CN107142332A - 一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Abstract
本专利为分析microRNA (miRNA)的浓度荧光构建了一个通过依赖锌离子连接作为扩增生物催化剂的脱氧核酶的传感平台。该平台是基于目标miRNA诱导连接两亚基底物并且通过连接产物打开信标发夹探针，打开发夹激发荧光基团，通过检测荧光信号的强弱来确定目标物的浓度。本方法包括测定荧光光谱溶液的制备—形成再生脱氧核酶—第一扩增步骤—第二扩增步骤—目标物含量的测定五个步骤。本方法通过引入辅助核酸与剪切酶大大提高了荧光强度，从而降低了系统的检测限而且检测成本低、灵敏度高。miRNA的检测对生物功能的研究及以疾病诊断都有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及传感平台检测领域，更具体的说是依赖锌离子连接作为扩增生物催化剂的脱氧核酶为分析microRNA (miRNA)荧光提出一个传感平台，利用这个平台为检测miRNA 构建一个通用的路径。
背景技术
癌症是目前全球都在攻克的难题，是一个造成死亡的主要原因，每年死于癌症的患者很多，所以癌症的早期诊断变得尤为重要，miRNA作为基因表达的重要调节器，肿瘤发生时，miRNA调节致癌与肿瘤抑制途径。在某些肿瘤中单个miRNA常发生复发性遗传和表观遗传的改变，相关研究也进一步阐明了公认的致癌和抑癌基因的作用机制。MiRNA不仅和癌症的发生有关，而且能够为癌症的相关治疗提供新的工具和希望。let-7在人类胚胎发育时期很难被检测到，但在成年时期变的相当丰富，在人类胚胎细胞分化过程中表达明显增加。let-7在肺癌组织中表达降低，恢复其正常表达有明显的肿官抑制作用。因此，我们现在需要发展更简单、准确、快捷、灵敏度高、选择性好的检测方法，用于癌症早期的检测判断。
miRNA表达的专一信号已经在临床组织样本中被发现，而且miRNA比mRNA更稳定，故可以将miRNA作为诊断中新型的生物标记物。同时研究表明miRNA能存在于极端的环境中，如酶促降解、冷冻、熔化、强酸强碱环境中。另外，miRNA在所有的体液和分泌物中也能被检测出来，包括尿液、排泄物、唾液、眼泪和羊水等。miRNA的检测分析技术对推进miRNA生物功能的进一步研究至关重要，并将形成以miRNA为疾病标志物的新诊断技术。但是绝大部分miRNA分子在细胞内的表达程度比较低，同源miRNA之间相似程度又高，所以发展简单、快速、准确、高灵敏度、高选择性的miRNA的检测方法对于miRNA生物功能的研究及以miRNA为生物标志物的疾病诊断都有重要意义。
检测miRNA的传统方法有Northern印迹法，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和微阵列法。然而，这些方法都有一些缺点。例如，Northern印迹是长而复杂的程序，需要放射性标记并且检测限通常低，而RT-PCR和微阵列具有良好的灵敏度，但需要昂贵的仪器。因此，我们需要发展灵敏度高、成本低的检测方法，现在出现了许多新的检测方法，如环诱导等温扩增技术、滚环扩增技术、分子信标等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是依赖锌离子连接作为扩增生物催化剂的脱氧核酶为分析microRNA (miRNA)荧光提出一个传感平台，利用这个平台为检测miRNA 构建一个通用的路径。
一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法，其特征是包括以下步骤：
1.1测定荧光光谱溶液的制备
所有的检测都在包含100 nM 氯化钠10 nM的氯化镁的10 nM 4-(2-乙基)N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸钠盐缓冲剂(pH=7.0)中进行；工作溶液包括0.5 μM的脱氧核酶亚基(4)和(5)，1 μM 底物亚基(2)和(3)，发夹探针的0.5 μM (8)，1 mM 锌离子，再加入不同浓度的目标miRNA，混合溶液继续培育扩增1.5小时在25 °C的环境下，各样品的体积均为20 μL，连接后，样品被稀释到50 μL；其中底物(2)需要用咪唑(pH=6.0，用HCl调节)、EDC·HCl修饰；方法：40 μL 10 μM的底物(2)与5 μL 0.1 μM咪唑和5 μL 0.1 μM EDC·HCl，25 °C培养2小时，再利用色谱分析柱(G-25)纯化底物；
1.2形成再生脱氧核酶
脱氧核酶序列(4)与改良咪唑底物亚基(2)和羟基化的亚基(3)结合，在锌离子的存在下连接到3′和5′各自底物亚基的末端；通过发夹域连接脱氧核酶是稳定的，包括亚基(4)与底物亚基(2)脱氧核酶序列的一部分结合； 脱氧核酶(5)脱氧核酶的第二段序列，结构域(I)的一个扩展的发夹结构域(II)；得到结合第二个底物亚基(3)的核酸(5)；在分析物(1)的存在下，发夹结构域(II)打开，使2个脱氧核酶和底物亚基(4)/(2)和(5)/(3)自组装在一起；在锌离子的存在下，脱氧核酶是有活性的，导致连接亚基(2)和(3)形成连接产品(7)；
1.3第一扩增步骤
在步骤1.2基础上引入一个“辅助”的核酸(6)，“辅助”核酸(6)与锌离子连接脱氧核酶亚基形成的一个更稳定的结构；由连接产物与锌离子脱氧核酶亚基和(7)/(8)双相组成的连接产物打开发夹；将连接物(7)从锌离子脱氧核酶亚基中的催化分离，“辅助”核酸(6)与锌离子连接脱氧核酶亚基互补；由于“辅助”核酸(6)和脱氧核酶单位之间的稳定双相结构，链置换过程，导致形成“M”结构并且释放原本没有产生荧光信号的连接产品，连接产品再打开发夹(8)，产生荧光；
1.4第二扩增步骤
混合物由连接产物(7)和脱氧核酶亚基之间双工结构组成，并且在(8)和连接产物(7)之间形成的双工结构是受Nt.BspQI切口酶的影响，Nt.BspQI切口酶切割在(7)/(8)的复式结构中(8)的单链区域；这导致分离为淬灭剂标记的核酸片段(9)，荧光标记片段(10)，和再生连接产品(7)，进一步打开发夹结构(8)；这是切割复式结构(7)/(8)再生连接产物，从而循环打开发夹(8)和催化再生荧光标记片段(10)，通过Nt.BspQI切割酶介导再生连接产物；
1.5目标物含量的测定
目标物的浓度在0-20 nM的范围内符合方程y=916.65+21.46x，R=0.79686；目标物的浓度在20-200 nM的范围内符合方程y=1225.96+4.18x，R=0.99492；由这两个方程我们可以利用荧光信号的强度来计算溶液中目标物的含量。
本发明的有益效果
(1)利用分子信标标记和荧光猝灭基团与环诱导等温扩增技术相结合的方法检测miRNA(let-7a)的荧光信号；
(2)对于miRNA生物功能的研究及以疾病诊断都有重要意义；
(3)本发明所述方法检测成本低、灵敏度高。
附图说明
图1为本文所述方法的反应原理图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
实施例1
一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法，其特征是包括以下步骤：
1.1测定荧光光谱溶液的制备
所有的检测都在包含100 nM 氯化钠10 nM的氯化镁的10 nM 4 –(2- 羟乙基)N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸钠盐缓冲剂(pH=7.0)中进行；工作溶液包括0.5 μM的脱氧核酶亚基(4)和(5)，1 μM 底物亚基(2)和(3)，发夹探针的0.5 μM (8)，1 mM 锌离子，再加入不同浓度的目标miRNA，混合溶液继续培育扩增1.5小时在25 °C的环境下，各样品的体积均为20 μL，连接后，样品被稀释到50 μL；其中底物(2)需要用咪唑(pH=6.0，用HCl调节)、EDC·HCl修饰；方法：40 μL 10 μM的底物(2)与5 μL 0.1 μM咪唑和5 μL 0.1 μM EDC·HCl，25 °C培养2小时，再利用色谱分析柱(G-25)纯化底物；
1.2形成再生脱氧核酶
脱氧核酶序列(4)与改良咪唑底物亚基(2)和羟基化的亚基(3)结合，在锌离子的存在下连接到3′和5′各自底物亚基的末端；通过发夹域连接脱氧核酶是稳定的，包括亚基(4)与底物亚基(2)脱氧核酶序列的一部分结合； 脱氧核酶(5)脱氧核酶的第二段序列，结构域(I)的一个扩展的发夹结构域(II)；得到结合第二个底物亚基(3)的核酸(5)；在分析物(1)的存在下，发夹结构域(II)打开，使2个脱氧核酶和底物亚基(4)/(2)和(5)/(3)自组装在一起；在锌离子的存在下，脱氧核酶是有活性的，导致连接亚基(2)和(3)形成连接产品(7)；
1.3第一扩增步骤
在步骤1.2基础上引入一个“辅助”的核酸(6)，“辅助”核酸(6)与锌离子连接脱氧核酶亚基形成的一个更稳定的结构；由连接产物与锌离子脱氧核酶亚基和(7)/(8)双相组成的连接产物打开发夹；将连接物(7)从锌离子脱氧核酶亚基中的催化分离，“辅助”核酸(6)与锌离子连接脱氧核酶亚基互补；由于“辅助”核酸(6)和脱氧核酶单位之间的稳定双相结构，链置换过程，导致形成“M”结构并且释放原本没有产生荧光信号的连接产品，连接产品再打开发夹(8)，产生荧光；
1.4第二扩增步骤
混合物由连接产物(7)和脱氧核酶亚基之间双工结构组成，并且在(8)和连接产物(7)之间形成的双工结构是受Nt.BspQI切口酶的影响，Nt.BspQI切口酶切割在(7)/(8)的复式结构中(8)的单链区域；这导致分离为淬灭剂标记的核酸片段(9)，荧光标记片段(10)，和再生连接产品(7)，进一步打开发夹结构(8)；这是切割复式结构(7)/(8)再生连接产物，从而循环打开发夹(8)和催化再生荧光标记片段(10)，通过Nt.BspQI切割酶介导再生连接产物；
1.5目标物含量的测定
目标物的浓度在0-20 nM的范围内符合方程y=916.65+21.46x，R=0.79686；目标物的浓度在20-200 nM的范围内符合方程y=1225.96+4.18x，R=0.99492；由这两个方程我们可以利用荧光信号的强度来计算溶液中目标物的含量。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南大学
<120> 一种酶性DNA机器用于miRNA检测
<130> 0717
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcactcacaa gc 12
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggaagagcat 10
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ctacctcaat ggtgtgagtg 20
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctgctcttct ttcgctagac cattgaggta gaactataca acctactacc tcaatgg 57
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tcactcacat ctagcgaa 18
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cgttctacgc tcttccgctt gtgaaaaaag aacg 34
Claims (4)
1.一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法，其特征是包括以下步骤：
1.1测定荧光光谱溶液的制备
所有的检测都在包含100 nM 氯化钠10 nM的氯化镁的10 nM 4-(2-羟乙基)N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸钠盐缓冲剂(pH=7.0)中进行；工作溶液包括0.5 μM的脱氧核酶亚基(4)和(5)，1 μM 底物亚基(2)和(3)，发夹探针的0.5 μM (8)，1 mM 锌离子，再加入不同浓度的目标miRNA，混合溶液继续培育扩增1.5小时在25 °C的环境下，各样品的体积均为20 μL，连接后，样品被稀释到50 μL；其中底物(2)需要用咪唑(pH=6.0，用HCl调节)、EDC·HCl修饰；方法：40 μL 10 μM的底物(2)与5 μL 0.1 μM咪唑和5 μL 0.1 μM EDC·HCl，25 °C培养2小时，再利用色谱分析柱(G-25)纯化底物；
1.2形成再生脱氧核酶
脱氧核酶序列(4)与改良咪唑底物亚基(2)和羟基化的亚基(3)结合，在锌离子的存在下连接到3′和5′各自底物亚基的末端；通过发夹域连接脱氧核酶是稳定的，包括亚基(4)与底物亚基(2)脱氧核酶序列的一部分结合； 脱氧核酶(5)脱氧核酶的第二段序列，结构域(I)的一个扩展的发夹结构域(II)；得到结合第二个底物亚基(3)的核酸(5)；在分析物(1)的存在下，发夹结构域(II)打开，使2个脱氧核酶和底物亚基(4)/(2)和(5)/(3)自组装在一起；在锌离子的存在下，脱氧核酶是有活性的，导致连接亚基(2)和(3)形成连接产品(7)；
1.3第一扩增步骤
在步骤1.2基础上引入一个“辅助”的核酸(6)，“辅助”核酸(6)与锌离子连接脱氧核酶亚基形成的一个更稳定的结构；由连接产物与锌离子脱氧核酶亚基和(7)/(8)双相组成的连接产物打开发夹；将连接物(7)从锌离子脱氧核酶亚基中的催化分离，“辅助”核酸(6)与锌离子连接脱氧核酶亚基互补；由于“辅助”核酸(6)和脱氧核酶单位之间的稳定双相结构，链置换过程，导致形成“M”结构并且释放原本没有产生荧光信号的连接产品，连接产品再打开发夹(8)，产生荧光；
1.4第二扩增步骤
混合物由连接产物(7)和脱氧核酶亚基之间双工结构组成，并且在(8)和连接产物(7)之间形成的双工结构是受Nt.BspQI切口酶的影响，Nt.BspQI切口酶切割在(7)/(8)的复式结构中(8)的单链区域；这导致分离为淬灭剂标记的核酸片段(9)，荧光标记片段(10)，和再生连接产品(7)，进一步打开发夹结构(8)；这是切割复式结构(7)/(8)再生连接产物，从而循环打开发夹(8)和催化再生荧光标记片段(10)，通过Nt.BspQI切割酶介导再生连接产物；
1.5目标物含量的测定
目标物的浓度在0-20 nM的范围内符合方程y=916.65+21.46x，R=0.79686；目标物的浓度在20-200 nM的范围内符合方程y=1225.96+4.18x，R=0.99492；由这两个方程我们可以利用荧光信号的强度来计算溶液中目标物的含量。
2.如权利要求1所述的一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法，其特征是酶性DNA机器的构建。
3.如权利要求1所述的一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法，其特征是酶性DNA机器用于miRNA的检测。
4.如权利要求1所述的一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法，其特征是步骤1.3和1.4的两步放大过程。
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|---|---|---|---|
| CN201710581787.9A CN107142332A (zh) | 2017-07-17 | 2017-07-17 | 一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法 |
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| CN201710581787.9A CN107142332A (zh) | 2017-07-17 | 2017-07-17 | 一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN107142332A true CN107142332A (zh) | 2017-09-08 |
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ID=59775808
Family Applications (1)
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| CN201710581787.9A Pending CN107142332A (zh) | 2017-07-17 | 2017-07-17 | 一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法 |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN107142332A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107727621A (zh) * | 2017-09-29 | 2018-02-23 | 济南大学 | 一种无酶标记DNA逻辑体系检测miRNA的方法 |
| CN108642137A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-10-12 | 福州大学 | 一种利用回文锁式探针检测肿瘤生物标志物的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN105018603A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-11-04 | 中山大学 | 一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用 |
-
2017
- 2017-07-17 CN CN201710581787.9A patent/CN107142332A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018603A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-11-04 | 中山大学 | 一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170908 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |