JP7313645B2 - Ｒｎａ検出方法 - Google Patents

Description

本開示はＲＮＡ検出方法及びＲＮＡ検出用キットに関する。

標的ＲＮＡを検出する方法として、ＲＮＡ－プライムローリングサークル型増幅（RNA-primed rolling circle amplification、ＲＰＲＣＡ）法が注目されている。ＲＰＲＣＡ法は、標的ＲＮＡを、その３’側配列と相補的な配列を有する環状の一本鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイズし、標的ＲＮＡの３’末端をＤＮＡ合成の開始点として、ＤＮＡプローブと相補性を有する一本鎖ＤＮＡをローリングサークル増幅（rolling circle amplification、ＲＣＡ）法により、連続的に合成する。合成された一本鎖ＤＮＡを検出することにより、逆転写（reverse transcription、ＲＴ）反応を行うことなく、標的ＲＮＡを検出することができる（例えば、特許文献１を参照。）。

ＲＰＲＣＡ法は従来のＲＮＡ検出法とは異なり、ＲＴ反応を必要とせず、標的ＲＮＡに混在しやすいＤＮＡの影響をほとんど受けないという利点を有している。また、ＲＴ反応を介さないため検出に必要な時間を大幅に短縮できる。さらに、増幅前後で検出に重要な核酸の３’末端の数が変化しないことから、既存のＤＮＡ増幅法に比べ、キャリーオーバーコンタミネーションによる偽陽性の発生が低くなると期待される。

米国特許出願公開第２００９／０１８１３９０号明細書 特開２０１２－０８０８７１号公報

しかしながら、従来のＲＰＲＣＡ法は、検出用プローブとして環状の一本鎖ＤＮＡを用いる。この場合、標的ＲＮＡの３’末端配列しか、ＤＮＡプローブの認識配列とすることができない。従って、３’末端配列が明確になっていないＲＮＡは、検出用プローブを構築することができず、検出対象とすることができない。また、３’末端配列がポリＡ配列となっている真核生物のｍＲＮＡも検出対象とすることができない。

標的ＲＮＡ上の任意の配列をＤＮＡプローブの認識配列として設定するために、環状プローブにハイブリダイズした標的ＲＮＡに対し、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を用いてニックを形成することも検討されている（例えば、特許文献２を参照。）。しかし、この場合、認識配列以外の部分にハイブリダイズしたＲＮＡにおいてもＲＮａｓｅＨによるニックが形成される。環状化ＤＮＡプローブを使用しているため、この場合にもＲＣＡ反応が進んでしまい、生体由来のＲＮＡでは非特異的にＤＮＡ増幅が確認されるという問題が生じる。

本開示の課題は、標的ＲＮＡ上の任意配列をプローブの認識配列として設定することができると共に、特異性が高いＲＮＡ検出方法を実現できるようにすることである。

本開示のＲＮＡ検出方法の一態様は、標的ＲＮＡと、標的ＲＮＡの内部配列に相補的なパドロック型のＤＮＡプローブとをハイブリダイズするハイブリダイズ工程と、標的ＲＮＡとハイブリダイズされたＤＮＡプローブをＤＮＡ結合酵素により環状化する環状化工程と、ＤＮＡプローブを環状化した後、ハイブリダイズされている標的ＲＮＡに、ＲＮａｓｅＨを用いてニックを形成するニック形成工程と、ニックが形成された標的ＲＮＡをプライマーとし、環状化したＤＮＡプローブを鋳型として、ローリングサークル型ＤＮＡ増幅法により一本鎖ＤＮＡの増幅を行う増幅工程と、を備えている。

ＲＮＡ検出方法の一態様において、標的ＲＮＡは、直鎖状ＲＮＡとすることができる。

ＲＮＡ検出方法の一態様に追いて、ＤＮＡプローブは、その配列の全部又は一部が、標的ＲＮＡに相補性を有していてもよい。

ＲＮＡ検出方法の一態様において、ハイブリダイズ工程では、標的ＲＮＡはその配列の一部がＤＮＡプローブとハイブリダイズされるようにできる。

ＲＮＡ検出方法の一態様において、増幅工程は、鎖置換活性を有するＤＮＡ合成酵素により行うことができる。

ＲＮＡ検出方法の一態様において、ニック形成工程及び増幅工程は一定温度で行うことができる。

ＲＮＡ検出方法の一態様は、増幅工程において増幅された一本鎖ＤＮＡに結合する色素を用いて検出を行う検出工程をさらに備えていてもよい。

この場合において、ＤＮＡプローブはグアニン４重鎖を形成させる配列を有し、色素は、グアニン４重鎖に特異的な検出用色素とすることができる。

ＲＮＡ検出方法の一態様において、検出工程は、増幅工程と並行して行うことができる。

本開示のＲＮＡ検出キットの一態様は、標的ＲＮＡの内部配列と相補的な配列を有するパドロック型のＤＮＡプローブと、標的ＲＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡプローブを環状化するＤＮＡ結合酵素と、ＤＮＡプローブが環状化された状態で、標的ＲＮＡにニックを形成するＲＮａｓｅＨと、ニックを形成した標的ＲＮＡをプライマーとし、ＤＮＡプローブを鋳型としてローリングサークル型ＤＮＡ増幅を行う、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素とを含む。

ＲＮＡ検出キットの一態様は、一本鎖ＤＮＡを特異的に検出する色素をさらに含んでいてもよい。

本開示のＲＮＡ検出方法によれば、標的ＲＮＡ上の任意配列をプローブの認識配列として設定することができると共に、特異性を向上できる。

一実施形態に係るＲＮＡ検出法の各ステップを示す概略図である。 ＤＮＡプローブの環状化条件の検討結果を示す電気泳動像である。 環状化効率の検討結果を示す電気泳動像である。 ニック形成及び増幅条件の検討結果を示す電気泳動像である。 ニック形成及び増幅条件の検討結果を示す電気泳動像である。 リアルタイム検出の検討結果を示すグラフである。 全ＲＮＡ抽出試料による測定結果を示す電気泳動像である。 全ＲＮＡ抽出試料によるリアルタイム検出の測定結果を示すグラフである。

本実施形態のＲＮＡ検出方法は、図１に示すように、標的ＲＮＡ１０１と、標的ＲＮＡ１０１の内部配列に相補的なパドロック型のＤＮＡプローブ１０２とをハイブリダイズするハイブリダイズ工程Ｓ１と、標的ＲＮＡ１０１とハイブリダイズされたＤＮＡプローブ１０２をＤＮＡ結合酵素（ＤＮＡリガーゼ）１０３により環状化する環状化工程Ｓ２と、ＤＮＡプローブ１０２を環状化した後、ハイブリダイズされている標的ＲＮＡ１０１に、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）１０４を用いてニックを形成するニック形成工程Ｓ３と、ニックが形成された標的ＲＮＡをプライマー１０１Ａとし、環状化されたＤＮＡプローブ１０２を鋳型として、ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）１０５を用いたローリングサークル型ＤＮＡ増幅法により一本鎖ＤＮＡ１０６の増幅を行う増幅工程Ｓ４とを備えている。

本実施形態において、標的ＲＮＡは、特に制限がない。このため、ＲＮＡを含むあらゆる試料を用いて、ＲＮＡ検出を行うことができる、具体的には、ウイルス、原核生物、及び真核生物の個体そのもの、又はその一部を試料とすることができる。例えば、人を含む脊椎動物においては、糞便、尿、又は汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、又は胆汁のような体液等を試料とすることができる。さらに、外科的に生体から取り出した組織、又は体毛のように生体から脱落した組織を試料することもできる。脊椎胴部に限らず、細菌、カビ、酵母、植物、及び昆虫等の生物に由来する種々の試料が対象となる。また、先に挙げた試料をさらに分画してその一部を取り出して試料とすることができる。

本実施形態において、標的ＲＮＡは、その３’末端にポリＡ鎖を有するものであってもよい。また、一本鎖、二本鎖のいずれも好適に使用できる。二本鎖ＲＮＡを標的とする場合は、二本鎖ＲＮＡを一本鎖に変性する前処理工程を行った後に本実施形態のＲＮＡ検出方法を行うことができる。二本鎖ＲＮＡを変性させるには、例えば、約９５℃で保持する方法等、当業者に公知の方法を用いることができる。

パドロック型のＤＮＡプローブは、例えばＤＮＡ合成機によって合成されたオリゴヌクレオチドを使用することができる。ＤＮＡプローブは、標的ＲＮＡの内部配列に相補的な配列を有し、標的ＲＮＡとハイブリダイズ可能であれば、どのようなものを用いることもできる。本開示において、標的ＲＮＡの内部配列とは、標的ＲＮＡの３’末端を含まない配列である。ＤＮＡプローブの配列は、全体が標的ＲＮＡと相補性を有していても、一部のみが標的ＲＮＡと相補性を有していてもよい。ＤＮＡプローブの大きさは、特に限定されないが、好ましくは３０ｂｐ～２０ｋｂ程度であり、より好ましくは５０ｂｐ～２０００ｂｐ程度である。

パドロック型のＤＮＡプローブと、標的ＲＮＡとのハイブリダイズは、標的ＲＮＡ及びプローブＤＮＡの組み合わせを考慮して、適宜最適な条件を設定すればよい。

標的ＲＮＡとハイブリダイズされたＤＮＡプローブ（RNA-splinted padlock probe）の環状化は、ＤＮＡ結合酵素（ＤＮＡリガーゼ）を用いて行うことができる。具体的には、T4DNA ligase又はSplintR ligaseを用いて行うことができる。特にSplintR ligaseは、系中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）濃度の影響を受けにくいため、好ましい。SplintR ligaseを用いる場合には、系中のＡＴＰ濃度は特に限定されないが、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは２０μｍ以上、好ましくは４ｍＭ以下、より好ましくは２ｍＭ以下とする。T4DNA ligaseを用いる場合には、系中のＡＴＰ濃度を１μＭ以上、好ましくは５μＭ以上、１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、より好ましくは１０μＭとする。

ＤＮＡプローブを環状化した後、標的ＲＮＡにおけるハイブリダイズしている部分に、ＲＮａｓｅＨを用いてニックを形成する。これにより、標的ＲＮＡにおけるＤＮＡプローブとハイブリダイズしている部分に３’末端が形成される。ハイブリダイズしている標的ＲＮＡにニックを形成する観点から、ＲＮａｓｅＨの濃度は好ましくは０．００３ユニット（Ｕ）以上、より好ましくは０．０３Ｕ以上とする、ハイブリダイズした標的ＲＮＡの完全な分解が生じないようにする観点から、好ましくは３Ｕ以下、より好ましくは０．３Ｕ以下とする。

ニック部分（３’末端）からローリングサークル（ＲＣＡ）型ＤＮＡ増幅法により一本鎖ＤＮＡの増幅（伸長）を行う。ローリングサークル型ＤＮＡ増幅法は、ハイブリダイズした後にニックを形成した標的ＲＮＡをプライマーとし、環状化されたＤＮＡプローブを鋳型として一本鎖ＤＮＡの伸長を行う。一本鎖ＤＮＡの伸長において、ＤＮＡの鎖置換（strand displacement）活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることが好ましい。「鎖置換活性」とは、ＤＮＡを複製していく過程において伸長方向に二本鎖のＤＮＡが既に形成されている場合、相補鎖を５’側から引き剥がして鋳型を一本鎖にしながら、一本鎖となった鋳型に対して新たな相補鎖を合成してゆく活性を意味する。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることにより、鋳型である環状化されたＤＮＡプローブの相補鎖が直列に繰り返し連結された高分子量の一本鎖ＤＮＡが得られる。

鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、特に限定されないが、例えば、phi29 DNA polymerase（New England BioLabs社他）、Klenow fragment(タカラバイオ社他)、Bst DNA polymerase (New England BioLabs社他)、BcaBEST DNA polymerase(タカラバイオ社)、PyroPhage^TM 3173 DNA polymerase（Lucigen社）等を用いることができる。中でもphi29 DNA polymeraseは、常温で反応が行えると共に、ＤＮＡ合成速度が高いため好ましい。

一本鎖ＤＮＡの増幅において使用される鎖置換型ＤＮＡ合成酵素の量（濃度）は、使用する酵素の種類によって至適化することが好ましい。例えば、phi29 DNA polymeraseの場合、好ましくは終濃度約０．０２５ｎｇ／μＬ～１μｇ／μＬ、より好ましくは終濃度約５ｎｇ／μＬ～２０ｎｇ／μＬとすることができる。

一本鎖ＤＮＡの増幅は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により反応温度を設定することができる。例えば、反応温度は一定の常温とすることができる。本開示における「常温」とは、２５℃～６５℃を意味する。具体的に、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてphi29 DNA polymeraseを使用する場合は、反応温度を好ましくは２５℃～４２℃とする。また、耐熱性酵素を使用して行う場合は、反応温度を好ましくは５５℃～６５℃とする。耐熱性酵素を使用する場合は、環状ＤＮＡプローブ鎖における標的ＲＮＡと相補的な部分の長さは約３０オリゴヌクレオチド以上であることが好ましい。

本実施形態のＲＮＡ検出方法においては、一本鎖ＤＮＡの増幅を一定温度で行うことができるため、サーマルサイクラーを用いる必要がない。

一本鎖ＤＮＡの増幅において、緩衝成分、マグネシウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含有する反応液を使用することができる。緩衝成分は、特に限定はないが、例えば、トリス塩酸又はトリス酢酸が好適に使用できる。マグネシウム塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム又は酢酸マグネシウムが好適に使用できる。塩化マグネシウムの場合その濃度は、好ましくは約５ｍＭ～２０ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭである。また、カリウム塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化カリウム、グルタミン酸カリウム（K-glutamate）又は酢酸カリウムが好適に使用できる。塩化カリウムの場合その濃度は、好ましくは約５ｍＭ～５０ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭである。また、アンモニウム塩としては、特に限定はないが、例えば、硫酸アンモニウム又は酢酸アンモニウムが好適に使用できる。その濃度は、好ましくは約５ｍＭ～６０ｍＭ、より好ましくは約４０ｍＭである。ＤＮＡ増幅の基質となるｄＮＴＰ混合物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）の濃度は、好ましくは約０．５ｍＭ～２ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭである。この他、反応液中には伸長反応の安定化を目的とした添加物を添加してもよい。例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を好ましくは約０．５ｍＭ～５ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ加えることができる。さらに、長時間反応に際し、副産物として生成される、ＤＮＡ合成反応の阻害剤であるピロリン酸を除去するためにピロフォスファターゼ（Pyrophosphatase）を加えることによって合成効率を上げることもできる。Pyrophosphataseは約０．０２Ｕ／反応、添加することが好ましい。

一本鎖ＤＮＡの増幅を行った後、増幅した一本鎖ＤＮＡの検出を行う。増幅した一本鎖ＤＮＡの検出には既知の方法を用いることができるが、例えば、増幅されたＤＮＡに結合する標識を添加し、その標識を検知する方法を用いることができる。このような標識として例えば、一本鎖の核酸に特異的に結合する染色試薬（例えば、SYBR GreenII、Invitrogen社）を用いることができる。

また、標識を増幅の反応系中に加えれば、増幅工程と並行してリアルタイムで検出を行うことができる。例えば、SYBR GreenIIを、増幅の際に反応系中に終濃度で約１倍となるように加えれば、リアルタイム検出を行うことができる。

また、増幅された一本鎖ＤＮＡがグアニン４重鎖を形成するようにし、グアニン４重鎖に特異的に結合する色素を、終濃度で約１倍となるように加えることによってもリアルタイム検出を行うことができる。グアニン４重鎖に特異的に結合する色素として、チオフラビンＴ又はその類自体を用いることができる。

これに限らず、増幅された一本鎖ＤＮＡに結合する標識を用いることができる。また、一本鎖ＤＮＡが部分的に二本鎖を形成するため、一般的な二本鎖ＤＮＡ検出に利用されるエチジウムブロマイド等を標識として用いることもできる。

この他、配列に特異的に結合する標識として、蛍光標識又は放射線標識等されたＤＮＡ断片、メチル化等の修飾を含むＲＮＡ断片、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）断片、並びにＤＮＡ配列に特異的に結合する抗体又は金属ナノ粒子等を用いることができる。標識の標的となる特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡ配列は、標的ＲＮＡの配列に相補的な配列であってもよいが、例えば、ＤＮＡプローブに標識の標的となる配列の相補的な配列を組み込んでおくことも可能である。また、配列に非特異的に結合する標識を用いることもできる。

標識の検出方法は、蛍光や放射線等、標識の種類に応じて適宜選択すればよい。また、抗体を標識に用いた場合は、二次抗体やカップリング反応を用いて検知することができる。金属ナノ粒子を用いた場合には、粒子間相互作用の変化に伴う物性変化を計測することにより検出することができる。さらに、クロマトグラフィーや電気泳動などを用いて検知することも可能である。この場合、標識せずに増幅した一本鎖ＤＮＡを検出することも可能である。

本実施形態のＲＮＡ検出方法では、ＤＮＡプローブの環状化を標的ＲＮＡとハイブリダイズした後でＤＮＡ結合酵素により行っている。このため、ＤＮＡプローブの認識配列以外の部分にＲＮＡがハイブリダイズした場合には、ＤＮＡプローブの環状化が生じず、ローリングサークル型のＤＮＡ増幅は行われない。従って、あらかじめ環状化されたＤＮＡプローブを用いる場合と比べて、特異性を大きく向上させることができる。

本実施形態のＲＮＡ検出方法に用いる反応試薬及び組成物は、ＲＮＡ検出キットとすることができる。本実施形態のＲＮＡ検出キットは、標的ＲＮＡと相補的な配列を含むパドロック型のＤＮＡプローブ、標的ＲＮＡとハイブリダイズしたパドロック型のＤＮＡプローブを環状化するＤＮＡ結合酵素、ＤＮＡプローブを環状化した後、ハイブリダイズした標的ＲＮＡにニックを形成するＲＮａｓｅＨ、ニックを形成した標的ＲＮＡをプライマーとし、環状化したＤＮＡプローブを鋳型として、一本鎖ＤＮＡの増幅を行う鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を含む。ＤＮＡ結合酵素は、T4DNA ligase又はSplintR ligaseが好ましい。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、phi29 DNA polymeraseが好ましい。この他、一本鎖ＤＮＡの増幅に用いる反応液及び増幅した一本鎖ＤＮＡの検出に用いる検出試薬等を含むことができる。反応液は、例えば緩衝成分、マグネシウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、及びｄＮＴＰ等の少なくとも１つを含有することができる。検出試薬は、例えば一本鎖の核酸に特異的に結合する色素等とすることができる。

本実施形態のＲＮＡ検出方法において、ＤＮＡプローブの環状化を行った後、ニック形成を行う前に、未反応のオリゴヌクレオチドを除去するオリゴヌクレオチド除去工程を行うことができる。未反応のオリゴヌクレオチドを除去することにより、感度をより向上させることができる。オリゴヌクレオチドの除去は、エクソヌクレアーゼを用いて行うことができる。

以下に、実施例を用いて本開示のＲＮＡ検出方法についてさらに詳細に説明する。以下の実施例は例示であり、本発明をこれに限定するものではない。

＜基本操作＞
－ハイブリダイゼーション－
あらかじめリン酸化したプローブと、標的ＲＮＡを含む試料とを混合した後、９５℃で２分間インキュベーションした後、３０℃まで徐々に温度を下げ、３０℃で１０分間インキュベーションした。混合液の最終量は１０μＬとした。混合液は、２０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのK-glutamate及び０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファとした。

－ハイブリダイゼーション産物の環状化－
１０μＬのハイブリダイゼーション産物に、所定濃度のＡＴＰ及びＤＮＡリガーゼを含む環状化反応液１０μＬを混合した。環状化反応液は、２０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのK-glutamate、２０ｍＭのMg-acetate及び２０ｍＭのＤＴＴを含むバッファとした。環状化反応液と混合した後、３７℃で１時間インキュベーションし環状化を行った。その後、６５℃で１０分間加熱することで酵素を失活させた。次に、Exonucleaseを用いて未反応のオリゴヌクレオチドを除去し、８０℃で１５分間加熱することにより酵素を失活させた。Exonucleaseは２０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのK-glutamate及び１０ｍＭのMg-acetateを含むバッファ中で作用させた。

－CircLigaseを用いたプローブの環状化－
指標となる環状化ＤＮＡは、以下のようにして形成した。最終量が２０μＬとなるように１×CircLigase reaction buffer（Epicentre社）と１００ｐｍｏｌのプローブ、０．０５ｍＭのＡＴＰ、２．５ｍＭのＭｎＣｌ₂、１００ＵのCircLigase ssDNA ligaseを混合した。その後、６０℃で１時間インキュベーションし、８０℃で２０分間加熱することで酵素を失活させた。

未反応のオリゴヌクレオチドの除去は、ハイブリダイゼーション産物の環状化と同様にして行った。

－ニック形成及び増幅－
プローブを環状化した試料に、所定量のＲＮａｓｅＨ及び鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を含む反応液を混合した。反応液は、３０ｍＭのトリス酢酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのK-glutamate、３０ｍＭの酢酸マグネシウム、８０ｍＭの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのｄＮＴＰ及び１０ｍのＭＤＴＴを含むバッファとした。その後、３０℃で所定時間インキュベーションし、６５℃で１０分間加熱することで酵素を失活させた。

－GFP mRNAのインビトロ転写－
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡのインビトロ転写は、Hiscrib T7 High Yield RNA Synthesis KitT7 Kit（New England Biolabs社）を用いて行った。１μｇのpET-AcGFPをＮｏｔＩで消化して得られた直鎖状の鋳型ＤＮＡを転写反応液に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。DNase処理により鋳型ＤＮＡを除去した後、転写したmRNAをNucleoSpin RNA Clean-nup XS(タカラバイオ)を用いて精製し、濃度測定はQuant-iT RNA BR Assay Kit（Invitrogen）とQubit fluorometer（Invitrogen）を用いて行った。転写したGFPmRNAは用時まで－８０℃で保存した。

＜環状化条件の検討＞
プローブの環状化条件を以下のようにして検討した。標的ＲＮＡには、配列表配列番号１に示される合成オリゴＲＮＡ１を用いた。ＲＮＡ１の配列は以下の通りである。
ＲＮＡ１：5’-rGrCrGrArUrCrArCrArUrGrArUrCrUrArCrurUrCrGrGrCrUrUrCrGrUrGrA-3’，30 mer
パドロックプローブには、配列表配列番号２に示されるプローブＤＮＡ１を用いた。ＤＮＡ１の配列は以下の通りである。ＤＮＡ１：5’Pho-AGATCATGTGATCGCgaattcgccagggttttcccagtcacgactTCACGAAGCCGAAGT-3’，60 mer。
なお、大文字部分がＲＮＡ１と相同性を持つ。

まず、ＲＮＡ１とＤＮＡ１とのハイブリダイゼーションを先に述べた方法により行った。ハイブリダイゼーション反応溶液中におけるＲＮＡ１の濃度は２５ｐｍｏｌとし、ＤＮＡ１の濃度は１００ｐｍｏｌとした。

次に、先に述べた方法により、プローブＤＮＡ１の環状化を行った。所定濃度のＡＴＰ及び種々のＤＮＡリガーゼを含む反応溶液１０μＬを混合した。ＡＴＰ濃度は、１ｍＭ、４００μＭ、又は１０μＭとした。ＤＮＡリガーゼは、２００ＵのT4DNA ligase、又は１２．５ＵのSplintR ligase（New England Biolabs社）とした。また、５ＵのT4RNA ligase2についても検討した。

未反応のオリゴヌクレオチドの除去は、１０ＵのExonuclease I（New England Biolabs社）、５０ＵのExonuclease III（New England Biolabs社）を用いた。環状化後にExonucleaseを含む反応液１０μＬを混合し、３０℃で１５分間インキュベーションした。その後、８０°Ｃで１５分間加熱することにより酵素を失活させた。

環状化されたプローブの精製は、フェノールクロロホルム抽出後に、High Pure PCR Cleanup Micro Kit（ロシュ・ライフサイエンス社）を用いて行った。精製には産物３０μＬを使用し、２０μＬで溶出した。

精製産物は変性のためにホルムアミドを加え、６５℃で１０分間加熱した後、１０％（ｗ／ｖ）の変性ポリアクリルアミド電気泳動（変性ＰＡＧＥ、２９：１［ｗ／ｗ］、acrylamide/bisacrylamide; 7 M urea, 1×TBE buffer）を行い、ミリＱ水により１０００倍希釈したUltra Power DNA/RNAセーフダイ（Gellex社）を用いて後染めを行い、ブルーライトを照射することにより産物を分析した。

T4DNA ligaseを用いた場合、ＤＮＡとハイブリダイズしたパドロック型プローブは、ＡＴＰ濃度にかかわらず環状化される。しかし、図２に示すように、今回ＲＮＡとハイブリダイズしたパドロック型プローブは、ＡＴＰ濃度が１０μＭの場合のみ環状化した。また、環状化効率は、ＤＮＡとハイブリダイズしたパドロック型プローブの場合と比べて低かった。SplintR ligaseを用いた場合、ＲＮＡとハイブリダイズしたパドロック型プローブも、ＡＴＰ濃度にかかわらず環状化した。ＲＮＡとハイブリダイズしたパドロック型プローブの環状化効率は、T4DNA ligaseを用いた場合の効率と比べて明らかに高かった。一方、T4RNA ligase2を用いた場合は、いずれの条件においても、パドロック型プローブの環状化を確認できなかった。

＜環状化効率の検討＞
次に、SplintR ligaseを用いた場合の、パドロック型プローブの環状化効率を検討した。標的ＲＮＡとしてインビトロ転写したGFPmRNAを用いた。パドロック型のＤＮＡプローブとして表１に示すプローブＰ１～Ｐ５（それぞれ配列表配列番号３～７に示す。）を用いた。プローブＰ１～Ｐ５は、１ｍＭのＡＴＰを添加した1×T4 Polynucleotide Kinase Buffer（タカラバイオ株式会社）と１０ＵのT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ株式会社）を使用してあらかじめリン酸化した。

なお、大文字部分が、GFPmRNAと相同性を有する部分である。また、左腕及び右腕のＴｍは、プローブ濃度が５μＭ、Ｎａイオン濃度が５０ｍＭ、ターゲットがＲＮＡであるとしてOligoanalyzer 3.1により計算した値である。

まず、GFPmRNAとプローブとのハイブリダイゼーションを先に述べたようにして行った。GFPmRNAの濃度は２５ｐｍｏｌ、プローブの濃度は１００ｐｍｏｌとした。

次に、先に述べたようにしてプローブの環状化を行った。SplintR ligaseの濃度は１２．５Ｕとした。未反応のオリゴヌクレオチドの除去は、５０ＵのExonuclease I（New England Biolabs社）、５０ＵのExonuclease III（New England Biolabs社）、１０μｇのリボヌクレアーゼＡ溶液（ナカライテスク社）を用いて行った。

環状化されたプローブの精製は、フェノールクロロホルム抽出後に、High Pure PCR Cleanup Micro Kit（ロシュ・ライフサイエンス社）を用いて行った。精製には産物３０μＬを使用し、２０μＬで溶出した。

精製産物は変性のためにホルムアミドを加え、６５℃で１０分間加熱した後、１０％（ｗ／ｖ）の変性ＰＡＧＥ（２９：１［ｗ／ｗ］、acrylamide/bisacrylamide; 7 M urea, 1×TBE buffer）を行い、ミリＱ水により１０００倍希釈したUltra Power DNA/RNAセーフダイ（Gellex社）を用いて後染めを行い、ブルーライトを照射することにより産物を分析した。

図３に示すように、Ｐ１～Ｐ５のすべてのプローブにおいてCircLigase ssDNA ligase（Epicentre社）により環状化した場合と同様の位置にバンドが認められ、SplintR ligaseによりすべてのプローブが環状化されていることが確認できた。プローブによってバンドの濃さにわずかに違いがあるため、プローブがハイブリする位置によって環状化効率に多少の差があると考えられるが、末端塩基の影響は小さいことが示された。

以上のことから、配列の一部しか判明していない標的ＲＮＡにおいても、パドロック型のＤＮＡプローブを作成し、ハイブリダイズした状態で環状化できることが明らかとなった。

＜ニック形成及び増幅条件の検討＞
ＤＮＡプローブを環状化した後のニック形成及び増幅の条件を検討した。試料として、１０ｆｍｏｌのインビトロ転写GFPmRNAを用い、プローブの濃度は２５０ｆｍｏｌとした。先に述べたようにして、GFPmRNAとリン酸化したプローブとをハイブリダイズし、プローブの環状化を行った。ＤＮＡ結合酵素には、１２．５ＵのSplintR ligaseを用いた。

次に、ニック形成及び一本鎖ＤＮＡの増幅を行った。ＲＮａｓｅＨの濃度は、０、０．０００３Ｕ、０．０００６Ｕ、０．００３Ｕ、０．００６Ｕ、０．０３Ｕ、０．０６Ｕ、０．３Ｕ及び５０Ｕとした。鎖置換型ＤＮＡ合成酵素は、１００ｎｇのphi29DNApolymeraseとした。２０μＬのライゲーション産物を用い、反応液の量は２０μＬとした。

得られた産物にUltraPowerDNA/RNAセーフダイを添加し、１％アガロースゲル電気泳動（1×TAE buffer）を行い、ブルーライトを照射することによりバンドを確認した。すべての反応と電気泳動は再現性を確認するために３回以上行った。

標的ＲＮＡにニックが形成されると、Phi29DNApolymeraseによりＤＮＡが伸長し、長鎖の一本鎖ＤＮＡが形成される。形成された一本鎖ＤＮＡは、電気泳動においてゲルのウェルの中にたまり、Ultra Power DNA/RNAセーフダイによる染色によりウェルの中が光って見えるようになる。図４には、プローブをＰ３とした場合の結果を示している。図４に示すように、ＲＮａｓｅＨを添加していない場合には、非常に薄いバンドが認められた。これは、転写が完全ではないＲＮＡ産物か、ＲＮＡが分解されたことによる結果と考えられる。ＲＮａｓｅＨの濃度が高くなるに従い、バンドの蛍光強度が増大した。これは、ニック形成が行われ、一本鎖ＤＮＡの増幅が進むことを示している。しかし、ＲＮａｓｅＨの濃度を０．０３Ｕ以上としてもほぼ一定となった。さらにＲＮａｓｅＨを高くし、５０Ｕとした場合（図示せず）には、バンドが確認できなかった。これは、高濃度のＲＮａｓｅＨにより、標的ＲＮＡが分解されたことによる。

図５には、各プローブにおける、ＲＮａｓｅＨの濃度を０．００６Ｕとした場合の結果を示している。図５に示すように、いずれのプローブを用いた場合においても、ＤＮＡの増幅が行われた。従って、ターゲットに対してプローブがハイブリダイズする位置に依存することなく、ＲＮＡの検出を行うことができる。

＜リアルタイム検出の検討＞
蛍光標識を用いたリアルタイム検出を行った。ニック形成及び増幅を、終濃度１×になるようにSYBR GreenII(インビトロジェン社)を反応液に加えた条件で、９６穴プレート中において行った。標的ＲＮＡは、インビトロ転写したGFPmRNAとし、濃度を１ｆｍｏｌ、５ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１００ｆｍｏｌとした。リアルタイム検出のために、ThermalCyclerDice（登録商標）RealTimeSystemII（タカラバイオ株式会社）を用い、励起波長４８２ｎｍ、蛍光波長５３６ｎｍで１０分ごとに測定しながら３０℃で２時間インキュベーションを行った。その他の条件は、先に述べた方法と同様にした。再現性確認のために、１回のリアルタイム検出において、各反応を複製数３で行った。

図６には、プローブをＰ４とした場合の蛍光強度の時間依存性を、標的ＲＮＡの濃度ごとに示している。１ｍｏｌを６．０×１０²³コピーとすると、この場合の検出感度は５ｆｍｏｌ（３．０×１０⁹コピー）～１ｆｍｏｌ（６．０×１０⁸コピー）であった。同様に、Ｐ１の場合は１０ｆｍｏｌ（６．０×１０⁹コピー）～５ｆｍｏｌ（３．０×１０⁹コピー）、Ｐ２の場合は５ｆｍｏｌ（３．０×１０⁹コピー）～１ｆｍｏｌ（６．０×１０⁸コピー）、Ｐ３の場合は５ｆｍｏｌ（３．０×１０⁹コピー）～１ｆｍｏｌ（６．０×１０⁸コピー）、Ｐ５の場合は１０ｆｍｏｌ（６．０×１０⁹コピー）～５ｆｍｏｌ（３．０×１０⁹コピー）であった。

＜全ＲＮＡ抽出試料による測定＞
ＧＦＰｍＲＮＡの発現を誘導した大腸菌及び誘導していない大腸菌から全ＲＮＡ抽出を行って作成した試料について、ＧＦＰｍＲＮＡの検出を行った。

ＧＦＰｍＲＮＡの発現は以下のようにして誘導した。まず、pET-AcGFPを用いて大腸菌株BL21（DE3）を形質転換し、50μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地（1%tryptone、0.5%yeastextract、1.0%NaCl、1.5%agar）により３７℃で１６時間培養した。その後、寒天培地上のシングルコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地に植菌し２８℃、１２０ｒｐｍで８時間培養した。ＧＦＰｍＲＮＡの誘導は、５０μｇ／ｍのLampicillinを含む３０ｍＬの転写誘導培地（０．０５％のグルコース及び２％のラクトースを含むＬＢ培地）に、前培養液を１０００倍希釈となるように植菌し、２８℃、１２０ｒｐｍで１３時間培養して行った。培養液は、ＬＢ培地にてＯＤ６６０＝１に希釈し、遠心分離（１５００ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）により集菌した。培養液の濁度の測定は比色計（ＡＮＡ－１８Ａ＋型、東京光電社製）により測定した。

なお、ＧＦＰｍＲＮＡの発現を誘導していない大腸菌は、転写誘導培地を、転写非誘導培地（2%のグルコースを含むＬＢ培地）とすることにより得た。

全ＲＮＡの抽出は、CicaGeneus（登録商標）RNAPrepKit(ForTissue、関東化学)を用いてDNase処理を含んだ推奨プロトコルに従って抽出した。ＲＮＡの濃度測定はQuant-iTRNABRAssayKitとQubitfluorometerを用いて行った。抽出試料中にゲノムＤＮＡが混入しているかどうかの確認は、以下のようにして行った。抽出試料にホルムアミドを加え、６５℃で１０分間加熱した後、１．５％アガロースゲル電気泳動（1×TAEbuffer）を行い、UltraPowerDNA/RNAセーフダイを用いて染色後、ブルーライトを照射して蛍光の有無を確認した。全ＲＮＡ抽出試料は使用するまで－８０℃にて保存した。

全ＲＮＡ抽出試料について、プローブとのハイブリダイゼーション、プローブの環状化、ニック形成及び増幅を行った。全ＲＮＡ量が２ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、４０ｎｇ及び８０ｎｇとなるように試料を用いた。ニック形成におけるＲＮａｓｅＨの濃度は０．００６Ｕとし、増幅の反応時間は４時間とした。最終産物の確認は、１％アガロースゲル電気泳動（1×TAE buffer）を行い、プル-ライトを照射することにより行った。すべての反応と電気泳動は再現性を確認するために３回以上行った。

図７に示すように、ネガティブコントロール及びＧＦＰ誘導を行っていない大腸菌から抽出した試料については、いずれのプローブを用いた場合にも増幅は認められず、優れた特異性を示した。一方、ＧＦＰ誘導を行った大腸菌から抽出した試料については、いずれのプローブを用いた場合にも、全ＲＮＡ濃度が８０ｎｇの場合には、増幅が確認された。また、プローブとしてＰ１～Ｐ４を用いた場合には、全ＲＮＡ濃度が４０ｎｇ以下の場合にも、増幅が確認された。

図８には、全ＲＮＡ抽出物について、リアルタイム検出を行った場合の結果を示している。ＧＦＰ誘導を行った大腸菌からの全ＲＮＡ抽出物を試料とした以外は、先に述べたリアルタイム検出と同様の条件で測定をした。試料中の全ＲＮＡ量が１０ｎｇ以上の場合には、増幅が認めら、全ＲＮＡ量が２０ｎｇ以上の場合には明確な増幅が認められた。

本開示のＲＮＡ検出方法は、標的ＲＮＡ上の任意配列をプローブの認識配列として設定することができると共に、特異性が高いＲＮＡ検出方法を実現できる。

１０１ 標的ＲＮＡ
１０１Ａ プライマー
１０２ ＤＮＡプローブ
１０３ ＤＮＡ結合酵素
１０４ リボヌクレアーゼＨ
１０５ ＤＮＡ合成酵素
１０６ 一本鎖ＤＮＡ

Claims (13)

1. 標的ＲＮＡと、前記標的ＲＮＡの３’末端を含まない内部配列に相補的なパドロック型のＤＮＡプローブとをハイブリダイズするハイブリダイズ工程と、
   前記標的ＲＮＡとハイブリダイズされた前記ＤＮＡプローブをＤＮＡ結合酵素により環状化する環状化工程と、
   前記ＤＮＡプローブを環状化した後、ハイブリダイズされている前記標的ＲＮＡに、ＲＮａｓｅＨを用いてニックを形成するニック形成工程と、
   ニックが形成された前記標的ＲＮＡをプライマーとし、環状化した前記ＤＮＡプローブを鋳型として、ローリングサークル型ＤＮＡ増幅法により一本鎖ＤＮＡの増幅を行う増幅工程と、を備え、
   前記各工程は、５ｍＭ以上、５０ｍＭ以下のカリウム塩の存在下で行う、ＲＮＡ検出方法。
2. 前記標的ＲＮＡは、直鎖状ＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡ検出方法。
3. 前記ＤＮＡプローブは、その配列の全部又は一部が、前記標的ＲＮＡに相補性を有している、請求項１又は２に記載のＲＮＡ検出方法。
4. 前記ハイブリダイズ工程において、前記標的ＲＮＡは、その配列の一部が前記ＤＮＡプローブとハイブリダイズされる、請求項１～３のいずれか１項に記載のＲＮＡ検出方法。
5. 前記増幅工程は、鎖置換活性を有するＤＮＡ合成酵素により行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ検出方法。
6. 前記ニック形成工程及び前記増幅工程が一定温度で行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載のＲＮＡ検出方法。
7. 前記増幅工程において増幅された一本鎖ＤＮＡに結合する色素を用いて検出を行う検出工程をさらに備えている、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮＡ検出方法。
8. 前記ＤＮＡプローブは、グアニン４重鎖を形成させる配列を有し、
   前記色素は、グアニン４重鎖に特異的な検出用色素である、請求項７に記載のＲＮＡ検出方法。
9. 前記検出工程は、前記増幅工程と並行して行われる、請求項７又は８に記載のＲＮＡ検出方法。
10. 前記カリウム塩は、グルタミン酸カリウムである、請求項１～９のいずれか１項に記載のＲＮＡ検出方法。
11. 標的ＲＮＡの３’末端を含まない内部配列と相補的な配列を有するパドロック型のＤＮＡプローブと、
    前記標的ＲＮＡとハイブリダイズした前記ＤＮＡプローブを環状化するＤＮＡ結合酵素と、
    前記ＤＮＡプローブが環状化された状態で、前記標的ＲＮＡにニックを形成するＲＮａｓｅＨと、
    ニックを形成した前記標的ＲＮＡをプライマーとし、前記ＤＮＡプローブを鋳型としてローリングサークル型ＤＮＡ増幅を行う、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素と、
    各反応を行うための５ｍＭ以上、５０ｍＭ以下のカリウム塩を含む反応溶媒とを含む、ＲＮＡ検出キット。
12. 一本鎖ＤＮＡを特異的に検出する色素をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
13. 前記カリウム塩は、グルタミン酸カリウムである請求項１１又は１２に記載のＲＮＡ検出キット。

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