CN110592186B - 一种and分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用 - Google Patents

一种and分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110592186B
CN110592186B CN201910822725.1A CN201910822725A CN110592186B CN 110592186 B CN110592186 B CN 110592186B CN 201910822725 A CN201910822725 A CN 201910822725A CN 110592186 B CN110592186 B CN 110592186B
Authority
CN
China
Prior art keywords
logic gate
mirna
sensing system
dna
strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910822725.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110592186A (zh
Inventor
刘亚青
吴浩天
王硕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN201910822725.1A priority Critical patent/CN110592186B/zh
Publication of CN110592186A publication Critical patent/CN110592186A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110592186B publication Critical patent/CN110592186B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种AND分子逻辑门传感体系，所述体系包括：由三条i、j、g单链DNA经高温退火形成的具有分子信标结构的MB1、MB2、MB3，及由三条单链DNA，即e、h、f杂交形成的探针复合物HC；其中f链DNA标记有荧光探针Cy5，h链DNA标记猝灭探针BHQ2；当形成探针平台后，f链与h链DNA能够杂交并使得Cy5的荧光被接近的BHQ2淬灭。本发明AND逻辑门传感体系能够实现同时检测两种肝癌相关的miRNA，具有操作简单高效、灵敏度高、特异性强、方法简单且快速的优势，能够提高肝癌诊断的准确性。

Description

一种AND分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于检测、化学分析技术领域，尤其是一种AND分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用。
背景技术
肝癌是全球致死率最高的的恶性肿瘤疾病之一，死亡率与发病率之比大于95％(J.Biol.Chem.2009,284,32015-32027)。目前检测癌症的方法存在一定的局限性，或灵敏度不高，或操作过程复杂，或需要昂贵的分析设备，增加了检测的难度及资金和时间的消耗，且通常需要等肿瘤生长到含有相当数量的癌细胞时才能检出，而此时通常已到发病晚期，治愈率极低，给病人带来极大的痛苦及经济负担。因此，亟需开发灵敏度高、选择性好、快速简便、费用低廉的肿瘤早期诊断新方法、新技术。
在分子水平上实现癌细胞与正常细胞的准确区分对于疾病诊断尤其重要。miRNA异常表达会导致疾病的产生和生理异常，在许多癌细胞如宫颈癌细胞和肝癌细胞中miRNA的表达水平都会有变化(Development 2005,132,4653-4662.；Br.J.Cancer 2006,94,776-780.)。因此，对组织或细胞样本中miRNA进行高灵敏度检测有利于重大疾病的早期诊断与治疗。内源性RNA是癌细胞亚型鉴定的分子候选者，但是RNA通常在活细胞中存在的丰度低，并且一些RNA通常在多种类型的细胞共同存在，仅检测一种RNA难以实现疾病的确诊，因此需要进行多种RNA的联合检测。如有研究表明miRNA-21在多种肿瘤细胞中普遍高表达，而miRNA-122在肝细胞中高表达(Cell Res.2008,18,350-359.；J.Hepatol.2015,62,448-457)，二者的联合检测将极大提高肝癌诊断的准确性。
但是由于miRNA具有尺寸小(19-24个碱基)、丰度低、序列同源性和易降解等特点，传统的检测方法很难做到高灵敏度准确检测。目前，常用的检测方法包括印记杂交法、定量—逆转录PCR法、滚环扩增法等(Science 2001,294,853-858.；Anal.Chem.2018,90,10001-10008.；Nat.Rev.Genet.2012,13,358-369.)。这些方法虽然经过多次的改进，但是仍然存在许多问题，例如过程复杂、使用仪器过于昂贵和实验成本过高等，而且灵敏度不高，因此在临床应用上受到一定程度的限制。近年来，基于分子逻辑门的智能化检测越来越受到研究人员的重视，分子逻辑门以输入信号的多种组合给出特定的运算结果，可实现智能化多元检测(Chem.Sci.2018,9,1774-1781)，日益受到科研人员的重视，在重大疾病早期诊疗一体化研究中有着巨大的应用前景。本发明即构建了一种基于AND逻辑门的传感体系，用于智能化同时检测两种RNA。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种AND分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用，该体系能够实现同时检测两种肝癌相关的miRNA，具有操作简单高效、灵敏度高、特异性强、方法简单且快速的优势，能够提高肝癌诊断的准确性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种AND分子逻辑门传感体系，所述体系包括：
由三条i、j、g单链DNA经高温退火形成的具有分子信标结构的MB1、MB2、MB3，及由三条单链DNA，即e、h、f杂交形成的探针复合物HC；其中f链DNA标记有荧光探针Cy5，h链DNA标记猝灭探针BHQ2；当形成探针平台后，f链与h链DNA能够杂交并使得Cy5的荧光被接近的BHQ2淬灭。
而且，所述AND逻辑门传感体系还包括磷酸盐缓冲液；
其中，每100mL磷酸盐缓冲液的配制方法为：取0.5930克二水合磷酸二氢钠，5.8028克十二水合磷酸氢二钠，用超纯水溶解，定容至100mL容量瓶中，置于4℃冰箱保存备用。
而且，所述AND逻辑门传感体系能够同时检测肝癌相关miRNA及肝脏特有miRNA，所述肝癌相关miRNA为miRNA-21，所述肝脏特有miRNA为miRNA-122，两种miRNA的同时检测有利于提高肝癌诊断准确性。
而且，所述AND逻辑门智能传感体系在进行RNA检测时：
靶分子miRNA-21与MB1发生toe-hold杂交反应，形成HP1，其释放出的单链部分可与HC继续发生toe-hold杂交反应，生成HP2并释放e链DNA，而另一靶分子miRNA-122与MB2发生toe-hold杂交反应形成HP3，HP3中的单链部分可与HP2继续发生toe-hold杂交反应生成HP4，同时将f链DNA及HP1部分从HP2中解离，f链DNA的释放使得荧光探针远离h链DNA中的猝灭剂，从而恢复Cy5的荧光信号；而释放的HP1继续与HC发生反应，可进一步促进荧光探针f链DNA的释放，实现第一重循环信号放大；反应产生的HP4则与MB3发生反应形成HP5，同时从HP4中释放的HP3能够与HP2继续反应而释放荧光探针f链DNA，这样实现了第二重循环信号放大；该传感体系只有在miRNA-122与miRNA-21同时存在时才会使得Cy5荧光恢复；由此，基于逻辑门智能传感体系能够实现对miRNA-21和miRNA-122的智能化同时检测。
一种如上所述的AND分子逻辑门传感体系在细胞内miRNA、DNA检测方面中、或在重大疾病早期诊断方面中、或在致病微生物检测方面中的应用。
一种如上所述的AND分子逻辑门传感体系的制备方法，步骤如下：
分别取等体积i、j、g单链DNA置于一个离心管中，放置于95℃水浴锅中5分钟，之后缓慢冷却到室温，三条单链DNA分别形成具有环-茎结构的分子信标MB1、MB2和MB3；
分别取等体积e、f、h单链DNA置于另一离心管中，以与上面所述同样方法退火得到HC复合物；所述i、j、g、e、f、h单链DNA的体积相同；
将上述DNA混合并用磷酸盐缓冲液稀释，使得各DNA链的终浓度为100nM，即得到完整的AND逻辑门传感体系，在冰箱4℃保存备用。
一种如上所述的AND分子逻辑门传感体系的制备方法，步骤如下：
根据靶分子miRNA-21和miRNA-122序列设计出相应的i链和j链DNA，将其置于离心管中，在95℃下孵育5分钟后再缓慢降至室温，形成发夹结构MB1和MB2；待测靶分子miRNA-21和miRNA-122分别作为输入信号1和输入信号2能够分别与MB1和MB2结构中的toe-hold部分互补，发挥着启动链置换反应的作用；e、f、h链DNA置于离心管中，在95℃下孵育5分钟后再缓慢降至室温，形成复合物HC，在miRNA-21和miRNA-122的共同作用下控制HC中荧光探针与淬灭剂之间的距离，并进行检测信号的循环放大；g链DNA在95℃下保持5分钟后再缓慢降至室温，形成具有发夹结构的MB3用于第二重循环信号放大；
将上述DNA混合并用磷酸盐缓冲液稀释，使得各DNA链的终浓度为100nM，即得到AND逻辑门传感体系。
利用如上所述的AND逻辑门传感体系同时检测两种miRNA以提高肝癌早期诊断准确度的方法，步骤如下：
进行荧光强度信号测试，激发波长固定为646nm，发射波长测定范围为665-800nm，激发光源狭缝宽度为10nm，发射光源狭缝宽度为10nm；
将含有单个靶分子miRNA-122或miRNA-21及同时含有两个靶分子的样品分别加入所制备的AND逻辑门传感体系中，室温反应6小时，然后测定传感体系的荧光信号响应。
而且，步骤如下：
⑴荧光检测：
将靶分子存在的情况定义为逻辑输入值(1)，不存在的情况定义为逻辑输入值(0)；将单个待测靶分子miRNA-21(1，0)或miRN-122(0，1)分别加入AND逻辑门传感体系，室温反应6小时，进行AND逻辑门荧光强度信号测试；进行荧光强度信号测试，激发波长固定为646nm，发射波长为665-800nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm；
将两个待测靶分子miRNA-21和miRNA-122(1，1)同时加入所制备的AND逻辑门传感体系，按照以上实验条件进行检测；
⑵AND逻辑门输出信号阈值的设定：
根据步骤⑴中AND逻辑门荧光强度信号测试结果，以670nm处的荧光响应为输出信号，以两种靶分子同时存在下的荧光强度为最大值进行归一化处理，将输出值0.5作为阈值，高于阈值则定义为高输出信号(1)，低于阈值则定义为低输出信号(0)；根据AND逻辑门的阈值，判定待测液中是否同时含有miRNA-21和miRNA-122两种靶分子。
而且，所述AND逻辑门传感体系中各DNA链的终浓度为100nM，反应体系为200μL。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明AND逻辑门传感体系能够实现同时检测两种肝癌相关的多种miRNA，具有操作简单高效、灵敏度高、特异性强、方法简单且快速的优势，能够提高肝癌诊断的准确性。
2、本发明体系主要是利用DNA链置换级联反应设计了两种miRNA同时控制的双重级联放大DNA逻辑传感体系，通过设计互补探针达到靶分子特异性识别，引起荧光探针与淬灭剂之间距离增大，从而增强传感体系荧光信号响应，达到检测靶分子的目的。该传感体系只有在两种miRNA同时存在的情况下，才能引起传感体系荧光信号的增强，实现基于AND逻辑门的智能化检测，可区分肝癌细胞和正常细胞。本发明提供的方法简单便捷、灵敏度高、检测速度快，可进一步应用于细胞内miRNA检测，促进重大疾病早期诊断的发展。
3、本发明检测方法是一种基于DNA间toe-hold取代反应的AND逻辑门传感体系同时检测两种与肝癌相关miRNA的方法，本发明在只有两种靶分子miRNA同时存在时才能启动链置换反应，使得染料与淬灭剂之间距离增大而增强染料荧光信号，达到两种靶分子miRNA同时检测的目的，从而实现癌细胞与正常细胞的区分。检测策略中设计的双重循环链置换反应可以增加检测的灵敏度，可促进疾病的早期诊断。
4、本发明检测方法能够同时对两种miRNA靶分子进行基于AND逻辑门的智能检测，实现高灵敏、高精准、操作简单的快速检测，其操作过程简单、耗时短，且检测结果具有良好的重现性，确保了检测结果的准确度。
附图说明
图1为本发明中基于AND逻辑门传感体系同时检测两种miRNA的工作原理示意图；
图2为本发明中AND逻辑门传感体系在不含有靶分子、只含有一种靶分子、同时含有两种靶分子情况下的荧光响应曲线图；其中，a):不含有靶分子miRNA-21和miRNA-122即输入信号为(0，0)时AND逻辑门传感体系的荧光响应曲线图；b):仅含有靶分子miRNA-21即输入信号为(1，0)时AND逻辑门传感体系的荧光响应曲线图；c):仅含有靶分子miRNA-122即输入信号为(0，1)时AND逻辑门传感体系的荧光响应曲线图；d):同时含有靶分子miRNA-21和miRNA-122即输入信号为(1，1)时AND逻辑门传感体系的荧光响应曲线图；
图3为本发明中在两种靶分子同时存在情况下AND逻辑门传感体系的在670nm处荧光强度随时间的变化曲线图；
图4为本发明中AND逻辑门不同输入情况对应的荧光强度(670nm)及真值表；
图5为本发明中不同浓度靶分子的荧光响应曲线图；其中，a):不含有miRNA-21和miRNA-122时AND逻辑门传感体系的荧光响应曲线图；b)：含有miRNA-21和miRNA-122(0.5nM，0.5nM)；c)：含有miRNA-21和miRNA-122(1nM，1nM)；d)：含有miRNA-21和miRNA-122(10nM，10nM)；e)：含有miRNA-21和miRNA-122(20nM，20nM)；f)：含有miRNA-21和miRNA-122(50nM，50nM)；g)：含有miRNA-21和miRNA-122(100nM，100nM)；时AND逻辑门传感体系的荧光响应曲线图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种AND分子逻辑门传感体系，所述体系包括：
由三条i、j、g单链DNA经高温退火形成的具有分子信标结构的MB1、MB2、MB3，及由三条单链DNA，即e、h、f杂交形成的探针复合物HC；其中f链DNA标记有荧光探针Cy5，h链DNA标记猝灭探针BHQ2；当形成探针平台后，f链与h链DNA能够杂交并使得Cy5的荧光被接近的BHQ2淬灭。
较优地，所述AND逻辑门传感体系还包括磷酸盐缓冲液；
其中，每100mL磷酸盐缓冲液的配制方法为：取0.5930克二水合磷酸二氢钠，5.8028克十二水合磷酸氢二钠，用超纯水溶解，定容至100mL容量瓶中，置于4℃冰箱保存备用。
较优地，所述AND逻辑门传感体系能够同时检测肝癌相关miRNA及肝脏特有miRNA，所述肝癌相关miRNA为miRNA-21，所述肝脏特有miRNA为miRNA-122，两种miRNA的同时检测有利于提高肝癌诊断准确性。
较优地，所述AND逻辑门智能传感体系在使用时：
靶分子miRNA-21与MB1发生toe-hold杂交反应，形成HP1，其释放出的单链部分可与HC继续发生toe-hold杂交反应，生成HP2并释放e链DNA，而另一靶分子miRNA-122与MB2发生toe-hold杂交反应形成HP3，HP3中的单链部分可与HP2继续发生toe-hold杂交反应生成HP4，同时将f链DNA及HP1部分从HP2中解离，f链DNA的释放使得荧光探针远离h链DNA中的猝灭剂，从而恢复Cy5的荧光信号；而释放的HP1远离h链DNA继续与HC发生反应，可进一步释放荧光探针f链DNA，实现第一重循环信号放大；反应产生的HP4则与MB3发生反应形成HP5，同时从HP4中释放的HP3能够与HP2继续反应而释放荧光探针f链DNA，这样实现了第二重循环信号放大；该传感体系只有在miRNA-122与miRNA-21同时存在时才会使得Cy5荧光恢复；由此，基于AND逻辑门传感体系能够实现对miRNA-21和miRNA-122的智能检测。
一种如上所述的AND分子逻辑门传感体系在细胞内miRNA检测方面中或在重大疾病早期诊断方面中的应用。
一种如上所述的AND分子逻辑门传感体系的制备方法，步骤如下：
分别取等体积i、j、g链DNA置于一个离心管中，放置于95℃水浴锅中5分钟，缓慢冷却到室温形成具有环-茎结构的分子信标MB1、MB2和MB3；
分别取等体积e、f、h链DNA置于另一离心管中，以与上面所述同样方法退火得到HC；所述i、j、g、e、f、h链的体积相同；
将上述DNA混合并用磷酸盐缓冲液稀释，使得各DNA链的终浓度为100nM，即得到完整的AND逻辑门传感体系，在冰箱4℃保存备用。
一种如上所述的AND分子逻辑门传感体系的制备方法，步骤如下：
根据靶分子miRNA-21和miRNA-122序列设计出相应的i链和j链DNA，将其置于离心管中，在95℃下孵育5分钟后再缓慢降至室温，形成发夹结构MB1和MB2；待测靶分子miRNA-21和miRNA-122分别作为输入信号1和输入信号2能够分别与MB1和MB2结构中的toe-hold部分互补，发挥着启动链置换反应的作用；e、f、h链DNA置于离心管中，在95℃下孵育5分钟后再缓慢降至室温，形成复合物HC，用于控制荧光探针与淬灭剂之间的距离，并进行信号循环放大，g链DNA在95℃下保持5分钟后再缓慢降至室温，形成具有发夹结构的MB3用于第二重循环信号放大；
将上述DNA混合并用磷酸盐缓冲液稀释，使得各DNA链的终浓度为100nM，即得到AND逻辑门传感体系。
利用如上所述的AND逻辑门传感体系同时检测两种miRNA以提高肝癌早期诊断准确度的方法，步骤如下：
进行荧光强度信号测试，激发波长固定为646nm，发射波长测定范围为665-800nm，激发光源狭缝宽度为10nm，发射光源狭缝宽度为10nm；
将含有单个靶分子miRNA-122或miRNA-21及同时含有两个靶分子的样品分别加入所制备的AND逻辑门传感体系中，室温反应6小时，然后测定传感体系的荧光信号响应。
较优地，步骤如下：
⑴荧光检测：
将靶分子存在的情况定义为逻辑输入值(1)，不存在的情况定义为逻辑输入值(0)；将单个待测靶分子miRNA-21(1，0)或miRNA-122(0，1)分别加入AND逻辑门传感体系，室温反应6小时，进行AND逻辑门荧光强度信号测试；进行荧光强度信号测试，激发波长固定为646nm，发射波长为665-800nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm；
将两个待测靶分子miRNA-21和miRNA-122(1，1)同时加入所制备的AND逻辑门传感体系，按照以上实验条件进行检测；
⑵AND逻辑门输出信号阈值的设定：
根据步骤⑴中AND逻辑门荧光强度信号测试结果，以670nm处的荧光响应为输出信号，以两种靶分子同时存在下的荧光强度为最大值进行归一化处理，将输出值0.5作为阈值，高于阈值则定义为高输出信号(1)，低于阈值则定义为低输出信号(0)；根据AND逻辑门的阈值，判定待测液中是否同时含有miRNA-21和miRNA-122两种靶分子。
较优地，所述AND逻辑门传感体系中各DNA链的终浓度为100nM，反应体系为200μL。
具体地：
AND逻辑门传感体系的制备包括如下步骤：分别取i、j、g链DNA各100μL置于离心管1中，放置于95℃水浴锅中，5分钟，缓慢冷却到室温得到MB1、MB2和MB3。分别取e、f、h链DNA各100μL置于离心管2中同样方法退火得到HC。将上述DNA混合并用磷酸盐缓冲液稀释，使得各DNA链的终浓度为100nM，得到完整AND逻辑门传感体系，置于冰箱4℃保存备用。
本发明AND逻辑门传感体系在使用时，将两种RNA(miRNA-122,miRNA-21)加入到设计的AND逻辑门传感体系中，室温反应6小时，测试荧光信号强度，实现对两种miRNA进行智能化逻辑检测。
具体操作方法如下：
(1)主要溶液的配制
磷酸缓冲液：取0.5930克二水合磷酸二氢钠，5.8028克十二水合磷酸氢二钠，用超纯水溶解，定容至100mL容量瓶中，置于4℃冰箱保存备用。
(2)探针设计及AND逻辑门传感体系制备
根据靶分子序列设计出相应的i链DNA和j链DNA，将i和j链DNA置于离心管中，95℃反应5分钟后再缓慢降至室温，形成发夹结构MB1和MB2。待测靶分子miRNA-21和miRNA-122分别作为输入信号1(IN1)和输入信号2(IN2)与MB1和MB2具有必要的互补部分，发挥着启动链置换反应的作用。DNA逻辑体系中e、f、h链通过DNA杂交形成复合物HC，用于控制染料与淬灭剂之间的距离和循环放大，g链在95℃下保持5分钟后再缓慢降至室温DNA形成自封闭的发夹结构MB3用于第二重循环信号放大。如图1所示。
将上述DNA混合并用磷酸盐缓冲液稀释，使得各DNA链的终浓度为100nM，得到逻辑门智能传感体系。
(3)基于AND逻辑门传感体系进行智能化检测
将靶分子存在的情况定义为逻辑输入值(1)，不存在的情况定义为逻辑输入值(0)；将单个待测靶分子miRNA-21(1，0)或miRNA-122(0，1)分别加入到AND逻辑门传感体系，室温反应6小时，进行AND逻辑门荧光强度信号测试；进行荧光强度信号测试，激发波长固定为646nm，发射波长为665-800nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm；
将两个待测靶分子miRNA-21和miRNA-122(1，1)同时加入到所制备的AND逻辑门传感体系，按照以上实验条件进行检测；
(4)AND逻辑门输出信号阈值的设定：
根据步骤⑴中AND逻辑门荧光强度信号测试结果，以670nm处的荧光响应为输出信号，以两种靶分子同时存在下的荧光强度为最大值进行归一化处理，将输出值0.5作为阈值，高于阈值则定义为高输出信号(1)，低于阈值则定义为低输出信号(0)；根据AND逻辑门的阈值，判定待测液中是否同时含有miRNA-21和miRNA-122两种靶分子。
更具体操作如下:
(1)主要溶液的配制：
磷酸缓冲液：取0.5930克二水合磷酸二氢钠，5.8028克十二水合磷酸氢二钠，用超纯水溶解，定容至100mL容量瓶中，置于4℃冰箱保存备用。
(2)将单链DNA：miRNA-21、miRNA-122、i、j、g、e、f和h分别在10000转/分钟的转速下离心1分钟。向管中分别加入超纯水使得各DNA链的浓度为100μM，后用磷酸盐缓冲液稀释，使各DNA链的浓度为10μM。
(3)分别取i、j、g链DNA(100μL)置于离心管1中，放置于95℃水浴锅中5分钟，缓慢冷却到室温得到MB1、MB2和MB3。分别取e、f、h链DNA(100μL)置于离心管2中同样方法退火得到HC。将上述两管溶液混合并用磷酸盐缓冲液稀释，使得各DNA链的终浓度为100nM，得到完整AND逻辑门传感体系，置于冰箱4℃保存备用。
(4)将含有单个靶分子miRNA-21(1，0)和miRNA-122(0，1)的样品加入所制备的AND逻辑门传感体系的磷酸盐缓冲液中，室温避光静置6小时，对输出荧光信号强度进行测试。激发波长固定为646nm，发射波长为665-800nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。
(5)将待测样品加入所制备的AND逻辑门传感体系的磷酸盐缓冲液中，室温避光静置6小时，测试荧光信号强度，所用的激发波长为646nm。根据AND逻辑门的阈值，判定待测液中是否同时含有miRNA-21和miRNA-122两种靶分子。
更具体地，本发明的相关实施例如下：
实施例1
将不含有靶分子miRNA-21和miRNA-122的溶液加入所制备的AND逻辑门传感体系为样品1，仅含有靶分子miRNA-21(100nM)的溶液加入所制备的AND逻辑门传感体系为样品2，仅含有靶分子miRNA-122(100nM)溶液加入所制备的AND逻辑门传感体系为样品3，同时含有靶分子miRNA-21(100nM)和miRNA-122(100nM)的溶液加入所制备的AND逻辑门传感体系中为样品4，将四个样品放置于室温避光静置6小时，测试体系的荧光响应。激发波长固定为646nm，发射波长为665-800nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。
检测原理验证：如图2所示，AND逻辑门传感体系在不含有靶分子miRNA-21和miRNA-122时其荧光强度很弱，在仅含有靶分子miRNA-21(100nM)或仅含有靶分子miRNA-122(100nM)时，传感体系的荧光响应只产生了微弱的增强，而同时含有两种靶分子输入时，荧光信号显著增强。
实施例2
链置换反应时间的优化(见图3)：将同时含有靶分子miRNA-21(100nM)和miRNA-122(100nM)的样品加入所制备的AND逻辑门传感体系中。将上述样品放置于室温避光分别静置0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，之后测试传感体系荧光信号强度。激发波长固定为646nm，发射波长为665-800nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。
如图3所示，随着靶分子在传感体系中孵育时间的增加，传感体系荧光强度(670nm)逐渐增加，6h后趋于稳定。因此选择6h作为最佳反应时间。
实施例3
基于AND逻辑门传感体系智能化检测(图4)：将不含有靶分子miRNA-21和miRNA-122情况作为AND逻辑门传感体系的(0，0)输入信号；仅含有靶分子miRNA-21(100nM)作为AND逻辑门传感体系的(1，0)输入信号；仅含有靶分子miRNA-122(100nM)作为AND逻辑门传感体系的(0，1)输入信号；同时含有靶分子miRNA-21(100nM)和miRNA-122(100nM)情况作为AND逻辑门传感体系的(1，1)输入信号，以传感体系在670nm处荧光强度为输出信号。并以在输入信号为(1,1)时传感体系在670nm处荧光响应为最大值，对输出信号进行归一化处理。如图4所示，(0，0)输入时传感体系仅有微弱荧光，(1，0)输入和(0，1)输入传感体系的荧光响应略有增强，而(1，1)输入时传感体系荧光响应有着明显的增强。根据检测结果，在对输出信号进行归一化后将AND逻辑门的阈值设置为0.5。由此得到AND逻辑门的真值表(图4中的插入表)。
实施例4
AND逻辑门传感体系对一系列浓度下miRNA-21和miRNA-122的同时检测(图5)：将不同浓度靶分子miRNA-21和miRNA-122(0nM，0.5nM，1nM，10nM，20nM，50nM，100nM)分别加入所制备的AND逻辑门传感体系，室温避光静置6小时后测试传感体系荧光响应。激发波长固定为646nm，发射波长为665-800nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。
如图5所示，可测得的靶分子miRNA-21和miRNA-122最低浓度为(0.5nM，0.5nM)，结果表明所构建的AND逻辑门智能传感器具有很高的灵敏度。
本发明中所使用的DNA和RNA序列如表1：
表1.本发明构建AND分子逻辑门传感体系所用DNA和靶分子RNA序列
Figure BDA0002188041120000111
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容，可广泛应用于细胞内、血液及体液等条件下的RNA及DNA的多元检测。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种AND分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> i（MB1）(Unknown)
<400> 1
tcgttcaaca tcagtctgat aagctattag catcagact 39
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> j（MB2）(Unknown)
<400> 2
actgcaaaca ccattgtcac actccagcat cagactcgag gtgacaataa ctgac 55
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> g（MB3）(Unknown)
<400> 3
ctcgagtttt cagactcgag gtgacaataa ctgacatttg g 41
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> e(Unknown)
<400> 4
atcagactcg ag 12
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> h(Unknown)
<400> 5
bhccaaatgt cagttattgt cacctcgagt ctgatgctaa 40
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> f(Unknown)
<400> 6
gacaataact gacatttcy 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> miRNA-21(Unknown)
<400> 8
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> miRNA-122(Unknown)
<400> 9
uggaguguga caaugguguu ug 22

Claims (1)

1.一种AND分子逻辑门传感体系，其特征在于：所述AND分子逻辑门传感体系包括：
由三条i、j、g单链DNA经高温退火形成的具有分子信标结构的MB1、MB2、MB3，及由三条单链DNA，即e、h、f杂交形成的探针复合物HC；其中f链DNA标记有荧光探针Cy5，h链DNA标记猝灭探针BHQ2；当形成探针平台后，f链与h链DNA能够杂交并使得Cy5的荧光被接近的BHQ2淬灭；
i的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，j的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，g的核苷酸序列为SEQID NO.3，e的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，h的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，f的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；
所述AND逻辑门传感体系还包括磷酸盐缓冲液；
其中，每100 mL磷酸盐缓冲液的配制方法为：取0.5930 克二水合磷酸二氢钠，5.8028克十二水合磷酸氢二钠，用超纯水溶解，定容至100 mL 容量瓶中，置于4℃冰箱保存备用。
CN201910822725.1A 2019-09-02 2019-09-02 一种and分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用 Active CN110592186B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910822725.1A CN110592186B (zh) 2019-09-02 2019-09-02 一种and分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910822725.1A CN110592186B (zh) 2019-09-02 2019-09-02 一种and分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110592186A CN110592186A (zh) 2019-12-20
CN110592186B true CN110592186B (zh) 2023-06-16

Family

ID=68856924

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910822725.1A Active CN110592186B (zh) 2019-09-02 2019-09-02 一种and分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110592186B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113340863B (zh) * 2021-06-07 2023-05-23 郑州轻工业大学 一种无酶循环放大核酸适配体传感器及其制备方法和应用
CN114002200B (zh) * 2021-11-01 2024-05-07 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 近红外二区激活型探针及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107727621A (zh) * 2017-09-29 2018-02-23 济南大学 一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法
CN108676849A (zh) * 2018-05-25 2018-10-19 中国科学院上海应用物理研究所 一种检测目标DNA或miRNA的方法
CN109680045A (zh) * 2019-01-24 2019-04-26 台州学院 一种基于磁纳米球的可重置分子逻辑门的合成及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107727621A (zh) * 2017-09-29 2018-02-23 济南大学 一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法
CN108676849A (zh) * 2018-05-25 2018-10-19 中国科学院上海应用物理研究所 一种检测目标DNA或miRNA的方法
CN109680045A (zh) * 2019-01-24 2019-04-26 台州学院 一种基于磁纳米球的可重置分子逻辑门的合成及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A DNA logic gate based on strand displacement reaction and rolling circle amplification,responding to multiple low-abundance DNA fragment input signals,and its application in detecting miRNAs.;Yuqi chen等;《Chem.Commun.》;20151231;第51卷;全文 *
Logic Sensing of microRNA in living cells using DNA-programmed nanoparticle network with high signal gain.;Renye Yue等;《ACS sens》;20181206;第4卷(第1期);全文 *
新型DNA分子逻辑门的构建及其初步应用;曹青锋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20170315;正文第三章 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110592186A (zh) 2019-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gu et al. Enzyme-free amplified detection of miRNA based on target-catalyzed hairpin assembly and DNA-stabilized fluorescent silver nanoclusters
Lan et al. A label-free colorimetric detection of microRNA via G-quadruplex-based signal quenching strategy
Wang et al. Target-assisted FRET signal amplification for ultrasensitive detection of microRNA
CN110592186B (zh) 一种and分子逻辑门传感体系及其制备方法和应用
WO2023025259A1 (zh) 检测微小rna的方法和试剂盒
CN107513568A (zh) 一种检测let‑7a microRNA的荧光化学传感器及其检测方法
CN112626209A (zh) 用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒
CN104928390B (zh) 一种MicroRNA的检测方法
CN105483285A (zh) 一种基于鸟嘌呤的超猝灭分子信标的构建及应用
CN108642164B (zh) miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒
Chen et al. A cancer cell membrane vesicle-packaged DNA nanomachine for intracellular microRNA imaging
Zhao et al. Triple-helix molecular-switch-actuated exponential rolling circular amplification for ultrasensitive fluorescence detection of miRNAs
CN110628950B (zh) 一种用于检测ev71病毒的引物组合、试剂盒和psr方法
You et al. Visual detection of heart failure associated MiRNA with DSN enzyme-based recycling amplification strategy
CN114507706B (zh) 基于酶dna修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用
CN113549692B (zh) 一种基于杂交链反应检测鼻咽癌抗放疗生物标志物的方法
CN111961730B (zh) 基于硫代修饰环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒
CN110004214B (zh) 一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法
CN113462753B (zh) 点击化学介导的单量子点纳米传感器及检测miRNAs的方法与应用
CN115094063A (zh) 一种肺癌早期智能诊断的多价可激活适配体探针及其制备与应用
CN110609020B (zh) 基于回文分子信标检测atp的生物传感器及其制备方法和应用
Wang et al. Fluorescent dual-mode assay of plant viral disease with polymerase chain reaction amplification
CN106636329B (zh) 一种检测哺乳动物血液中微量循环肿瘤细胞的特异性方法
CN107271408B (zh) 非连续rna g-四链体的检测方法
CN114540503B (zh) 基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let-7a检测试剂盒及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant