CN110628888B - 一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像 - Google Patents

Abstract

本发明属于核酸检测技术领域，具体公开了一组miRNA‑21触发组装的核酸探针及其在活细胞中的检测应用，该探针的核苷酸序列包括有本发明序列1~序列6中的任意一条序列所示的DNA片段。利用该探针对靶核酸miRNA‑21的特异性识别能力，实现活细胞中DNA分子自组装，以达到荧光成像。且该探针各个模块之间相互独立，仅在靶核酸miRNA‑21触发条件下才可进行DNA分子自组装，产生荧光信号，实现靶核酸miRNA‑21的检测与成像分析。

Description

一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体公开了一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像，且该探针对靶核酸miRNA-21具有特异性识别能力，并能实现于活细胞内进行DNA分子自组装，以达到荧光成像。

背景技术

具有约20个核苷酸的短长度的MicroRNA(miRNA)是一种内源性和非编码RNA，低水平条件下可精确调节基因表达。其生物功能是通过碱基互补配对与信使RNA(mRNA)序列中3’UTR区或编码区结合从而调控靶基因的蛋白表达，在动植物发育、细胞生长分化和凋亡、代谢等生命活动过程中发挥重要调控作用。其异常表达水平与许多人类疾病(特别是癌症)相关，突出表明miRNA 是一类潜在靶标，可作为诊断生物标志物和治疗焦点。因此，对其进行高性能检测，不仅在理解RNA生理学功能方面，鉴定疾病细胞和评估疗效方面都具有重要意义。

核酸探针具有很强的特异性，利用其对miRNA进行检测是一种最有效、最直观的方法。近几年，国内外在核酸探针应用于分析领域的研究发展迅猛。Robert M.Dirks于2004年提出的杂交链式反应(HCR)在无酶等温条件下进行催化发夹自组装，以此形成稳定的线性结构达到组装效果。现代分析技术中，核酸探针分析技术已得到广泛研究和发展，为各层次生化信息获取提供检测手段，由此可见核酸探针分析技术有着深层巨大的学术价值。而探针的构建与应用是核酸探针分析技术的基础，也是分析化学工作者研究重点之一；其在多种生化对象检测分析中展现出优良的性能：如高灵敏性、高选择性等。利用核酸探针对目标物的特异性识别能力来设计DNA自组装路线与核酸序列，这对分析领域发展意义显著。

发明内容

本发明将结合分子工程技术、分子生物学手段、生化分析等前沿技术和交叉学科，通过在活细胞内构建一组miRNA-21触发组装的核酸探针，在miRNA-21 触发条件下进行自组装；实现对miRNA的荧光检测、成像监测；便于早期肿瘤细胞的检测治疗。由此，将为疾病的预测、临床诊断治疗等提供新的技术手段，将进一步推动纳米尺度和分析水平上的生化分析研究。

为实现上述目的，本发明具体实行的方案是：

先分别将荧光A链与猝灭A链、荧光B链与猝灭B链溶解在 Tris-Acetic-EDTA-Mg²⁺(TAE-Mg²⁺)缓冲液中，该缓冲液含有Tris缓冲液(40 mM，pH 8.0)，乙酸(20mM)，EDTA(2mM)和Mg(OAc)₂(12.5mM)；然后放入95℃沸水中加热5分钟后拿出室温缓慢退火，促使模块A、B的形成。采用稳态瞬态荧光光谱仪收集1：2比例的模块A、B反应后所释放的荧光光谱图，根据荧光信号响应变化来证明实验的可行性。

所述的寡核苷酸序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

所述的Mg(OAc)₂、Tris碱、乙酸、尿素、乙二胺四乙酸、硼酸和过硫酸铵从国药集团化学试剂有限公司购买；

所述的四甲基乙二胺从阿拉丁试剂(上海)有限公司购买；

所述的6×Loading buffer、丙烯酰胺制胶液从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买；

所述的SYBRTM Gold核酸染色剂、

3000Transfection Kit从invitrogen公司购买；

所述的PBS缓冲液、DMEM培养基从HyClone^TM公司购买。

本发明所述核酸探针序列设计：

(1)根据miRNA-21序列设计触发核酸探针构建的自组装过程；

(2)依据核酸探针自组装过程来设计各个反应模块；

(3)模拟测试各个反应模块的碱基互补配对结合能力。

本发明优势在于：该核酸探针可特异性地检测miRNA-21，且有很强的稳定性，对分析领域的发展意义显著。由此，将为疾病的预测、临床诊断治疗等提供新的技术手段，将进一步推动纳米尺度和分析水平上的生化分析研究。

附图说明

图1为实施例1中miRNA-21触发DNA组装的凝胶成像表征；

图2为实施例2中miRNA-21触发DNA组装的荧光响应表征；

图3为实施例3中对不同浓度miRNA-21的荧光信号响应；

图4为实施例4中对不同种类miRNA的荧光信号响应；

图5为实施例5中细胞内miRNA-21催化DNA分子组装的荧光成像；

图6为miRNA-21触发DNA组装原理图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，旨在易于理解本发明的技术方案特征，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者是等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

实施例1中miRNA-21触发DNA组装的凝胶成像表征

配制凝胶电泳成像所需的溶液：配制10％过硫酸铵溶液，放置4℃冰箱中待用；配制5xTBE缓冲溶液(PH＝8.3)；将合成好的各个探针模块置于4℃冰箱中待用。

(1)先配制好15％丙烯酰胺凝胶溶液，注胶，插梳，定型后清洗3遍上样口，并置于电泳槽中待用；

(2)分别取各个模块样品溶液7μL，6×Loading buffer 1μL和SYBRTM Gold 核酸染色剂2μL；

(3)将其混合均匀，分别加入各个上样口；

(4)在电压100V的条件下通电流90min；

(5)结束后置于凝胶电泳成像仪中成像。

结果分析：从图1(A)可以观察到其发生的组装过程，即证明了该探针构建的可行性；而图1(B)在其可行性条件成立的前提下进行时间对探针自组装过程的影响，可以看出随着时间的增加模块A、B的消耗越来越多，所显示的条带亮度越来越微弱，而产物A、B则与之相反；上样口亮度越来越亮也表明了DNA 自组装随着时间的增长而越来越多。由此可以证明该自组装过程是存在的，并且每个结构单元都在自组装过程中起着作用，随着时间的增长会促进组装构建。

实施例2中miRNA-21触发DNA组装的荧光响应表征

为了进一步验证该探针各个模块单元的作用，以及该探针自组装过程的可行性；利用标记好荧光基团与猝灭基团的模块A、B来进行荧光强度的实验探究。

(1)根据实验可行性验证的条件，固定探针浓度为100nM，依次按A:B＝1： 2往0.5mL EP管中分别加入模块A(10μM)2μL、辅助连A(10μM)4μL、模块B(10μM)4μL、辅助连B(10μM)8μL和miRNA-21(100nM)4μL 溶于终体积为200μL PBS缓冲液中；

(2)根据所需验证条件，分别加入探针的各个模块，且探针浓度一致；

(3)将混匀后的EP管置于25℃恒温反应水浴槽中孵育5h；

(4)在激发波长为542nm下测试并记录562-700nm的荧光响应信号。

结果分析：由图2模块A、B与辅助链A、B的荧光强度信背比图可以看出：(A) 其他条件不变的情况下，当反应体系中只存在模块A时荧光强度信背比是较低的；但只存在模块B时，荧光强度信背比基本保持不变；只有当两个模块同时存在的情况下，该反应体系的荧光强度信背比才会有较强响应。而(B)是对辅助链作用的探究，与(A)一致的是：单独存在一种辅助链的情况下，所达到的荧光强度信背比都较低，或没有信号响应；只有当两条辅助链同时存在条件下，该反应体系才会有较高荧光强度信号响应。由此更加可以证明该探针进行自组装过程时，每个模块与辅助链的作用是必不可少的，两者都是影响实验进行的关键。

实施例3中对不同浓度miRNA-21的荧光信号响应

观察探针对不同浓度miRNA-21荧光信号响应趋势；

(1)在最优实验条件下，对miRNA-21浓度从0至200nM进行荧光信号响应趋势探究；

(2)在激发波长为542nm下测试并记录562-700nm的荧光响应信号。

结果分析：从图3中可以看出，相同反应条件下，探针会随着miRNA-21浓度的增加呈现出信号增强趋势；荧光信号响应明显，且最低可检测浓度能达到10pM，拥有较敏感的检测能力。

实施例4中对不同种类miRNA的荧光信号响应

观察探针对不同种类miRNA的特异性识别能力；

(1)相同条件下，该核酸探针对miRNA-21，碱基错配，碱基缺失，碱基插入和随机序列的特异性荧光响应。

(2)在激发波长为542nm下测试并记录562-700nm的荧光响应信号。

结果分析：通过图4可以看出该探针对miRNA-21具有检测专一性，而对其他任何检测物都不会有明显荧光信号响应。

实施例5中细胞内miRNA-21催化DNA分子组装的荧光成像

将最佳反应体系运用于活细胞中，且对该探针的活细胞特异性识别能力检测，选取miRNA-21高表达的MCF-7细胞与正常肝细胞L0-2进行特异性识别，利用激光共聚焦成像系统对其进行荧光成像研究。

(1)先将MCF-7细胞与L0-2细胞铺于共聚焦皿上，待其生长至70％-80％左右待用；

(2)分别在两个0.5mL EP管中各加入无血清培基125μL和150μL；

(3)往125μL培基中加入3.8μL Lipofectamine^TM3000 Reagent混合待用；

(4)往150μL培基中按比例加入各个探针模块后再加入7.5μL P3000^TMReagent混合待用；

(5)将(4)与(3)混合均匀，于室温中放置10-15min；

(6)用PBS缓冲溶液将生长好的共聚焦皿清洗1-2遍后将(5)加入皿中；

(7)将其放置于细胞培养箱内转染1h后再加入700μL含血清的培基继续培养4h；

(8)成像前，用PBS缓冲溶液清洗2-3次后，加入1mL PBS缓冲液于共聚焦皿中用于成像。

结果分析：通过图5可以明显地观察到，同等反应条件下(A)具有较强的荧光信号成像；而(B)为正常肝细胞，基本没有明显的荧光信号成像；由此可以确定该核酸探针对miRNA-21具有很强的特异性识别能力，可以在活细胞中实现特异性检测。

序列表

<120> 一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像

<130> 327346687

<140> 2019105040578

<141> 2019-06-12

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgtgcctat tatgtctcct cctgtgtgcc tattatgtct cctccttcaa catcagtctg 60

ataagcta 68

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatcagactg atgttgagac ataataggca cacgacataa taggcacac 49

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcctatta tgtcgtgtgc ctattatgtc tcaaca 36

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggaggagac ataataggca cactagctta tcagactgat gttga 45

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaacatcag tctgagtgtg cctattatgt ctc 33

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcacactcag actgatgtt 19

Claims (2)

1.一组miRNA-21触发组装的核酸探针，其特征在于，该组探针为序列1~序列6所示的核苷酸序列：

序列1所代表的荧光A链：

5’-/Cy3/GTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTGTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTTC

AACATCAGTCTGATAAGCTA-3’

序列2所代表的猝灭A链：

5’-TATCAGACTGATGTTGAGACATAATAGGCACACGACATAATAGGCACAC

/BHQ2/-3’

序列3所代表的辅助A链：

5’-GTGCCTATTATGTCGTGTGCCTATTATGTCTCAACA-3’

序列4所代表的荧光B链：

5’-AGGAGGAGACATAATAGGCACACTAGCTTATCAGACTGATGTTGA

/Cy3/-3’

序列5所代表的猝灭B链：

5’-/BHQ2/TCAACATCAGTCTGAGTGTGCCTATTATGTCTC-3’

序列6所代表的辅助B链：

5’-GCACACTCAGACTGATGTT-3’。

2.根据权利要求1所述的一组miRNA-21触发组装的核酸探针，其特征在于：探针对miRNA-21具有特异性识别能力。

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