CN117867077A - 一种基于链置换反应的生物传感器及其应用 - Google Patents

一种基于链置换反应的生物传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于链置换反应的生物传感器，所述生物传感器包括催化型发夹CH1、催化型发夹CH2、Cas12a蛋白、crRNA和ssDNA报告分子；本发明基于Toehold介导的DNA链替换反应的恒温、无酶核酸扩增技术，并结合CRISPR/Cas12a系统构建一种新型、高扩增效率且检测信号联级放大的TMSDR‑Cas12a生物传感器，该技术灵敏度高、特异性好，常温条件下就能够用于样品中痕量核酸的快速可视化检测。

Description

一种基于链置换反应的生物传感器及其应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，尤其涉及一种基于链置换反应的生物传感器及其应用。
背景技术
传统的核酸检测方法主要有Southern杂交、Northern杂交、基因芯片技术、实时荧光定量PCR(QT-qPCR)和高通量测序等。然而Northern杂交技术耗时长、操作繁琐、样品需要量大且灵敏度低；基因芯片和高通量技术虽然有高通量的优势,但是样本需要预处理、灵敏度低且成本高；qPCR技术具有较高的灵敏度和实用性,但对引物的设计要求高且需要特殊的检测仪器。因此，开发一种用于核酸检测的灵敏度高、简单快速、检测限低的生物传感器，且能通过可视化观察直接获得与疾病发生发展相关的遗传信息，成为临床医学分子诊断的迫切需要。
DNA分子具有高特异性和可预测的Watson-Crick碱基配，可通过恒温自组装动力学被用于构建不同的DNA纳米结构与纳米器件。这种DNA恒温自组装的基础是Toehold介导的DNA链替换反应(toehold-mediated stand displacement reaction,TMSDR)，即通过一条单链DNA置换出部分复合物中原绑定链的反应过程，Toehold在反应中的作用是为DNA链分支迁移反应提供立足点从而促进反应顺利进行。利用Toehold驱动的链置换反应在恒温条件下构建DNA分子机器和复杂DNA反应网络，从而实现特定的DNA纳米器件的构建。
Cas12a是一种可在crRNA引导下与靶标DNA序列结合并切割基因组DNA的效应蛋白，当特异性结合和切割目标dsDNA后，能够产生具有非特异性切割单链DNA的活性(Broughton et al.,2020；Zhang et al.,2020)。该系统CRISPR/Cas12a，在单核苷酸多态性分析、癌症筛查、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力。CRISPR/Cas12a系统包括一个靶标序列识别的向导RNA(crRNA)和一个Cas12a效应蛋白，在靶标序列识别时，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，Cas12a效应蛋白的核酸酶活性被激活，然后不加区分的切割旁边的单链DNA(ssDNA)。通过引入标记有荧光团和猝灭剂或荧光团和生物素的单链DNA报告分子，可以用荧光检测器或侧向流试纸条检测切割结果。由于Cas12a的靶标及底物均为DNA，稳定性较强，该系统对实验操作环境要求低，可应用于现场疾病与病源微生物的核酸快速检测。
但是，现有技术的生物传感器还存在一些问题，如需要添加酶驱动反应、检测成本高，需要复杂仪器设备与熟练的操作人员等。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于链置换反应的生物传感器及其应用。本发明基于Toehold介导的DNA链替换反应的恒温、无酶核酸扩增技术，并结合CRISPR/Cas12a系统构建一种新型、高扩增效率且检测信号联级放大的TMSDR-Cas12a生物传感器，该技术灵敏度高、特异性好，常温条件下就能够用于样品中痕量核酸的快速可视化检测。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于链置换反应的生物传感器，所述生物传感器包括催化型发夹CH1、催化型发夹CH2、Cas12a蛋白、crRNA和ssDNA报告分子；
所述催化型发夹CH1含有一段碱基对互补形成茎部结构，该结构包被着可激活Cas12a效应蛋白的核苷酸链DNA序列，催化型发夹CH1粘性末端的单链作为支点链可与目标链杂交；催化型发夹CH1的结构如图1所示。
所述催化型发夹CH2含有一段碱基对互补形成茎部结构，其中一条带有悬挂支点链的序列与催化型发夹CH1环结构序列形成碱基互补配对，催化型发夹CH2的环结构序列中包含了目标链(即待测靶标DNA链)，其作用在于在杂交反应过程中能够将与发夹CH1杂交结合的目标链置换出来；催化型发夹CH2的结构如图2所示。
所述Cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的Cas12a蛋白；所述ssDNA报告分子带有荧光基团，用于荧光信号检测和可视化检测，其可由化学合成并HPLC纯化；
所述crRNA由构建crRNA体外转录载体并用T7转录试剂盒进行体外转录和纯化获得；所述crRNA能与Cas12a以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合体产生trans切割的活性并切割荧光基团标记的ssDNA报告分子，产生荧光信号。
上述生物传感器中，在无目标链存在的情况下，DNA发夹CH1与DNA发夹CH2均以茎环结构稳定存在。当目标链存在时，以DNA发夹CH1粘性末端的单链作为支点链(toehold)可与目标链杂交，打开CH1的茎环结构，形成一条新的粘性端杂交链HB1，并暴露出包被的核苷酸链DNA序列；暴露出的核苷酸链DNA序列可以激活Cas12a效应蛋白的附属切割活性并产生荧光信号；随后DNA发夹CH2部分粘性末端的单链成为支点链，在自由能的驱动下，发夹CH2的茎环结构逐步打开，与杂交链HB1杂交，形成一条稳定的杂交链HB2，并将待测目标链从杂交链HB1中置换下来，置换出的目标链继续引发下一轮杂交反应，使检测信号得到循环放大。
作为具体实施方案，所述催化型发夹CH1、催化型发夹CH2、ssDNA报告分子和crRNA的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述Cas12a蛋白为LbCas12a，其序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)。
作为具体实施方案，所述ssDNA报告分子的5‘端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。
本发明还提供了所述的基于链置换反应的生物传感器在核酸检测中的应用。
进一步的，所述的基于链置换反应的生物传感器在单链DNA或单链RNA检测中的应用。
本发明最后提供了一种核酸检测方法，包括采用所述的基于链置换反应的生物传感器。
作为具体实施方案，所述方法包括将待测样品与所述的基于链置换反应的生物传感器在反应缓冲液中混合，恒温条件下反应，反应结束后进行荧光检测。
进一步优选的，在总体积50μL的反应体系中，各组分浓度如下：0.4-0.6μM催化型发夹CH1、0.4-0.6μM催化型发夹CH2、0.1-0.3μMCas12a蛋白、0.3-0.5μM crRNA、0.1-0.3μMssDNA报告分子；所述反应缓冲液为1×TAE/Mg2+，主要成分包括：35-45mM Tris-HCl，10-20mM MgCl2，15-25mM冰醋酸，15-25mM EDTA，pH 7.5-8.5。
进一步优选的，所述恒温条件为25-37℃，更优选为30℃，反应的时间为15-60min，更优选为30min。
作为具体实施方案，所述待测样品包括离体的血液、体液、组织或细胞。
本发明利用Toehold介导的链置换反应与CRISPR/Cas12a系统结合，构建了一种在恒温条件下的无蛋白酶核酸扩增检测技术，不仅实现了用于检测不同来源样品中的核酸分子，而且方法简便、条件宽松以及检测结果灵敏度高、速度快。
本发明的工作原理如图1所示，首先利用待测目标链激活Toehold介导的链置换反应，暴露出发夹结构包裹的一条可以激活Cas12a效应蛋白的核苷酸链DNA，同时靶标分子序列释放出来并进一步激活下一个发夹结构，如此反复循环可以获得大量可以激活Cas12a效应蛋白的核苷酸链DNA。当反应体系中含有FAM/BHQ1或FAM/Biotin标记的ssDNA报告分子时，激活的Cas12a效应蛋白切割ssDNA报告分子，再一次进行信号放大，利用荧光检测仪或试纸条层析显色方法可实现样品中的核酸(DNA或RNA)的可视化检测。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)发夹结构自组装反应无需酶催化，利用位形熵的增加自发进行链置换-杂交循环反应，实现检测信号放大的杂交反应；
(2)检测方案设计简单、方便快捷，且实验操作无需特殊加热设备，常温条件下可发生反应，无需专业技术人员；
(3)提供一个可用于核酸检测的无酶、特异性好、灵敏度高的技术。
附图说明
图1为催化型发夹CH1的结构。
图2为催化型发夹CH2的结构。
图3为本发明的工作原理图。
图4为不同浓度靶标核酸的检测荧光值图
图5为试纸条层析显色检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
一种基于链置换反应的生物传感器，其为一种新型可用于核酸检测的信号放大型荧光生物传感器制备法，使用了包括催化型发夹CH1、催化型发夹CH2、CRISPR/Cas12a蛋白、crRNA、FAM/BHQ1标记的单链DNA报告分子及检测反应条件。其中，Cas12a蛋白为LbCas12a，其序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)
本实施例以诺如病毒为例描述该方法的操作步骤：
1、本实施例中设计一段可选用的诺如病毒基因特异寡核苷酸序列，其序列特征如SEQ ID NO.5：
5’-TCATCACCATAGAAGGAGAAGAGAGAATTAGCCTGTATGATGTCTGGG GACAAATTTGT-3’
依据SEQ ID NO.5序列设计crRNA，其序列特征如SEQ ID NO.4：
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCCCAGACAUCAUACAGGC-3’
2、本实施例中依据催化发夹反应原理设计可选用的发夹结构CH1与发夹结构CH2；
所述发夹结构CH1含有一段碱基对互补形成茎部结构，该结构包被着可激活Cas12a效应蛋白的核苷酸链DNA序列；结构如图1所示。
所述发夹结构CH2含有一段碱基对互补形成茎部结构，其中一条带有悬挂支点链的序列与发夹CH1环结构序列形成碱基互补配对，发夹CH2的环结构序列中包含了目标链，其作用在于在杂交反应过程中能够将与发夹CH1杂交结合的目标置换出来；结构如图2所示。
所述发夹CH1具有序列特征如SEQ ID NO.1：
5’-TGATGTCTGGGGGAGTATTGCGGAGGATAGGGGACTCCCCCAGAC ATCATACAGGCTA-3’
所述发夹H2具有序列特征如SEQ ID NO.2：
5’-CCCCAGACATCATAGCCTGTATGATGTCTGGGGGAGTCCCC-3’
3、所述单链DNA报告分子两端分别由荧光基团FAM与淬灭基团BHQ1修饰，具有序列特征如SEQ ID NO.3：5’FAM-TGTTCCACTAAATT-3’BHQ1；所述单链DNA报告分子作用在于结合Cas12a蛋白并被切割断裂释放荧光信号。
4、催化型发夹CH1的制备：所述发夹H序列由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分形成稳定的催化型发夹结构，如图2所示。
5、催化型发夹CH2的制备：所述发夹H2序列由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分形成稳定的催化型发夹结构，如图3所示。
6、靶标核酸分子的检测反应：1×TAE/Mg2+缓冲液中(主要成分包括：40mM Tris-HCl，15mM MgCl2，20mM冰醋酸,20mM EDTA,pH 8.0)，加入本发明所述主要组分包括0.5μM催化型发夹CH1、0.5μM催化型发夹CH2、0.2μMCas12a蛋白、0.4μM crRNA、0.5μM单链DNA报告分子，加入不同浓度的待测靶标核酸样品，补充去离子水至总体积50μl；将反应混合液置于恒温条件下，优选温度为30℃，反应时间为30分钟；采用荧光仪采集反应荧光信号，荧光仪激发波长为490nm，发射波长为518nm，每组数据平行测定三次，测定结果如图4所示。
实施例2
一种基于链置换反应的生物传感器，其为一种新型可用于核酸检测的试纸条层析显色生物传感器制备方法，使用了包括催化型发夹CH1、催化型发夹CH2、CRISPR/Cas12a蛋白、crRNA、FAM/Biotin标记的单链DNA报告分子及检测反应条件。其中，Cas12a蛋白为LbCas12a，其序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)
本实施例以诺如病毒为例描述该方法的操作步骤：
1、本实施例中设计一段可选用的诺如病毒基因特异寡核苷酸序列，其序列特征如SEQ ID NO.5：
5’-TCATCACCATAGAAGGAGAAGAGAGAATTAGCCTGTATGATGTCTGGG GACAAATTTGT-3’
依据SEQ ID NO.5序列设计crRNA，其序列特征如SEQ ID NO.4：
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCCCAGACAUCAUACAGGC-3’
2、本实施例中依据催化发夹反应原理设计可选用的发夹结构CH1与发夹结构CH2；
所述发夹结构CH1含有一段碱基对互补形成茎部结构，该结构可激活Cas12a效应蛋白的核苷酸链DNA序列；
所述发夹结构CH2含有一段碱基对互补形成茎部结构，其中一条带有悬挂支点链的序列与发夹H1环结构序列形成碱基互补配对，发夹CH2的环结构序列中包含了目标链，其作用在于在杂交反应过程中能够将与发夹CH1杂交结合的目标置换出来；
所述发夹CH1具有序列特征如SEQ ID NO1：
5’-TGATGTCTGGGGGAGTATTGCGGAGGATAGGGGACTCCCCCAGAC ATCATACAGGCTA-3’
所述发夹H2具有序列特征如SEQ ID NO2：
5’-CCCCAGACATCATAGCCTGTATGATGTCTGGGGGAGTCCCC-3’
3、所述单链DNA报告分子两端分别由荧光基团FAM与生物素Biotin修饰，具有序列特征如SEQ ID NO5：5’FAM-TGTTCCACTAAATT-3’Biotin；所述单链RNA报告分子作用在于结合Cas12a蛋白并被切割断裂释放可用于试纸条层析显色的放大信号。
4、催化发夹CH1的制备：所述发夹CH序列由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分形成稳定的催化发夹结构，如图2所示。
5、催化发夹CH2的制备：所述发夹CH2序列由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液(10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分形成稳定的催化发夹结构，如图3所示。
6、靶标核酸分子的检测反应：1×TAE/Mg2+缓冲液中(主要成分包括：40mM Tris-HCl，15mM MgCl2，20mM冰醋酸,20mM EDTA,pH 8.0)，加入本发明所述主要组分包括0.5μM催化发夹CH1、0.5μM催化发夹CH2、0.2μMCas12a蛋白、0.4μM crRNA、0.5μM单链DNA报告分子，加入不同浓度的待测靶标核酸样品，补充去离子水至总体积50μl；将反应混合液置于恒温条件下，优选温度为30℃，反应时间为30分钟；反应产物加入50μl样本稀释液，于室温下试纸条层析显色2min，肉眼进行结果判读，如图5所示，NTC为阴性，PC为阳性，阳性在T线显色，阴性样本在检测线处不显色。

Claims (10)

1.一种基于链置换反应的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括催化型发夹CH1、催化型发夹CH2、Cas12a蛋白、crRNA和ssDNA报告分子；
所述催化型发夹CH1含有一段碱基对互补形成茎部结构，该结构包被着可激活Cas12a效应蛋白的核苷酸链DNA序列，催化型发夹CH1粘性末端的单链作为支点链可与目标链杂交；
所述催化型发夹CH2含有一段碱基对互补形成茎部结构，其中一条带有悬挂支点链的序列与催化型发夹CH1环结构序列形成碱基互补配对，催化型发夹CH2的环结构序列中包含了一段目标链，其作用在于在杂交反应过程中能够将与发夹CH1杂交结合的目标链置换出来；
所述Cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的Cas12a蛋白；所述ssDNA报告分子带有荧光基团，用于荧光信号检测和可视化检测；
所述crRNA能与Cas12a以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合体产生trans切割的活性并切割荧光基团标记的ssDNA报告分子，产生荧光信号。
2.根据权利要求1所述的基于链置换反应的生物传感器，其特征在于，所述催化型发夹CH1、催化型发夹CH2、ssDNA报告分子和crRNA的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述Cas12a蛋白为LbCas12a，其序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)。
3.根据权利要求1所述的基于链置换反应的生物传感器，其特征在于，所述ssDNA报告分子的5‘端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。
4.权利要求1-3任一项所述的基于链置换反应的生物传感器在核酸检测中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的基于链置换反应的生物传感器在单链DNA或单链RNA检测中的应用。
6.一种核酸检测方法，其特征在于，包括采用权利要求1-3任一项所述的基于链置换反应的生物传感器。
7.根据权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括将待测样品与权利要求1-3任一项所述的基于链置换反应的生物传感器在反应缓冲液中混合，恒温条件下反应，反应结束后进行荧光检测。
8.根据权利要求7所述的核酸检测方法，其特征在于，在总体积50μL的反应体系中，各组分浓度如下：0.4-0.6μM催化型发夹CH1、0.4-0.6μM催化型发夹CH2、0.1-0.3μMCas12a蛋白、0.3-0.5μM crRNA、0.1-0.3μM ssDNA报告分子；所述反应缓冲液为1×TAE/Mg2+，主要成分包括：35-45mM Tris-HCl，10-20mM MgCl2，15-25mM冰醋酸，15-25mM EDTA，pH 7.5-8.5。
9.根据权利要求7所述的核酸检测方法，其特征在于，所述恒温条件为25-37℃，反应的时间为15-60min。
10.根据权利要求7所述的核酸检测方法，其特征在于，所述待测样品包括离体的血液、体液、组织或细胞。
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