸の検出工程を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記核酸増幅反応が、ＲＴ−ＰＣＲ又はＮＡＳＢＡである、請求項２又は３に記載の方法。
5. 以下の（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）逆転写ＤＮＡポリメラーゼ、及び（ｉｉｉ）ヘリカーゼを備える、ｃＤＮＡ合成キット。
   （ｉ）以下の（ｉ−１）又は（ｉ−２）に記載の逆転写酵素；
   （ｉ−１）：配列番号１のアミノ酸配列において、６９位のグルタミン酸、１０８位のアスパラギン酸、１１７位のグルタミン酸、１２４位のアスパラギン酸、２８６位のグルタミン酸、３０２位のグルタミン酸、３１３位のトリプトファン、４３５位のロイシン及び４５４位のアスパラギンからなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸が、正電荷アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写酵素
   （ｉ−２）：（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉ−１）の逆転写酵素のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつ逆転写活性を有する、逆転写酵素
   （ｉｉ）以下の（ｉｉ−１）又は（ｉｉ−２）に記載の逆転写ＤＮＡポリメラーゼ；
   （ｉｉ−１）：配列番号２のアミノ酸配列において、３２６番目、３２９番目、３８４番目、３８８番目、４０８番目、及び４３８番目のアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がアラニンに置換されたアミノ酸配列からなる、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
   （ｉｉ−２）：（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換が維持された状態から１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉｉ−１）の逆転写ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつ逆転写活性を有する、逆転写ＤＮＡポリメラーゼ
   （ｉｉｉ）以下の（ｉｉｉ−１）又は（ｉｉｉ−２）に記載のヘリカーゼ；
   （ｉｉｉ−１）：配列番号３のアミノ酸配列からなる、ヘリカーゼ
   （ｉｉｉ−２）：（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（ｉｉｉ−１）のヘリカーゼのアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有し、かつヘリカーゼ活性を有する、ヘリカーゼ

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