CN110628888A - 一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像 - Google Patents
一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域,具体公开了一组miRNA‑21触发组装的核酸探针及其在活细胞中的检测应用,该探针的核苷酸序列包括有本发明序列1~序列6中的任意一条序列所示的DNA片段。利用该探针对靶核酸miRNA‑21的特异性识别能力,实现活细胞中DNA分子自组装,以达到荧光成像。且该探针各个模块之间相互独立,仅在靶核酸miRNA‑21触发条件下才可进行DNA分子自组装,产生荧光信号,实现靶核酸miRNA‑21的检测与成像分析。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域,具体公开了一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像,且该探针对靶核酸miRNA-21具有特异性识别能力,并能实现于活细胞内进行DNA分子自组装,以达到荧光成像。
背景技术
具有约20个核苷酸的短长度的MicroRNA(miRNA)是一种内源性和非编码RNA,低水平条件下可精确调节基因表达。其生物功能是通过碱基互补配对与信使RNA(mRNA)序列中3’UTR区或编码区结合从而调控靶基因的蛋白表达,在动植物发育、细胞生长分化和凋亡、代谢等生命活动过程中发挥重要调控作用。其异常表达水平与许多人类疾病(特别是癌症)相关,突出表明miRNA 是一类潜在靶标,可作为诊断生物标志物和治疗焦点。因此,对其进行高性能检测,不仅在理解RNA生理学功能方面,鉴定疾病细胞和评估疗效方面都具有重要意义。
核酸探针具有很强的特异性,利用其对miRNA进行检测是一种最有效、最直观的方法。近几年,国内外在核酸探针应用于分析领域的研究发展迅猛。Robert M.Dirks于2004年提出的杂交链式反应(HCR)在无酶等温条件下进行催化发夹自组装,以此形成稳定的线性结构达到组装效果。现代分析技术中,核酸探针分析技术已得到广泛研究和发展,为各层次生化信息获取提供检测手段,由此可见核酸探针分析技术有着深层巨大的学术价值。而探针的构建与应用是核酸探针分析技术的基础,也是分析化学工作者研究重点之一;其在多种生化对象检测分析中展现出优良的性能:如高灵敏性、高选择性等。利用核酸探针对目标物的特异性识别能力来设计DNA自组装路线与核酸序列,这对分析领域发展意义显著。
发明内容
本发明将结合分子工程技术、分子生物学手段、生化分析等前沿技术和交叉学科,通过在活细胞内构建一组miRNA-21触发组装的核酸探针,在miRNA-21 触发条件下进行自组装;实现对miRNA的荧光检测、成像监测;便于早期肿瘤细胞的检测治疗。由此,将为疾病的预测、临床诊断治疗等提供新的技术手段,将进一步推动纳米尺度和分析水平上的生化分析研究。
为实现上述目的,本发明具体实行的方案是:
先分别将荧光A链与猝灭A链、荧光B链与猝灭B链溶解在 Tris-Acetic-EDTA-Mg2+(TAE-Mg2+)缓冲液中,该缓冲液含有Tris缓冲液(40 mM,pH 8.0),乙酸(20mM),EDTA(2mM)和Mg(OAc)2(12.5mM);然后放入95℃沸水中加热5分钟后拿出室温缓慢退火,促使模块A、B的形成。采用稳态瞬态荧光光谱仪收集1:2比例的模块A、B反应后所释放的荧光光谱图,根据荧光信号响应变化来证明实验的可行性。
所述的寡核苷酸序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成;
所述的Mg(OAc)2、Tris碱、乙酸、尿素、乙二胺四乙酸、硼酸和过硫酸铵从国药集团化学试剂有限公司购买;
所述的四甲基乙二胺从阿拉丁试剂(上海)有限公司购买;
所述的6×Loading buffer、丙烯酰胺制胶液从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买;
所述的SYBRTM Gold核酸染色剂、3000Transfection Kit从invitrogen公司购买;
所述的PBS缓冲液、DMEM培养基从HyCloneTM公司购买。
本发明所述核酸探针序列设计:
(1)根据miRNA-21序列设计触发核酸探针构建的自组装过程;
(2)依据核酸探针自组装过程来设计各个反应模块;
(3)模拟测试各个反应模块的碱基互补配对结合能力。
本发明优势在于:该核酸探针可特异性地检测miRNA-21,且有很强的稳定性,对分析领域的发展意义显著。由此,将为疾病的预测、临床诊断治疗等提供新的技术手段,将进一步推动纳米尺度和分析水平上的生化分析研究。
附图说明
图1为实施例1中miRNA-21触发DNA组装的凝胶成像表征;
图2为实施例2中miRNA-21触发DNA组装的荧光响应表征;
图3为实施例3中对不同浓度miRNA-21的荧光信号响应;
图4为实施例4中对不同种类miRNA的荧光信号响应;
图5为实施例5中细胞内miRNA-21催化DNA分子组装的荧光成像;
图6为miRNA-21触发DNA组装原理图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和过程,旨在易于理解本发明的技术方案特征,对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者是等效替换而形成的技术方案,均落在本发明权利保护范围之内。
实施例1中miRNA-21触发DNA组装的凝胶成像表征
配制凝胶电泳成像所需的溶液:配制10%过硫酸铵溶液,放置4℃冰箱中待用;配制5xTBE缓冲溶液(PH=8.3);将合成好的各个探针模块置于4℃冰箱中待用。
(1)先配制好15%丙烯酰胺凝胶溶液,注胶,插梳,定型后清洗3遍上样口,并置于电泳槽中待用;
(2)分别取各个模块样品溶液7μL,6×Loading buffer 1μL和SYBRTM Gold 核酸染色剂2μL;
(3)将其混合均匀,分别加入各个上样口;
(4)在电压100V的条件下通电流90min;
(5)结束后置于凝胶电泳成像仪中成像。
结果分析:从图1(A)可以观察到其发生的组装过程,即证明了该探针构建的可行性;而图1(B)在其可行性条件成立的前提下进行时间对探针自组装过程的影响,可以看出随着时间的增加模块A、B的消耗越来越多,所显示的条带亮度越来越微弱,而产物A、B则与之相反;上样口亮度越来越亮也表明了DNA 自组装随着时间的增长而越来越多。由此可以证明该自组装过程是存在的,并且每个结构单元都在自组装过程中起着作用,随着时间的增长会促进组装构建。
实施例2中miRNA-21触发DNA组装的荧光响应表征
为了进一步验证该探针各个模块单元的作用,以及该探针自组装过程的可行性;利用标记好荧光基团与猝灭基团的模块A、B来进行荧光强度的实验探究。
(1)根据实验可行性验证的条件,固定探针浓度为100nM,依次按A:B=1: 2往0.5mL EP管中分别加入模块A(10μM)2μL、辅助连A(10μM)4μL、模块B(10μM)4μL、辅助连B(10μM)8μL和miRNA-21(100nM)4μL 溶于终体积为200μL PBS缓冲液中;
(2)根据所需验证条件,分别加入探针的各个模块,且探针浓度一致;
(3)将混匀后的EP管置于25℃恒温反应水浴槽中孵育5h;
(4)在激发波长为542nm下测试并记录562-700nm的荧光响应信号。
结果分析:由图2模块A、B与辅助链A、B的荧光强度信背比图可以看出:(A) 其他条件不变的情况下,当反应体系中只存在模块A时荧光强度信背比是较低的;但只存在模块B时,荧光强度信背比基本保持不变;只有当两个模块同时存在的情况下,该反应体系的荧光强度信背比才会有较强响应。而(B)是对辅助链作用的探究,与(A)一致的是:单独存在一种辅助链的情况下,所达到的荧光强度信背比都较低,或没有信号响应;只有当两条辅助链同时存在条件下,该反应体系才会有较高荧光强度信号响应。由此更加可以证明该探针进行自组装过程时,每个模块与辅助链的作用是必不可少的,两者都是影响实验进行的关键。
实施例3中对不同浓度miRNA-21的荧光信号响应
观察探针对不同浓度miRNA-21荧光信号响应趋势;
(1)在最优实验条件下,对miRNA-21浓度从0至200nM进行荧光信号响应趋势探究;
(2)在激发波长为542nm下测试并记录562-700nm的荧光响应信号。
结果分析:从图3中可以看出,相同反应条件下,探针会随着miRNA-21浓度的增加呈现出信号增强趋势;荧光信号响应明显,且最低可检测浓度能达到10pM,拥有较敏感的检测能力。
实施例4中对不同种类miRNA的荧光信号响应
观察探针对不同种类miRNA的特异性识别能力;
(1)相同条件下,该核酸探针对miRNA-21,碱基错配,碱基缺失,碱基插入和随机序列的特异性荧光响应。
(2)在激发波长为542nm下测试并记录562-700nm的荧光响应信号。
结果分析:通过图4可以看出该探针对miRNA-21具有检测专一性,而对其他任何检测物都不会有明显荧光信号响应。
实施例5中细胞内miRNA-21催化DNA分子组装的荧光成像
将最佳反应体系运用于活细胞中,且对该探针的活细胞特异性识别能力检测,选取miRNA-21高表达的MCF-7细胞与正常肝细胞L0-2进行特异性识别,利用激光共聚焦成像系统对其进行荧光成像研究。
(1)先将MCF-7细胞与L0-2细胞铺于共聚焦皿上,待其生长至70%-80%左右待用;
(2)分别在两个0.5mL EP管中各加入无血清培基125μL和150μL;
(3)往125μL培基中加入3.8μL LipofectamineTM3000 Reagent混合待用;
(4)往150μL培基中按比例加入各个探针模块后再加入7.5μL P3000TMReagent混合待用;
(5)将(4)与(3)混合均匀,于室温中放置10-15min;
(6)用PBS缓冲溶液将生长好的共聚焦皿清洗1-2遍后将(5)加入皿中;
(7)将其放置于细胞培养箱内转染1h后再加入700μL含血清的培基继续培养4h;
(8)成像前,用PBS缓冲溶液清洗2-3次后,加入1mL PBS缓冲液于共聚焦皿中用于成像。
结果分析:通过图5可以明显地观察到,同等反应条件下(A)具有较强的荧光信号成像;而(B)为正常肝细胞,基本没有明显的荧光信号成像;由此可以确定该核酸探针对miRNA-21具有很强的特异性识别能力,可以在活细胞中实现特异性检测。
序列表
<120> 一组miRNA-21触发组装的核酸探针及细胞荧光成像
<130> 327346687
<140> 2019105040578
<141> 2019-06-12
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgtgcctat tatgtctcct cctgtgtgcc tattatgtct cctccttcaa catcagtctg 60
ataagcta 68
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatcagactg atgttgagac ataataggca cacgacataa taggcacac 49
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgcctatta tgtcgtgtgc ctattatgtc tcaaca 36
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggaggagac ataataggca cactagctta tcagactgat gttga 45
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaacatcag tctgagtgtg cctattatgt ctc 33
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacactcag actgatgtt 19
Claims (3)
1.一组miRNA-21触发组装的核酸探针,其特征在于:该探针主要由两个模块单元A和B与两条辅助链A-A和A-B所组成;而模块单元分别由一条修饰荧光基团和另一条修饰猝灭基团的DNA序列通过碱基互补配对组成,且模块上带有与传统发夹相似的颈环结构;通过靶核酸miRNA-21的触发,先打开模块A上第一个颈环结构,在引入辅助链A-A情况下将进一步打开第二个颈环结构,从而负载并触发模块B颈环结构的开启;而两个模块之间可以相互负载触发反应的进一步发展,进而促使DNA组装延续生长。
2.本发明所述探针的核苷酸序列包括以下序列1~序列6中任意一条序列所示的DNA片段:
序列1所代表的荧光A链:5’-/Cy3/GTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTGTGTGCCTATTATGTCTCCTCCTTC
AACATCAGTCTGATAAGCTA-3’
序列2所代表的猝灭A链:5’-TATCAGACTGATGTTGAGACATAATAGGCACACGACATAATAGGCACAC
/BHQ2/-3’
序列3所代表的辅助A链:
5’-GTGCCTATTATGTCGTGTGCCTATTATGTCTCAACA-3’
序列4所代表的荧光B链:
5’-AGGAGGAGACATAATAGGCACACTAGCTTATCAGACTGATGTTGA
/Cy3/-3’
序列5所代表的猝灭B链:
5’-/BHQ2/TCAACATCAGTCTGAGTGTGCCTATTATGTCTC-3’
序列6所代表的辅助B链:
5’-GCACACTCAGACTGATGTT-3’。
3.本发明所设计的核酸探针,其特征在于:只针对miRNA-21具有特异性识别能力。
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