CN104928390B - 一种MicroRNA的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种MicroRNA的检测方法，通过修饰有聚集诱导发光化合物(AIE分子)的DNA探针分子与待测的MicroRNA相结合，在DNA外切酶Ⅲ的作用下，探针中亲水的脱氧核糖核酸会被水解，剩余的疏水性AIE物质会聚集发光，靶标MicroRNA会释放出来，再次与探针结合，探针再次被水解，循环多次后荧光增强，从而检测出MicroRNA。本发明还公开了一种应用该方法检测miR‑21的探针分子及试剂盒。本发明的方法用于MicroRNA的检测，速度快、检测限低；用于该检测方法的探针，工艺简单、成本低廉。

Description

一种MicroRNA的检测方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种MicroRNA的检测方法。

背景技术

MicroRNA是一类长度为17～25nt的单链非编码RNA，平均长度22nt，在植物和动物中广泛存在，具有很广泛的调控作用，是高等植物、动物生长发育的重要调节因子，进化上高度保守。1993年Lee及其同事首先在秀丽杆线虫机体内确认第一个MicroRNA(Lin-4)，此后随着高通量测序、生物信息学等技术的发展，大量MicroRNA被陆续发现。MicroRNA在各种生物中普遍存在，到2009年初在各个物种中总共已经发现了约8000种MicroRNA，包括人类中的近700种MicroRNA。MicroRNA能够通过与靶MicroRNA的特异性碱基配对引起靶MicroRNA的降解或者翻译抑制，在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及疾病的发生，尤其是肿瘤的发生发展中起着重要的作用。MicroRNA的异常表达与各种疾病状态有着至关重要的联系，对MicroRNA的早期诊断对疾病的早期治疗非常有帮助，例如，最近几年的各种癌症，包括大肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌等。BCL2、RAS等癌基因可受到MicroRNA的抑制，而某些MicroRNA可充当癌基因的角色。

miR-21作为这类MicroRNA中的一种，近年来引起了人们的极大重视。miR-21在人类多种组织中高表达，通过作用于多种靶基因，参与细胞增殖、分化、凋亡，与肿瘤生长、侵袭、转移、耐药等密切相关。miR-21作为一类具有重要调控作用的内源性小MicroRNA分子广泛参与了机体多种生物学过程的调控。由于miR-21几乎参与了肿瘤发生发展的每一步过程，所以miR-21在肿瘤的诊断、预后、对化疗药物的疗效预测以及治疗的新靶点方面均有很好的应用前景。因此，对miR-21的检测也在癌症诊疗中起着重要作用。

荧光探针在MicroRNA的定性和定量检测中是一种非常重要的工具，根据靶标物(MicroRNA)和探针(DNA探针和RNA探针)的比例分为两大类，一类是1:1比例的，一个靶标只能与一个探针结合；第二类是1:N(N>1)比例的,等温扩增技术就是其中的一种。然而，上述实验中的所有探针均修饰了荧光基团和猝灭基团，双标修饰增加了探针设计的困难和合成的难度，从而导致增大错误信号出现的可能性，所以探针结构的简化是解决以上现实中限制问题的途径之一。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种MicroRNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将待测MicroRNA、RNA重组酶抑制剂、石墨烯以及探针分子加入缓冲液在25℃～37℃温度下进行反应，使所述探针分子和所述待测MicroRNA充分结合；所述探针分子为5’端修饰有聚集诱导发光化合物(AIE分子)的DNA序列；

步骤二：将DNA外切酶Ⅲ加入缓冲液后，4℃～37℃下充分反应检测缓冲液的荧光强度，即可得到所述待测MicroRNA的检测结果；

所述缓冲液含有1×DNA外切酶Ⅲ缓冲液，以及生理盐水浓度的NaCl。

优选地，所述探针分子在缓冲液中的浓度为1μM～10μM。

优选地，所述AIE分子为2-(4-(苄基叠氮)苯基-1,1,2-三苯基乙烯，结构式如式I所示

作为进一步优选地，步骤二中所述荧光检测的发射波长为420nm～460nm。

作为进一步优选地，当MicroRNA浓度较低时，步骤二中可通过降低反应温度、延长反应时间来实现荧光效果的增强，此时步骤二中的反应条件为4℃下反应3天，对所述待测MicroRNA的最低检测限为100aM(10^-16mol/L)。

作为进一步优选地，所述探针分子的结构式如式Ⅲ所示，用于检测miR-21

按照本发明的另一方面，还提供了一种用于该方法的探针分子，其特征在于，所述探针分子的结构式如式Ⅲ所示

本发明还提供了一种式Ⅲ所示探针分子的合成方法，其特征在于，合成路线如下

上述合成方法的优选条件为：

式I化合物和式Ⅱ化合物在溴化亚铜和抗坏血酸钠的催化下，通过点击反应，再通过反向高效液相色谱纯化得到式Ⅲ所示的探针分子；其中，式I化合物、式Ⅱ化合物、溴化亚铜和抗坏酸钠的摩尔比为10:1:11.5:23；反应条件为温度为25℃～30℃，无氧环境下搅拌反应24小时左右。

按照本发明的另一方面，还提供了一种包括式Ⅲ所示的探针分子的试剂盒，其特征在于，用于检测miR-21。

优选的，该试剂盒还包括RNA重组酶抑制剂、石墨烯溶液、DNA外切酶Ⅲ缓冲液、NaCl溶液、无RNA酶水以及DNA外切酶Ⅲ。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于利用AIE分子的聚焦荧光增强效应，用于标记DNA探针分子，能够取得下列有益效果：

1、利用MicroRNA可以和探针分子循环反应累计荧光的效果，提高了反应灵敏度；检测100nM的RNA样本时，37℃下反应40分钟内即可检测出明显的荧光；4℃温度下反应3天时，可检测出浓度最低为100aM(10^-16mol/L)的样本。

2、本发明中所用的探针只修饰荧光基团，合成简单，廉价，可降低MicroRNA检测的成本；

3、通过设计适当的探针核苷酸序列和选择适当的荧光基团进行标记，实现了对低浓度的miR-21的定性检测，在癌症诊疗中具有应用前景。

附图说明

图1是按照本发明方法检测miR-21的原理图。

图2是实施例1中特定时刻的荧光强度跟零时刻荧光强度的比值的关系图。

图3是实施例1与对比例的荧光强度对比。

图4是不同浓度的miR-21荧光强度检测结果。

图5是实例7用中检测实际样品的结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

根据miR-21的序列(SEQ NO:2)设计DNA序列如SEQ NO:1的探针分子，并在5’端修饰上炔基，与2-(4-(苄基叠氮)苯基-1,1,2-三苯基乙烯在溴化亚铜和抗坏血酸钠的催化下进行反应，合成路线如下：

反应中，式Ⅱ化合物:式I化合物:溴化亚铜:抗坏酸钠＝1:10:11.5:23(摩尔比)；反应条件：无氧环境，温度为25℃～30℃，搅拌24小时左右。反应产物通过反向高效液相色谱纯化，最后通过质谱测试表征得到分子结构如式Ⅲ所示的探针分子。

实施例2

步骤一：以合成的miR-21为待测物，配置成100nM的溶液。向一个1.5mL离心管中分别加入23μL无RNA水、5μL NaCl溶液(500mM)、5μL探针分子(100μM)、0.5μL RNA重组酶抵制剂(40U/μL)、5μLmiR-21(100nM)、5μL石墨烯溶液、5μL 10×DNA外切酶Ⅲ缓冲液，37℃水浴反应30分钟；

步骤二：加入1.5μL DNA外切酶Ⅲ(200U/μL)后,立即测量荧光值；然后在温度为37℃时，每隔3分钟测一次荧光值，得到的荧光强度随时间变化的曲线如图2，其荧光光谱测量条件为：激发狭缝和发射狭缝均为5nm，电压是600v，激发波长是350nm，发射扫描范围为400～600nm，用50μL石英比色皿进行测量。

实施例3

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤一中miR-21的浓度为100aM(10^{- 16}mol/L)；步骤二中的反应温度为加4℃，3天后测量荧光强度。

实施例4

以所述的相同步骤重复实施例2，区别在于，miR-21的浓度为1000aM(10^-15mol/L)。

实施例5

以所述的相同步骤重复实施例2，区别在于，miR-21的浓度为10fM(10^-14mol/L)。

实施例6

以所述的相同步骤重复实施例2，区别在于，步骤一中以5μL的无RNA水取代miR-21样品。

实施例7

利用Urine microRNA Purification Kit试剂盒(Product#29000)从病人的尿液提取20～25nt的短MicroRNA作为待检测样品。病人均来自于南昌，其中一女八男，平均年龄在62岁，都被诊断为膀胱癌症。

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，以相同体积的待检测样品替代合成的miR-21，步骤二中加入1.5μL DNA外切酶Ⅲ(200U/μL)后,在37℃温度下反应30分钟，测量荧光强度。

实施例8

一种用于检测miR-21的试剂盒，包括：反应试剂100份、阳性对照样本和阴性对照样本。阳性对照样本为10^-16mol/L、10^-14mol/L、10^-12mol/L、10^-10mol/L、10^-9mol/L、10^-8mol/L、10^-7mol/L的miR-21共7份；阴性对照为无RNA酶水。

其中，每一份反应试剂包括：100μM探针分子5μL、40U/μL RNA重组酶抵制剂0.5μL、0.5mg/mL石墨烯溶液5μL、10×DNA外切酶Ⅲ缓冲液5μL、500mM的NaCl溶液5μL、无RNA酶水23μL以及200U/μL DNA外切酶Ⅲ1.5μL。

使用时，按实施例7所述的相同步骤进行，并以阳性对照和阴性对照样本对荧光强度结果进行对比验证。

对比例1

以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，步骤二中以无RNA酶水取代DNA外切酶Ⅲ，在37℃水浴反应40分钟后，测量荧光强度，测量条件与实施例1相同。

对比例2

以所述的相同步骤重复对比例1，区别在于，步骤二中以Bst 2.0DNA聚合酶取代无RNA酶水。

对比例3

以所述的相同步骤重复对比例1，区别在于，步骤二中以凝血酶取代无RNA酶水。

图1是按照本发明方法定量检测miR-21的原理图。

图2是实施例2中荧光检测时间与特定时刻的荧光强度跟零时刻荧光强度的比值的关系图，可以看出，反应30分钟后即可检测出明显的荧光，40分钟荧光强度即达到最大值并趋于平稳。

图3是实施例2与对比例1-3的荧光强度。可以看出，只有加入DNA外切酶Ⅲ的反应体系才检测出了明显荧光值，这验证了DNA外切酶Ⅲ对荧光探针的放大效果。

图4是实施例3-6中不同浓度的miR-21样本的荧光强度检测结果，当miR-21浓度为100aM时，即可检测出明显的荧光强度变化，且浓度越高，荧光值越强，说明该方法能对RNA的浓度进行检测，并且检测限为100aM。

图5是用实施例7中该发明方法检测实际样品的结果。可以看出该方法的可靠性很好，同时也验证了在发射波长在420nm～460nm的范围内都有较好的检测效果，而发射波长为430nm的情况下荧光最为明显。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种非诊断目的的MicroRNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将待测MicroRNA、RNA重组酶抑制剂、石墨烯以及探针分子加入缓冲液在25℃～37℃温度下进行反应，使所述探针分子和所述待测MicroRNA充分结合；所述探针分子为5’端修饰有聚集诱导发光化合物的DNA序列；所述聚集诱导发光化合物为AIE分子；

步骤二：将DNA外切酶Ⅲ加入缓冲液后，4℃～37℃下充分反应检测缓冲液的荧光强度，即得到所述待测MicroRNA的检测结果；

所述步骤一中AIE分子为2-(4-(苄基叠氮)苯基-1,1,2-三苯基乙烯，结构式如式I所示：

所述步骤一中探针分子的结构式如式Ⅲ所示：

2.如权利要求1所述非诊断目的的MicroRNA的检测方法，其特征在于，所述探针分子在缓冲液中的浓度为1μM～10μM。

3.如权利要求1所述非诊断目的的MicroRNA的检测方法，其特征在于，步骤二中所述荧光检测的发射波长为420nm～460nm。

4.如权利要求1所述非诊断目的的MicroRNA的检测方法，其特征在于，步骤二中的反应温度为4℃，对所述待测MicroRNA的最低检测限为100aM。

5.一种用于如权利要求1所述检测方法的探针分子，其特征在于，所述探针分子的结构式如式Ⅲ所示

6.一种合成如权利要求5所述探针分子的方法，其特征在于，合成路线如下

7.一种包括如权利要求5所述探针分子的试剂盒，其特征在于，用于检测miR-21。

8.如权利要求7所述试剂盒，还包括RNA重组酶抑制剂、石墨烯溶液、DNA外切酶Ⅲ缓冲液、NaCl溶液、无RNA酶水以及DNA外切酶Ⅲ。