CN113186259A - 一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用 - Google Patents

一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测茎环DNA或RNA的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用。所述荧光等温扩增方法包括：(1)以待测核酸样品中的茎环DNA或RNA为模板，合成特异性扩增引物；(2)使用所述特异性扩增引物、高保真DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶进行荧光等温扩增，并检测扩增体系中的荧光，得到检测结果。本发明所述特异性扩增引物包括外引物和内引物，可扩增多种茎环结构且设计方法简单；其中，内引物携带荧光基团和淬灭基团，其3'端末端的碱基与模板互补配对或错配。本发明提供的荧光等温扩增方法具有高度的灵敏性和特异性，并且具有良好的检测限，其多重检测限均可低至3copies/反应。

Description

一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与 应用
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及茎环核酸的检测，尤其涉及一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用。
背景技术
核酸检测已应用于临床分子诊断、食品安全监测、基因表达分析和基础分子生物学等多个领域。目前，实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)是核酸检测的金标准，然而，RT-qPCR检测依赖于大型综合医院的卫生保健设施或政府实验室(如CDC)的先进设施，需要可靠的电力供应和训练有素的人员，而且相对耗时(约1.5～2小时)，这些限制了RT-PCR在即时诊断方面以及资源有限地区的应用。
一系列核酸等温扩增的检测方法被建立起来，比如链替换扩增技术(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)及交叉引物扩增(CPA)等。这些方法在等温条件下进行扩增，因此对仪器的要求显著下降，更适合于POCT(即时检验，Point-of-care testing)。
现有核酸等温扩增的检测方法主要基于嵌入式染料法，并且常用非特异性结合染料。例如，CN109777861A公开了一种错配耐受的环介导等温扩增方法及应用。所述方法对于扩增反应的反应体系进行了优化，特别是DNA聚合酶的选用，该方法可良好地应用于基于环介导等温扩增的检测，与传统方法相比，简便、快速、灵敏、准确，具有更高的检出率和更短的检测时间。然而，该方法基于嵌入式染料法，容易造成假阳性结果，并且也无法对多种病原同时进行检测。
目前，恒温扩增主要是通过链置换恒温扩增酶，以及复杂的引物设计，引入茎环结构，实现扩增。另外，很多DNA或RNA分子局部易形成茎环等复杂结构，目前并无直接利用DNA或者RNA茎环结构实现恒温扩增的方法。
针对所述问题，本领域迫切需要开发简便、快速、灵敏、准确的用于检测多种茎环DNA的荧光等温扩增方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测茎环DNA或RNA的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用。将Bst DNA聚合酶结合高保真DNA聚合酶以及荧光探针，提供一种高灵敏，高特异性的用于检测多种茎环DNA的荧光等温扩增法。本发明的又一目的在于提供一种用于检测多种茎环DNA的荧光等温扩增体系。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测茎环DNA的荧光等温扩增方法，所述荧光等温扩增方法包括如下步骤：
(1)以待测核酸样品中的茎环DNA为模板，合成特异性扩增引物；
其中，所述特异性扩增引物包含第一引物和第二引物；
所述第一引物包括至少一条外引物，所述外引物包括FOP和/或BOP；
所述第二引物包括至少一条携带荧光基团和淬灭基团的内引物，所述内引物包括LIF和/或LIB，并且，所述第二引物的3'末端的碱基为与模板互补配对的碱基或与模板错配的碱基；
(2)使用所述特异性扩增引物和链置换DNA聚合酶进行荧光等温扩增，并检测扩增体系中的荧光，得到检测结果。
本发明提供了一种用于检测多种茎环DNA的荧光等温扩增法，以待测核酸样品为模板，以特异性扩增引物进行环介导等温扩增；其中DNA聚合酶应用链置换DNA聚合酶。
所述第一引物FOP和BOP，为外引物，结合在茎环DNA的上下游特异性位点，起始茎环DNA的扩增；
以FOP为例，其包含与茎环DNA茎部结合的序列和与茎环DNA的环上特异位点结合的序列，尽管其分为结合茎部和环的两部分序列，在设计FOP序列的过程中，只需要依靠模板的基本结构即模板茎环处的核苷酸序列直接进行设计即可，无需对模板进行复杂的引物设计引入茎环结构。其设计过程简单。
所述第二引物LIF和LIB，为内环引物，用于加速扩增反应，其两端修饰荧光基团作为荧光引物；
目前而言，以LIF为例，LIF的3'端与待检测的模板检测区序列必须为错配的，且错配碱基数可以为1～5个碱基(例如1个、2个、3个、4个或者5个)，若两种之间没有发生错配，则会导致扩增无法正常进行。
本发明中，所述的待检测模板为具有各种茎环结构的DNA或RNA，或具有同种茎环结构的多种DNA模板。在检测多种DNA模板的过程中，对应的就需要增加特异性扩增引物的种类。
作为本发明优选的技术方案，所述第二引物的5'端携带荧光基团，并且3'端携带淬灭基团；或者，所述第二引物的3'端携带荧光基团，并且5'端携带淬灭基团；优选为3'端携带荧光基团，并且5'端携带淬灭基团。
优选地，所述荧光基团包括FAM、Cy5、Texas Red、HEX、VIC、TET、JOE、TAMRA、ROX、LCRed610、LC Red640、LCCyan500或Yakima Yellow中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ3、Eclipse、TAMRA、BHQ2或Dabcyl中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，通过对荧光引物修饰不同的荧光和淬灭基团对，即可实现茎环DNA的多重检测或多种茎环DNA的同时检测。
此外，本发明中外引物FOP和BOP作为第一引物，内引物LIF和或LIB作为第二引物，四条引物最好同时使用，可以极大提高扩增和反应效率；FOP与LIF两两配合、BOP与LIB两两配合也是可以的，但是检测效率相比于四条引物同时使用有明显降低。
优选地，步骤(1)中所述特异性扩增引物还包括第三引物，所述第三引物包括至少一条未经荧光基团或淬灭基团修饰的内引物，其与第二引物的序列相同。
当LIF或LIB修饰荧光基团时，额外添加未经荧光修饰的正常LIF和/或LIB引物，能明显提高反应速度。
优选地，步骤(1)中所述茎环DNA包括I型茎环结构、II型茎环结构或III型茎环结构中的任意一种或至少两种的组合。
其中，I型茎环结构、II型茎环结构或III型茎环结构如图1所示。
另外，本发明发现在不添加高保真DNA聚合酶，在只有链置换DNA聚合酶存在的条件下，也可以实现荧光探针的检测，当存在高保真DNA聚合酶时，能明显加快反应速度。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)的反应体系中还包括高保真DNA聚合酶。
优选地，所述高保真DNA聚合酶包括Q5 DNA聚合酶、KOD plus neo DNA聚合酶、Blend Taq DNA聚合酶、Promstar HS DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD FX DNA聚合酶或KODTM DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为Q5 DNA聚合酶或KOD plus neo DNA聚合酶。
本发明中，LIF的3'端与模板检测区序列可以是正常匹配的，也可以是错配的，当LIF与模板完全配对时，高保真DNA聚合酶发挥3'-5'聚合酶活性，识别3'-OH封闭的荧光基团为错配基团，切掉封闭3'-OH的核苷酸，释放荧光基团，产生荧光信号；
当荧光引物与3'末端不匹配时，高保真DNA聚合酶便可以将其识别为错配碱基，将其切割下来，产生荧光信号并继续进行扩增。
不同的高保真酶对于切割荧光引物封闭3'端的效率有所不同，其中以Q5酶的效率最高。
优选地，步骤(2)中所述链置换DNA聚合酶包括Bst 3.0或Bst 4.0 DNA/RNA聚合酶。
优选地，以茎环RNA为模板，步骤(2)的反应体系中还包括反转录酶，或者，所述反应体系中的链置换DNA聚合酶为具有逆转录活性的链置换DNA聚合酶。
优选地，步骤(2)中所述荧光等温扩增的扩增温度为61～65℃，例如可以是61℃、62℃、63℃、64℃或65℃等，优选为64℃。
优选地，步骤(2)中所述荧光等温扩增的扩增时间为5～70min，例如可以是5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、65min或70min等，优选为30min。
第二方面，本发明还提供一种使用第一方面所述的荧光等温扩增方法检测茎环DNA或RNA的荧光等温扩增体系，包括：
链置换DNA聚合酶、特异性扩增引物、dNTPs、Mg2+和缓冲液.
其中，所述特异性扩增引物包含第一引物和第二引物；所述第一引物包括至少一条外引物，所述外引物包括FOP和/或BOP；所述第二引物包括至少一条携带荧光基团和淬灭基团的内引物，所述内引物包括LIF和/或LIB，并且，所述第二引物的3'末端的碱基为与模板互补配对的碱基或与模板错配的碱基。
作为本发明优选的技术方案，所述特异性扩增引物还包括第三引物，所述第三引物包括至少一条未经荧光基团或淬灭基团修饰的内引物，其与第二引物的序列相同。
优选地，所述荧光等温扩增体系还包括高保真DNA聚合酶。
优选地，所述高保真DNA聚合酶的浓度为0.1～0.5U；换言之，总反应体系中可以添加或者不添加高保真DNA聚合酶，即高保真DNA聚合酶的浓度为0～0.5U，例如可以是0.1U、0.2U、0.3U、0.35U、0.4U、0.45U或0.5U等。
优选地，所述链置换DNA聚合酶的浓度为6～8U，例如可以是6.2U、6.4U、6.5U、6.8U、7U、7.2U、7.5U或7.8U等。
优选地，所述第一引物的浓度为0.6～1.2μM，例如可以是0.65μM、0.7μM、0.75μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.05μM或1.1μM等。
优选地，所述第二引物的浓度或第二引物与第三引物的总浓度为0.2～0.6μM，例如可以是0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM、0.55μM或0.6μM等。
优选地，所述dNTPs的摩尔浓度为1.0～1.8mM，例如可以是1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM或1.8mM等。
优选地，所述Mg2+的摩尔浓度为6～10mM，例如可以是6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM或10mM等。
优选地，所述缓冲液包括NH4 +、K+或Triton X-20中的任意一种或至少两种的组合。
示例性地，本发明提供的荧光等温扩增体系如下表1所示：
表1
Figure BDA0003066471250000071
其中，所述Isothermal Buffer可以是任意的市售链置换DNA聚合酶缓冲液。
第三方面，本发明还提供了一种核酸检测试剂盒，所述核酸检测试剂盒包含如第二方面所述的荧光等温扩增体系。
所述荧光等温扩增体系能够用于制备检测SARS-COV-2的试剂盒，且所述试剂盒为一步法检测，在有无F3和B3的情况下都可实现核酸检测。
第四方面，本发明还包括如第一方面所述的荧光等温扩增方法、如第二方面所述的荧光等温扩增体系或如第三方面所述的核酸检测试剂盒在体外检测病原微生物中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)经过广泛而深入的研究，本发明中开发了一种高特异性、高灵敏度的用于多种茎环核酸的荧光等温扩增法；所述扩增方法结合链置换DNA聚合酶、扩增引物和荧光探针等，达到了检测多种不同类型的茎环DNA或RNA的目的，且操作简便；
(2)本发明所述的方法在有无高保真DNA聚合酶的条件下均能实现，若在该方法所用的反应体系中结合高保真DNA聚合酶使用，能够提高扩增效率，提高检测的灵敏性和特异性，所得该方法的检测限较低，在多重检测时，其检测限均能达到3copies/反应；同时，所述方法利用Q5高保真酶的3'-5'外切酶活性，能同时用于正常以及突变目的序列的检测，适用于高变异病毒目标序列的检测；
(3)本发明提供的荧光等温扩增方法可以进行多重荧光检测，将其应用于检测SARS-CoV-2等病原体时，具有极高的灵敏性和特异性，在20min以内可实现低至3copies/反应的检测。
附图说明
图1为本发明所述的I型茎环结构、II型茎环结构和III型茎环结构示意图。
图2为本发明提供的用于茎环DNA检测的荧光等温扩增原理图，包括I型茎环结构、II型茎环结构和III型茎环结构的扩增。
图3(A)为实施例1中分别在含有和不含有高保真DNA聚合酶的情况下针对I型茎环DNA进行荧光检测所得的曲线图。
图3(B)为实施例1中LIF引物3'最后碱基正常与A→G突变探针的扩增效果比较图。
图4为实施例1中针对不同浓度的I型茎环DNA荧光等温扩增检测结果图，其中曲线1～5分别为浓度3×104、3×103、3×102、3×101、3×100的扩增结果，曲线6为空白对照NTC。
图5为实施例2中针对不同浓度的II型茎环DNA荧光等温扩增检测结果图，其中曲线1～5分别为浓度3×104、3×103、3×102、3×101、3×100的扩增结果，曲线6为空白对照NTC。
图6为实施例3中针对III型茎环DNA一步法对Nsp3基因、E基因、actin基因进行多重荧光检测的检测结果图。
图7(A)实施例3中针对III型茎环DNA一步法多重荧光对SARS-CoV-2Nsp3基因的灵敏度检测结果图，其中曲线1～7分别为浓度3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100的扩增结果，曲线8为空白对照NTC。
图7(B)为实施例3中针对III型茎环DNA一步法多重荧光对SARS-CoV-2E基因检测的灵敏度检测结果图，其中曲线1～7分别为浓度3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100的扩增结果，曲线8为空白对照NTC。
图8为实施例3中针对III型茎环DNA一步法对SARS-CoV-2多重荧光检测的特异性检测结果图，曲线1为Nsp3阳性对照、曲线2为E基因阳性对照、曲线3～19为17种呼吸道病毒样本核酸、曲线20为无核酸酶水的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
本发明提供了一种简便、高特异性、高灵敏度，可用于茎环DNA的多重荧光检测。为了更好地理解本发明，下面结合图2，对本发明的原理进行详细的阐述：
如图2所示，待检测模板为茎环DNA，其可来自于等温扩增中间产物或本身具有发夹结构的DNA，待检测茎环DNA可为多种结构，如I型、II型和III结构。
本发明基于链置换DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶和修饰荧光的LP引物，利用高保真DNA聚合酶的3'-5'外切酶活性，切除3'末端修饰的荧光基团。
在本发明中，一方面3'修饰荧光基团，3'-OH被封闭，此时，高保真DNA聚合酶从3'端将最后一个碱基切下(无论3'末端错配与否)。荧光基团与淬灭基团分离，从而出现荧光信号。
另一方面，暴露出荧光引物3'-OH，在链置换DNA聚合酶的作用下延伸，从而使扩增产物增加，荧光信号累积，即可实现对扩增过程的实时监控。
无论模板与荧光引物的3'末端是否匹配均可以实现扩增。
当引物与模板完全配对时，高保真DNA聚合酶发挥3'-5'聚合酶活性，识别3'-OH封闭的荧光基团为错配基团，切掉封闭3'-OH的核苷，释放荧光基团，产生荧光信号；当荧光引物与3'末端不匹配时，高保真DNA聚合酶便可以将其识别为错配碱基，将其切割下来，产生荧光信号并继续进行扩增。
本发明提供的等温扩增方法具体实施步骤为：
(1)基于野生型序列设计第一引物对以及第二引物对(荧光引物)，对于荧光引物，3'标记荧光基团，5'标记淬灭基团。
(2)用以上特异性引物对对待测模板进行检测，当引物与模板完全配对时，高保真DNA聚合酶发挥3'-5'聚合酶活性，识别3'-OH封闭的荧光基团为错配基团，切掉封闭3'-OH的核苷，释放荧光基团，产生荧光信号；
当引物与模板不完全匹配时，高保真DNA聚合酶识别3'错配碱基并切除，产生荧光信号。
(3)通过实时Q-PCR仪器进行结果的检测或电泳检测。
实施例1针对I型茎环结构DNA的荧光恒温扩增
(1)选取SARS-CoV-2基因组区域的Nsp3基因，构建I型茎环DNA结构，合成单链DNA序列(SEQ ID NO.1)并设计对应的特异性引物。
I型茎环DNA模板序列(SEQ ID NO.1)：
GACGCGCAGGGAATGGATAATTCCACTACTTCTTCAGAGACTGGTTTTAGATCTTCGCAGGCAAGATTATCCATTCCCTGCGCGTCCTCTGACTTCAGTACATCAAACGAATTTGATGTTTCAACTGGTTTTGTGCTCCAAAGACAACGTATACACCAGGTATTTATTCGTTTGATGTACTGAAGTCAGA
FOP(SEQ ID NO.2)：
TCTGACTTCAGTACATCAAACGAATAAATACCTGGTGTATACGTTGTC
BOP(SEQ ID NO.3)：
GACGCGCAGGGAATGGATAATTCCACTACTTCTTCAGAGACT
针对Nsp3基因区域的荧光引物3'修饰CY5，5'修饰BHQ2基团；
同时Nsp3区域的荧光引物3'端设计一个错配碱基，为A→G的突变。
LIF-正常(SEQ ID NO.4)：
5'-BHQ2-TGTTTCAACTGGTTTTGTGCTCCA-CY5-3'；
LIF-突变(SEQ ID NO.5)：
5'-BHQ2-TGTTTCAACTGGTTTTGTGCTCCG-CY5-3'；其中，下划线所示为突变位点；
LIB(SEQ ID NO.6)：
TCTTGCCTGCGAAGATCTAAAAC
用合成的单链DNA序列104copies/μL做模板，每反应加3μL，设置有Q5高保真DNA聚合酶和无Q5高保真DNA聚合酶两个平行实验。
25μL反应体系如下表2所示：
表2
Figure BDA0003066471250000121
表中，FOP和BOP以摩尔比为1:1混合，LIF(荧光探针)、LIF(普通引物)和LIB以摩尔比为1:1:2混合。
结果如图3(A)所示，有无Q5高保真酶的反应均有扩增信号，添加Q5高保真DNA聚合酶的反应速度明显加快，表明添加Q5高保真酶可加速参与切割荧光引物，提高反应速度；
图3(B)结果表明，无论3'端突变与否，本发明提供的方法均可以有效检测。
(2)将合成的单链DNA序列分别从104copies/μL以10倍梯度依次稀释到10copies/μL，每个反应分别加3μL进行扩增，观察扩增效率。
结果如图4所示，I型茎环DNA检测在104copies/μL～102copies/μL均可以达到很好的检测效果。
实施例2针对II型茎环结构DNA的荧光恒温扩增
选取SARS-CoV-2基因组区域的Nsp3基因，构建II型茎环DNA结构，合成单链DNA序列(SEQ ID NO.7)，所使用的引物为上述实施例1中的特异性引物；
II型DNA茎环模板序列(SEQ ID NO.7)：
GTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGACGCGCAGGGAATGGATAATTCCACTACTTCTTCAGAGACTGGTTTTAGATCTTCGCAGGCAAGATTATCCATTCCCTGCGCGTCCTCTGACTTCAGTACATCAAACGAATTTGATGTTTCAACTGGTTTTGTGCTCCAAAGACAACGTATACACCAGGTATTTATTCGTTTGATGTACTGAAGTCAGACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTT
将合成的DNA序列从104copies/μL以10倍梯度依次稀释到100copies/μL，每个反应分别加3μL进行扩增，观察扩增效率。
扩增结果如图5所示，表明利用本方法检测II型茎环DNA的扩增效果也很好，动态线性范围均在104～101copies/μL。
实施例3针对III型茎环结构DNA的一步法多重荧光恒温扩增
基于上述实施例，尝试同时加入SARS-CoV-2的E基因以及人actin基因，其中对E基因的引物LIB3'FAM修饰，5'BHQ1修饰；Actin基因的LIB3'HEX，5'BHQ1修饰。
(1)E基因
FOP(SEQ ID NO.8)：
ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTATTCGTTTCGGAAGAGACG
BOP(SEQ ID NO.9)：
TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT
LIB(SEQ ID NO.10)：
5'-BHQ1-CTGCGCTTCGATTGTGTGCGT-FAM-3'
(2)Actin基因
FOP(SEQ ID NO.11)：
AAGTCCAGGGCGACGTAGCAC-CGGCCGAGCGGGAAAT
BOP(SEQ ID NO.12)：
GAGATGGCCACGGCTGCTTCC-ATTGCCAATGGTGATGACCT
LIB(SEQ ID NO.13)：
5'-BHQ1-AGAGCTACGAGCTGCCTG-HEX-3'
将Nsp3以及E基因片段克隆到质粒载体上，合成Nsp3以及E基因DNA序列，通过体外转录获取两个基因片段的RNA标准品作为阳性对照，人actin基因mRNA作为内参，无核酸酶水作为阴性对照，进行III型茎环结构DNA一步法多重荧光检测。
Nsp3基因DNA模板序列(SEQ ID NO.14)：
ACACACCCTCTTTTAAGAAAGGAGCTAAATTGTTACATAAACCTATTGTTTGGCATGTTAACAATGCAACTAATAAAGCCACGTATAAACCAAATACCTGGTGTATACGTTGTCTTTGGAGCACAAAACCAGTTGAAACATCAAATTCGTTTGATGTACTGAAGTCAGAGGACGCGCAGGGAATGGATAATCTTGCCTGCGAAGATCTAAAACCAGTCTCTGAAGAAGTAGTGGAAAATCCTACCATACAGAAAGACGTTCTTGAGTGTAATGTGAAAACTACCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACCAGCAAATAATAGTTTAAAAATTACAGAAGAGGTTGGCCACACA
E基因DNA模板序列(SEQ ID NO.15)：
GCCTGAAGAACATGTCCAAATTCACACAATCGACGGTTCATCCGGAGTTGTTAATCCAGTAATGGAACCAATTTATGATGAACCGACGACGACTACTAGCGTGCCTTTGTAAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAACGAACTAAATATTATATTAGTTTTTCTGTTTGGAACTTTAATTTTAGCCATGGCAGATTCCAACGGTACTATTACCGTTGAAGAGC
分别用104copies/μL的Nsp3和E基因的RNA以及人内参基因mRNA作为模板，每个反应加3μL，进行扩增反应；
进一步地，将获得的RNA标准品梯度稀释为106～100copies/μL，每个反应分别加3μL，进行灵敏度检测。
如图6所示，阴性对照无扩增信号，多重体系中，阳性对照Nsp3和E以及内参基因均能很好的扩增。
同时，如图7(A)和图7(B)所示，本实施例中提供的方法对阳性对照Nsp3和E基因的多重灵敏度检测可达到3copies/25μL反应，表明该多重等温扩增方法具有明显良好的扩增效果。
为了进一步验证本发明的特异性，用17种呼吸道病毒样本核酸(包括呼吸道合胞病毒A-B，冠状病毒NL-63、OC-43、229E、HKU-1、流感病毒A-C、肠道病毒、副流感病毒1-3、腺病毒、鼻病毒、博卡病毒、NTC)作为阴性对照；
SARS-COV-2RNA标准品Nsp3和E基因作为阳性对照，无核酸酶水作为NTC。
如图8所示，17种呼吸道病毒(曲线3～19)以及无核酸酶水(曲线20)均无扩增信号，只有阳性对照(曲线1为Nsp3阳性对照，曲线2为E基因阳性对照)有扩增信号。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市公共卫生临床中心
<120> 一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用
<130> 20210507
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gacgcgcagg gaatggataa ttccactact tcttcagaga ctggttttag atcttcgcag 60
gcaagattat ccattccctg cgcgtcctct gacttcagta catcaaacga atttgatgtt 120
tcaactggtt ttgtgctcca aagacaacgt atacaccagg tatttattcg tttgatgtac 180
tgaagtcaga 190
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tctgacttca gtacatcaaa cgaataaata cctggtgtat acgttgtc 48
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gacgcgcagg gaatggataa ttccactact tcttcagaga ct 42
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgtttcaact ggttttgtgc tcca 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgtttcaact ggttttgtgc tccg 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tcttgcctgc gaagatctaa aac 23
<210> 7
<211> 248
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gtaaaacgac ggccagtgaa ttcgacgcgc agggaatgga taattccact acttcttcag 60
agactggttt tagatcttcg caggcaagat tatccattcc ctgcgcgtcc tctgacttca 120
gtacatcaaa cgaatttgat gtttcaactg gttttgtgct ccaaagacaa cgtatacacc 180
aggtatttat tcgtttgatg tactgaagtc agacaggaaa cagctatgac catgattacg 240
ccaagctt 248
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
accacgaaag caagaaaaag aagtattcgt ttcggaagag acg 43
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ttgctagtta cactagccat ccttaggttt tacaagactc acgt 44
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ctgcgcttcg attgtgtgcg t 21
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
aagtccaggg cgacgtagca ccggccgagc gggaaat 37
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gagatggcca cggctgcttc cattgccaat ggtgatgacc t 41
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
agagctacga gctgcctg 18
<210> 14
<211> 356
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
acacaccctc ttttaagaaa ggagctaaat tgttacataa acctattgtt tggcatgtta 60
acaatgcaac taataaagcc acgtataaac caaatacctg gtgtatacgt tgtctttgga 120
gcacaaaacc agttgaaaca tcaaattcgt ttgatgtact gaagtcagag gacgcgcagg 180
gaatggataa tcttgcctgc gaagatctaa aaccagtctc tgaagaagta gtggaaaatc 240
ctaccataca gaaagacgtt cttgagtgta atgtgaaaac taccgaagtt gtaggagaca 300
ttatacttaa accagcaaat aatagtttaa aaattacaga agaggttggc cacaca 356
<210> 15
<211> 451
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gcctgaagaa catgtccaaa ttcacacaat cgacggttca tccggagttg ttaatccagt 60
aatggaacca atttatgatg aaccgacgac gactactagc gtgcctttgt aagcacaagc 120
tgatgagtac gaacttatgt actcattcgt ttcggaagag acaggtacgt taatagttaa 180
tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt attcttgcta gttacactag ccatccttac 240
tgcgcttcga ttgtgtgcgt actgctgcaa tattgttaac gtgagtcttg taaaaccttc 300
tttttacgtt tactctcgtg ttaaaaatct gaattcttct agagttcctg atcttctggt 360
ctaaacgaac taaatattat attagttttt ctgtttggaa ctttaatttt agccatggca 420
gattccaacg gtactattac cgttgaagag c 451

Claims (10)

1.一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法，其特征在于，所述荧光等温扩增方法包括如下步骤：
(1)以待测核酸样品中的茎环DNA或RNA为模板，合成特异性扩增引物；
其中，所述特异性扩增引物包含第一引物和第二引物；
所述第一引物包括至少一条外引物，所述外引物包括FOP和/或BOP；
所述第二引物包括至少一条携带荧光基团和淬灭基团的内引物，所述内引物包括LIF和/或LIB，并且，所述第二引物的3'末端的碱基为与模板互补配对的碱基或与模板错配的碱基；
(2)使用所述特异性扩增引物和链置换DNA聚合酶进行荧光等温扩增，并检测扩增体系中的荧光，得到检测结果。
2.根据权利要求1所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，所述第二引物的5'端携带荧光基团，并且3'端携带淬灭基团；或者，所述第二引物的3'端携带荧光基团，并且5'端携带淬灭基团；优选为所述第二引物的3'端携带荧光基团，并且5'端携带淬灭基团；
优选地，所述荧光基团包括FAM、Cy5、Texas Red、HEX、VIC、TET、JOE、TAMRA、ROX、LCRed610、LC Red640、LCCyan500或YakimaYellow中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ3、Eclipse、TAMRA、BHQ2或Dabcyl中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，步骤(1)中所述特异性扩增引物还包括第三引物，所述第三引物包括至少一条未经荧光基团或淬灭基团修饰的内引物，其与第二引物的序列相同；
优选地，步骤(1)中所述茎环DNA包括I型茎环结构、II型茎环结构或III型茎环结构中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1～3任一项所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系中还包括高保真DNA聚合酶；
优选地，所述高保真DNA聚合酶包括Q5 DNA聚合酶、KOD plus neo DNA聚合酶、BlendTaq DNA聚合酶、Promstar HSDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、KOD FX DNA聚合酶或KODTM DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为Q5 DNA聚合酶或KOD plus neo DNA聚合酶；
优选地，步骤(2)中所述链置换DNA聚合酶包括Bst 3.0DNA/RNA聚合酶或Bst4.0 DNA/RNA聚合酶；
优选地，以茎环RNA为模板，步骤(2)的反应体系中还包括反转录酶，或者，所述反应体系中的链置换DNA聚合酶为具有逆转录活性的链置换DNA聚合酶。
5.根据权利要求1～4任一项所述的荧光等温扩增方法，其特征在于，步骤(2)中所述荧光等温扩增的扩增温度为61～65℃，优选为64℃；
优选地，步骤(2)中所述荧光等温扩增的扩增时间为5～70min，优选为30min。
6.一种使用权利要求1～5所述的荧光等温扩增方法检测茎环核酸的荧光等温扩增体系，其特征在于，所述荧光等温扩增体系包括：
链置换DNA聚合酶、特异性扩增引物、dNTPs、Mg2+和缓冲液；
其中，所述特异性扩增引物包含第一引物和第二引物；
所述第一引物包括至少一条外引物，所述外引物包括FOP和/或BOP；
所述第二引物包括至少一条携带荧光基团和淬灭基团的内引物，所述内引物包括LIF和/或LIB，并且，所述第二引物的3'末端的碱基为与模板互补配对的碱基或与模板错配的碱基。
7.根据权利要求6所述的荧光等温扩增体系，其特征在于，所述特异性扩增引物还包括第三引物，所述第三引物包括至少一条未经荧光基团或淬灭基团修饰的内引物，其与第二引物的序列相同；
优选地，所述第一引物的浓度为0.6～1.2μM；
优选地，所述第二引物的浓度或第二引物与第三引物的总浓度为0.2～0.6μM。
8.根据权利要求6或7所述的荧光等温扩增体系，其特征在于，所述荧光等温扩增体系还包括高保真DNA聚合酶；
优选地，所述高保真DNA聚合酶的浓度为0.1～0.5U；
优选地，所述链置换DNA聚合酶的浓度为6～8U；
优选地，所述dNTPs的摩尔浓度为1.0～1.8mM；
优选地，所述Mg2+的摩尔浓度为6～10mM；
优选地，所述缓冲液包括NH4 +、K+或Triton X-20中的任意一种或至少两种的组合。
9.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒包含如权利要求6～8任一项所述的荧光等温扩增体系。
10.如权利要求1～5任一项所述的荧光等温扩增方法、如权利要求6～8任一项所述的荧光等温扩增体系或如权利要求9所述的核酸检测试剂盒在体外检测病原微生物中的应用。
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