CN116622823A - 用于lamp等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用 - Google Patents
用于lamp等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116622823A CN116622823A CN202310656762.6A CN202310656762A CN116622823A CN 116622823 A CN116622823 A CN 116622823A CN 202310656762 A CN202310656762 A CN 202310656762A CN 116622823 A CN116622823 A CN 116622823A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chain
- cdp
- lamp
- probe
- real
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 53
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 67
- 238000004637 computerized dynamic posturography Methods 0.000 description 41
- 210000001233 cdp Anatomy 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 101150076401 16 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 description 1
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于LAMP等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用，属于生物化学技术领域。该CDP探针包含一条产物识别链DS链和一条信号链CS链，DS链为未修饰的核苷酸链，CS链为溶解温度大大增加了的化学修饰核苷酸链。该DS链的5’端标记有荧光淬灭基团，该CS链的3’端标记有荧光基团并与DS链的5’端序列完全互补配对，两条单链互补组成半双链DNA。该DS链的3’端碱基序列可特异性识别LAMP扩增产物，并随特异性扩增产物的增加而实时释放荧光信号。本发明提供的CDP探针可用于辅助LAMP等温扩增，可降低LAMP的假阳性和假阴性，可应用于非疾病诊断的分子诊断检测领域。
Description
技术领域
本发明涉属于生物化学技术领域，具体涉及一种用于LAMP等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用。
背景技术
核酸检测技术是生命科学领域最有价值、应用最为广泛的生物学技术之一，在基础科研和临床诊断中发挥着极其重要的作用。鉴于疾病快速筛查和早期诊断的重要性，快速核酸检测(即POCT核酸检测)已成为目前最为迫切需求之一。传统核酸检测技术(PCR、二代测序技术和基因芯片)都存在设备昂贵、操作复杂、耗时耗力等问题，故难以实现POCT核酸检测。
等温扩增技术是一种在恒定温度下扩增和检测核酸的技术，具有简单、快速、高效的特点。由于等温扩增技术的反应温度恒定，故简单的恒温设备即可实现核酸检测，这使分子诊断发生了革命性的变化，为POCT核酸检测提供了可能。
环介导等温扩增(LAMP)是一种应用最为广泛的等温扩增技术之一，具有灵敏、快速、经济等优点，是一种前景广阔的POCT核酸检测技术。LAMP反应需要使用4条引物(与模板DNA的6个区域进行杂交)，这些引物与模板结合，在BstDNA聚合酶的催化产生一个两端带有茎环序列的哑铃状中间体。该哑铃状中间体利用自身3’端茎环触发连续的自我延伸，以及作为模板触发引物配对延伸，从而实现指数级的核酸扩增反应。为监测LAMP反应过程和判断检测结果，荧光染料SYBRGreenI被添加到LAMP反应液中。游离的SYBRGreenI无明显荧光，当其与双链DNA结合，荧光强度明显增加。另外，受扩增原理和所用聚合酶限制，LAMP不能像PCR一样，采用水解TapMan探针的方法来监测反应过程和判断检测结果。
然而，染料法LAMP存在严重不足。LAMP的引物繁多，容易出现非特异性扩增，进而导致LAMP假阳性。另外，当样本中背景核酸较多时，背景核酸大量吸附荧光染料，导致染料耗竭，进而导致假阴性(即使发生扩增，但无荧光信号增加，无扩增曲线)。换言之，LAMP既存在假阳性，又存在假阴性。因此，研发特异性更高、准确性更好的探针法LAMP意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于LAMP等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用，为解决传统染料法LAMP既存在假阳性、又存在假阴性的两大不足。通过本发明提供的化学修饰实时荧光双链探针辅助LAMP等温扩增是一种便携式分子诊断技术，其特异性更高、准确性更好，具有重要的临床意义、广阔的应用前景和巨大的社会经济效益。
为了达到上述目的，本发明提供了一种化学修饰实时荧光双链探针CDP，CDP探针包含一条5’端标记有荧光淬灭基团的产物识别链DS链和一条3’端标记有荧光基团的化学修饰的信号链CS链，化学修饰为增加DNA亲和力的修饰；其中，荧光基团和荧光淬灭基团可以互换位置设置，CS链与DS链的5’端序列能完全互补配对或部分配对，且DS链上的荧光淬灭基团与CS链上的荧光基团处于淬灭范围内；DS链3’端的未与CS链配对的碱基序列特异性识别LAMP扩增产物，与LAMP扩增产物互补配对；CS链的碱基序列与LAMP扩增产物不相配对；
进一步地，上述DS链的长度为30-50nt；CS链的长度为15-20nt。
进一步地，上述CS链的核苷酸为经化学修饰的核苷酸，用于提高CS链的溶解温度，增加CS链与DS链的结合强度。
进一步地，上述的化学修饰包含2’-氟修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰一种或两种以上。
本发明提供的CDP探针可用于降低LAMP等温扩增中假阳性和假阴性。
本发明还提供了一种通过上述CDP探针辅助LAMP等温扩增的实时荧光分析方法，通过将CDP探针加入LAMP等温扩增的反应体系中得到CAMP扩增反应体系，并进行实时荧光分析。
进一步地，上述的CAMP扩增反应体系为20μL体系，包含NEBWarmStartLAMP2XMasterMix10μL、四条LAMP引物各2μL、CDP探针1μL、模板DNA1μL；其中，CDP探针是通过将2μM的DS链和2μM的CS链等体积混合所得。
本发明提供的实时荧光分析方法可用于非疾病诊断的分子诊断检测领域。
本发明的化学修饰实时荧光双链探针应用在LAMP中，解决了传统染料法LAMP既存在假阳性，又存在假阴性等问题，具有以下优点：
本发明提供的CDP探针能够识别特异性扩增产物，能够特异性地输出荧光信号，将CDP探针添加到无荧光染料的普通LAMP反应体系之中，本发明将其命名为CDP辅助的LAMP等温扩增(CAMP)，CAMP可实现探针法实时荧光LAMP扩增。CAMP通过恒温荧光仪实时监测反应过程中的荧光强度变化，阳性呈典型的S型扩增曲线，阴性无扩增曲线，与染料法LAMP相比，添加了CDP探针的CAMP具有更低的假阳性和假阴性。
与未修饰的CDP探针相比，本发明提供的化学修饰的CDP探针具有更高的溶解温度(Tm值)，具有更好的稳定性。
与染料法LAMP相比，本发明提供的CAMP技术既保留了LAMP简单、快速、灵敏、经济的特性，CAMP的CDP探针能够识别特异性扩增产物，能特异性地输出荧光信号，故CAMP减少了假阳性和假阴性的发生概率。
CAMP有望成为实用性更佳的便携式分子诊断技术，在非疾病诊断的分子检测领域具有重要的意义、广阔的应用前景和巨大的社会经济效益。
附图说明
图1为本发明中CDP探针的工作原理图。
图2为本发明中化学修饰对CDP探针Tm值的影响情况图。
图3为本发明中CAMP扩增Template1的实时荧光结果图。
图4为本发明中LAMP和CAMP假阳性比较结果图。
图5为本发明中LAMP和CAMP假阴性比较结果图。
图6为本发明中CAMP扩增Template2的实时荧光结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
说明：本发明未具体说明的方法均为本领域的常规方法，未具体说明的试剂均为本领域常规试剂。
部分简写名称的说明：
LAMP：环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification)；
CDP：化学修饰实时荧光双链探针(Chemicallymodifiedduplexfluorescenceprobe)；
CAMP：CDP辅助的LAMP等温扩增。
CDP探针的设计开发，具体方案如下：
本发明通过设计一条较长的产物识别链(Detentionstrand，DS链)和一条较短的化学修饰的信号链(Chemicallymodifiedsignalstrand，CS链)，两条单链均为核苷酸链，互补组成半双链DNA即为CDP探针。
其中，在CDP探针中，DS链的长度为30-50nt，其5’端标记有荧光淬灭基团；CS链的长度为15-20nt，并且与DS链的5’端序列完全互补配对；CS链的标记有荧光基团，该荧光基团因双链互补配对进一步与DS链的荧光淬灭基团靠近，使荧光淬灭，其中，荧光基团和荧光淬灭基团可以互换位置设置。例如当荧光基团为FAM时，淬灭基团则选择与之较适配的淬灭基团BHQ1，还可以选择使用其它适配的荧光和淬灭基团。当DS链和CS链组装成双链时，FAM和BHQ1将位于CDP的同一端，两者相距很近，故FAM的荧光会被BHQ1高效淬灭。DS链的3’端碱基序列可以特异性识别LAMP扩增产物，与LAMP扩增产物互补配对(配对长度为16-30nt)。而CS链的碱基序列(即CDP的双链部分)与扩增产物无关且不相配对，因此可以在不同LAMP反应之间通用。
CDP探针的工作原理如图1所示，当发生特异性扩增时，CDP探针的3’端单链与特异性LAMP扩增产物结合；然后，CDP的3’端单链在BstDNA聚合酶的催化下参照模板进行延伸，其延伸产物随后也会被当作模板被利用；当CDP被用作模板时，BstDNA聚合酶的链置换功能会将带FAM的CS链剥离下来，使得FAM与BHQ1相互远离，从而高效释放荧光信号，并实现高效、灵敏、特异的实时荧光LAMP检测。
众所周知，LAMP的工作温度一般在60-65℃。在此温度下，双链DNA处于解链和复性的动态平衡之中，双链DNA处于一种不稳定的状态。自然而然，CDP双链探针也处于不稳定状态。由于CDP探针的双链区域比较短，因此大多数CDP会处于解链状态(荧光基团和淬灭基团远离)。其不良后果就是荧光背景较高，信噪比较低。为保证低背景和高信噪比，本发明所用的CS链为化学修饰的核苷酸，以提高CS链与DS链的亲和力和结合强度。这些化学修饰包括2’-氟修饰(2’-F)、锁核酸修饰(LAN)、肽核酸修饰(PNA)，以及其它增加DNA亲和力的修饰。化学修饰对CDP探针Tm值的影响情况如图2所示，可知，与未修饰的探针相比，化学修饰的CDP探针(2’-F、LAN、PNA修饰)具有更高的溶解温度(Tm值)，故具有更好的稳定性。
本发明提供的CDP探针是由DS链和CS链两条寡核苷酸链组装而成。DS链和CS链一般通过化学合成获得。将CDP探针添加到无荧光染料的普通LAMP反应体系之中(终浓度为0.05-0.5μM)，即可实现探针法实时荧光LAMP扩增，本发明将其命名为CDP辅助的LAMP等温扩增(CAMP)。CAMP通过恒温荧光仪实时监测反应过程中的荧光强度变化，阳性呈典型的S型扩增曲线，阴性无扩增曲线。
实施例1：CAMP检测人工构建的DNA模板Template1
1、模板、LAMP引物和CDP探针修饰
本实施例所采用的模板是人工构建的DNA，命名为Template1，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，该Template1为人乳头瘤病毒16型基因(HPV16-DNA)的部分片段，该HPV16-DNA的GenBank登录号为K02718.1。针对该模板的LAMP引物包括T1-F3、T1-B3、T1-FIP、T1-BIP四条引物，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5。该实施例中，CDP探针的T1-DS链和T1-CS链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7。CS链的所有碱基均进行2’-F修饰。
2、配制CDP探针
将合成的化学修饰后的DS链和CS链用TEbuffer分别溶解成2μM，再将2μM的DS链和2μM的CS链等体积混合，然后95℃变性5分钟，然后缓慢降温至室温，最终制备成1μM的CDP探针。
3、配制CAMP反应液
CAMP反应采用20μL体系，包括10μL的NEBWarmStartLAMP2XMasterMix，2μL的2μM的T1-F3，2μL的2μM的T1-B3，2μL的16μM的T1-FIP，2μL的16μM的T1-BIP，1μL的1μM的CDP探针，1μL的Template1(1×106copies/μL)，加了模板的记为阳性实验组(CAMP-Pos)；同时设置无模板(1μL的ddH2O)的阴性对照组(CAMP-Neg)，除不加模板外其余与实验组相同。
4、CAMP的实时荧光分析
将配制好的CAMP反应液置于实时荧光恒温仪63℃孵育90分钟，每分钟检测一次反应管的荧光值。CAMP扩增Template1的实时荧光结果如图3所示，可以看出，CAMP的确可以高效地扩增Template1。
对比例1：CAMP与染料法LAMP效果对比
1、LAMP和CAMP假阳性比较
染料法LAMP的缺点之一就是不能识别非特异性扩增，容易出现LAMP假阳性。而CDP探针能识别特异性扩增产物，故CAMP不易出现假阳性。为验证CAMP在减少假阳性方面的功能，本对比例加倍了LAMP和CAMP引物的浓度，以引发非特异性扩增。
参照上述实施例1的步骤进行实时荧光分析，LAMP和CAMP假阳性比较结果如图4所示，其中，图4中的(A)为实时荧光LAMP扩增结果。图4中的(B)为将图A的扩增产物进行PAGE凝胶电泳结果。图4中的(C)为实时荧光CAMP扩增结果。图4中的(D)为将图C的扩增产物进行PAGE凝胶电泳结果；M为DNAMarker，Pos表示阳性对照，Neg为无模板阴性对照。为引发非特异性扩增，LAMP和CAMP的引物浓度进行了加倍。根据实时荧光分析结果可知：染料法LAMP的阴性对照在70分钟左右出现了典型的扩增曲线，发生了假阳性(图4的A)，PAGE电泳也证实了非特异性扩增的发生(图4的B)。然而，尽管PAGE电泳证实，CAMP也发生了非特异性扩增(图4的D)，但实时荧光分析却显示，CAMP的阴性对照在90分钟内都没有出现扩增信号(图4的C)。上述结果说明：CAMP可以减少假阳性的发生。
2、LAMP和CAMP假阴性比较
染料法LAMP的另一个缺点就是：当大量背景DNA存在时，容易因染料耗竭而出现假阴性。而CDP探针是通过识别特异性扩增产物而输出扩增信号，不存在染料耗竭问题，故可以减少假阴性。为验证CAMP在减少假阴性方面的功能，本对比例在LAMP和CAMP的阳性对照中添加了大量背景DNA(含200ng的人基因组DNA)。
参照上述实施例1的步骤进行实时荧光分析，LAMP和CAMP假阴性比较结果如图5所示，其中，图5中的(A)为实时荧光LAMP扩增结果。图5中的(B)为将图A的扩增产物进行PAGE凝胶电泳结果。图5中的(C)为实时荧光CAMP扩增结果。图5中的(D)为将图C的扩增产物进行PAGE凝胶电泳结果；M为DNAMarker，Pos表示阳性对照(含200ng的人基因组DNA)，Neg为无模板阴性对照。根据实时荧光分析结果可知：染料法LAMP的阳性对照背景荧光很高，且未出现典型的扩增曲线(图5的A)，PAGE电泳进一步证实，阳性对照的确是发生了扩增的(图5的B)。因此，高背景条件下，染料法LAMP出现了假阴性。然而，同样的高背景条件下，CAMP的阳性对照却出现了典型的扩增曲线(图5的C)，PAGE电泳也证实阳性对照发生了扩增(图5的D)。上述结果说明：CAMP可以减少假阴性的发生。
实施例2：CAMP检测人工构建的DNA模板Template2
1、模板及引物
本实施例重新构建了另一段DNA模板，命名为Template2，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，该Template2为非洲猪瘟病毒基因(ASFV-DNA)的部分片段，该ASFV-DNA的GenBank登录号为MH713612.1。针对Template2的引物包括T2-F3、T2-B3、T2-FIP、T2-BIP，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12。该实施例中，T2-CDP探针的T2-DS链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13。本实施例所用的T2-CS链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7，与实施例1的T1-CS链完全一致。
2、CAMP扩增Template2的反应液配制
T2-CDP探针的制备参照实施例1中CDP探针的制备过程，CAMP反应采用20μL体系：包括10μL的NEBWarmStartLAMP2XMasterMix，2μL的2μM的T2-F3，2μL的2μM的T2-B3，2μL16μM的T2-FIP，2μL的16μM的T2-BIP，1μL的1μM的T2-CDP探针，1μL的Template2(1×106copies/μL)。加了模板的记为阳性实验组(CAMP-Pos)；同时设置无模板的阴性对照组(CAMP-Neg)。
3、CAMP扩增Template2
将配制好的CAMP反应液置于实时荧光恒温仪63℃孵育90分钟，每分钟检测一次反应管的荧光值。CAMP扩增Template2的实时荧光结果如图6所示，可知，CAMP同样可以高效地扩增Template2，证明了CAMP的普遍适用性。
综上可知，通过本发明提供的CAMP扩增即用化学修饰的CDP探针辅助LAMP扩增，与染料法LAMP相比，CAMP的CDP探针能够识别特异性扩增产物，能够特异性地输出荧光信号，因此CAMP具有更低的假阳性和假阴性。CAMP技术既保留了LAMP简单、快速、灵敏、经济的特性，还进一步增加特异性，减少了假阳性和假阴性的发生概率。因此，CAMP有望成为实用性更佳的便携式分子诊断技术，有望在在非疾病诊断的分子检测领域中发挥重要作用。因此，通过本发明提供的CDP探针开发的CAMP技术具有重要的意义、广阔的应用前景和巨大的社会经济效益。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (8)
1.一种化学修饰实时荧光双链探针CDP，其特征在于，CDP探针包含一条5’端标记有荧光淬灭基团的产物识别链DS链和一条3’端标记有荧光基团的化学修饰的信号链CS链；其中，所述荧光基团和荧光淬灭基团可以互换位置设置，所述CS链与所述DS链的5’端序列能完全互补配对或部分配对，且DS链上的荧光淬灭基团与CS链上的荧光基团处于淬灭范围内；
所述DS链3’端的未与所述CS链配对的碱基序列特异性识别LAMP扩增产物，与LAMP扩增产物互补配对；所述CS链的碱基序列与LAMP扩增产物不相配对；
所述的化学修饰为增加DNA亲和力的修饰。
2.根据权利要求1所述的化学修饰实时荧光双链探针CDP，其特征在于，所述DS链的长度为30-50nt；所述CS链的长度为15-20nt。
3.根据权利要求1所述的化学修饰实时荧光双链探针CDP，其特征在于，所述CS链的核苷酸为经化学修饰的核苷酸，用于提高CS链的溶解温度，增加CS链与DS链的结合强度。
4.根据权利要求3所述的化学修饰实时荧光双链探针CDP，其特征在于，所述的化学修饰包含2’-氟修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰一种或两种以上。
5.如权利要求1所述的化学修饰实时荧光双链探针CDP在降低LAMP等温扩增中假阳性和假阴性的应用。
6.一种通过如权利要求1-5中任意一项所述的化学修饰实时荧光双链探针CDP辅助LAMP等温扩增的实时荧光分析方法，其特征在于，通过将所述的CDP探针加入LAMP等温扩增的反应体系中得到CAMP扩增反应体系，并进行实时荧光分析。
7.根据权利要求6所述的实时荧光分析方法，其特征在于，所述的CAMP扩增反应体系为20μL体系，包含NEBWarmStartLAMP2XMasterMix10μL、四条LAMP引物各2μL、CDP探针1μL、模板DNA1μL；其中，所述的CDP探针是通过将2μM的DS链和2μM的CS链等体积混合所得。
8.如权利要求6或7所述的实时荧光分析方法在非疾病诊断的分子检测领域中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310656762.6A CN116622823A (zh) | 2023-06-05 | 2023-06-05 | 用于lamp等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310656762.6A CN116622823A (zh) | 2023-06-05 | 2023-06-05 | 用于lamp等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116622823A true CN116622823A (zh) | 2023-08-22 |
Family
ID=87641666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310656762.6A Pending CN116622823A (zh) | 2023-06-05 | 2023-06-05 | 用于lamp等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116622823A (zh) |
-
2023
- 2023-06-05 CN CN202310656762.6A patent/CN116622823A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8906621B2 (en) | Cross priming amplification of target nucleic acids | |
| US20220090195A1 (en) | Structure and application of double-stranded oligonucleotide nucleic acid probe | |
| US20120040349A1 (en) | Method for detecting nucleic acids | |
| Asadi et al. | The mechanism and improvements to the isothermal amplification of nucleic acids, at a glance | |
| US6063572A (en) | Method of assay of nucleic acid sequences | |
| CN113186259B (zh) | 一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用 | |
| CN104164478A (zh) | 一种基因单碱基变异的cras-pcr检测方法 | |
| CN113186257A (zh) | 一种基于液态芯片技术的pcr扩增后恒温杂交方法 | |
| CN116179658B (zh) | 一种荧光引物扩增阻滞突变系统及其应用 | |
| CN112980928A (zh) | 一种茎环引物辅助的等温核酸扩增方法 | |
| CN110172500B (zh) | 一种单核苷酸多态性的等温分型方法 | |
| CN115418392A (zh) | 一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法 | |
| CN116622823A (zh) | 用于lamp等温扩增的化学修饰实时荧光双链探针及其应用 | |
| Li et al. | One-pot, ultrasensitive, and multiplex detection of SARS-CoV-2 genes utilizing self-priming hairpin-mediated isothermal amplification | |
| CN114045330B (zh) | 一种基于滑动复制的核酸等温扩增方法 | |
| CN115058493B (zh) | 一种用于多重核酸检测的dna探针、crispr-反向点杂交核酸检测系统及应用 | |
| CN113981044B (zh) | 一种基于滚环扩增与分子信标的tsRNA检测方法 | |
| US20220154268A1 (en) | System and Methods for Detection of Low-Copy Number Nucleic Acids and Protein | |
| US9212398B2 (en) | Cross priming amplification of target nucleic acids | |
| JP4644944B2 (ja) | 標的核酸検出法およびそのための試薬 | |
| CN117625768A (zh) | 一种通用数字pcr检测体系及其应用 | |
| WO2024062126A1 (en) | Method of detection of a target nucleic acid sequence | |
| CN117867077A (zh) | 一种基于链置换反应的生物传感器及其应用 | |
| CN117925790A (zh) | 一种用于恒温指数扩增的模板 | |
| CN113930484A (zh) | 一种快速、特异、灵敏、抗降解的微流控rna芯片及方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |