JP4871481B2

JP4871481B2 - 損傷及びｄｎａ修復に関わるタンパク質の活性を検出及び特徴付ける方法

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Publication number: JP4871481B2
Application number: JP2001586602A
Authority: JP
Inventors: ソウヴェイゴ，シルヴィ
Original assignee: コミッサリアアレネルジーアトミークエオゼネルジザルタナテイヴ
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2012-02-08
Anticipated expiration: 2021-05-23
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Description

【０００１】
（ＤＮＡ損傷の修復に関与するタンパク質の活性の検出及び特徴付け）
（技術的分野）
本発明の目的は、ＤＮＡ損傷の修復に関与するタンパク質の活性を検出して特徴付けするための方法である。
それは、ＤＮＡの修復に関与する酵素及びタンパク質因子の研究、そして生活圏にある化学物質又は物理的因子の遺伝毒性の研究へ特に応用できる。
【０００２】
（先行技術の状況）
傷害や損傷は、種々の化学的因子又は物理的因子へ曝すことによって、特に照射（イオン化及び太陽放射）、酸化剤による誘導によって、又はある遺伝毒性又は細胞毒性剤へ曝した後で、細胞性ＤＮＡに形成される。損傷ヌクレオチドも、細胞老化の過程の間に、自然に蓄積する。
核酸に対する傷害又は損傷には幾つかの型があり、殆どの場合、それらを誘導する薬剤の特徴である。これらの型の損傷には、核酸に対する単鎖及び二重鎖開裂、エベイシック部位及び修飾を含む。
【０００３】
異なる修復機構は、傷害の性質に依存して関与しており、そしてそれらでさえも競争を始める。三つの主要な修復機構の間には、区別をつけることが可能である；ミスマッチ修復、ヌクレオチドの切除による修復（ＲＥＮ)、そして塩基の切除による修復（ＲＥＢ)である。さらには、減数分裂の間に関与する細胞性機構に相当する組み換えは、二重鎖ＤＮＡ切断の修復を可能にする。
これらの機構には、異なる修復タンパク質が関与する。従って、ヌクレオチドの切除による修復機構（ＲＥＮ）には、以下のような幾つかの工程が関与する：
１）タンパク質複合体による損傷の認識、
２）傷害の各部位の、傷害を含有するストランドの切開、
３）傷害を含有するオリゴヌクレオチド断片の切除、そして
４）最終ライゲーションによる新規の良好なＤＮＡ鎖の合成。
【０００４】
この機構には、多くのタンパク質及び酵素が関与しており、光誘導傷害及び化学的処理によって生じる大容量の損傷を主に修復する。
塩基除去修復（ＲＥＢ）機構には、グリコシラーゼと呼ばれる酵素のファミリーが働く。これらは、時折、切除される基質に対して特異的であるが、通常は修飾カテゴリーを認識する。又、幾つかのグリコシラーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を有する。これらの酵素は、酸化された、断片化された、又はアルキル化された塩基を修復する。このシステムには、また、エベイシック部位、あるミスマッチ、そしてある一本鎖切断が含まれる。
【０００５】
６つのグリコシラーゼがヒトにおいて同定され（Wilson III, D. M 及びThompson, L.H., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., 94, 12754-12757ページ[9]）、それらは、脱アミノ化された、酸化された、アルキル化された塩基の修復、又はあるミスマッチの修正にとって主に有用である。グリコシラーゼの作用は、除去される塩基からホスホジエステル結合の５'を切開する特異的エンドヌクレアーゼによって認識されるエベイシック部位の形成を生じる。ポリメラーゼは除去されたヌクレオチドを置換し、リガーゼはヌクレオチド鎖を閉じる。あるグリコシラーゼが、傷害部位のホスホジエステル結合の３'を切開し、５'リン酸末端の形成を生じせしめることに注記すべきである。ＤＮＡの小さな損傷断片が除去され、次いで置換される間に、このＲＥＢ法の代替法がある。これは、ある単鎖ＤＮＡ切断に関連する。同定された遺伝子によってコードされる特異的酵素は、それ故に、確定した傷害の切除に関連している。
【０００６】
細胞性修復活性を評価するために設計された方法は、複雑であり、実施するには困難である。それらは、しばしば、化学的に修飾されたプラスミドの利用を必要とする。細胞性抽出物の修復能力は、切除されたストランドの再合成の間の、印の付いたヌクレオチドの取り込みに関連するこれら修飾を修復することによって、インビトロで測定される。この方法は、最初に、Woodら., Cell, 53, 1988, ９７−１０６ページ［１］によって開発された。超曲線化されたプラスミドは、Ｃ型ＵＶ照射、又はアセチルアミノフルオレン、又はシスジクロロジアミノネプラチンによって修飾される。次いで、プラスミドを、細胞性抽出物、４つのデオキシヌクレオシド三リン酸で、そのうちの１つを^３２Ｐによってそのα位置をマークしたもの、ＡＴＰ及びＡＴＰ再生システムを含有する培地でインキュベートする。傷害は、Sallesら., Biochimie, 77, 1995, 796-802ページ[2]に記載のように、ヌクレオチド切除又は塩基切除システムによって、インキュベーションの間に除去することができる。ＤＮＡ再合成速度は、アガロースゲル上でのＤＮＡの移動の後、そして探索片の放射活性を計測した後で決定する。修復の重要性と特異性は、抽出物の質、そしてプラスミド、生成された傷害、及び反応パラメーターに関連している。特に、最初のプラスミド調製は、処理前の切断物を含有するプラスミドの除去、又は重合開始部位を提供するであろう細菌性染色体断片の除去のために重要である。
【０００７】
この技術のその他の不利な点は、生成された傷害に関連している。用いられる処置は、単一の欠点を誘導しない。例えば、ＵＶＣ照射によって生成された殆どの損傷は、ピリミジン二量体のシクロブタン型である。しかし、他の傷害は、例えば光生産物、鎖切断、シトシン水和物、等として形成される。従って、各型の傷害の修復の特定のモニタリングは、これら基質を使用しては容易ではない。
【０００８】
文献ＦＲ-Ａ-２７３１７１１［３］は、固体支持体上にＤＮＡを固定し、次いで、傷害を産する産物の手法によってこのＤＮＡ上に傷害を生成し、そして修復因子とマーカーを含有する細胞抽出物を用いることで構成されるＤＮＡ傷害を検出する方法を記載している。このシステムの目的は、ある化学的基質の遺伝毒性効果を測定することが可能なことである。プラスミド型のＤＮＡは、最初に固体層（マイクロプレートウェル）上に固定され、次いで、そのプラスミドは化学的に修飾される。修復反応は、新しく合成された鎖の非放射活性検出を可能にする修飾三リン酸ヌクレオチドの存在下でおこなわれる。このシステムでは、必修の位置に標的化手法によって特定の修飾を取り込むことが不可能である。それは、修復系によって認識される損傷を同定することなしに、ＤＮＡ修飾剤の広範な効果を検出することができるシステムである。さらには、この方法の目的は、ＤＮＡ修復に関与するタンパク質の活性を検出及び定量化するのではなく、むしろ処理されたＤＮＡ上の損傷の存在を同定することである。
【０００９】
Pageら., Biochemistry, 29, 1990, ページ1016-1024[4]及びHuangら., Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 1994, ページ12213-12217, [5], は、種々の起源からの細胞性抽出物を用いて、異なる試験を使用して損傷切除能力を測定する。特定の損傷は、短い合成オリゴヌクレオチドへ作成又は取り込まれられた。次いで、より長い二重鎖断片（１５０〜１８０対の塩基）を得るために、リガーゼによって互いに結合された。断片上の異なる位置での^３２Ｐの取り込みは、修復酵素によって作成される切断部位を位置付ける手法を提供する。この分析は、アクリルアミドゲル上での電気泳動の後のオートラジオグラフィーによっておこなわれる。この試験は、ＲＥＢ及びＲＥＮ型修復に応用できる。
【００１０】
上に示したすべての方法には、不利な点がある。殆どの場合、電気泳動による放射活性マーキング及びロングセパレーションは、損傷の切除を決定するために必要である。プラスミドの純度を保証し、バックグラウンドノイズを最小化するために注意を払う必要があるために、プラスミドの使用を実行することは困難である。さらには、すでに言及しているように、一つのストレスによって単一の型の損傷を誘導することは不可能であり、従って、幾つかの損傷がＤＮＡに同時に存在する。
Romieuら., J. Org. Chem., 63, 1998, ページ5245-5249[6]及びD'Hamら., Biochemistry, 38, 1999, ページ3335-3344[7]によって示されているように、より明確な損傷を含有する１５〜５０長塩基の合成オリゴヌクレオチド上に修復酵素を使用して、特定の特徴及び損傷の切除機構を研究することに関する方法も知られている。
【００１１】
殆どのケースでは、研究されるべき化学修飾を含有するオリゴヌクレオチドは、その末端で放射活性で標識されている。酵素の作用（切除動態、アフィニティー常数の決定、オリゴヌクレオチド断片の切断又は切断なし、単鎖又は二重鎖上への作用）は、電気泳動の後に、アクリルアミドゲル上で分析される。
その他の技術は、放射活性の使用を避けるが、大量の投資を必要とする；これは、質量分析計（ＭＡＤＩ-ＴＯＦ）による消化の分析である。この分析は、切除機構の研究を可能にするので、興味深い。一方では、それは、酵素活性の日常的な分析にとっては全く適切ではない。
【００１２】
また、修飾塩基の切除は、質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィーによって追跡される。これは、γ照射によって照射されたＤＮＡ上をエンドヌクレアーゼIIIによって、５-ヒドロキシ-５，６-ジヒドロチミン及び５，６-ジヒドロチミンの切除から始まることが示されている。この正確な技術には、幾つかの不利な点がある；それは、分析材料の大量投資を必要とし、それは、非常に感度がよくなく、そして大量の原材料を必要とし、そして日常的な分析には適切ではない。
【００１３】
発明の提示
本発明の目的は、容易に実行でき、異なる修復様式に適用でき、日常的に容易及び迅速に使用することができ、放射活性を使用しない、ＤＮＡ損傷の修復に関与しているタンパク質の検出と特徴付けについての方法である。
本発明によると、ＤＮＡの修復に関与しているタンパク質の一つ又は幾つかの活性を検出し、特徴付けることについての方法は、次の工程を含む：
ａ）少なくとも一つの損傷を含む少なくとも一つの損傷ＤＮＡを固体支持体上に固定する工程、
ｂ）この損傷ＤＮＡの修復に貢献する少なくとも一つのタンパク質を含み得る又は含まないであろう修復組成物の作用を応用する工程、及び、
ｃ）工程ｂ）の支持体上に固定する、又は工程ｂ）の支持体上から除去されたマーカーによって放射されたシグナルの変化を測定することによって、修復に関するこの（これらの）タンパク質の活性を決定する工程。
【００１４】
このプロセスでは、少なくとも一つの傷害が知られている損傷ＤＮＡは、バイオチップのような固体支持体上に固定され、修復酵素のようなタンパク質の作用、又はこのタンパク質を含み得る組成物に曝され、そして、最初に損傷ＤＮＡへ固定、又は修復プロセスの間にそれへ添加し得るマーカーを使用して修復はモニターされる。
従って、このプロセスは、ＤＮＡの修復に関与するタンパク質を特徴付けるために使用することができる。また、それは、既知の傷害に関するあるタンパク質の非機能性を示すために、又は通常はＤＮＡ修復タンパク質を含む組成物中のＤＮＡ修復タンパク質の欠如を検出するために使用できる。
【００１５】
診断上の使用のために、これらの結果を得ることは有用である。ある疾患では、修復遺伝子が弱まっていて、それらの酵素活性又は関連タンパク質は機能的ではない、又は単に部分的に機能的である（例えば、色素性乾皮症）。
このプロセスでは、固体支持体は、損傷ＤＮＡの断片によって明確化される少なくとも一つの固定化部位、そして有利には、異なる前もって選択した損傷ＤＮＡ断片を固定化することが可能な幾つかの固定化部位を含む。
【００１６】
活性が測定されるべきタンパク質は、一般的に、損傷の認識、ＤＮＡ鎖の切開、損傷の又は核酸の断片の切除、ＤＮＡのインサイツ合成、そして新しく形成されたストランドのライゲーションを含む修復プロセスに関与するタンパク質である。
例えば、このプロセスに関わるこのタンパク質は：
−傷害の偵察に関わるタンパク質、例えば、ＸＰＡ、ＴＦＩＩＨ転写因子及びその構成ポリペプチド、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ及びそれらに関連するタンパク質（ＥＲＣＣファミリー、など）、ＨＳＳＢ、など（Sancar, A.(1995) Annu. Rev. Genetics, 29, ページ69-105,[10])、
−傷害の切除に関わるタンパク質、例えばグリコシラーゼ、
−切除ストランドのヌクレオチドの再合成に関わるタンパク質、例えばポリメラーゼ、及び
−新しく形成されたストランドのライゲーションに関わるタンパク質、例えばリガーゼから選ぶことができる。
【００１７】
本発明によるプロセスの最初の実施態様によると、マーカーは、支持体上に固定された損傷ＤＮＡ上に存在し、それは、工程ｂ）のタンパク質の作用によって除去される。
例えば、この実施態様は、損傷ＤＮＡ傷害に関する切開又は切除酵素の活性を決定するために使用され得る。この場合には、マーカーは、損傷ＤＮＡの一つの末端に存在し得る。従って、切開又は切除は、マーカーを有する損傷ＤＮＡ断片を除去し、損傷ＤＮＡが固定されている支持体上の位置上のシグナルの損失を生じせしめる。
【００１８】
また、最初の実施態様は、例えば抗体のような、損傷ＤＮＡの傷害に関する特異的マーカーとともに使用してもよく、それは、工程ｂ）の前にこれら傷害を明らかにする。タンパク質が作用し、そして傷害が修復された後は、このマーカーは、もはや固定されず、修復タンパク質の活性を代表するマーカーのシグナルの損失は、観察され得る。
従って、例えば酵素反応のような、タンパク質反応の後に抗体によって放射されたシグナルに対して修復されたＤＮＡの前の特異的抗体によって放射されたシグナルの比率は、ＤＮＡ修復比率と相関している。この場合には、損傷の修復は、傷害に対して特異的なシグナルの消失によって評価される。
【００１９】
本発明によるプロセスの第二の実施態様によると、マーカーは、修復組成物に存在し、工程ｂ）の支持体に固定されたＤＮＡへ添加される。
この場合には、例えば、ポリメラーゼによって取り込まれた修飾ヌクレオチドを組成物へ添加することが可能であり、それは、新しく形成されたストランドのマーキングに使用することができる。これらの修飾ヌクレオチドは、ビオチン、ハプテン、蛍光化合物、又は核酸のマーキングに適合するいずれかの分子を有し得る。再合成の工程で導入されたこれらのマーカーは、その後に検出されることができ、そして一致するシグナルは修復比率に相関する。
【００２０】
ＤＮＡの修復に関わるタンパク質の活性を決定するために使用できるマーカーは、それらが検出できる、又は検出可能なシグナルを放射することによって明らかにすることができるシグナルを放出するという条件で、異なる型であってもよい。
幾つかのマーカー又は開発方法は、修復に関連するタンパク質活性によって、損傷ＤＮＡ断片上に生じた状態変化を示すために、同時又は順々に使用してもよい。
特に、このマーカーは、アフィニティー分子、蛍光化合物、抗体、ハプテン又はビオチンであり得る。
好ましくは、本発明によると、マーカー又はマーカーデベロッパーは、直接蛍光又は間接蛍光をともなう蛍光性化合物で構成される。例えば、これらの分子は、ストレプトアビジン-フィコエリトリン、ユウロピウムクリプテイト、フルオレセインなどの蛍光化合物、ローダミンなどによって明らかにされたアビジンであり得る。
【００２１】
蛍光分子間のエネルギー移転特性も、基質オリゴヌクレオチドにおける修復に関わっている酵素活性を定量化するために使用できる。傷害を有する塩基を含むオリゴヌクレオチドも、同じオリゴヌクレオチド又は最初のものと接触するオリゴヌクレオチドのいずれかに位置するその他の蛍光分子とのエネルギーの転移を担う蛍光分子を有する場合は、励起後のシグナルの放射は、傷害が支持体上に存在することを証明する。修復酵素による、傷害を含むオリゴヌクレオチドの切開は、切開断片の除去、蛍光シグナルの損失を生じせしめ、エネルギー転移は起こらない。このシグナル変化は、測定することができ、特定の消化速度と相関している。
本発明によると、常套的プロセスを使用して、損傷ＤＮＡを固体支持体上に固定することができる。
従って、損傷ＤＮＡは、例えば、修飾塩基を取り込むことが可能な自動化合成装置によって、固体支持体上に直接に合成することができる。
【００２２】
また、損傷ＤＮＡは、損傷ＤＮＡ断片の統合性を維持することと両立する任意の方法によって、例えば、支持体上に固定化されているその他のＤＮＡ断片とハイブリダイズすることによって、アフィニティ分子による固定化によって、又は沈着又は他の任意の方法によってチップ上に直接に固定化することによって、固体支持体上に固定することができる。
好ましくは、バイオチップは、異なる又は同一であるが完全に同定されている傷害を含む、又は完全に同定されていない複数の傷害を含むＤＮＡ断片が確定した位置に固定されている固体支持体として使用される。
【００２３】
固定化損傷ＤＮＡ断片は、短いオリゴヌクレオチド（１５−１００塩基長、好ましくは１５−５０塩基長）又はより長い断片（１００−２００００塩基）であってよい。損傷を含むオリゴヌクレオチドを長いＤＮＡ断片へ取り込ませるための異なる方法が存在する：ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ライゲーション。固定化ＤＮＡ断片は、一本又は二重ストランド型であり得る。修飾ＤＮＡは、直接又は中間分子（ビオチン、抗原、核酸、等）を介して結合し得る。
【００２４】
また、長いＤＮＡ断片は、傷害を含む任意の物理的又は化学的処理によって損傷し得る。例えば、それらは、放射活性、太陽又は紫外線照射によって照射される。それらは、光感作によって、化学剤によって、発癌物質によって損傷を受け得る。この場合、傷害は、ヌクレオチド鎖に沿って統計的に誘導される。誘導傷害の質、特異性及び量は、傷害を起こす化学又は物理的因子の選択に依存する。従って、ＤＮＡ断片へ誘導されるべき傷害のカテゴリーを標的とすることができる。
【００２５】
例えば、支持体は、ＤＮＡ断片を含有するバイオチップであってもよく、その上には、損傷ＤＮＡの相補的な部分、及びバイオチップの一つのＤＮＡ断片の相補的な部分を含むオリゴヌクレオチドを添加することによるハイブリダイゼーションによって固定化される。
本発明は、オリゴヌクレオチドの化学合成の利点から益を得て、従って、損傷を含有して包囲する正確な配列を選択することが可能であるという事実から益を得る。
【００２６】
同じような支持体は、同一又は異なる配列をともなうヌクレオチド断片によって機能化し得る。損傷は、確定してもよく又はなくてもよい配列中の異なる位置に位置し得る。
支持体（大きさ、各損傷の数及び位置など）上に固定化した断片の性質は、変化させることが可能であり、必要とされる情報の性質に依存する。
【００２７】
また、傷害を含む断片の相補性断片又は傷害を含むＤＮＡ断片は、酵素修復活性に関連するＤＮＡ形質転換の検出にとって有用であるマーカーを含み得る。これらのマーカーは、アフィニティ分子、蛍光性化合物、又は特定の型のチップに関連する任意の特定の検出システムであってもよい。
チップ（参考のチップ）上にＤＮＡ断片を固定化する場合、展開は、断片が見出される状態を特徴付けるためにおこなわれる。チップの異なるピンは、従って、それらが発するシグナルによって特徴付けられる。それらは、参考のシグナルとして使用される。
【００２８】
参考チップ、又は被験チップと呼ばれる、参考チップ上のそれらの同一の損傷ＤＮＡ断片を含むチップは、次いで、酵素修復活性を含み得る溶液の存在下でインキュベートされる。チップ上に固定化した修飾ＤＮＡ断片は、存在する酵素活性によって変換される。
被験チップ又は参考チップの第二次検討は、適切な条件の下、及び必修の展開段階の後におこなわれる。チップのピンは、従って、第一次検討でのシグナルとは異なるシグナルを発し、これは、幾つかの酵素反応のうちの一つがチップ上でおこなわれたことを意味する。
【００２９】
使用されるマーカーが検出システムと互換性があるならば、修復系に関連する酵素によって損傷を受けたＤＮＡの形質転換の測定は、チップ上の異なるピンによって放出されるシグナルの連続的な記録を作ることによってモニターされてもよいことに注意すべきである。
本発明によるプロセスは、精製タンパク質因子の酵素の研究、及び細胞性抽出物に存在する活性の研究に対して使用され得る。
【００３０】
また、ある修復酵素、特にグリコシラーゼに関する異なるＤＮＡ傷害の特異的な特徴を研究するために使用することができる。同じような分野では、これら傷害の修復動態は、異なる因子の機能としてモニターされる。これらの因子は、ヌクレオチド配列（例えば、修復される周囲の塩基の効果）又は阻害剤、又は一方では、修復活性シミュレーターに関連し得る。
特定の傷害に関する偵察及び切除に関与する酵素活性のアッセイに関する同定された傷害の修復をモニターすることが可能なことは、興味深い。例えば、特定のグリコシラーゼが、特定の傷害の切除のために存在することが知られている。従って、特定の酵素の欠損は、特定の傷害が修復されることを防ぐ。
【００３１】
支持体の小型化は、特に細胞性抽出物が使用された場合、システムの感度を向上させる手段である。本発明は、培養細胞又は生検から始まる、修復システムに関連する異なるタンパク質の検出を促進する。さらには、異なる既知の傷害を有する幾つかの損傷ＤＮＡ配列を含むバイオチップが使用された場合、同じ細胞性抽出物の限られた量に関する各損傷の修復に関する能力を検出することができる。これは、特に、ある病理及び遺伝疾患の診断をおこなう場合に、非常に重要である。
特に、本発明は、数多くの利点を有する。
【００３２】
それは、酵素活性のアッセイに関するシステムの小型化、さらに特定すると修復に関する活性を可能にする。この結果は、感度の向上となる。細胞性抽出物を得ることは、特に、それらが生物学的試料に由来して細胞株に由来しない場合に困難であるために、この改良は、非常に重要である。
それは、原核又は真核系のＤＮＡに対する損傷の修復に関連する異なる工程の機能、誘導及び抑制に関する正確な情報を得るために使用することができる。
【００３３】
従って、それは、ヒトにおける酵素活性の生物学的アッセイを評価することを容易にする。特に、色素性乾皮症、Cockaine's diseaseなどの放射線感受性又は光感受性が関与する病状に見出し得る酵素欠損の検出を可能にする。また、それは、酵素修復活性への老化の効果を研究することを容易にする。
また、本発明は、同じ小型化支持体上に固定化されたヌクレオチド断片へ取り込まれた異なる傷害に関する酵素の作用の同時研究の手段である。これは、結果の間の比較を容易にし、それらを、さらに信用可能で再現性可能にする。その他の結果は、重要な時間の節約である。
【００３４】
一番目に、本発明は、修復系の機能の評価への全体的な方法へ、幾つかの傷害、及び幾つかの機構、又は修復機構へのアクセスを同時に提供する。
研究されるべき酵素系による作用後のチップの異なるピンによって放射されるシグナルの直接の分析は、種々の修復系での工程に関する直接の情報を与え、それらがどのように機能するのかという結論へ到達することを可能にする。
【００３５】
本発明は、標的にされた傷害の修復に関わる特定のタンパク質のアッセイ、例えば、酸化された塩基の切除に関わるグリコシラーゼのアッセイを可能にする。この場合には、標的とされたグリコシラーゼにとって、好ましい基質として知られている傷害が、合成オリゴヌクレオチドに含まれ、チップ上の特定の位置に固定される。従って、異なる標的とされた傷害を含む幾つかのオリゴヌクレオチドが、ＲＥＢ系に関わる異なるグリコシラーゼの機能の評価を得るために、チップ上の異なる位置に固定される。しかし、また、本発明は、ポリメラーゼ及びリガーゼのような、すべての傷害の修復に共通する工程に関わるタンパク質のアッセイを可能にする。この場合には、低い正確性で同定された傷害を含むＤＮＡ断片を使用することができる。
【００３６】
また、チップの異なるピンに固定化された異なる基質の選択を、我々が興味を持っている修復系を標的とすることに使用できるという事実によって、本発明を特徴付けることができる。傷害を含む短いオリゴヌクレオチド（２５塩基よりも短い）の固定化は、ＲＥＢ系のタンパク質を標的化する手段である。傷害を含むより長い断片（５０塩基より長い）の固定化は、ＲＥＢ及びＲＥＮ系のタンパク質を同時に標的化する手段である。次いで、固定化された損傷の正確な選択は、研究されるべき修復系を標的にすることを可能にする。
【００３７】
従って、本発明によるプロセスは、タンパク質によるＤＮＡ傷害に対する修復動態をモニターするため、ＤＮＡの修復に関わるタンパク質の合成を阻害又は刺激する物質又は物理的因子の遺伝毒性効果を評価するため、又は疾患に関連する修復タンパク質欠乏の診断のために，既知のＤＮＡ傷害に関する修復に関わっているタンパク質の特異的性質及び機能の研究に使用することが可能である。
本発明の他の特徴及び利点は、明らかに例示的な目的及び少しも限定されずに，添付図面に関連して提供されている、以下の実施例を読んだ後に、より明確になる。
【００３８】
（実施態様の詳細な説明）
実施例１
本発明によるプロセスの最初の実施態様は、傷害としての８-オキソ-７，８ジヒドロ-２'-デオキシグアノシンを含む損傷オリゴヌクレオチドに対するグリコシラーゼ型修復活性を測定するために、この実施例で用いられている。
異なる配列（Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ）による４つの合成オリゴヌクレオチドによって機能化する４つのピンを含み、Livacheら., Biosens. Bioelectron, 13, 1998, ページ６２９及び６３４［８］に記載のようにして得られた、MICAM pb4型バイオチップが用いられる。このＨ配列は次の通りである：
Ｈ配列：５' TTTTT CCA CAC GGT AGG TAT CAG TC.
【００３９】
このバイオチップの機能化部分は、８-オキソ-７、８ジヒドロ-２'-デオキシグアノシン及びオリゴヌクレオチド、及びＯオリゴヌクレオチド（ｃＯ）の相補的部分を含む（ｃＯｃＨ）、そしてバイオチップ（ｃＨ）上に固定したＨオリゴヌクレオチドの相補的部分を含む損傷オリゴヌクレオチド（Ｏ）から形成されるハイブリッドの存在下でインキュベートされる。このＯオリゴヌクレオチドは、その３'末端にビオチンを含む。
Ｏ：５' GAA CTA GTG XAT CCC CCG GGC TGC−ビオチン３'
（Ｘは８-オキソ-７、８ジヒドロ-２'-デオキシグアノシン）。
ｃＯｃＨ：５' GCA GCC CGG GGG ATC CAC TAG TTC GAC TGA CTA CCG TGT GG;
【００４０】
Ｏ-ｃＯｃＨハイブリッドは、０．２ＭのＮａＣｌを含有する２００μｌのＰＢＳバッファー中で、１０pmolesのｃＯｃＨ及び１２pmolesのＯを、３７℃で６０分間にわたってインキュベーションすることによって得られる。この溶液の２０μｌを抜き出し、シャーレを形成するチップの機能化部分へ添加する。湿った環境での３７℃で１時間にわたるインキュベーションの後、このチップを洗浄バッファー（PBS/ 0.2M NaCl/ tween20 0.05%）に浸す。
図１は、Ｈオリゴヌクレオチドを含むバイオチップのピン１上でのＯオリゴヌクレオチドの固定化によって得られるシステムを示す。このＨオリゴヌクレオチドは、３' 末端及び傷害７にビオチン５を有する損傷Ｏオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした配列をも含むオリゴヌクレオチド３のｃＨ配列とハイブリダイズする。
【００４１】
傷害を含み、ハイブリダイゼーションによってバイオチップに固定化されたＯオリゴヌクレオチドを、０．５％のウシアルブミン血清及び１μｌのストレプトアビジン-フィコエリトリンＲ（０．５mg/ml；Jackson ImmunoResearch）を含む２０μｌのＰＢＳ／ＮａＣｌバッファーで１０分間にわたって大気温度でインキュベーションした後に展開した。
PBS/NaCl/tweenで洗浄した後、このバイオチップを、蛍光顕微鏡下で観察し、そのシグナルをImage Pro Plus ソフトウェアーを用いて分析した。
そのシグナルは、ピクセルで一体化した。機能化されたピンは、ハイブリダイゼーションがなくても、弱い蛍光シグナルを発した。非機能化ピンは、黒である。
【００４２】
強烈な飽和蛍光シグナルは、２５０ピクセルでＨオリゴヌクレオチドによって機能化ピン上で観察された。比較として、Ｉ配列によって機能化されたピンは、約１１０ピクセルの最高蛍光発光を有する。シグナルのノイズ（Ｈ／Ｉ）に対する比率は、２．２７である。
従って、ＤＮＡ傷害を含むオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは特異的である。さらには、バイオチップ上の定義済みの部位の明らかな損傷を含む核酸の断片を固定化できると見ることができる。
そのバイオチップを、バイオチップからＯ及びｃＯｃＨオリゴヌクレオチドを除去する効果を有する１０分間にわたって０．１ＮＮａＯＨで洗浄し、１０分間にわたってＨ_２Ｏですすぎ洗いした。顕微鏡を、すべてのシグナルが消失していることを調べるために用いた。
【００４３】
チップを、前もって定めた条件下で、Ｏ-ｃＯｃＨハイブリッドで再びハイブリダイズした。PBS/NaCl/tweenで洗浄した後、このチップを、１０分間にわたって０．１ＭＫＣｌ、Ｔｒｉｓバッファーでバランスをとり、次いで０．５μｇのＦａｐｙＤＮＡグリコシラーゼ（S.Boiteux、CEA Fontenay-aux-Roses, France）を含有する２０μｌのこのバッファーを添加した。このチップを、湿った空気中で３０分間にわたって３７℃でインキュベーションする。
PBS/NaCl/tweenで洗浄した後、展開段階を、ストレプトアビジン-フィコエリトリンＲを用いる前と同じ方法で実行する。PBS/tweenで洗浄した後に、シグナルを記録する。Ｈピン上の強烈な蛍光は、消滅する。シグナルのノイズに対する比率（Ｈ／Ｉ）は１．０４である。
【００４４】
図２は、グリコシラーゼ型酵素での反応の後のシステムの状態を示す。
この図は、Ｏオリゴヌクレオチドがバイオチップから取り除かれたことを示す。Fapy DNA グリコシラーゼ酵素は、８-オキソ-７，８-ジヒドロ-デオキシグアノシンでＯオリゴヌクレオチドを切断する。従って、ＤＮＡの短い断片は、使用される条件下で、不安定なハイブリッドから生成され、バイオチップから取り除かれる。これは、ビオチンの展開に起因する蛍光シグナルの消失を生じる。
従って、この実施例は、ＤＮＡ塩基の傷害のあるＤＮＡの断片を有するマイクロ支持体上で、ＤＮＡ修復活性が検出できることを示す。
【００４５】
実施例２
この実施例は、本発明によるプロセスの最初の実施例を用いた、細胞可溶化液中のグリコシラーゼ型活性の検出を例示する。
この実施例では、８-オキソ-７，８-ジヒドロ-デオキシグアノシンを含む、実施例１で使用のＯオリゴヌクレオチドを、図１に示すシステムに一致するバイオチップpb4上へ、実施例１のようにハイブリダイズする。
全細胞性可溶化液を、培養液のHela細胞から開始して調製する。
この細胞をトリプシン処理し、次いでＰＢＳバッファーで洗浄する。約１５ｘ１０^６細胞を含有する主成分を、１mlの溶解バッファー（Tris-HCl 10mM pH7.5, MgCl₂ 10mM, KCl 10mM, EDTA 1mM, 抗プロテアーゼ"Complete, Mini"（Boehringer Mannheim）の10ml に対して１ペレットを含有する）及び５μｌのフェニルメチルスルフォニルフルオライド（PMSF, シグマ、イソプロパノール中に17.4mg/ml）に溶解する。細胞をすりつぶし、次いで，その可溶化液を、４℃で５０分間にわたって６５０００rpmで、Beckman超遠心分離器で遠心分離する。その浮遊物質を回収し、次いで，２００μｌのグリセロール及び２０μｌの０．１Ｍのジチオスレイトールを添加した。この可溶化液を等分し、−８０℃で貯蔵した。
次に、バイオチップを３７℃で４５分間にわたって、２０μｌの細胞抽出物でインキュベートする。展開は、実施例１のようにしておこなった。
Ｈピンからのシグナルを記録し、それは１８０ピクセルであった。
【００４６】
この実験は、変性可溶化液で繰り返した（１００℃まで、１０分間にわたって）。Ｈピンからのシグナルは、２５０ピクセルズで飽和する。従って、未処理細胞可溶化液での損傷を含有する二重鎖によって機能化されたバイオチップのインキュベーションの後で、シグナルの損失がある。このシグナルの損失は、約３０％であり、可溶化液に含有される酵素によって修飾されたＯオリゴヌクレオチドの部分的切断部に一致する。
これらの実験は、Ｏオリゴヌクレオチドの放射活性マーキングの後にポリアクリルアミドゲル上で分析することで確かめられる。
【００４７】
実施例３
この実施例は、マイクロ支持体上に固定した修飾ＤＮＡ断片を用いた、全細胞可溶化液の切除／再合成修復活性の検出を例示する。
本発明によるプロセスの二番目の実施態様が，この場合に用いられている。
５０００対の塩基からなるＤＮＡ断片を、Rocheの「Expand（商品名）Long template PCR system」キットを用いてラムダファージからＰＣＲ増幅によって調製する。増幅プライマーの一つは、ファージにハイブリダイズした配列から、アミノシントンによって分離されたその５' 末端の１５塩基（Ｊ_１５）の配列を含む。この配列は、ＰＣＲ増幅の後に、一本鎖にとどまる。このＰＣＲ断片は、micro-spin S300カラム(Amersham-Pharmacia)によって精製される。そのＤＮＡ鎖は、３分間にわたって、Ｃ型紫外線によって照射される（γ_ｍａｘ254nm、0.8J/cm^２）。
【００４８】
次に、照射されたＤＮＡを、オリゴヌクレオチドｃＩ_１５ｃＪ_１５の３０塩基長によって、最初にＩ_１５配列に対して、そして二番目にＪ_１５配列に対して相補的に、Ｉ_１５と呼ばれる配列を含む、４つの異なるピン（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｉ_１５）上の４つの異なるオリゴヌクレオチド配列を含むｐｂ２バイオチップ（MICAM）上にハイブリダイゼーションする。
Ｉ_１５：５' TTTTT ATC CGT TCT ACA GCC
ハイブリダイゼーションは、約０．１pmoleのＰＣＲ増幅産物を含有する２０μｌのＰＢＳ／ＮａＣｌバッファー中で、１時間にわたって３７℃でおこなわれる。
【００４９】
次に、上記にて適応されるバッファー中で、全細胞抽出物の存在下で、チップをインキュベートする。
機能化チップ上での切除-再合成実験：
プロトコールは、Robinsら., the EMBO Journal, col.10, No. 12, ページ3913-3921, 1991[10]から適応した。溶液は、全容量で５０μｍのHela細胞の２５μｌの細胞可溶化液、１０μｌの５Ｘ反応バッファー（Hepes KOH 225mM pH7.8, KCl, 350mM, MgCl₂37.5mM, DTT 4.5mM, EDTA 2mM, BSA 0.09mg/ml, グリセロール17%)、ＡＴＰ２ｍＭ、ｄＧＴＰ５μｍ、ｄＡＴＰ５μＭ、ｄＣＴＰ５μＭ、ｄＴＴＰ１μＭ、ビオチン-１６-２'-デオキシウリジン-５'-三リン酸４μＭ、ホスホクレアチン２００ｍＭ、クレアチンホスホキナーゼタイプＩ１２．５μｇを含んで調製される。この溶液の２５μｌを、湿った大気中で、３０℃で２時間３０分にわたってインキュベートするバイオチップ上に配する。
【００５０】
PBS/NaCl/tweenで洗浄した後、展開をストレプトアビジン-フィコエリトリンでおこなう。
次に、チップを顕微鏡で分析する。
強い蛍光が、Ｉ_１５オリゴヌクレオチドによって機能化されたピンで観察される（飽和シグナル）。シグナルのノイズに対する比率（Ｉ_１５／Ｓ３）は２．２である。
可溶化液中に含有されている酵素による修飾ＤＮＡ断片の修復の前におこなわれるストレプトアビジン-フィコエリトリン展開は、シグナルのノイズに対する比率（Ｉ_１５／Ｓ３）を１とする。
実験は、ＰＣＲ反応によって得られた非修飾断片で繰り返される。前と同じような条件下（シグナル／ノイズ１）で実行される切除／再合成反応の後に、チップにはシグナルは見られなかった。
この実施例は、ＤＮＡの修飾塩基の修復に関わる酵素活性が、修飾塩基を含むＤＮＡの断片によって機能化されたチップ上に検出できることを示す。
【００５１】
実施例４
この実施例は、シクロブタン型ピリミジンダイマーで構成される傷害を示す特異的抗体の用途を例示する。
同じバイオチップは、実施例３と同じような条件下で、同じオリゴヌクレオチドｃＩ_１５ｃＪ_１５を用いて照射したＤＮＡを固定化する、実施例３で使用される。
PBS/NaCl/tweenで洗浄した後、ＵＶＢ照射によって形成されたシクロブタン型ピリミジンダイマーを展開した。
【００５２】
チップを、１μｌの抗-ダイマー抗体（５００μｇ／ｍｌ；Kamiya Biomedicam Company, Seattle, USA）を含有する２０μｌのPBS/NaClのバッファーで、１時間にわたって３７℃でインキュベートする。
PBS/NaCl/tweenで洗浄した後、チップを、１μｌのＣｙ^ＴＭ３マーカー（１．４ｍｇ／ｍｌ；Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）を共役させた抗-マウスヤギ抗体を含有する２０μｌのPBS/NaClの存在下で、３７℃で１時間にわたってインキュベートする。
PBS/NaCl/tweenで洗浄した後、シグナルをチップ上に記録した。シグナルのノイズに対する比率（Ｉ_１５／Ｓ３）は１．３３である。
従って、ＤＮＡ抗-損傷抗体の使用は、損傷を特異的に検出し、それ故に、修復酵素によるそれらの除去をモニターするために使用することができる。
【００５３】
引用文献
［１］：Woodら., Cell, 53, 1988, ページ97-106.
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［１０］：Sancar, A. (1995) Annu. Rev. Genetics, 29, ページ69-105.
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に記載の方法の最初の工程におけるシステムの状態を図表的に示す。
【図２】本発明に記載の方法における工程ｂ）後の図１のシステムの状態を図表的に示す。

Claims

ａ）固体支持体の幾つかの定まった位置へ、異なる既知の傷害を有する同一の配列を有するオリゴヌクレオチド及び／又は異なる配列及び同一又は異なる既知の傷害を有するオリゴヌクレオチドから成る幾つかの損傷ＤＮＡを固定する工程、
ｂ）この損傷ＤＮＡを、少なくともこの損傷ＤＮＡの修復に関わる一つのタンパク質を含み得る又は含み得ない修復組成物の作用へ曝す工程、及び、
ｃ）修復に関する、この（これらの）タンパク質の活性を、工程ｂ）の支持体上に固定される、又は固体支持体上から除去されるマーカーによって発せられるシグナルの変化を測定することによって確定する工程を含んでなる、ＤＮＡの修復に関わる一つ又は幾つかのタンパク質の活性を検出及び特徴付けるための方法。
請求項１の方法であって、タンパク質が、ＤＮＡ傷害の偵察に関わるタンパク質、ＤＮＡ傷害の切除に関わるタンパク質、切除されたストランドのヌクレオチドの再合成に関わるタンパク質、及び新しく形成されたストランドのライゲーションに関わるタンパク質から選択される方法。
マーカーが、支持体上に固定化された損傷ＤＮＡ中に存在し、工程ｂ）においてタンパク質の作用によって除去される、請求項１に記載の方法。
マーカーが損傷ＤＮＡの一末端に固定化されており、タンパク質が損傷ＤＮＡの傷害の切開酵素又は切除酵素であり、及び切開又は切除がマーカーを保有する損傷ＤＮＡの断片の除去を起こす、請求項３の方法。
マーカーが、工程ｂ）の前にこれらの傷害を明らかにすることができる損傷ＤＮＡ傷害の特異的マーカーであり、傷害はマーカーが傷害を明らかにすることができないように修復の間に除去される、請求項３に記載の方法。
マーカーが修復組成物中に存在し、工程ｂ）において支持体上に固定化されたＤＮＡに導入される、請求項１に記載の方法。
修復組成物が、マーカーによって修飾されたヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。
修復組成物が、細胞可溶化液又は精製修復酵素である、請求項１に記載の方法。
マーカーがアフィニティー分子、蛍光化合物、抗体、ハプテン又はビオチンである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
支持体が、損傷ＤＮＡの相補的部分、及びバイオチップのＤＮＡ断片の一つの相補的部分を含んでなるオリゴヌクレオチドを使用してハイブリダイズすることによって損傷ＤＮＡが固定化されたＤＮＡ断片を含んでなるバイオチップである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
損傷ＤＮＡが、その化学合成の間にオリゴヌクレオチドに導入された傷害を含んでなる１５から１００塩基長、好ましくは１５から５０塩基長の短いオリゴヌクレオチドである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
損傷ＤＮＡが、１００から２００００塩基長のポリヌクレオチドである、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
損傷ＤＮＡが、一本鎖又は二重鎖の形態である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
幾つかの定まった位置で、既知の異なる傷害を有し、同一の配列を有するオリゴヌクレオチド、及び／又は異なる配列及び同一又は異なる傷害を有するオリゴヌクレオチドからなる、幾つかの損傷ＤＮＡが固定化されたバイオチップ。
既知のＤＮＡ傷害に関する修復に関わるタンパク質の特異的性質及び機能の研究のための、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法の使用。
タンパク質によるＤＮＡ傷害の修復の動態をモニターするための、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法の使用。
ＤＮＡの修復に関わるタンパク質の合成を阻害又は刺激する物質又は物理的因子の遺伝毒性効果を評価するための、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法の使用。
疾患に関連する修復タンパク質の欠損の検出のための、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法の使用。