CN107727621A - 一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法，涉及荧光检测miRNA领域。通过设计互补探针，无需加入相应的标记和特异性酶，达到目标物的特异性识别。利用原卟啉和G‑四链体结合后荧光增强的特性实现光信号增大的表征，达到检测目标物的目的。使用互补的自发进行链置换反应探针破坏上述结合，实现NOT门输出。本方法检测成本低、灵敏度高。
Description
技术领域
miRNA广泛存在于各种动、植物中，参与多种重要的生命活动。至2014年6月，Sanger研究所最新的miRNA数据库Release 21.0已收录了223个物种的28645个miRNA前体，35828个成熟的miRNA。目前，已经在人体中发现了两千多种miRNA，占人类基因组的1%，它们对30%基因的表达发挥着调控作用。它的调控范围并不仅限于人体内正常的生理过程（如细胞的增殖、分化、发育、凋亡等），还同心脏病、肿瘤的发生和发展等有着密切的联系。
背景技术
miRNA广泛存在于各种动、植物中，参与多种重要的生命活动。至2014年6月，Sanger研究所最新的miRNA数据库Release 21.0已收录了223个物种的28645个miRNA前体，35828个成熟的miRNA。目前，已经在人体中发现了两千多种miRNA，占人类基因组的1%，它们对30%基因的表达发挥着调控作用。它的调控范围并不仅限于人体内正常的生理过程（如细胞的增殖、分化、发育、凋亡等），还同心脏病、肿瘤的发生和发展等有着密切的联系。
miRNA异常表达会导致疾病的产生和生理异常，在许多癌细胞如乳腺癌细胞和大肠癌细胞中，miRNA的表达水平会有变化，有可能起到抑癌基因和原癌基因的作用。此外，在许多其他病变细胞或组织中也检测到miRNA的异常表达。因此，对组织或细胞样本中miRNA进行及时的检测，有助于人们进一步的了解miRNA与疾病发展之间的关系，为疾病的早期诊断提供新思路。
目前，miRNA的常见检测方法包括印记杂交法（Northern Blotting）、微阵列法、荧光标记法、定量-逆转录（PCR）法、滚环扩增法、基因芯片技术等。这些方法经过多次的改进，仍然有许多问题，例如过程复杂、使用仪器过于昂贵和实验成本过高等，而且灵敏性较差，因而在临床应用上受到一定程度的限制。上述方法都显示出不可避免的缺点，因此有必要开发一种方法，能够敏感的定量检验出不同的标本甚至低丰度的miRNA，能够分别同源高的同源miRNA，且操作便捷，不需要价格高昂的设备或者试剂。本实验试图开发一种更简单高效的方法，建立能无酶标记的DNA逻辑体系，该方法不需要较长的分析时间，能够通过荧光信号强度变化观察到结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是通过DNA链置换技术构建一种无酶标记的光信号DNA逻辑体系检测miRNA方法；
一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)主要溶液的配制
Tris-EDTA-KCl 缓冲液：取0.0605 g 三羟甲基氨基甲烷，0.0146 g 乙二胺四乙酸，5.84 g 氯化钠，0.375 g 氯化钾，用灭菌水溶解，定容至50 mL容量瓶中，于4 ℃环境保存备用，使用时pH调至8.0；
6 mM 原卟啉溶液：取0.1879 g原卟啉，用灭菌水溶解，定容至50 mL 容量瓶中,于4 ℃环境保存避光备用，全程在避光条件下进行；
10 % 过硫酸铵：取0.2 g过硫酸铵，加入2 mL 灭菌水，混匀，于4 ℃环境保存备用。
(2)探针设计
根据目标物设计相应的G1、G2和I链。
(3)构建DNA逻辑体系
无RNA酶环境下，将所使用的目标物miRNA、G1和G2分别离心。低温操作，向离心管中加入15 μL TEK缓冲液，1 μM G1、G2和目标物miRNA各10 μL，混匀，离心。
(4)荧光检测
进行荧光强度信号测试，激发波长固定为410 nm，发射波长为550—750 nm，激发狭缝宽度为20 nm，发射狭缝宽度为20 nm。
上述溶液加热到88 ℃，反应10分钟，缓慢降至室温，加入5 μL 6 mM原卟啉溶液，室温下反应1小时，进行YES门荧光强度信号测试。管中加入10 μL的4 μM I链，室温下反应1小时，进行NOT门荧光强度信号测试。
本发明的有益效果
(1)根据链置换反应和原卟啉荧光特性建立了无酶标记的DNA逻辑体系，无需进行先前的标记步骤；
(2)利用荧光技术检测miRNA，灵敏度较高，实验步骤便捷，可以快速的得出结果；
(3)本发明所述方法检测成本低、灵敏度高、特异性好。
附图说明
图1为本文所述方法YES门的实验原理图。
图2为本文所述方法NOT门的实验原理图。
图3为本文所述方法的探针设计。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)主要溶液的配制
Tris-EDTA-KCl 缓冲液：取0.0605 g 三羟甲基氨基甲烷，0.0146 g 乙二胺四乙酸，5.84 g 氯化钠，0.375 g 氯化钾，用灭菌水溶解，定容至50 mL容量瓶中，于4 ℃环境保存备用，使用时pH调至8.0。
6 mM 原卟啉溶液：取0.1879 g原卟啉，用灭菌水溶解，定容至50 mL 容量瓶中,于4 ℃环境保存避光备用，全程在避光条件下进行。
10 % 过硫酸铵：取0.2 g过硫酸铵，加入2 mL 灭菌水，混匀，于4 ℃环境保存备用。
(2)探针设计
根据目标物设计相应的G1、G2和I链。
(3)构建DNA逻辑体系
无RNA酶环境下，将所使用的目标物miRNA、G1和G2分别离心。低温操作，向离心管中加入15 μL TEK缓冲液，1 μM G1、G2和目标物miRNA各10 μL，混匀，离心。
(4)荧光检测
进行荧光强度信号测试，激发波长固定为410 nm，发射波长为550—750 nm，激发狭缝宽度为20 nm，发射狭缝宽度为20 nm。
上述溶液加热到88 ℃，反应10分钟，缓慢降至室温，加入5 μL 6 mM原卟啉溶液，室温下反应1小时，进行YES门荧光强度信号测试。管中加入10 μL的4 μ M I链，室温下反应1小时，进行NOT门荧光强度信号测试。
实施例2
检测步骤同例1，不同之处是：I溶液初浓度分别为4 μM、2 μM、0.4 μM、0.3 μM、0.2 μM、0.1 μM和0.05 μM。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法
<130> 0913
<141> 2017-09-20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggtctacc tca 13
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaacctatg ggtagggcgg g 21
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agactaaact atacaaccat gctcagatga a 31
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ugagguagua gguuguauag uu 22
Claims (4)
1.一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：
1.1主要溶液的配制
Tris-EDTA-KCl 缓冲液：取0.0605 g 三羟甲基氨基甲烷，0.0146 g 乙二胺四乙酸，5.84 g 氯化钠，0.375 g 氯化钾，用灭菌水溶解，定容至50 mL容量瓶中，于4 ℃环境保存备用，使用时pH调至8.0；
6 mM 原卟啉溶液：取0.1879 g原卟啉，用灭菌水溶解，定容至50 mL 容量瓶中,于4 ℃环境保存避光备用，全程在避光条件下进行；
10 % 过硫酸铵：取0.2 g过硫酸铵，加入2 mL 灭菌水，混匀，于4 ℃环境保存备用；
1.2探针设计
根据目标物序列设计出相应的G1、G2和I链，G1、G2富含G碱基构成G-四链体部分，目标物及I链具有必需部分，发挥着启动链置换反应的作用，这两部分是体系中固定不变的，链中的其他序列根据目标miRNA的不同进行相应的设计；
1.3构建DNA逻辑体系
无RNA酶环境下，将所使用的目标物miRNA、G1和G2分别离心，低温操作，向离心管中加入15 μL TEK缓冲液，1 μM G1、G2和目标物miRNA各10 μL，混匀，离心；
1.4荧光检测
进行荧光强度信号测试，激发波长固定为410 nm，发射波长为550—750 nm，激发狭缝宽度为20 nm，发射狭缝宽度为20 nm；
上述溶液加热到88 ℃，反应10分钟，缓慢降至室温，加入5 μL 6 mM原卟啉溶液，室温下反应1小时，进行YES门荧光强度信号测试，管中加入10 μL的4 μ M I链，室温下反应1小时，进行NOT门荧光强度信号测试。
2.根据权利要求1所述，一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法，其特征在于，利用原卟啉与G-四链体结合后荧光强度会明显上升的特点，将光学信号作为最后输出建立DNA逻辑体系。
3.根据权利要求1所述，一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法，其特征在于，无需加入相应的标记和特异性酶，使得构建相对简单而且成本低廉。
4.根据权利要求1所述，一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法，其特征在于，通过必需部分控制启动链置换反应，破坏之前构建的G-四链体结构，使得荧光强度大幅下降。
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