CN112903641A - 一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器及其检测方法和应用 - Google Patents

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CN112903641A CN202110071288.1A CN202110071288A CN112903641A CN 112903641 A CN112903641 A CN 112903641A CN 202110071288 A CN202110071288 A CN 202110071288A CN 112903641 A CN112903641 A CN 112903641A
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Abstract

本发明提供一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器及其检测方法和应用，属于检测分析技术领域。本发明中的生物传感器至少包括组蛋白修饰酶酶促底物、DNA探针、磁珠和滚环扩增模板；其中，所述组蛋白修饰酶酶促底物为羧基端生物素化的多肽；所述DNA探针包括适配体和引物序列；所述适配体识别待测组蛋白修饰酶；所述引物与滚环扩增模板发生结合互补。本发明基于适配体介导的组蛋白修饰位点特异性滚环扩增，从而在飞摩尔水平上对组蛋白修饰酶进行无标记检测，无需涉及任何抗体和放射性/荧光标记，并且引入组蛋白修饰位点特异性滚环扩增可以大大提高检测灵敏度，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器及其检测方法和应用
技术领域
本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器及其检测方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
组蛋白是染色质的关键蛋白质成分，负责将基因组DNA包装在真核细胞中。在细胞核中，H2A、H2B、H3和H4四个核心组蛋白被147bp的DNA片段包裹，形成核小体结构，重复的核小体在接头组蛋白H1的协助下进一步浓缩为染色质。蛋白质在进化上高度保守，其N末端经常受到各种组蛋白修饰酶催化的翻译后修饰(例如，乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等)。这些正常的组蛋白修饰在基本的细胞功能中起着关键作用，包括转录调控、信使RNA的剪接和记忆形成。然而，组蛋白修饰酶的失调可能会干扰组蛋白修饰并影响下游的生物学功能。
此前，基于放射性同位素标记底物的放射性测定已广泛用于组蛋白修饰酶测定，但是有害物质的介入和异质程序限制了它们的实际应用。另外，已引入酶联测定法以同质方式进行组蛋白修饰酶的非放射性检测，但它们需要多种酶的配合，成本高昂且复杂。质谱分析法能够通过直接鉴定修饰的底物残基来检测组蛋白修饰酶，但是它涉及昂贵的仪器和复杂的程序。近年来，已开发出多种基于抗体的组蛋白修饰酶检测方法，并结合了基于量子点的荧光共振能量转移、基于金纳米颗粒的比色检测以及基于全内反射荧光的单分子检测。抗体相对昂贵且难以从细胞和动物中产生，在苛刻的测定条件下稳定性差。到目前为止，由于无法像核酸一样扩增酶/蛋白质信号，因此对低丰度组蛋白修饰酶的灵敏检测仍然具有挑战性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器及其检测方法和应用。本发明基于适配体介导的组蛋白修饰位点特异性滚环扩增，从而在飞摩尔水平上对组蛋白修饰酶进行无标记检测，适配体-引物可以与滚环扩增的模板结合，产生丰富的单链滚环扩增产物，可以通过使用SYBR Gold染料以无标记的方式简单地进行测量。该测定法使用适配体进行修饰位点识别，并使用SYBR Gold染料进行信号测量，检测限低至200飞摩尔每升，本发明无需涉及任何抗体和放射性/荧光标记，并且引入组蛋白修饰位点特异性滚环扩增可以大大提高检测灵敏度，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器，所述生物传感器至少包括组蛋白修饰酶酶促底物、DNA探针、磁珠和滚环扩增模板；
其中，
所述组蛋白修饰酶酶促底物为羧基端生物素化的多肽；
所述DNA探针包括适配体和引物序列；
所述适配体可以有效识别待测组蛋白修饰酶；
所述引物与滚环扩增模板可以发生结合互补。
进一步的，所述适配体和引物序列之间设置有间隔区，从而以减少适配体-肽结合和引物-模板碱基配对中的空间位阻。
所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠，在待测组蛋白修饰酶存在的情况下，所述组蛋白修饰酶催化组蛋白修饰酶酶促底物产生修饰位点，由于修饰位点和适配体之间的高结合亲和力，所得底物可通过特定的生物素-链霉亲和素相互作用组装在链霉亲和素包被的磁珠上，从而形成磁珠-肽链-适配体-引物复合结构。
进一步的，所述生物传感器还包括荧光染料，所述荧光染料可以是SYBR Gold染料，由于SYBR Gold染料-核酸复合物的量子产率高，因此SYBR Gold染料可以结合核酸以诱导超过1000倍的信号增强，从而进行信号测量。
当所述组蛋白修饰酶为乙酰基转移酶Tip60时，所述组蛋白修饰酶酶促底物为H4多肽底物，其氨基酸序列如下：GGKGLGKGGAKRHRK-biotin(SEQ ID NO.1)；
所述DNA探针其核苷酸序列如下：
Figure BDA0002905875250000031
Figure BDA0002905875250000032
所述滚环扩增模板其核苷酸序列如下：
CTC AGC TGT GTA ACAACA TGA AGA TTG TAG GTC AGA ACT CAC CTG TTAGAA ACTGTG AAG ATC GCT TAT TAT GTC CTA TC(SEQ ID NO.3)；
其中，带下划线的碱基表示DNA探针的引物序列与RCA模板结合的互补区，加黑部分的碱基表示DNA探针的适体序列。
本发明的第二个方面，提供一种检测组蛋白修饰酶的方法，所述方法包括：
1)将待测物与组蛋白修饰酶酶促底物共孵育后加入DNA探针继续孵育；
2)向步骤1)中加入磁珠孵育，结束后洗涤磁珠并将剩余DNA探针进行解离，然后继续高温孵育处理；
3)向步骤2)洗脱后的DNA探针加入滚环扩增模板进行滚环扩增。
所述检测组蛋白修饰酶的方法还包括对步骤3)滚环扩增产物进行荧光染色，从而实现实时荧光检测和/或凝胶电泳，以及荧光光谱测量。
本发明的第三个方面，提供上述生物传感器和/或检测方法在组蛋白修饰酶活性检测和/或筛选组蛋白修饰酶相关药物中的应用。
需要说明的是，本发明虽然以检测组蛋白修饰酶为例，提供相关检测生物传感器以及检测方法，但是基于本发明的构思，如将底物肽链以及DNA探针序列进行替换用于检测其他组蛋白酶或者其他酶类等显然也是容易想到的，因此同样应属于本发明的保护范围。
上述技术方案的有益技术效果：
1.组蛋白修饰特异性DNA适配体首次用于组蛋白修饰酶活性测定中，为整合各种DNA扩增技术(例如聚合酶链反应、指数扩增反应、链置换扩增、环介导的等温扩增)的组蛋白修饰酶的扩增检测开辟了一条新途径。该方法无标记，以SYBR Gold荧光作为信号输出，避免了昂贵的荧光标记物的参与以及不完全荧光淬灭引起的假阳性。适配体替代昂贵、稳定性差的抗体，从而实现了酶信号到可扩增DNA信号的特异性转导。
2.灵敏度高：该检测方法的检测限低至200飞摩尔每升，这是迄今为止报道的最灵敏的组蛋白修饰酶检测方法。重要的是，该检测方法可通过简单地改变肽和DNA序列轻松地扩展到其他组蛋白修饰酶的检测，为组蛋白修饰酶相关的生物医学研究和临床诊断提供了强大的平台。
3.特异性好：所使用的Tip60特异性底物肽链和特异性适配体，使得本技术方案具有较高的检测特异性；此外，对本技术方案中的各项反应条件也做了细致的优化，因此检测特异性较为出色。
4.应用范围广：上述技术方案既能实现对组蛋白乙酰转移酶Tip60活性的定量检测，也能很好地开展关于Tip60抑制剂筛选的实验；此外，上述技术方案还可用于Tip60动力学的相关测定以及成分复杂的实际样品(癌细胞)内该酶活性的灵敏测定，应用范围广泛。通过指数富集系统配体进化技术筛选其他种类组蛋白修饰酶的特异性适配体，并结合扩增技术，从而实现多种组蛋白修饰酶的特异性、超灵敏检测。因此，上述技术方案具有广泛的应用范围。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：基于组蛋白修饰位点特异性滚环扩增构建用于超灵敏检测Tip60的无标记适配体传感器示意图。插图显示了DNA探针的结构。
图2为脂糖凝胶分析滚环扩增反应产物和SYBRGold染料的荧光发射光谱相关图，其中，A为脂糖凝胶分析滚环扩增反应产物。M道：DL2000 DNA标准物；泳道1：phi29+DNA探针+滚环扩增模板；泳道2：Tip60+DNA探针+滚环扩增模板；泳道3：Tip60+phi29+DNA探针；泳道4：Tip60+phi29+滚环扩增模板；泳道5：Tip60+phi29+DNA探针滚环扩增模板；B为SYBRGold染料的荧光发射光谱。多肽底物+DNA探针(线4)，Tip60+多肽底物+DNA探针(线3)，多肽底物+DNA探针+滚环扩增模板(线2)和Tip60+多肽底物+DNA探针+滚环扩增模板(线1)。实验中使用了200纳摩尔每升Tip60、60微摩尔每升多肽底物，0.6Uphi29 DNA聚合酶，500纳摩尔每升DNA探针和0.4纳摩尔每升滚环扩增模板。
图3为Tip60荧光响应相关图，其中，A为响应Tip60系列稀释的荧光发射光谱；B为荧光强度与Tip60浓度的对数之间的线性关系。误差棒代表来自三个独立测量值的标准偏差。
图4为响应BSA(10微克每毫升)，Dam(10单位每毫升)，CpG(10单位每毫升)，PKA(10单位每毫升)，PNK(10单位每毫升)，TIP60(200纳摩尔每升)的荧光强度，对照组则不含任何蛋白质/酶。误差棒代表来自三个独立测量的标准偏差。
图5为Tip60对不同浓度有机小分子NU9056的相对活性。插图显示了有机小分子NU9056的结构。误差棒代表来自三个独立测量值的标准偏差。
图6为宫颈癌细胞的SYBR Gold的荧光发射光谱相关图；其中，A为响应不同数量的宫颈癌细胞的SYBR Gold的荧光发射光谱；B为Tip60响应有机小分子NU9056处理的10000个宫颈癌细胞的相对活性。误差棒代表来自三个独立测量值的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，现有针对组蛋白修饰酶等酶类检测普遍存在耗时长、样品消耗量大、制备或检测过程复杂繁琐、灵敏度差等缺点。
有鉴于此，开发一种简单、灵敏的方法来检测组蛋白修饰酶的活性是非常必要的。本发明首次开发了适配体介导的组蛋白修饰位点特异性滚环扩增，用于在飞摩尔水平上对组蛋白修饰酶进行无标记检测。Tip60是一种乙酰基转移酶，可以催化H4组蛋白上的赖氨酸残基乙酰化。Tip60的存在下，催化产生修饰位点。由于修饰位点和适配体之间的高亲和力，从而形成磁珠-肽链-适配体-引物生物复合结构。适配体-引物可以与滚环扩增的模板结合，产生丰富的单链滚环扩增产物，可以通过使用SYBR Gold染料以无标记的方式简单地进行测量。该测定法使用适配体进行修饰位点识别，并使用SYBR Gold染料进行信号测量，检测限低至200飞摩尔每升，这是迄今为止报道的最灵敏的组蛋白修饰酶检测方法。本技术无需涉及任何抗体和放射性/荧光标记，并且引入组蛋白修饰位点特异性滚环扩增可以大大提高检测灵敏度。本技术还可进一步应用于酶活动力学分析、酶活性抑制剂的筛选及不同细胞系中组蛋白修饰酶活性的检测，为组蛋白修饰酶相关的生物医学研究和临床应用研究提供了强有力的检测技术平台。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器，所述生物传感器至少包括组蛋白修饰酶酶促底物、DNA探针、磁珠和滚环扩增模板；
其中，
所述组蛋白修饰酶酶促底物为羧基端生物素化的多肽；
所述DNA探针包括适配体和引物序列；
所述适配体可以有效识别待测组蛋白修饰酶；
所述引物与滚环扩增模板可以发生结合互补。
本发明的又一具体实施方式中，所述适配体和引物序列之间设置有间隔区，从而以减少适配体-肽结合和引物-模板碱基配对中的空间位阻。
本发明的又一具体实施方式中，所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠，在待测组蛋白修饰酶存在的情况下，所述组蛋白修饰酶催化组蛋白修饰酶酶促底物产生修饰位点，由于修饰位点和适配体之间的高结合亲和力，所得底物可通过特定的生物素-链霉亲和素相互作用组装在链霉亲和素包被的磁珠上，从而形成磁珠-肽链-适配体-引物复合结构。
本发明又一具体实施方式中，所述生物传感器还包括荧光染料，所述荧光染料可以是SYBR Gold染料，由于SYBR Gold染料-核酸复合物的量子产率高，因此SYBR Gold染料可以结合核酸以诱导超过1000倍的信号增强，从而进行信号测量。
本发明又一具体实施方式中，当所述组蛋白修饰酶为乙酰基转移酶Tip60时，所述组蛋白修饰酶酶促底物为H4多肽底物，其氨基酸序列如下：GGKGLGKGGAKRHRK-biotin(SEQID NO.1)；
本发明的又一具体实施方式中，所述DNA探针其核苷酸序列如下：
Figure BDA0002905875250000081
本发明的又一具体实施方式中，所述滚环扩增模板其核苷酸序列如下：
CTC AGC TGT GTA ACA ACATGA AGA TTG TAG GTC AGA ACT CAC CTG TTA GAAACT GTG AAG ATC GCT TAT TAT GTC CTATC(SEQ ID NO.3)；
其中，带下划线的碱基表示DNA探针的引物序列与RCA模板结合的互补区，加黑部分的碱基表示DNA探针的适体序列。
本发明又一具体实施方式中，提供一种检测组蛋白修饰酶的方法，所述方法包括：
1)将待测物与组蛋白修饰酶酶促底物共孵育后加入DNA探针继续孵育；
2)向步骤1)中加入磁珠孵育，结束后洗涤磁珠并将剩余DNA探针进行解离，然后继续高温孵育处理；
3)向步骤2)洗脱后的DNA探针加入滚环扩增模板进行滚环扩增。
其中，
所述步骤1)中，所述磁珠为链霉亲和素包覆的磁珠；
共孵育处理条件为：35～40摄氏度孵育0.5～2小时，优选为37摄氏度孵育40分钟；
继续孵育处理条件为：20～30摄氏度孵育0.5～2小时，优选为37摄氏度孵育60分钟；
所述步骤2)中，加入磁珠孵育处理条件为：室温下孵育0.5～2小时，优选为室温孵育30分钟；
高温孵育处理条件为90～100摄氏度孵育0.1～1小时，优选为95摄氏度孵育10分钟。
所述步骤3)中，滚环扩增反应条件具体为：35～40摄氏度孵育0.5～2小时，优选为37摄氏度孵育60分钟。
所述检测组蛋白修饰酶的方法还包括对步骤3)滚环扩增产物进行荧光染色，从而实现实时荧光检测和/或凝胶电泳，以及荧光光谱测量。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述生物传感器和/或检测方法在组蛋白修饰酶活性检测和/或筛选组蛋白修饰酶相关药物中的应用。
在所述应用中，对组蛋白修饰酶活性检测的应用环境可以为外界自然环境或者生物体体内环境，所述生物体体内环境包括生物个体、器官、组织或细胞，可以是生物体细胞(如癌细胞)。
所述组蛋白修饰酶相关药物包括但不限于组蛋白修饰酶抑制剂或组蛋白修饰酶激活剂。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中涉及的核苷酸/氨基酸序列信息如下表所示：
Figure BDA0002905875250000101
带下划线的碱基表示DNA探针的引物序列与RCA模板结合的互补区，加黑部分的碱基表示DNA探针的适体序列。
实施例
细胞培养和细胞提取物的制备：将人宫颈癌细胞(HeLa细胞)在含有10％胎牛血清、50单位每毫升青霉素和50微克每毫升链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagles medium，DMEM)，在含5％二氧化碳的37℃培养箱中进行培养。使用核提取试剂盒，根据说明书制备全细胞提取物。将细胞用8毫升预冷的磷酸盐缓冲溶液/磷酸酶抑制剂缓冲液(0.8毫升10×磷酸盐缓冲溶液、6.8毫升去离子水、0.4毫升磷酸酶抑制剂)洗涤两次，然后通过轻轻刮擦细胞，从培养皿中取出并转移到预冷的2毫升管中。将细胞悬液在4℃预冷的离心机中以200相对离心力离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于300微升裂解缓冲液(30微升10毫摩尔每升二硫苏糖醇、267微升裂解缓冲液、3.0微升蛋白酶抑制剂混合物)中。将该悬浮液在冰上孵育30分钟，以2分钟的时间间隔上下吸液混合3分钟。将悬浮液涡旋30秒，并在预冷至4℃的离心机中以14000相对离心力离心20分钟。将含有核蛋白提取物的上清液转移至预冷的微量离心管中，并保存在-80℃。
Tip60检测：将含有指定浓度的Tip60、60微摩尔每升多肽底物、500微摩尔每升乙酰辅酶A，1微升反应缓冲液(100毫摩尔每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5)的10微升反应混合物在37℃下孵育40分钟。然后加入500纳摩尔每升DNA探针，并在1×结合缓冲液(3毫摩尔每升氯化钾、10毫摩尔每升磷酸氢二钠、2毫摩尔每升磷酸二氢钾、10毫摩尔每升氯化钠和5毫摩尔每升氯化镁，pH 7.4)中于24℃孵育60分钟。随后，添加20微升磁珠并在室温下孵育30分钟。将磁珠洗涤3次后，将剩余的DNA探针用40微升去离子水解离，然后在95℃下孵育10分钟。对于滚环扩增反应，反应混合物50微升，其中包含5微升10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液(500毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-盐酸、100毫摩尔每升氯化镁、100毫摩尔每升(硫酸铵、40毫摩尔每升二硫苏糖醇、pH 7.5)、0.4纳摩尔每升滚环扩增模板、200微摩尔每升dNTP、0.6U phi29 DNA聚合酶和40微升洗脱的DNA探针在37℃下孵育60分钟。用1×SYBRGold将滚环扩增产品染色，并用荧光仪进行测量。测量荧光的最终体积为60微升，其中包含50微升滚环扩增产物、6微升10×SYBR Gold和4微升去离子水。记录520-750纳米范围内的发射光谱以进行数据分析。
凝胶电泳：在室温下在1×TAE缓冲溶液(40毫摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-乙酸、2毫摩尔每升乙二胺四乙酸)中以110V恒定电压在室温下通过1％琼脂糖凝胶(1.4g琼脂糖、2.8毫升50×TAE缓冲液、137.2毫升去离子水)电泳分析20微升最终扩增产物。将包含20微升的滚环扩增产物、1×上样缓冲液、1×SYBR Gold的混合物加载到凝胶上进行电泳，凝胶运行时间50分钟，并通过成像系统成像。
Tip60活性抑制实验：为了评估Tip60抑制剂的作用效果，将9微升含有指定浓度的有机小分子NU9056、0.54微升的3.71微摩尔每升Tip60、0.6微升的1毫摩尔每升多肽底物、1微升的10×反应缓冲液(1摩尔每升4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.5)的反应混合物在室温下孵育10分钟。随后，将1微升的5毫摩尔每升乙酰辅酶A添加到混合物中，并在37℃下孵育40分钟。Tip60活性测定遵循上述相同步骤。
实验原理(如图1)：合成了羧基端生物素化的15个氨基酸的多肽，作为Tip60的酶促底物。此外，合理地设计了一种DNA探针，该探针由39个核苷酸的适配体和一个20个核苷酸的引物组成，该引物由间隔区隔开，用于识别并将Tip60酶信号转导为可扩增的核酸信号。引入间隔区以减少适配体-肽结合和引物-模板碱基配对中的空间位阻。在目标Tip60的存在下，它催化H4肽底物乙酰化，产生修饰位点。由于修饰位点和适配体之间的高结合亲和力，所得的乙酰化肽底物可通过特定的生物素-链霉亲和素相互作用组装在链霉亲和素包被的磁珠上，从而形成磁珠-肽链-适配体-引物复合结构。在通过洗涤磁珠去除未结合的探针后，与修饰位点结合的探针在95℃加热下被解离。由于引物与滚环扩增模板之间具有完美的互补性，释放的DNA探针的引物可以与滚环扩增模板结合，产生丰富的单链滚环扩增产物，可以通过使用SYBR Gold染料以无标记的方式简单地进行荧光测量。由于SYBR Gold染料-核酸复合物的量子产率高，因此SYBR Gold染料可以结合核酸以诱导超过1000倍的信号增强。相反，在没有Tip60的情况下，H4肽底物保持不变，不产生H修饰位点，也无法触发滚环扩增来产生扩增的DNA信号。该测定法使用适配体进行组蛋白修饰酶识别，并使用SYBRGold染料进行信号测量，而无需涉及任何抗体和放射性或荧光标记，并且引入组蛋白修饰位点特异性滚环扩增可以大大提高检测灵敏度。
1.原理的实验验证
使用1％琼脂糖凝胶分析滚环扩增反应的产物。如图2A所示，在没有Tip60的情况下(图2，A，泳道1)，即使存在phi29 DNA聚合酶+DNA探针+滚环扩增模板，也没有观察到明显的条带。相反，在进一步添加Tip60时，观察到滚环扩增产物的明显条带(图2，A，泳道5)。此外，在反应系统中缺少phi29聚合酶(图2，A，泳道2)、DNA探针(图2，A，泳道3)和滚环扩增模板(图2，A，泳道4)中的任何一个的情况下，滚环扩增产物消失，表明这些成分对于靶标诱导的滚环扩增反应至关重要。这些结果清楚地表明，仅靶标Tip60存在时可以诱导滚环扩增反应。
进一步采用荧光测量来验证靶标诱导的信号放大。当不存在Tip60时，在存在肽底物+DNA探针的情况下观察到较低的背景信号(图2，B，4)，并且通过进一步添加靶标Tip60(图2，B，3)，信号增强了83％(DNA探针与乙酰化肽底物结合的结果)。此外，与不使用Tip60的组(图2，B，2)相比，由于添加了Tip60的滚环扩增模板，响应Tip60(图2，B，1)的荧光信号增强了785％。滚环扩增放大的信号比没有滚环扩增放大的信号高9.46倍，这表明扩增的引入有利于低丰度组蛋白修饰酶的灵敏检测。
2.灵敏度实验
在最佳实验条件下，测量了连续稀释Tip60的荧光信号。随着Tip60浓度的增加，荧光信号逐渐增强(图3，A)，并且在537纳米处的荧光强度与Tip60浓度的对数之间(在1皮摩尔每升至100纳摩尔每升之间)获得了良好的线性关系(图3，B)。回归方程为F＝48.5log10C+259.8，线性相关系数为0.9846，其中F和C分别表示荧光强度和Tip60浓度。通过评估空白的平均信号加上三倍标准偏差，可以将检测极限计算为220飞摩尔每升。此测定法的灵敏度比异硫氰酸荧光素标记的基于肽的荧光测定法(100皮摩尔每升)高454倍，比基于抗体和基于量子点的荧光测定法(500皮摩尔每升)高2224倍，和比基于抗体的单分子荧光检测(21皮摩尔每升)高两倍.灵敏度提高归因于以下因素：(1)通过特异性适配体识别将Tip60信息有效转导至核酸信号，(2)磁性分离导致的最低背景，以及(3)滚环扩增诱导的高信号放大。
3.特异性实验
如图4所示，通过使用牛血清白蛋白(BSA)、DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam)、CpG甲基转移酶(CpG)、蛋白激酶A(PKA)和T4多核苷酸激酶(PNK)进一步研究了该技术的特异性。BSA是一种经常使用的无关蛋白。Dam和CpG是甲基转移酶，可催化5'…GATC…3'序列中的腺嘌呤残基和5'...CG...3'序列中的胞嘧啶残基的甲基化。PKA负责丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化。PNK可以催化磷酸基团从三磷酸腺苷到DNA/RNA的5'-羟基末端的转移。从理论上讲，这些蛋白质/酶中的任何一种都不能使肽链乙酰化，因此磁珠无法捕获任何DNA探针并进行滚环扩增反应，也没有检测到信号。如预期的那样，仅在响应目标Tip60时观察到高荧光信号，而在响应BSA、Dam、CpG、PKA和PNK时观察到与对照组相似的低信号。这些结果证明了所提出的适配体传感器对Tip60的优异特异性。
4.抑制剂实验
对于抑制分析，使用有机小分子NU9056作为模型小分子抑制剂。NU9056可以特异性地靶向Tip60以减少Tip60催化的组蛋白乙酰化。如图5所示，随着有机小分子NU905浓度的增加，Tip60的相对活性以剂量依赖性方式降低。半抑制浓度数值经计算为1.7939微摩尔每升，与通过放射性测定获得的值(2微摩尔每升)一致。这些结果表明该测定法可用于筛选Tip60抑制剂，且具有较高的选择性。在药物开发和疾病治疗方面表现出巨大的潜力。
5.细胞实验
为了验证所提出的用于实际样品分析的测定方法的可行性，直接测量了人类宫颈癌细胞系(HeLa细胞)细胞提取物中的内源性Tip60活性。如图6，A所示，随着宫颈癌细胞的数目从0增加到10000个细胞，荧光信号增强，甚至可以灵敏地检测到500个细胞。此外，10微摩尔每升和100微摩尔每升有机小分子NU9056可以分别导致Tip60活性降低60.4％和68.3％(图6，B)。这些结果表明，该测定法可用于复杂生物样品中内源性Tip60活性的准确定量。这些结果清楚地表明，所提出的方法可用于检测组蛋白乙酰转移酶，为癌症研究和非侵入性诊断提供了新的强大平台。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器及其检测方法和应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> H4多肽底物
<400> 1
Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys Arg His Arg Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> DNA探针
<400> 2
gtaagttaat tggacttggt cgtgtgcggc acagcgataa aaaaaaaaaa aaacacagct 60
gaggatagga cat 73
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 滚环扩增模板
<400> 3
ctcagctgtg taacaacatg aagattgtag gtcagaactc acctgttaga aactgtgaag 60
atcgcttatt atgtcctatc 80

Claims (10)

1.一种检测组蛋白修饰酶的生物传感器，所述生物传感器至少包括组蛋白修饰酶酶促底物、DNA探针、磁珠和滚环扩增模板；
其中，
所述组蛋白修饰酶酶促底物为羧基端生物素化的多肽；
所述DNA探针包括适配体和引物序列；
所述适配体识别待测组蛋白修饰酶；
所述引物与滚环扩增模板发生结合互补。
2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述适配体和引物序列之间设置有间隔区。
3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述磁珠为链霉亲和素包被的磁珠；
所述生物传感器还包括荧光染料，所述荧光染料包括SYBR Gold染料。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述检测组蛋白修饰酶为乙酰基转移酶Tip60。
5.如权利要求4所述的生物传感器，其特征在于，
所述组蛋白修饰酶酶促底物为H4多肽底物，其氨基酸序列如下：GGKGLGKGGAKRHRK-biotin(SEQ ID NO.1)；
所述DNA探针其核苷酸序列如下：5'-GTA AGT TAA TTG GAC TTG GTC GTG TGC GGCACA GCG ATA AAA AAA AAA AAA AAC ACA GCT GAG GAT AGG ACA T-3'(SEQ ID NO.2)；
所述滚环扩增模板其核苷酸序列如下：
CTC AGC TGT GTA ACA ACA TGA AGA TTG TAG GTC AGA ACT CAC CTG TTA GAA ACTGTG AAG ATC GCT TAT TAT GTC CTA TC(SEQ ID NO.3)。
6.一种检测组蛋白修饰酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)将待测物与组蛋白修饰酶酶促底物共孵育后加入DNA探针继续孵育；
2)向步骤1)中加入磁珠孵育，结束后洗涤磁珠并将剩余DNA探针进行解离，然后继续高温孵育处理；
3)向步骤2)洗脱后的DNA探针加入滚环扩增模板进行滚环扩增。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述磁珠为链霉亲和素包覆的磁珠；
共孵育处理条件为：35～40摄氏度孵育0.5～2小时，优选为37摄氏度孵育40分钟；
继续孵育处理条件为：20～30摄氏度孵育0.5～2小时，优选为37摄氏度孵育60分钟；
所述步骤2)中，加入磁珠孵育处理条件为：室温下孵育0.5～2小时，优选为室温孵育30分钟；
高温孵育处理条件为90～100摄氏度孵育0.1～1小时，优选为95摄氏度孵育10分钟；
所述步骤3)中，滚环扩增反应条件具体为：35～40摄氏度孵育0.5～2小时，优选为37摄氏度孵育60分钟。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测组蛋白修饰酶的方法还包括对步骤3)滚环扩增产物进行荧光染色，从而实现实时荧光检测和/或凝胶电泳，以及荧光光谱测量。
9.权利要求1-5任一项所述生物传感器和/或权利要求6-8任一项所述检测方法在组蛋白修饰酶活性检测和/或筛选组蛋白修饰酶相关药物中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，对组蛋白修饰酶活性检测的应用环境为外界自然环境或者生物体体内环境，所述生物体体内环境包括生物个体、器官、组织或细胞；或，
所述组蛋白修饰酶相关药物包括组蛋白修饰酶抑制剂或组蛋白修饰酶激活剂。
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