CN109913534A - 一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，该检测方法包括如下步骤：(1)根据第一个目标物miRNA序列设计DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1，根据第二个目标物miRNA序列设计DNA发卡信号链H2和DNA发卡燃料链F2，所述发卡信号链H1和H2分别修饰6‑羧基荧光素(FAM)和羧基四甲基罗丹明(TMR)并且组装在同一个纳米金表面；(2)在目标miRNA存在时引发级联催化发夹组装反应；(3)FAM和TMR相互靠近发生荧光共振能量转移效应，实现miRNA荧光定量分析。该检测方法灵敏度高，特异性好，稳定性强，操作简单，为miRNA检测提供了新方法。
Description
技术领域
本发明属于核酸杂交检测领域，具体涉及一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法。
背景技术
MiRNAs是一系列由内源基因编码的单链，小(大约19-25个核苷酸)的非编码RNA，miRNA因其在进化上高度保守的特性可以作为基因表达的关键控制因子，通常在转录后水平调控细胞的增殖、分化、凋亡、代谢等过程。由于miRNA能够很好地识别并配对后转录基因进而调控蛋白的表达，所以它与动物体内的生物过程息息相关。大量的研究表明miRNA作为生物标志物与多种疾病的病理生理过程密切相关，miRNA的异常行为会导致疾病的出现，包括心血管疾病，肝肾损伤，神经发育失常，甚至癌症。[Nature，2012，482，347.]所以在疾病的诊断以及治疗过程中miRNA的浓度都是一个重要的生物指标。
目前为止，通用的miRNA检测方法包括：Northern Blotting印迹法，miRNA微阵列荧光检测法，和qRT-PCR。[Chem.Rev.，2013，113，6207.]其中Northern Blotting印迹法是最经典的miRNA检测手段，但是它本身步骤繁琐，检测灵敏度较低，耗时长，并且需要大量的样品。而miRNA微阵列荧光检测法，虽然可以实现高通量检测，但该方法的重现性和精密度较差。qRT-PCR检测方法具有高灵敏度，高精度的特点，但是步骤繁琐，实验条件要求严格，并且对操作人员具有一定的技能要求。这些方法常常需要昂贵的仪器，复杂的操作，对miRNA进行标记等，无法满足miRNA床边检测的要求：不需要标记，在检测非常少的样品中miRNA具有足够高的灵敏度和选择性，能够很好地区分miRNA家族中1-2碱基的错配，廉价且便携适用于小型临床等。
DNA分子信标修饰的纳米金探针可以实现对miRNA进行简单快速高灵敏地检测，分子信标与目标miRNA分子配对后发生结构的转变会引起荧光信号的出现，最终实现miRNA的检测。[Chem.Commun.，2016，52，4569]但是这些技术中存在一个明显的问题，每一次信号分子的输出都伴随着目标分子的消耗，而miRNA分子表达往往十分有限，所以上述的技术在实现miRNA分子的检测具有很大的限制。
因此，为了克服现有技术中miRNA分子检测的困难，本发明人发现利用级联的DNA链循环反应实现两种miRNA同时检测的方法，该检测方法具有较高的选择性和特异性，操作简单等特点，为建立快速简便的新型miRNA检测方法提供了新思路。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，解决了现有技术中的检测方法需要大量的目标miRNA等缺点。
本发明提供一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法：(1)根据第一个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1，根据第二个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H2和DNA发卡燃料链F2；(2)将所述的DNA发卡信号链H1和H2组装到球形纳米金表面；(3)将两个目标miRNA与所述球形纳米金表面的所述DNA发卡信号链杂交；(4)体外荧光定量分析。
通过上述简单的步骤，本发明提供了一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，该方法操作简单、不需要对目标miRNA进行标记和PCR扩增，具有成本低廉等优势。
在所述步骤(1)中，所述的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2的5’端修饰有巯基和10个T碱基，所述的DNA发卡信号链H1的3’端修饰6-羧基荧光素(FAM)，所述的DNA发卡信号链H2的3’端修饰羧基四甲基罗丹明(TMR)。所述的DNA信号链H1，DNA信号链H2，DNA燃料链H1，DNA燃料链H2均通过分子内退火杂交的方法形成发卡结构。通过调整DNA发卡信号链和DNA发卡燃料链上的识别区域，本发明所提供的方法可以根据目标miRNA的碱基进行适应性调整，从而满足各种不同的检测要求。
在所述步骤(2)中，所述的球形纳米金粒径为15nm，将具有荧光素的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2组装到球形纳米金表面，由于球形纳米金的荧光淬灭作用，FAM和TMR的荧光被淬灭，通过该步骤，背景荧光得以降低，从而提高灵敏度。
在所述步骤(2)中，所述的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2通过巯基和金之间的金硫键组装到球形纳米金表面，即为设计的纳米探针，该金硫键可将信号链牢牢地固定于球形纳米金表面，无需其他辅助分子维持信号链在界面上的形态和取向。
在所述步骤(2)中，所述的DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间的摩尔比经过优化为1∶4。
在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA引发级联催化发夹组装反应，目标miRNA打开DNA发卡信号链，DNA信号链未与目标miRNA结合的部分打开DNA发卡燃料链，DNA信号链与DNA燃料链杂交后将目标miRNA竞争下来，目标miRNA与下一个DNA发卡信号链杂交，开启新一轮循环反应。
在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA与DNA发卡信号链之间、所述的DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间杂交均为完全互补杂交，即DNA发卡信号链不具有缺口地与目标miRNA互补，DNA发卡信号链不具有缺口地与DNA发卡燃料链互补，利用核酸之间的氢键作用以及DNA之间的碱基堆积作用增强了杂交反应的稳定性。
在所述步骤(3)中，第一个目标miRNA与DNA发卡信号链H1结合、第二个目标miRNA与DNA发卡信号链H2结合后，FAM荧光供体和TMR荧光受体之间会产生荧光共振能量转移信号，当目标miRNA不存在时，DNA发卡信号链不会被打开，FAM和TMR之间不产生荧光共振能量转移信号。
在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA的浓度为0.01-250nM。
在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA的序列选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10。当所述miRNA的序列选自SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：8时，本发明的方法能够很好地区分miRNA-21家族和miRNA-200c家族中的单碱基错配，具有良好的特异性。当所述miRNA的序列选自SEQ ID NO：9-SEQ ID NO：10时，具有良好的选择性。
在所述步骤(4)中，将目标miRNA与纳米探针在37℃恒温孵育1h，反应后取200μL到全黑96孔板中，荧光信号的测定使用荧光酶标仪，激发波长为492nm，分别在518nm和582nm处收集荧光发射信号。步骤简单，检测方法成本低廉。
总之，本方法所提供的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法是一种高灵敏度的检测miRNA的方法，从而解决了现有技术中需要大量的测试样品(miRNA)的难点，并且检测的特异性好，选择性高，能够很好地区分同组的miRNA的碱基错配。与利用单链DNA探针相比，本发明的方法稳定性更高。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明的原理示意图；
图2为本发明实施例所述的反应可行性的聚丙烯酰胺凝胶电泳成像图
其中：泳道1：miRNA-21；泳道2：DNA发卡信号链H1；泳道3：DNA发卡燃料链F1；泳道4：DNA发卡信号链H1+DNA发卡燃料链F1；泳道5：DNA发卡信号链H1+DNA发卡燃料链F1共退火；泳道6：miRNA-21+DNA发卡信号链H1共退火；泳道7：miRNA-21+DNA发卡信号链H1在37℃共孵育2h；泳道8：miRNA-21、DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1共退火；泳道9：miRNA-21、DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1在37℃共孵育2h；
图3为发明实施例所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针的灵敏度和检测限荧光光谱图
其中：(A)为基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针的miRNA检测灵敏度分析；(B)为基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针对不同浓度miRNA-21的响应关系；(C)为基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针对不同浓度miRNA-200c的响应关系；
图4为发明实施例所述的单核苷酸多态性检验的聚丙烯酰胺凝胶电泳成像图
其中：泳道1：完全互补配对的miRNA-21；泳道2：单碱基错配的miRNA-21；泳道3：单碱基插入的miRNA-21；泳道4：单碱基缺失的miRNA-21；泳道5：DNA发卡信号链H1；泳道6：DNA发卡燃料链F1；泳道7：完全互补配对的miRNA-21、DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1共退火；泳道8：完全互补配对的miRNA-21、DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1在37℃共孵育2h；泳道9：单碱基错配的miRNA-21、DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1在37℃共孵育2h；泳道10：单碱基插入的miRNA-21、DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1在37℃共孵育2h；泳道11：单碱基缺失的miRNA-21、DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1在37℃共孵育2h；
图5为发明实施例所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针的选择性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
该实施例同时检测的两个目标miRNA，第一个目标miRNA以miRNA-21为例，第二个目标miRNA以miRNA-200c为例。
基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，该检测方法包括如下步骤：
(1)根据第一个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1，根据第二个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H2和DNA发卡燃料链F2；
(2)将所述的DNA发卡信号链H1和H2组装到球形纳米金表面；
(3)将两个目标miRNA与所述球形纳米金表面的所述DNA发卡信号链杂交；
(4)体外荧光定量分析。
hsa-miR-21(从左到右为5’-3’)：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO：1)
hsa-miR-200c(从左到右为5’-3’)：UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA(SEQ ID NO：2)
DNA发卡信号链H1(从左到右为
5’-3’)：TTTTTTTTTTTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACTG-FAM(SEQ ID NO：11)
DNA发卡燃料链F1(从左到右为5’-3’)：
ATAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTGCCATGTGTAGA(SEQ ID NO：12)
DNA发卡信号链H2(从左到右为5’-3’)：
TTTTTTTTTTTTCCATCATTACCCGGCAGTATTACCATGTGTAGATAATACTGCCGGGTAA-TMR(SEQID NO：13)
DNA发卡燃料链F2(从左到右为5’-3’)：
CAGTATTATCTACACATGGTAATACTGCCGGGTAACCATGTGTAGA(SEQ ID NO：14)
所述步骤(1)的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2的5’端修饰有巯基和10个T碱基，DNA发卡信号链H1的3’端修饰荧光素FAM，DNA发卡信号链H2的3’端修饰荧光素TMR。所述的DNA信号链H1，DNA信号链H2，DNA燃料链H1，DNA燃料链H2在1×TAE缓冲液条件下在95℃加热5分钟，然后立即放入冰水中30分钟，然后在室温下继续使用，形成发卡结构。
所述步骤(2)的球形纳米金通过经典的柠檬酸钠还原法制得，粒径为15nm，将具有荧光素的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2组装到球形纳米金表面，由于球形纳米金的荧光淬灭作用，FAM和TMR的荧光被淬灭，通过该步骤，背景荧光得以降低，从而提高灵敏度。DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2通过巯基和金之间的金硫键组装到球形纳米金表面，即为设计的纳米探针，该金硫键可将信号链牢牢地固定于球形纳米金表面，无需其他辅助分子维持信号链在界面上的形态，取向。所述的DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间的摩尔比为1∶4。
所述步骤(3)的过程如下：目标miRNA引发级联催化发夹组装反应，目标miRNA打开DNA发卡信号链，DNA信号链未与目标miRNA结合的部分打开DNA发卡燃料链，DNA信号链与DNA燃料链杂交后将目标miRNA竞争下来，目标miRNA与下一个DNA发卡信号链杂交，开启新一轮循环反应。第一个目标miRNA与DNA发卡信号链H1结合、第二个目标miRNA与DNA发卡信号链H2结合后，FAM荧光供体和TMR荧光受体之间会产生荧光共振能量转移信号，当目标miRNA不存在时，DNA发卡信号链不会被打开，FAM和TMR之间不产生荧光共振能量转移信号。目标miRNA与DNA发卡信号链之间、DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间杂交均为完全互补杂交，利用核酸之间的氢键作用以及DNA之间的碱基堆积作用增强了杂交反应的稳定性。
所述步骤(4)的分析方法如下：在反应体系中包含1×TAE缓冲液，加入最终浓度为5nM的纳米探针，将浓度依次为0nM，0.01nM，0.5nM，2nM，5nM，10nM，20nM，30nM，50nM，100nM，150nM，250nM的目标miRNA-21和目标miRNA-200c恒温培养1h，反应后取200μL到全黑96孔板中，荧光信号的测定使用荧光酶标仪，激发波长为492nm，分别在518nm和582nm处收集荧光发射信号，平行测定三次，分别计算518nm处和582nm处荧光信号强度的平均值和标准差，荧光谱图见图3。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
为验证反应的可行性，我们进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。制胶过程在室温下进行，电泳过程在冰水浴环境中进行，电泳分析使用20％的聚丙烯酰胺凝胶和0.5×TBE缓冲液(45mM Tris，45mM Boric Acid，10mM EDTA，pH 8.0)，用4μL SYBR Gold进行染色。样品混合液中核酸的终浓度0.5μM，加样孔中加入2μL样品混合液。在100V电压下电泳90分钟。电泳结束后，用BIO-RAD ChemiDoc XRS凝胶成像系统观察条带并拍照，具体结果见图2。
基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针的体外检测
我们选取荧光共振能量转移信号的改变强度来考察纳米探针的检测性能。图3(A)描述的是基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针在不同的目标miRNA-21浓度和不同的目标miRNA-200c浓度下的荧光光谱曲线。由图可知，荧光共振能量转移信号强度随着目标浓度在0.01nM到250nM范围内逐渐增加。该现象说明，随着目标浓度的增大，引发的级联催化发夹组装反应越多，产生的荧光共振能量转移信号越强。图3(B)为基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针对不同浓度miRNA-21的响应关系，根据3σ规则计算得到的检测限为24.7pM，灵敏度较高；图3(C)为基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针对不同浓度miRNA-200c的响应关系，根据3σ规则计算得到的检测限为20.8pM，灵敏度较高。上述结果表明本实验方法可以用于miRNA-21和miRNA-200c的高灵敏的同时检测。
基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针的特异性和选择性
单碱基错配hsa-miR-21(从左到右为5’-3’)：UAGCUUAUCAUACUGAUGUUGA(SEQ IDNO：3)
单碱基插入hsa-miR-21(从左到右为5’-3’)：UAGCUUAUCAGUACUGAUGUUGA(SEQ IDNO：4)
单碱基缺失hsa-miR-21(从左到右为5’-3’)：UAGCUUAUCAACUGAUGUUGA(SEQ IDNO：5)
单碱基错配hsa-miR-200c(从左到右为5’-3’)：UAAUACUGCCGUGUAAUGAUGGA(SEQID NO：6)
单碱基插入hsa-miR-200c(从左到右为5’-3’)：UAAUACUGCCGGUGUAAUGAUGGA(SEQID NO：7)
单碱基缺失hsa-miR-200c(从左到右为5’-3’)：UAAUACUGCCGGUAAUGAUGGA(SEQ IDNO：8)
hsa-miR-16(从左到右为5’-3’)：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG(SEQ ID NO：9)
hsa-miR-155(从左到右为5’-3’)：UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU(SEQ ID NO：10)
为了考察本纳米探针的应用潜力，我们对其的特异性和选择性进行了评估。在图4的结果中，泳道8-11可以看出，当目标miRNA与信号链完全互补配对时，循环反应可行，并且最终形成H1-F1复合物，而当目标miRNA与信号链没有完全互补配对时，循环放大反应将不会被开启，说明探针具备区分单碱基错配的能力。图5的结果显示，当存在完全配对的miR-21和miR-200c时，同时显示FAM和TMR的发射峰；当只有miR-21或者存在完全互补配对的miR-21和单碱基错配的miR-200c时，只显示FAM的发射峰，并且由于未发生荧光共振能量转移，该峰值较高；当只有miR-200c或者存在完全互补配对的miR-200c和单碱基错配的miR-21时，只显示TMR的发射峰，并且由于未发生荧光共振能量转移，没有荧光供体，该处峰值较小。因此，这种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的探针可以有效地用于区分miR-21和miR-200c。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：(1)根据第一个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H1和DNA发卡燃料链F1，根据第二个目标miRNA序列设计DNA发卡信号链H2和DNA发卡燃料链F2；(2)将所述的DNA发卡信号链H1和H2组装到球形纳米金表面；(3)将两个目标miRNA与所述球形纳米金表面的所述DNA发卡信号链杂交；(4)体外荧光定量分析。
2.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2的5’端修饰有巯基和10个T碱基，所述的DNA发卡信号链H1的3’端修饰6-羧基荧光素(FAM)，所述的DNA发卡信号链H2的3’端修饰羧基四甲基罗丹明(TMR)。
3.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述的DNA信号链H1，DNA信号链H2，DNA燃料链H1，DNA燃料链H2均通过分子内退火杂交的方法形成发卡结构。
4.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的球形纳米金的粒径为15nm，通过巯基和纳米金之间的金硫键将所述的DNA发卡信号链H1和DNA发卡信号链H2组装到球形纳米金表面，即为设计的纳米探针。
5.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述的DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间的摩尔比为1∶4。
6.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA引发级联催化发夹组装反应，目标miRNA打开DNA发卡信号链，DNA信号链未与目标miRNA结合的部分打开DNA发卡燃料链，DNA信号链与DNA燃料链杂交后将目标miRNA竞争下来，目标miRNA与下一个DNA发卡信号链杂交，开启新一轮循环反应。
7.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA与DNA发卡信号链之间、所述的DNA发卡信号链与DNA发卡燃料链之间杂交均为完全互补杂交。
8.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，第一个目标miRNA与DNA发卡信号链H1结合、第二个目标miRNA与DNA发卡信号链H2结合后，FAM荧光供体和TMR荧光受体之间会产生荧光共振能量转移信号，当目标miRNA不存在时，DNA发卡信号链不会被打开，FAM和TMR之间不产生荧光共振能量转移信号。
9.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA的浓度为0.01-250nM。
10.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的目标miRNA的序列选自：SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。
11.如权利要求1所述的基于级联DNA链循环反应和荧光共振能量转移效应的两种miRNA同时检测的方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，将目标miRNA与最终浓度为5nM的纳米探针在37℃恒温孵育1h，反应后取200μL到全黑96孔板中，荧光信号的测定使用荧光酶标仪，激发波长为492nm，分别在518nm和582nm处收集荧光发射信号。
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