CN117089605B - 一种基于fq-rca的rna等温实时基因分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于FQ‑RCA的RNA等温实时基因分型方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种基于FQ‑RCA的RNA等温实时基因分型方法，先通过splintR DNA连接酶连接分别与野生型RNA和突变型RNA完全匹配的两条锁式探针，形成DNA环状模板，再通过含有两套FQ探针的RCA反应进行实时荧光信号检测。此方法将FQ探针和RCA技术结合，实现了对RCA反应中突变位点的实时检测，并结合了splintR DNA连接酶能够以RNA为夹板高效连接DNA的特性，以及两套锁式探针相互竞争减少非特异性连接的方法，可以直接以RNA为靶标进行SNP基因分型检测，无需逆转录成cDNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是人类最常见的遗传变异之一，在致病基因鉴定、药物反应预测和个性化治疗中都发挥着至关重要的作用。因此，SNP检测在基础研究和临床应用中的重要性日益凸显。
SNP基因分型技术有很多，绝大多数是以DNA为检测靶标，以RNA为识检测靶标的方法很少。现有的以DNA为检测靶标的SNP基因分型技术主要有DNA测序、PCR、限制性核酸内切片段长度多态性(RFLP)分析和基因芯片这几种。DNA测序能够直接读取DNA序列，是最直接、可靠的基因分型方法，但它的缺陷也很明显，就是速度慢、成本高，且对仪器和试剂要求高，这导致它无法被推广应用。
PCR应用于SNP检测主要有扩增阻滞突变系统PCR(ARMS-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-PCR)两大类。其中，ARMS-PCR建立在等位基因特异性延伸反应的基础上，通过凝胶电泳分辨有无扩增产物，从而确定SNP基因型。ARMS-PCR虽然简便、低成本，但是它特异性不高，容易造成假阳性结果，且需要分管进行，增加了检测量。RT-PCR检测SNP位点主要有依赖荧光探针的TaqMan探针和分子信标探针技术，以及依赖荧光染料和熔解曲线的高分辨率熔解曲线技术(HRM)。RT-PCR大大提高了SNP分型的速度和通量，但是对热循环的要求仍是它在这个领域中的一个不足。
RFLP分析关键在于限制性内切酶特异性识别序列并切割。这种方法虽然操作简单，成本低，但是并非所有的SNP位点均能找到合适的限制性核酸内切酶，所以不适用于所有SNP位点分型。
基因芯片技术实质上是一种大规模集成的固相杂交技术，在固相支持物上固定特定的寡聚核苷酸，再与样品杂交，检测分析。基因芯片实现了SNP检测的集成化和高通量化，但是它杂交、洗脱条件严苛，否则特异性难以保证。
以RNA为检测靶标的SNP基因分型技术则主要是先将RNA逆转录成cDNA再使用以DNA为检测靶标的SNP基因分型技术进行后续的检测，这样无疑会增加实验的成本和时间。并且，由于逆转录酶没有3’-5’的外切酶活性，没有校正功能，逆转录合成的cDNA出错的概率较高，会出现信息偏差，因此，RNA水平的序列信息更能体现表观遗传的核酸信息。对于一些非模式生物研究、与蛋白表达水平相关的应用和RNA样本更易获取的场景，如RNA病毒检测、个体化用药指导和基于游离RNA的无创性产前诊断等，检测RNA会更加直接和准确。
splintR DNA连接酶(即PBCV-1DNA连接酶)是一种ATP依赖的DNA连接酶，它能够高效催化与一条互补的RNA单链配对的两条相邻DNA单链的连接反应。这两条相邻的DNA链中，提供3’羟基的被称之为受体DNA链(Acceptor DNA)，提供5’磷酸的被称之为供体DNA链(Donor DNA)；在这个连接过程中需要一条互补的RNA链对两条DNA单链起“夹板”或“支架”的作用。研究发现，splintR DNA连接酶对于以RNA为夹板的DNA末端连接具有很高的活性，比T4 DNA连接酶的连接效率要高很多。因此，出现了直接以RNA为连接探针进行RNA序列检测的技术。但是，splintR DNA连接酶的碱基特异性识别能力较差，这导致直接以RNA为靶标的SNP检测技术受到限制。因此，开发一种简单、经济且特异性好的直接以RNA为检测靶标进行SNP基因分型的方法很有意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型试剂盒，所述试剂盒的成分包含锁式探针(Padlock probe)杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂；所述锁式探针杂交试剂的成分包含第一锁式探针和第二锁式探针；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型RNA模板和突变型RNA模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分包含splintR DNA连接酶；所述splintR DNA连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分包含滚环扩增引物；所述滚环扩增引物能够分别与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂用于将第一环化产物和第二环化产物滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分包含第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；所述淬灭探针杂交试剂的成分包含淬灭探针；所述淬灭探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第一检测探针产生的信号；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第二检测探针产生的信号。
在本发明的一种实施方式中，所述第一锁式探针与野生型RNA模板完全匹配；所述第二锁式探针与突变型RNA模板完全匹配。
在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增引物能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针互补配对，进而与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，最终引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增。
在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增试剂的成分包含dNTP和DNA聚合酶；所述dNTP能够在DNA聚合酶的作用下进行第一环化产物和第二环化产物的滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物。
在本发明的一种实施方式中，所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
在本发明的一种实施方式中，所述第一检测探针和第二检测探针上分别偶联有第一荧光标记物和第二荧光标记物；所述淬灭探针上偶联有荧光淬灭标记物；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；所述淬灭探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述第一荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述第二荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭。
在本发明的一种实施方式中，所述第一荧光标记物包括VIC荧光基团、FAM荧光基团、HEX荧光基团或JOE荧光基团；所述第二荧光标记物包括VIC荧光基团、FAM荧光基团、HEX荧光基团或JOE荧光基团；所述荧光淬灭标记物包括BHQ淬灭基团、MGB淬灭基团或Dabcyl淬灭基团。
在本发明的一种实施方式中，所述第一锁式探针和第二锁式探针的5’端修饰有磷酸基团。DNA序列5’端一般为羟基(-OH)，而连接酶是将5’端的磷酸基团(5’-P)与3’端的羟基基团(3’-OH)进行连接形成磷酸二酯键，因此需要将挂锁探针的5’端进行磷酸化修饰，才能让其连接成环。
在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增引物的3’端设置有两个或三个碱基的硫代修饰。两个碱基的硫代修饰能够有效防止滚环扩增引物被phi29DNA聚合酶的外切酶活性酶切。三个碱基的硫代修饰能够完全防止滚环扩增引物被phi29 DNA聚合酶的外切酶活性酶切。
在本发明的一种实施方式中，所述第一检测探针的3’端修饰有VIC荧光基团；所述第二检测探针的3’端修饰有FAM荧光基团；所述淬灭探针的5’端修饰有BHQ淬灭基团，3’端修饰有磷酸基团。
在本发明的一种实施方式中，所述锁式探针杂交试剂的成分由第一锁式探针和第二锁式探针组成；所述锁式探针环化试剂的成分由splintR DNA连接酶组成；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分由滚环扩增引物组成；所述滚环扩增试剂的成分由dNTP和DNA聚合酶组成；所述检测探针杂交试剂的成分由第一检测探针和第二检测探针组成；所述淬灭探针杂交试剂的成分由淬灭探针组成。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含splintR DNA连接酶缓冲液、ExoⅠ、RNase H、ExoⅠbuffer、RNase H buffer、牛血清白蛋白、ROX参比染料和phi29 DNA聚合酶缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含ddH2O。
在本发明的一种实施方式中，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测时，所述第一锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一种实施方式中，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测时，所述野生型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型方法，所述方法使用上述试剂盒对待测RNA进行SNP基因分型检测。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：将待测RNA与锁式探针杂交试剂混合后进行孵育，得到孵育液A；将孵育液A与锁式探针环化试剂混合后进行孵育，得到孵育液B；将孵育液B与核酸内切酶和核酸外切酶混合后进行孵育，得到孵育液C；将孵育液C与滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂混合后进行反应，得到检测体系；对检测体系进行荧光定量PCR；根据荧光定量PCR结果判断待测RNA的SNP基因分型结果。若第一检测探针的荧光信号下降，第二检测探针的荧光信号不变，则待测RNA为野生型；若第一检测探针的荧光信号不变，第二检测探针的荧光信号下降，则待测RNA为突变型；若第一检测探针和第二检测探针的荧光信号同时下降，则待测RNA为野生突变杂合型。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：将待测RNA、第一锁式探针、第二锁式探针和ddH2O混合后，先于90～100℃孵育2～10min，再降温至20～30℃，得到孵育液A；将孵育液A、splintR DNA连接酶和splintR DNA连接酶缓冲液(splintR buffer)混合后，先于20～37℃孵育1～16h，再于60～70℃孵育15～30min使splintR DNA连接酶灭活，得到孵育液B；将孵育液B、ddH2O、ExoⅠ(核酸外切酶Ⅰ)、RNase H(核酸内切酶)、ExoⅠbuffer和RNase Hbuffer混合后，先于20～40℃孵育30～120min进行消化，再于75～90℃孵育10～20min使ExoⅠ和RNase H灭活，得到孵育液C；对孵育液C中的第一环化产物和第二环化产物进行纯化浓缩，得到浓缩产物；将浓缩产物、滚环扩增引物、dNTP、phi29 DNA聚合酶、第一检测探针、第二检测探针、淬灭探针、牛血清白蛋白(BSA)、ROX参比染料、phi29 DNA聚合酶缓冲液(phi29 buffer)和ddH2O混合后，于20～40℃反应30～180min，得到检测体系；对检测体系进行荧光定量PCR；根据荧光定量PCR结果判断待测RNA的分型结果。所述方法中，ddH2O用于补足各孵育体系和反应体系，若各孵育体系和反应体系其余组分已满足标准，则无需额外添加ddH2O。
在本发明的一种实施方式中，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测时，所述第一锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一种实施方式中，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测时，所述野生型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述待测RNA、第一锁式探针、第二锁式探针和ddH2O的混合体积比为1～10：1～2：1～2：0～7。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育液A、splintR DNA连接酶和splintR DNA连接酶缓冲液的混合体积比为5～11：0.5～1：1.5～2。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育液B、ddH2O、ExoⅠ、RNase H、ExoⅠbuffer和RNase H buffer的混合体积比为15～20：0～1：2～10：1～2：2～3：2～3。
在本发明的一种实施方式中，所述浓缩产物、滚环扩增引物、dNTP、phi29DNA聚合酶、第一检测探针、第二检测探针、淬灭探针、牛血清白蛋白、ROX参比染料、phi29 DNA聚合酶缓冲液和ddH2O的混合体积比为2～7：1～2：1～2：0.5～1：1～2：1～2：2～4：0.5～1：0.5～1：2～2.5：0～5。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育液B中，第一锁式探针的浓度为0.1～2μM，第二锁式探针的浓度为0.1～2μM，splintR DNA连接酶的浓度为0.5～2.5U/μL。
在本发明的一种实施方式中，所述孵育液C中，ExoⅠ的浓度为0.5～2.5U/μL，RNaseH的浓度为0.4～0.8U/μL。
在本发明的一种实施方式中，所述检测体系中，滚环扩增引物的浓度为0.1～1μM，第一检测探针的浓度为50～500nM，第二检测探针的浓度为50～500nM，淬灭探针的浓度为100～1000nM，dNTP的浓度为100～500μM，DNA聚合酶的浓度为0.1～1U/μL，牛血清白蛋白的浓度为1～2mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述检测体系中，滚环扩增引物的浓度为200nM，淬灭探针的浓度为400nM，第一检测探针的浓度为200nM，第二检测探针的浓度为200nM，dNTP的浓度为200μM，DNA聚合酶的浓度为0.25U/μL。
本发明还提供了上述试剂盒或上述方法在SNP基因分型检测中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
在本发明的一种实施方式中，所述SNP基因分型以RNA为检测靶标。
在本发明的一种实施方式中，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测时，所述第一锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一种实施方式中，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测时，所述野生型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型试剂盒，所述试剂盒的成分包含锁式探针杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂；所述锁式探针杂交试剂的成分包含第一锁式探针和第二锁式探针；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型RNA模板和突变型RNA模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分包含splintR DNA连接酶；所述splintR DNA连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分包含滚环扩增引物；所述滚环扩增引物能够分别与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂用于将第一环化产物和第二环化产物滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分包含第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；所述淬灭探针杂交试剂的成分包含淬灭探针；所述淬灭探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第一检测探针产生的信号；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第二检测探针产生的信号。使用所述试剂盒进行SNP基因分型检测具有如下优势：
第一，能够成功区分出三种基因型，检测准确度较高；
第二，将FQ探针和RCA(滚环扩增)技术结合，实现了对RCA反应中突变位点的实时检测，并结合了splintR DNA连接酶能够以RNA为夹板高效连接DNA的特性，以及两套锁式探针相互竞争减少非特异性连接的方法，可以直接以RNA为靶标进行检测SNP，无需逆转录成cDNA；
第三，使用两条分别与野生型和突变型模板完全匹配的锁式探针，两条探针之间互相形成竞争关系，可以有效抑制非特异性连接；当有野生型和突变型两种锁式探针存在时，由于碱基互补长度和结合自由能，野生型模板更易与野生型锁式探针配对，突变型模板更易与突变型锁式探针配对，从而减少由于splintR DNA连接酶碱基特异性识别不佳带来的非特异性连接，进而降低splintR DNA连接酶特异性不好的影响；
第四，使用FQ探针，使得RCA反应的信号可以被实时的监测；
第五，由于RCA反应的产物是单链，且反应温度一般较低，导致能实时检测RCA信号的探针很少，如分子信标的茎环结构的开合比较依赖于温度，RCA的反应温度(30℃)一般较难打开其茎环，而FQ探针不依赖于温度，在低温时也能够与RCA产物结合，产生荧光信号的变化，对控温要求不高，反应全程都可以在恒温甚至室温下反应，操作简单，且对仪器热循环性能要求低。
进一步地，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测时(野生型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，第一锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第二锁式探针的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，此处基于CYP2C9基因的rs1057910突变位点设计的所有引物和探针序列具有较好的特异性，可以用于CYP2C9基因的SNP检测。
2、本发明提供了一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型方法，所述方法使用上述基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型试剂盒对待测RNA进行检测，先通过splintR DNA连接酶连接分别与野生型RNA和突变型RNA完全匹配的两条锁式探针，形成DNA环状模板，再通过含有两套FQ探针的RCA反应进行实时荧光信号检测。使用所述方法进行SNP基因分型具有如下优势：
第一，能够成功区分出三种基因型，检测准确度较高；
第二，将FQ探针和RCA(滚环扩增)技术结合，实现了对RCA反应中突变位点的实时检测，并结合了splintR DNA连接酶能够以RNA为夹板高效连接DNA的特性，以及两套锁式探针相互竞争减少非特异性连接的方法，可以直接以RNA为靶标进行检测SNP，无需逆转录成cDNA；
第三，使用两条分别与野生型和突变型模板完全匹配的锁式探针，两条探针之间互相形成竞争关系，可以有效抑制非特异性连接；当有野生型和突变型两种锁式探针存在时，由于碱基互补长度和结合自由能，野生型模板更易与野生型锁式探针配对，突变型模板更易与突变型锁式探针配对，从而减少由于splintR DNA连接酶碱基特异性识别不佳带来的非特异性连接，进而降低splintR DNA连接酶特异性不好的影响；
第四，使用FQ探针，使得RCA反应的信号可以被实时的监测；
第五，由于RCA反应的产物是单链，且反应温度一般较低，导致能实时检测RCA信号的探针很少，如分子信标的茎环结构的开合比较依赖于温度，RCA的反应温度(30℃)一般较难打开其茎环，而FQ探针不依赖于温度，在低温时也能够与RCA产物结合，产生荧光信号的变化，对控温要求不高，反应全程都可以在恒温甚至室温下反应，操作简单，且对仪器热循环性能要求低。
进一步地，所述方法包括：将待测RNA与锁式探针杂交试剂混合后进行孵育，得到孵育液A；将孵育液A与锁式探针环化试剂混合后进行孵育，得到孵育液B；将孵育液B与核酸内切酶和核酸外切酶混合后进行孵育，得到孵育液C；将孵育液C与滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂混合后进行反应，得到检测体系；对检测体系进行荧光定量PCR；根据荧光定量PCR结果判断待测RNA的SNP基因分型结果；所述检测体系中，滚环扩增引物的浓度为200nM，淬灭探针的浓度为400nM，第一检测探针的浓度为200nM，第二检测探针的浓度为200nM，dNTP的浓度为200μM，DNA聚合酶的浓度为0.25U/μL。此处浓度下荧光变化更为明显，有利于SNP基因分型检测。
进一步地，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测时(野生型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变型RNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，第一锁式探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第二锁式探针的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，淬灭探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。此处基于CYP2C9基因的rs1057910突变位点设计的所有引物和探针序列具有较好的特异性，可以用于CYP2C9基因的SNP检测。
附图说明
图1：分型原理示意图。图1中，A为野生型和突变型RNA靶标成环和FQ-RCA反应示意图；B为FQ探针荧光变化示意图；C为野生型(WW)、杂合型(WM)和突变型(MM)三种基因型理论荧光变化程度示意表；D为野生型(WW)、杂合型(WM)和突变型(MM)三种基因型理论基因分型结果示意图。
图2：基因分型效果图。图2中，A为FAM通道荧光信号；B为VIC通道荧光信号；C为以FAM信号变化值为横坐标，VIC信号变化值为纵坐标进行基因分型的分型结果。
图3：优化实验结果图。图3中，A为引物量对荧光变化的影响；B为dNTP量对荧光变化的影响；C为phi29聚合酶量对荧光变化的影响；D为FQ探针量对荧光变化的影响。误差棒代表三个重复平行组的标准偏差。
图4：突变频率检测图。图4中，A为不同突变频率样本的检测结果；B为突变频率与FAM、VIC两种荧光信号变化值之比的关系。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型试剂盒
本实施例提供了一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型试剂盒，所述试剂盒的成分由锁式探针(Padlock probe)杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂、淬灭探针杂交试剂、ddH2O、splintR DNA连接酶缓冲液、ExoⅠ、RNase H、ExoⅠbuffer、RNase H buffer、牛血清白蛋白、ROX参比染料和phi29 DNA聚合酶缓冲液组成；所述锁式探针杂交试剂的成分由第一锁式探针和第二锁式探针组成；所述第一锁式探针与野生型RNA模板完全匹配，所述第二锁式探针与突变型RNA模板完全匹配，并且，所述第一锁式探针和第二锁式探针的5’端修饰有磷酸基团；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型RNA模板和突变型RNA模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分由splintR DNA连接酶组成；所述splintR DNA连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分由滚环扩增引物组成，并且，所述滚环扩增引物的3’端设置有三个碱基的硫代修饰；所述滚环扩增引物能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针互补配对，进而与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，最终引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂的成分由dNTP和DNA聚合酶组成；所述dNTP能够在phi29 DNA聚合酶的作用下进行第一环化产物和第二环化产物的滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分由第一检测探针和第二检测探针组成；所述第一检测探针的3’端修饰有VIC荧光基团，所述第二检测探针的3’端修饰有FAM荧光基团，并且，所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；所述淬灭探针杂交试剂的成分由淬灭探针组成；所述淬灭探针的5’端修饰有BHQ淬灭基团，3’端修饰有磷酸基团，并且，所述淬灭探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述VIC荧光基团的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述FAM荧光基团的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭。
实施例2：一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型方法
本实施例提供了一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型方法，所述方法使用实施例1的试剂盒对待测RNA进行SNP基因分型检测，检测过程如下：
将待测RNA(4μL)、锁式探针混合物(含10μM第一锁式探针和10μM第二锁式探针，2μL)和ddH2O(2μL)于微量反应管中混合后，先于95℃孵育3min，再降温至室温(25℃)，得到孵育液A；向微量反应管中加入splintR DNA连接酶(25U/μL，1μL，购于NEB公司)和10×splintR DNA连接酶缓冲液(10×splintR buffer，1μL，购于NEB公司)混匀离心后，放于PCR仪中先于25℃孵育2h，再于65℃孵育20min使splintR DNA连接酶灭活，得到孵育液B(此时，孵育液B中，第一锁式探针的浓度为1μM，第二锁式探针的浓度为1μM，splintR DNA连接酶的浓度为2.5U/μL)；向微量反应管中加入ddH2O(2μL)、ExoⅠ(核酸外切酶Ⅰ，5U/μL，2μL，购于Takara公司)、RNase H(核酸内切酶，5U/μL，2μL，购于赛默飞公司)、10×ExoⅠbuffer(2μL，购于Takara公司)和10×RNase H buffer(2μL，购于赛默飞公司)混合后，先于37℃孵育60min进行消化，再于80℃孵育15min使ExoⅠ和RNase H灭活，得到孵育液C(此时，孵育液C中，ExoⅠ的浓度为0.5U/μL，RNase H的浓度为0.5U/μL)；用胶回收试剂盒(购于诺唯赞公司，该试剂盒可以去除反应液中的盐离子和酶等杂质，减少对后续RCA实验的影响)将孵育液C中制成的环DNA进行纯化浓缩，得到浓缩产物；将浓缩产物(2μL)、滚环扩增引物(10μM，2μL)、dNTP(1mM，2μL)、phi29 DNA聚合酶(10U/μL，1μL)、检测及淬灭探针混合物(含2μM第一检测探针、2μM第二检测探针和4μM淬灭探针，2μL)、牛血清白蛋白(BSA，40mg/mL，1μL)、10×ROX参比染料(1μL，购于诺唯赞公司)和10×phi29 DNA聚合酶缓冲液(10×phi29 buffer，2μL，购于诺唯赞公司)混合后，加ddH2O至总体积为20μL，得到检测体系(此时，检测体系中，滚环扩增引物的浓度为1μM，第一检测探针的浓度为200nM，第二检测探针的浓度为200nM，淬灭探针的浓度为400nM，dNTP的浓度为500μM，DNA聚合酶的浓度为0.5U/μL，牛血清白蛋白的浓度为2mg/mL)；将检测体系于7500实时荧光定量PCR仪上反应，反应条件为：30℃15s，30℃60s，以上为一个循环，共30个循环；循环过程中，由qPCR仪实时采集荧光信号；根据荧光信号判断待测RNA的分型结果。
本方法的工作原理如图1所示。图1A中，WT和MT为只有一个碱基差异的野生型和突变型RNA靶标，两条挂锁探针WPLP和MPLP分别与WT和MT完全匹配。当挂锁探针与靶标完全匹配时，它们之间的结合自由能比有一个碱基不匹配时更低，所以更容易结合并成环。因此当挂锁探针与靶标完全匹配时，成环数量多(+)，当有一个碱基不匹配时成环效率低，仅有少许非特异性成环(-)。将成环后的产物进行RCA，并投入荧光淬灭探针FQ，可以将信号变化实时展现。成环多的组别信号变化更强(+)，成环少的组别信号更弱(-)。图1B中，当FQ探针从游离状态转变为与靶标结合的状态，荧光探针F的荧光会被淬灭探针Q淬灭，导致荧光信号减弱。检测样本时，我们在成环阶段同时投入两条挂锁探针WPLP、MPLP，在RCA阶段投入淬灭探针Q和两条分别与WPLP和MPLP反义链互补的荧光探针WF(3’VIC)、MF(3’FAM)。野生型(WW)样本含有两份野生等位基因，没有突变等位基因，故其VIC通道信号变化较强(++)，FAM通道信号变化弱(-)，三种基因型样本信号情况如图1C所示。当将FAM和VIC信号变化值作为横纵坐标，则可得到如图1D所示的基因分型结果。通过所述方法获得荧光信号后，若第一检测探针的荧光信号下降，第二检测探针的荧光信号不变，则待测RNA为野生型；若第一检测探针的荧光信号不变，第二检测探针的荧光信号下降，则待测RNA为突变型；若第一检测探针和第二检测探针的荧光信号同时下降，则待测RNA为野生突变杂合型。
实验例1：试剂盒的性能验证
本实验例以对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测为例，对实施例1中试剂盒的分型性能进行验证，验证过程如下：
根据CYP2C9基因的rs1057910突变位点，设计模板链WT、模板链MT、第一锁式探针WPLP、第二锁式探针MPLP、滚环扩增引物P、第一检测探针WF、第二检测探针MF以及淬灭探针(FQ探针)Q(序列见表1)；
在实施例2的基础上，以模板链WT(10μM，2μL)+模板链MT(10μM，2μL)作为待测RNA，对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测，检测结果见图2。
由图2可知，FAM通道荧光信号中，突变型(MM)信号下降最多，杂合型(WM)次之，野生型(WW)信号变化最少(图A)；VIC通道荧光信号中，野生型(WW)信号下降最多，杂合型(WM)次之，突变型(MM)信号变化最少(图B)；以FAM信号变化值为横坐标，VIC信号变化值为纵坐标进行基因分型，能够明显区分出三种不同基因型(图C)。
表1序列
表1中，“*”是指硫代修饰，碱基前加r表示该碱基为RNA的碱基，BHQ为淬灭基团，Pho为磷酸基团。表1中的各序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。
实验例2：分型的条件优化
本实验例以对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测为例，对实施例2中方法的分型条件进行优化，优化过程如下：
在实验例1的基础上，以ddH2O为溶剂将滚环扩增引物稀释至浓度分别为20、200、2000和20000nM；以ddH2O为溶剂将dNTP稀释至浓度分别为20、200、2000和20000μM；以ddH2O为溶剂将phi29 DNA聚合酶稀释至浓度分别为0.5、1、5、10U/μL；以ddH2O为溶剂将检测及淬灭探针混合物稀释至淬灭探针浓度分别为40、400、4000和40000nM(第一检测探针和第二检测探针的浓度均分别为20、200、2000和20000nM)；分别使用不同浓度的滚环扩增引物、dNTP、phi29 DNA聚合酶和淬灭探针对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测，检测结果见图3。
由图3可知，滚环扩增引物的浓度为2000nM、dNTP的浓度为2000μM、phi29 DNA聚合酶的浓度为5U/μL(phi29 DNA聚合酶的用量5U)、淬灭探针(FQ probe)的浓度为4000nM为最优条件(最优条件下，所述检测体系中，滚环扩增引物的浓度为200nM，淬灭探针的浓度为400nM，第一检测探针的浓度为200nM，第二检测探针的浓度为200nM，dNTP的浓度为200μM，DNA聚合酶的浓度为0.25U/μL)。
实验例3：优化后的性能验证
本实验例以对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测为例，对实施例2中经优化的方法的分型性能进行验证，验证过程如下：
在实验例2的基础上，分别以模板链WT(4μM，4μL)+模板链MT(4μM，1μL)(突变频率20％)、模板链WT(4μM，3μL)+模板链MT(4μM，2μL)(突变频率40％)、模板链WT(4μM，2μL)+模板链MT(4μM，3μL)(突变频率60％)、模板链WT(4μM，1μL)+模板链MT(4μM，4μL)(突变频率80％)作为待测RNA，使用浓度为2000nM的滚环扩增引物、浓度为2000μM的dNTP、浓度为5U/μL的phi29 DNA聚合酶(phi29 DNA聚合酶的用量5U)以及浓度为4000nM的淬灭探针(FQprobe)对CYP2C9基因的rs1057910突变位点进行SNP基因分型检测，检测结果见图4。
由图4可知，调整WT和MT的比例，检测两种荧光信号的变化，发现随着M的频率增高以及W的频率降低，FAM荧光(突变信号)的变化值会随之增长，VIC荧光(野生信号)的变化值会随之下降，符合预期。
综合图1～4的结果可知，在本实验例中，将FQ探针和RCA技术结合，实现了对RCA反应中突变位点的实时检测，并结合了splintR DNA连接酶能够以RNA为夹板高效连接DNA的特性，以及两套锁式探针相互竞争减少非特异性连接的方法，直接检测RNA的SNP，而不用逆转录。此研究方法能够成功区分出三种基因型，且对控温要求不高，反应全程都可以在室温下进行，操作简单，对实验仪器要求低。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分包含锁式探针杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂；所述锁式探针杂交试剂的成分包含第一锁式探针和第二锁式探针；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型RNA模板和突变型RNA模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分包含splintRDNA连接酶；所述splintR DNA连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分包含滚环扩增引物、dNTP和DNA聚合酶；所述滚环扩增引物能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针互补配对，进而与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，最终进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述dNTP能够在DNA聚合酶的作用下进行第一环化产物和第二环化产物的滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分包含第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针上分别偶联有第一荧光标记物和第二荧光标记物，且所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；所述淬灭探针杂交试剂的成分包含淬灭探针；所述淬灭探针上偶联有荧光淬灭标记物，且所述淬灭探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述第一荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述第二荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一荧光标记物包括VIC荧光基团、FAM荧光基团、HEX荧光基团或JOE荧光基团；所述第二荧光标记物包括VIC荧光基团、FAM荧光基团、HEX荧光基团或JOE荧光基团；所述荧光淬灭标记物包括BHQ淬灭基团、MGB淬灭基团或Dabcyl淬灭基团。
4.如权利要求1~3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一锁式探针和第二锁式探针的5’端修饰有磷酸基团。
5.如权利要求1~3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述滚环扩增引物的3’端设置有两个或三个碱基的硫代修饰。
6.一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型方法，其特征在于，所述方法为非疾病的诊断和治疗目的，所述方法使用权利要求1~5任一项所述的试剂盒对待测RNA进行分型检测，所述方法包括：将待测RNA与锁式探针杂交试剂混合后进行孵育，得到孵育液A；将孵育液A与锁式探针环化试剂混合后进行孵育，得到孵育液B；将孵育液B与核酸内切酶和核酸外切酶混合后进行孵育，得到孵育液C；将孵育液C与滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂混合后进行反应，得到检测体系；对检测体系进行荧光定量PCR；根据荧光定量PCR结果判断待测RNA的SNP基因分型结果。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测体系中，滚环扩增引物的浓度为200nM，淬灭探针的浓度为400nM，第一检测探针的浓度为200nM，第二检测探针的浓度为200nM，dNTP的浓度为200μM，DNA聚合酶的浓度为0.25U/µL。
8.权利要求1~5任一项所述的试剂盒或权利要求6或7所述的方法在RNA分型检测中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病的诊断和治疗目的。
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