JP2002538415A - 変異走査アレイ、およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本方法は、複数の個体における複数の遺伝子もしくは同じ遺伝子内の不一致もしくは多型を同定するための変異走査アレイの使用に関する。このアレイは、チップまたはミクロスフェアであり得る。好ましくは、このアレイは、少なくとも１０個の異なる遺伝子全体に集合的にわたる、固定されたオリゴヌクレオチドを含むエレメントを有する。標的ＤＮＡ配列内の変異を同定するために、変異走査アレイを使用する方法であって、ここで該変異走査アレイは、複数のエレメントを含み、ここで該エレメントは、少なくとも１０個の異なる遺伝子全体に集合的にわたる、固定されたオリゴヌクレオチド８〜５０塩基長を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （連邦政府によって支援される研究に関する供述） 本発明は、ＵＳＰＨＳによって与えられた助成金Ｒ２９ ＣＡ６３３３４、Ｋ
０４ ＣＡ６９２９６、およびＲＯ１ ＣＡ７２０４６の下で、政府の援助によ
って行われた。政府は本発明において特定の権利を有し得る。

【０００２】 （本発明の分野） 本発明は、変異走査アレイ、およびその使用方法に関する。好ましい実施形態
において、核酸セグメント、または核酸セグメントもしくは遺伝子の任意の混合
物における、変異および／または多型を迅速に同定するために、本方法を使用し
得る。

【０００３】 （本発明の背景） 変異の検出は、近年非常に目的の分野である。例えば、特定の遺伝子における
変異は、血液疾患から癌にわたる種々の疾患と関連している。従って、遺伝子試
験は医学的ケアのますます重要な一面になりつつある。従って、迅速および効率
的に変異および多型を検出する能力が重要である。

【０００４】 そのような変異を検出され得る、配列の差異に関してＤＮＡを迅速にスクリー
ニングするために、多くの電気泳動技術が開発された。変性剤濃度勾配ゲル電気
泳動（ＤＧＧＥ）［Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｍａｎｉａｒｉｓ，Ｔ．およびＬｅ
ｒｍａｎ，Ｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５５、５０
１−５２７（１９８７）］、定量変性剤ゲル電気泳動（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｄｅ
ｎａｔｕｒａｎｔ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＣＤＧＥ）［
Ｂｏｒｒｅｓｅｎ，Ａ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
、８８、８４０５（１９９１）］、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）［Ｏｒｒｉ
ｔａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、２７６６
−２７７０（１９８９）］、ヘテロ二重鎖分析（ＨＡ）［Ｎａｇａｍｉｎｅ，Ｃ
．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、４５、３７７−３９９（１９？９
）］およびタンパク質切断試験（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ Ｔｅ
ｓｔ）（ＰＴＴ）［Ｒｏｅｓｔ，Ｐ．Ａ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ
ｅｔ．、２、１７１９−１７２１（１９９３）］が、しばしば使用される方法で
ある。多くの研究室は、変異検出効率を最大にするために、これらの方法の組み
合せを使用する。これら全ての方法は、ゲル電気泳動を必要とする。ゲル電気泳
動を必要としない方法もまた、存在する。例えば、固定化された標的配列に対す
る選択的ハイブリダイゼーションは、まれな公知の変異についてのスクリーニン
グを可能にする［Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ２２３、１１０４−１１０９（１９９７）］、一方、質量分析が、タンパ
ク質の分子量を分析することによって変異を検出するために使用されてきた［Ｌ
ｅｗｉｓ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４、１０２−１１０（
１９９８）］。

【０００５】 現在存在する変異および多型の検出方法の根本的な問題は、それらは１度に１
つの遺伝子における変異しかスクリーニングできないことである（すなわち、そ
の方法は、変異を有すると推測される「目的の遺伝子」を調べることに指向され
る）。ヒトゲノムが５０，０００−１００，０００遺伝子を有するとすれば、こ
れは重大な限界である。公知および未知の両方の、いくつかの他の遺伝子におけ
る未知の変異および多型が、「目的の遺伝子」における変異／多型と同時に存在
する可能性がある。しかし、それら他の遺伝子における変異は、同定されない可
能性がある。従って、スクリーニングする遺伝子を同定する最初の必要性なしに
、広い遺伝子のアレイに関して同時に「変異／多型走査」を行い得る方法は有用
である。ゲル電気泳動ベースの方法は、本質的に１度に１つの遺伝子における変
異を調査するのに制限される。１つの遺伝子に制限されない、変異を同定する非
ゲル電気泳動方法を考案する試みがなされてきた［Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８５巻、４３９７−４４０１頁、（１
９８８）］［Ｎｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４
、１１−８、（１９９３、３月）］［Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．米国特許第
５４５９０３９号、（１９９５）］。しかし、これらの方法は、複雑であり、代
表的にはいくつかの酵素的工程を必要とし、そして多くの擬陽性を引き起こす（
すなわち正常ＤＮＡにおいてしばしば変異および多型を記録する）ので、限られ
た成功しかおさめなかった（Ｎｏｌｌａｕ，Ｐ．およびＷａｇｅｎｅｒ Ｃ．、
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１１１４−１１２８（１９９７
））。ゲノムの大きな範囲にわたる、変異／多型を含む部位の高感度および特異
的な同定ならびに迅速な精製を可能にする方法を有することが所望される。

【０００６】 遺伝子発現（例えば、「レパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」および正常細胞
対癌細胞で発現される遺伝子の量）に関してＤＮＡフラグメントの大きなセット
を同時に走査し得るＤＮＡアレイおよび方法論が公知であるが［Ｗｏｄｉｃｋａ Ｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１３５９−１３６７
（１９９７）；Ｌｏｃｋｈａｒｔ，ＤＪ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ １４：１６７５−１６８０（１９９６）；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．、Ｔｒｅ
ｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３０１−３０６、（１９９８）；Ｙａｎ
ｇ，Ｔ．Ｔ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４９８−５０３、（１９９
５）］、未知の変異に関して無作為なＤＮＡフラグメントの大きなセットを走査
する能力は、技術が遅れている、より大変な労力を有する過程である［Ｇｉｎｏ
ｔ Ｆ．、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １０：１−１０（１９９７）］。従
って、多型（ＳＮＰ）および変異を走査するＤＮＡアレイベースの方法は、特定
の遺伝子に限られていた［Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，Ｒ．Ｊ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ １９：４４２−４４７（１９９５）；Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｇ．、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２８０：１０７７−１０８２（１９９８）］。一方、いくつかの遺伝子に
わたる未知の変異の検出は、現在のアレイによっては現在達成できない選択性お
よび感度を必要とする［Ｇｉｎｏｔ Ｆ．、Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １
０：１−１０（１９９７）］。例えば、未知の変異を検出する場合、ＡＰＣの大
きさ（８．５ｋｂ）のコード配列を有する単一の遺伝子さえ、特に過剰の正常対
立遺伝子が同時に存在する場合、単一の実験でスクリーニングするのは困難であ
る［Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１０５４−１０５８
（１９９７）］。従って、現在のアレイは５’末端から３’末端までの全遺伝子
を走査しないが、選択的に遺伝子を標本抽出する。例えば、発現アレイは３’末
端に偏っている。１つの遺伝子および複数の遺伝子の大きな部分にわたって、遺
伝子を標本抽出し得る方法論を有することが所望される。ゲノムの大きい範囲に
対して不一致の同定を可能にする方法もまた、所望される。

【０００７】 （発明の概要） 本発明者らは、現在のＤＮＡチップ技術に存在する分解能および他の限界を克
服し、数百または数千の遺伝子を同時に変異走査し、そして変異または多型を含
む短い（５０−３００塩基）ＤＮＡセグメントを同定するために、存在するＤＮ
Ａチップ技術を利用することを可能にする方法を発見した。本方法は、最初に不
一致を含むＤＮＡセグメントを同定することを含む。それらの不一致は、単一ヌ
クレオチドの多型（ＳＮＰ）または変異のいずれかであり得る。その後、不一致
を含む約５０−３００ヌクレオチドのＤＮＡセグメントを選択する。それらのＤ
ＮＡセグメントをＰＣＲによって増幅し得、次いでＤＮＡチップ上でスクリーニ
ングし得る。従って、１度に１つの遺伝子を選択して、そしてそれが変異を含む
かどうか試験する代わりに、本発明の方法論は、最初にＤＮＡを走査して不一致
を含有するＤＮＡフラグメント、およびそれによって変異を含有するＤＮＡフラ
グメントを同定および単離し（遺伝子型選択）、次いで入手可能なＤＮＡアレイ
を使用することによって、これらのＤＮＡフラグメントがどの遺伝子に属するの
か決定する。従って、変異の探索は、ＤＮＡアレイで遺伝子を探索してどこで不
一致が起こっているか同定するという、より容易な仕事に変換される。従って、
多重遺伝子発現走査に現在使用されているＤＮＡアレイ［Ｗｏｄｉｃｋａ Ｌ．
、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１３５９−１３６７（１
９９７）；Ｌｏｃｋｈａｒｔ，ＤＪ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ １４：１６７５−１６８０（１９９６）；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．、Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３０１−３０６（１９９８）；Ｙａｎｇ，Ｔ
．Ｔ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４９８−５０３（１９９５）］を
、直接または本開示に基づいて当業者に公知の小さい修飾を伴って使用して、変
異を走査し得る。

【０００８】 従って、多型および、変異ならびに／または多型を含むＤＮＡセグメントを同
定するあらゆる方法を使用し得る。例えば、そのような不一致を含むＤＮＡフラ
グメントを同定する１つの好ましい方法は、以下の工程を包含する：（ａ）変異
についてスクリーニングされる核酸（例えばＤＮＡ）（標的ＤＮＡと呼ばれる）
を単離する工程、ＰＣＲプライマーを加える工程、そしてそれをコントロールＤ
ＮＡとハイブリダイズさせて不一致を作る工程。これらの不一致は、変異または
多型の正確な位置で起こる；（ｂ）例えばＤＮＡをヒドロキシアミンで処理する
ことによって、前から存在する、任意の自然発生的なアルデヒドを除去する工程
；（ｃ）修復グリコシラーゼ酵素（Ｍｕｔ ＹおよびＴＤＧ）を使用して、不一
致を反応性部位、すなわちアルデヒド含有無塩基部位へ変換する工程（これらの
酵素は不一致を認識し、そして核酸塩基（例えば、アデニン）をその部位で「切
断」し、反応性部位を作る）；（ｄ）１つの部位ではＤＮＡの反応性部位に共有
結合し得、そして第２の部位で、検出し得る独特の部分を含む官能基を有する化
合物（例えばリガンド）を使用する工程；（ｅ）ＤＮＡ結合リガンドの検出可能
な第２の部位に、抗体またはアビジンを結合させる工程。これらの抗体またはア
ビジンは、化学発光または他の標識を有し得、その結果、試験された核酸（例え
ば、ＤＮＡセグメント）の全反応性部位が、例えば化学発光によって定量される
；（ｆ）反応性部位が存在するセグメントを精製する工程（例えば免疫沈降によ
って、またはＥＬＩＳＡ−マイクロプレートベースの技術によって、またはマイ
クロスフィア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）ベースの技術によって）。次いで、不
一致を含まない残りの核酸、例えばＤＮＡを廃棄し得る；そして（ｇ）残りの、
不一致を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）をＰＣＲによって、最初の工程で加えられ
たプライマーを使用して増幅する工程。次いで、その不一致含有ＤＮＡを、本発
明者らの変異走査アレイを用いる、上記の方法において使用し得る。（これらの
アレイはＤＮＡチップといわれることもある）。本発明のアレイを用いて、それ
ぞれの同定された不一致が、どの遺伝子に属するのか決定し得る。その後、公知
の技術を使用して、その不一致が疾患を引き起こすかまたは疾患と関連している
かのいずれかの変異であるか、または単に対立遺伝子の変化、すなわち多型であ
るかを決定し得る。

【０００９】 より詳細には、本発明は、標的核酸配列における化学的修飾変異に対する、生
化学的アプローチを可能にする。変異は、コントロール核酸配列とのハイブリダ
イゼーション後、不一致に変換される。次いで、ハイブリッド核酸（例えば、Ｄ
ＮＡ）における不一致を、リガンド分子によって共有結合させ得、次いで、検出
可能な部分によって同定し得る。続いて、不一致含有ＤＮＡを、免疫沈降のよう
な公知の方法によって精製し得、そして変異含有遺伝子を検出し得る。

【００１０】 標的核酸は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであり得る。例えばＤＮＡは、変異
／多型に関してスクリーニングされる必要性のある細胞から回収した全ｍＲＮＡ
から合成されたｃＤＮＡ；もしくはその画分；または変異／多型に関してスクリ
ーニングする必要のある細胞から回収された全ゲノムＤＮＡ；もしくはその画分
；または酵素によってより小さいフラグメントに消化された上記のあらゆる組み
合せのような、１つまたは様々な大きさのＤＮＡを含むあらゆる混合物であり得
る。ｃＤＮＡの使用が好ましい。

【００１１】 本方法はまた、グリコシラーゼ酵素または化学的方法で反応性部位に変換され
るＤＮＡ損傷（例えば、密集ＤＮＡ損傷部位；無塩基部位；発癌性物質−ＤＮＡ
付加生成物；損傷ＤＮＡ塩基）のような、様々の他の標識ＤＮＡ部位を検出する
ために使用し得る。これらの実施形態において、標的ＤＮＡを野生型ＤＮＡと混
合して不一致を作ることは必要でない。酵素は損傷を認識し、そして標的ＤＮＡ
に直接反応性部位を作製する。そのような酵素は、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、
ウラシルグリコシラーゼ、Ｔ４ エンドヌクレアーゼＶ、３−メチルアデニンＤ
ＮＡグリコシラーゼ、３−または７−メチルグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、ヒ
ドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラー
ゼ、Ｍ．Ｌｕｔｅｕｓ ＵＶ−ＤＮＡグリコシラーゼのような、全ての公知のグ
リコシラーゼを含む。また、ブレオマイシン、アルキル化剤、または単純な酸加
水分解のような化学的薬剤が、任意の酵素なしに標的ＤＮＡにおいて反応性部位
を自動的に作製し得る。しかし、決定的な工程は再び同一の、すなわちＤＮＡ損
傷の反応性部位にあるいくつかの化合物を加えることであり、それは損傷含有Ｄ
ＮＡの同定を可能にする。

【００１２】 （発明の詳細な説明） 本方法は、例えば標的ＤＮＡ配列における不一致部位の化学的同定のための、
生化学的アプローチを可能にする。標的ＤＮＡを、検出可能な部分によって同定
し得、そして続いて免疫沈降、マイクロプレート技術またはマイクロスフィア技
術によって検出および精製し得る。続いて、精製した変異含有ＤＮＡフラグメン
トを、広範な種々のハイブリダイゼーション技術（ＤＮＡチップ、大規模ハイブ
リダイゼーションアレイ等）による、これら不一致の単一工程スクリーニングに
おいて使用し得る。

【００１３】 例えば、未知の変異を検出しようとする場合、今までは約８．５ｋｂの１つの
遺伝子（例えばＡＰＣ）を１つの実験でスクリーニングすることは、特に過剰な
正常対立遺伝子が同時に存在する場合、困難であることがわかった［Ｓｉｄｒａ
ｎｓｋｙ，Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１０５４−１０５８（１９９７）］
。対照的に、本方法は、１度におよび／または複数の個体における複数の遺伝子
をスクリーニングし得、そして変異／多型を含むそれらのフラグメントのみを選
択および単離する。これらの不一致含有セグメントをＰＣＲによって増幅し得、
そして例えばＤＮＡアレイにおいて使用され、アレイ中で適合する遺伝子を単に
探索して、これらの変異含有フラグメントがどの遺伝子に属するかを同定し得る
。従って、当該分野で公知のような、多重遺伝子発現走査のために存在するアレ
イを使用し得る。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕ６８００ ＤＮＡ Ｃｈ
ｉｐ、または公知のアレイ［Ｗｏｄｉｃｋａ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：１５：１３５９−１３６７（１９９７）；Ｌｏｃｋａｒｔ
，Ｄ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６７５−
１６８０（１９９６）；Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ
ｃａｌ １６：３０１−３０６（１９９８）；Ｙａｎｇ，Ｔ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４９８−５０３（１９９５）；Ｇｉｎｏｔ Ｆ．
Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １０：１−１０（１９９７）］。

【００１４】 解像度（すなわち、変異／多型を含む遺伝子セグメントの解像力）を増加させ
るために、フラグメントは小さくなければならない。しかし、ＰＣＲのような標
準的な技術によって大量の不一致含有フラグメントを効果的に調製するために、
フラグメントは少なくとも約５０塩基であるべきである。操作を容易にするため
のいくつかの場合において、解像度の損失は許容され得、そしてより大きなフラ
グメントが使用される。

【００１５】 好ましくは、不一致含有フラグメントは５０〜３００塩基、より好ましくは５
０〜２００塩基、さらにより好ましくは５０〜１００塩基、そして最も好ましく
は約５０塩基である。

【００１６】 アレイ上のヌクレオチド（遺伝子エレメント）は、８−３００塩基の間、好ま
しくは不一致含有フラグメントのＤＮＡの大きさより大きくない。改良された解
像度のために、より小さい大きさを使用すべきである。例えば、５０塩基または
それ未満、より好ましくは８〜２５塩基。現在入手可能な多くのアレイは、約２
５塩基のヌクレオチドフラグメントを使用する。典型的には、これらのヌクレオ
チドセグメントは、転写物の３’部分に近いように選択される。

【００１７】 しかし、議論したような他のＤＮＡアレイ（前出）もまた、使用し得る。遺伝
子の全長にわたる（すなわち、遺伝子の５’末端および３’末端の両方から）フ
ラグメントを含むそのようなアレイが好ましい。

【００１８】 これらの変異走査アレイは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ不一致のタグ化を可能にし
、それによって核酸（例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡセグメント）にお
ける迅速な変異の同定を可能にするあらゆる方法と共に使用し得る。不一致含有
ＤＮＡを同定する１つの好ましい方法が、同時係属出願の米国特許第０９／２２
４，２２７号において開示されている。その方法は、以下の工程を包含する：（
ａ）変異についてスクリーニングされる核酸（例えばＤＮＡ）（標的ＤＮＡと呼
ばれる）を単離し、そしてそれをコントロールＤＮＡとハイブリダイズさせて不
一致を作る工程。これらの不一致は、変異または多型の正確な位置で生じる；（
ｂ）例えば、ＤＮＡをヒドロキシアミンで処理することによって、前から存在す
る、任意の自然発生的なアルデヒドを除去する工程；（ｃ）修復グリコシラーゼ
酵素を用いて、不一致を反応性部位、すなわちアルデヒド含有無塩基部位に転換
する工程（これらの酵素は不一致を認識し、そしてその部位で核酸塩基（例えば
、アデニン）を「切断」して反応性部位を作製する）；（ｄ）１つの部位でＤＮ
Ａの反応性部位に共有結合し得、そして第２の部位において検出され得る独特の
部分を含む官能基を有する化合物（例えばリガンド）を使用する工程；（ｅ）Ｄ
ＮＡ結合リガンドの検出可能な第２の部位へ抗体またはアビジンを結合させる工
程。これらの抗体またはアビジンは、化学発光または他の標識を有し得、その結
果、試験された核酸（例えば、ＤＮＡセグメント）の全反応性部位を、例えば、
化学発光によって定量する。；（ｆ）反応性部位が存在するセグメントを精製す
る工程（例えば免疫沈降によって、またはＥＬＩＳＡ−マイクロプレートベース
の技術によって、またはマイクロスフィアベースの技術によって）。変異を含ま
ない核酸（例えば、ＤＮＡ）の残りを、次いで廃棄し得る；そして（ｇ）残りの
、変異含有核酸（例えば、ＤＮＡ）をＰＣＲによって複製する工程。次いで、そ
のＤＮＡを、それぞれの同定された不一致がどの遺伝子に属するのかを見出すた
めに、本発明者らのＤＮＡアレイと共に使用し得る。その後、公知の技術によっ
て、その不一致が、疾患を引き起こすかまたは疾患に関連する変異のいずれか、
または単に対立遺伝子の変化（すなわち、多型）であるのか決定する。

【００１９】 本方法は、標的ＤＮＡおよびコントロール（野生型）ＤＮＡのハイブリダイゼ
ーション時に形成される不一致を認識する。当業者は、不一致は遺伝性または獲
得性遺伝的変化の結果として現れ得ることを認識している。また、全ての不一致
が変異の結果ではなく、いくつかの不一致は単に集団において天然に存在する多
型を表すことを認識する。ＤＮＡにおける遺伝性および獲得性遺伝的変化はどち
らも、不一致を引き起こす。

【００２０】 さらに、当業者は、全ての真核生物細胞は各染色体の２つのコピー、１つは父
親由来および１つは母親由来を含むので、各遺伝子の２つの対立遺伝子間の違い
も、不一致を引き起こし得ることを認識している。この場合、１つの遺伝子コピ
ー（例えば父親由来）がコントロールＤＮＡとして作用し、そして２番目の遺伝
子コピー（母親由来）は標的ＤＮＡとして作用し、そして母親由来ＤＮＡおよび
父親由来ＤＮＡのハイブリダイゼーション時に（すなわち、単に細胞内に存在す
るＤＮＡの自己ハイブリダイゼーションによって）、不一致が形成される。これ
らの遺伝性の違いは、多型または変異のいずれかを表し得る。

【００２１】 特定の不一致が、遺伝性の多型または変異、または獲得性の変異であるのかを
区別するために、当該分野で公知の多くの方法が存在する。

【００２２】 獲得性の変異を同定するために使用し得る１つの方法は、同じ個体に由来する
コントロールＤＮＡを有することである。例えば、悪性細胞をスクリーニングす
る場合、コントロールＤＮＡを対応する非悪性細胞から得ることができる。最初
に非悪性細胞単独で、次いで悪性細胞（または悪性および非悪性細胞の混合物）
をスクリーニングすることによって、２つの場合における検出された不一致を比
較し得る。悪性細胞のみに現れ、そして正常細胞に現れない違いは、悪性に至り
得る獲得性変異を含む。

【００２３】 遺伝性（遺伝的）変異／多型（すなわち、野生型からの変化が誕生時に、そし
て身体の全ての細胞に存在する場合）を同定する必要がある場合、正常細胞のみ
を調査する必要がある。説明したように、２つの対立遺伝子間の遺伝性の違いは
、自己ハイブリダイゼーション時に不一致を引き起こす。これらの不一致の検出
は、遺伝性多型または変異の位置を示す。その後、遺伝性多型を遺伝性変異から
区別する１つの標準的な方法は、家系をスクリーニングし、そして不一致が正常
な家系に存在するか否か（すなわち、良性の多型）、または特定の異常を示す家
系にのみ存在するかどうか（すなわち、消耗性の変異）を決定する。

【００２４】 変異および多型を分類するデータベースの使用も、ますます一般的である。従
って、同定した遺伝的バリエーションと、データベースに含まれるものとの比較
が、多くの場合、検出されたＤＮＡの不一致が変異によるものか、または多型に
よるものか決定するために使用し得る。不一致が発現されたタンパク質の切断を
引き起こすかどうかも見ることができる。

【００２５】 最後に、変異および多型を区別するために使用し得る別の方法は、インビボア
ッセイの使用による。従って、アッセイにおいて野生型の遺伝子を、少なくとも
１つの操作された塩基置換変異を有する遺伝子で置換して、変異を有する遺伝子
が野生型の正常遺伝子と機能的に置換できるかどうかを決定し得る。アッセイに
おいて遺伝子が野生型正常遺伝子を置換し得、そしてほとんど正常な機能を示す
場合、その遺伝子は変異ではなく、対立遺伝子のバリエーション（すなわち、多
型）と判断される。もしできなければ、その遺伝子は変異と判断される。

【００２６】 現在使用されている変異検出方法に対して、本アプローチの１つの利点は、ゲ
ノム中の多様な場所における多くの変異を同定する能力である。これは、特定の
異常に現在関連していない特定の遺伝子が、その異常となんらかの関係を有し得
るかどうかを決定することを可能にする。例えば、遺伝性非ポリポーシス結腸直
腸癌（ＨＮＰＣＣ）の場合、ＭＳＨ２およびＭＬＨ１における変異が、約９０％
の場合原因であると考えられる。多くの他の遺伝子が、他の１０％の場合に原因
であると同定された。しかし、スクリーニングのコストの観点から、典型的には
主にＭＳＨ２およびＭＬＨ１を見る。遺伝子のアレイを同時に見たとき、他の遺
伝子における変異も、特定の病状を有する個体においては大きな役割を果たして
いることがわかり得る。これらの他の変異が、病状の重症度に関連し得る。これ
らのさらなる遺伝子をモニターすることによって、ならびに疾患の状態および回
復を見ることによって、現在入手可能なものよりも、より良い予後および治療法
の考えを展開し得る。

【００２７】 ゲノムＤＮＡを使用する場合、当業者は多くの不一致が非コード遺伝領域で起
こり得る、および起こることを認識する。非コード領域を見ることは、発現およ
び発現レベルに影響を与える変異の同定を可能にし得る。一方、発現されたタン
パク質における変異を探すことに興味がある場合、ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡ
を作製し、次いで本アプローチによって検出し得る不一致を形成させることが好
ましい。

【００２８】 好ましい標的核酸はＤＮＡであるが、ｍＲＮＡも使用し得る。ＤＮＡは、変異
／多型をスクリーニングする必要がある細胞から採集したｍＲＮＡ全体から合成
したｃＤＮＡ；もしくはその画分；もしくは変異／多型をスクリーニングする必
要がある細胞から回収したゲノムＤＮＡ全体；またはその画分；または酵素によ
ってより小さい断片に消化した上記の任意の組み合せのような、１つまたは様々
な大きさのＤＮＡを含む任意の混合物であり得る。

【００２９】 その後、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全部またはそのより小さい断片をスクリーニング
して、不一致を含むそれらの断片を同定し得る。次いで、不一致含有断片を、残
りの核酸セグメントから単離する。不一致含有セグメントに対する、この選択の
結果として、正常対立遺伝子が異常型セグメントに数でまさっているかどうかは
関係ない。さらに、ＰＣＲのような技術を使用して、不一致含有セグメントを増
幅し得る。

【００３０】 コントロールは、標的と同様の野生型画分である。この野生型は、変異を有さ
ない可能性がある。コントロール核酸は、試験の目的によって選択し得る。例え
ば、癌細胞における獲得性変異をスクリーニングする場合、コントロール核酸は
、同じ個体の「正常」細胞から由来し得る。他の場合、例えば遺伝性（遺伝的）
成分が関与し得る場合、コントロールＤＮＡは核酸を提供したのとは別の被験体
由来である；または単に、父親由来および母親由来の対立遺伝子間の違いは、調
査する個体のＤＮＡの自己ハイブリダイゼーションによって調査し得る。

【００３１】 ＤＮＡの単離後、ＤＮＡを断片化して、望ましい５０−３００塩基対へ大きさ
を減少させ、そして後の段階で調製物を増幅するために一般的なＰＣＲプライマ
ーを核酸に加える。

【００３２】 その後１つの実施形態では、標的ＤＮＡを野生型ＤＮＡと混合およびハイブリ
ダイズさせ、変異／多型と予測される違いの位置で不一致を作製する。不一致を
標識し、そして不一致含有ＤＮＡを残りのＤＮＡから単離する。この様式におい
て、潜在的に干渉するバックグラウンドシグナルを除去する。従って、ＤＮＡア
レイと共に使用される唯一のＤＮＡは、少なくとも１つの不一致を含むＤＮＡで
ある。

【００３３】 大量に不一致を標識する任意の方法を使用し得る。１つの好ましい方法は、修
復グリコシラーゼおよびグリコシラーゼによって明らかになった不一致を同定す
るために特定のアルデヒド化合物を使用することを含む。

【００３４】 例えば、野生型および標的ＤＮＡの混合物を作製すること、ならびに野生型：
野生型、標的ＤＮＡ：標的ＤＮＡ、および標的ＤＮＡ：野生型の対を含むセグメ
ントの混合物を作製すること。混合物を、好ましくはヒドロキシルアミンのよう
な化合物で処理し、任意の自然発生的なアルデヒドを除去する。その後、野生型
：標的ＤＮＡハイブリッドで起こった不一致を、Ｍｕｔ ＹおよびチミンＤＮＡ
グリコシラーゼ（ＴＤＧ）（例えばＨｅｌｅ細胞またはＥ．ｃｏｌｉ由来）のよ
うなグリコシラーゼ修復酵素のような酵素によって認識および反応性部位（アル
デヒド）に転換する。これら酵素の独特の性質は、それらは高度に特異的である
、すなわちそれらは不一致にのみ作用し、不一致を含まないＤＮＡを完全にその
ままにしておくということである。

【００３５】 これらの反応性部位を、−Ｏ−ＮＨ₂（−ヒドロキシルアミン）、または−Ｎ
ＨＮＨ₂（−ヒドラジン）または−ＮＨ₂（−アミン）のような、アルデヒド結合
部分を含み、そして検出可能な存在（例えばフルオレセイン、ビオチン、ジゴキ
シゲニン、これらは、それぞれ抗フルオレセイン抗体、アビジン、および抗ジゴ
キシゲニン抗体と反応する。抗体は化学ルミネセンスタグを有し得、それによっ
て検出可能である）と反応する第２の部分も有する化合物を用いて同定する。本
アプローチの独特の性質は、アルデヒド結合部分が、産生された酵素の反応性部
位に共有結合することである。不一致修復酵素の特異性と組み合せて、変異の位
置に共有結合するリガンドの使用は、変異および多型の検出に関する他の方法に
並ぶもののない、感度および特異性を生ずる。

【００３６】 その化合物は、以下の一般式を有する： Ｘ−Ｚ−Ｙ、 ここでＸは検出可能な部分、好ましくは、ＺはＮＨ₂、ＳＨ、ＮＨＮＨ₂、フルオ
レセイン誘導体、ヒドロキシクマリン誘導体、ローダミン誘導体、ＢＯＤＩＰＹ
誘導体、ジゴキシゲニン誘導体、またはビオチン誘導体である； ＹはＮＨＮＨ₂、Ｏ−ＮＨ₂、またはＮＨ₂であり、好ましくは、ＹはＮＨ₂であ
る、 Ｚは炭化水素、アルキルヒドロキシル、アルキルエトキシ、アルキルエステル
、アルキルエーテル、アルキルアミドまたはアルキルアミンである。Ｚは、Ｓ−
Ｓのような切断可能な基を含み得る。Ｚは置換されてもよいし、または置換され
なくともよい。

【００３７】 これらの反応性部位を、−Ｏ−ＮＨ₂（−ヒドロキシルアミン）、または−Ｎ
ＨＮＨ₂（−ヒドラジン）または−ＮＨ₂（−アミン）のような、アルデヒド結合
部分（Ｙ）を含み、そして検出可能な存在（例えばフルオレセイン、ビオチン、
ジゴキシゲニン、それぞれ抗フルオレセイン抗体、アビジン、および抗ジゴキシ
ゲニン抗体と反応する。抗体は化学ルミネセンスタグを有し得、それによって検
出される）と反応する第２の部分（Ｘ）も有する化合物を用いて同定する。アル
デヒド結合部分は、産生された酵素の反応性部位に共有結合する。不一致修復酵
素の特異性と組み合せて、変異の位置に共有結合するリガンドの使用は、高い感
度および特異性を生ずる。

【００３８】 本発明の１つの好ましい実施形態は、以下の一般式を有する； Ｘ’−（ＣＨ₂）_n−（ＣＨ₂−Ｗ）_n''−（ＣＨ₂）_n'−Ｙ’、 ここでＸ’はＮＨＮＨ₂またはＮＨ₂、好ましくはＮＨ₂である； Ｙ’はＯ−ＮＨ₂またはＮＨ₂、好ましくはＯ−ＮＨ₂である； Ｗは−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（ＯＨ）−、−Ｃ（ＯＨ）−、−ＮＨ−、Ｃ
−Ｏ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、またはＣ（Ｏ）Ｏ−で
ある； ｎは０から１２までの整数、好ましくは４−７、そしてより好ましくは６であ
る； ｎ’は０から１２までの整数、好ましくは４−７、そしてより好ましくは６で
ある、そして ｎ’’は１から４までの整数、好ましくは１−２、そしてより好ましくは１で
ある。

【００３９】 好ましくは、化合物は１００−５００、より好ましくは１００−３００、さら
により好ましくは１５０−２００の間の分子量を有する。

【００４０】 ＺおよびＷは、合成された化合物の可溶性を増強する基で置換し得る。好まし
くは式Ｘ−（ＣＨ２）_n−（ＣＨ２−Ｗ）_n''−（ＣＨ２）_n'−Ｙの化合物は、使
用される溶媒中で全体的に可溶性である。

【００４１】 好ましい実施形態は、以下の式を有する；

【００４２】

【化１】 ここでＸ’’、Ｙ’’、ｎおよびｎ’は上記で記載した通りである。 より好ましい化合物は、２−（アミノアセチルアミノ）エチレンジアミン（ＡＥ
Ｄ）、（ＮＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ₂ＯＮＨ₂）である。

【００４３】

【化２】 ２−（アミノアセチルアミノ）エチレンジアミン（ＡＥＤ） 別の実施形態では、グリコシラーゼのような酵素によって認識されるＤＮＡ反
応性部位を、ヒドロキシルアミン反応基を含む化合物を用いることによって同定
する。ヒドロキシルアミン化合物の例は、ＦＡＲＰおよびＦＡＲＰｈｃを含み、
これらはどちらも蛍光性である。ＦＡＲＰは、フルオレセインの誘導体を含む新
規ヒドロキシルアミンであり、そしてＦＡＲＰｈｃはヒドロキシクマリンの誘導
体を含む新規ヒドロキシルアミンである。

【００４４】 これらの化合物は、以下のような一般式を有する； Ｘ’’’−（ＣＨ₂）_n−（ＣＨ₂−Ｗ）_n''−（ＣＨ₂）_n'−Ｙ’’’ ここでＹ’’’はＯ−ＮＨ₂である； Ｘ’’’は蛍光分子、フルオレセイン誘導体、またはヒドロキシクマリン誘導
体である。

【００４５】 Ｗ、ｎ、ｎ’、ｎ’’およびｎ’’’は上記で定義する。

【００４６】 より好ましい化合物は、フルオレセインアルデヒド反応性プローブ、ＦＡＲＰ
、および蛍光反応性プローブヒドロキシクマリン、ＦＡＲＰｈｃを含む。

【００４７】

【化３】 上記で記載したようにＤＮＡグリコシラーゼ酵素で調製および処理した不一致
を含むＤＮＡサンプルは、ＦＡＲＰおよびＦＡＲＰｈｃと共有結合的なオキシム
結合を形成する。

【００４８】 代替的実施形態では、グリコシラーゼのような酵素によって認識されるＤＮＡ
反応性部位を、ヒドラジン反応基を含む化合物を使用することによって同定する
。このクラスの化合物の例は、ビオチンヒドラジンを含む。本発明は、ヒドラジ
ン化合物を使用して、ＤＮＡグリコシラーゼ酵素によって産生された反応性部位
を標識することを可能にする。さらに別の代わりの実施形態では、化合物は、Ｂ
ＡＲＰ、ヒドロキシルアミンのビオチン化誘導体［ＢＡＲＰ、Ｋｕｂｏ，Ｋ．ら
、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：３７０３−３７０８（１９９２）］のよう
な、ビオチンアルデヒド反応性プローブである。

【００４９】 これらのビオチン化ヒドロキシルアミンまたはヒドラジン化合物は、以下の一
般式を有する； Ｘ’’’’−（ＣＨ₂）_n−（ＣＨ₂−Ｗ）_n''−（ＣＨ₂）_n'−Ｙ’’’ ここでＹ’’’はＯ−ＮＨ₂またはＮＨＮＨ₂である； Ｘ’’’’は、検出可能な分子、ビオチンまたはビオチン誘導体である。

【００５０】 Ｗ、ｎ、ｎ’、およびｎ’’は上記のように定義する。 例えば、アミンのようなＹ分子は、例えばＤＮＡ上のアルデヒドと反応し、一方
Ｘ基はさらなる修飾および検出のためにフリーのままである。

【００５１】 さらにより好ましい化合物は、ビオチンアルデヒド反応性プローブ、ＢＡＲＰ
［Ｋｕｂｏ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：３７０３−３７０８（
１９９２）］およびビオチンヒドラジドを含む：

【００５２】

【化４】 Ｍｕｔ ＹまたはＴＧＤのようなグリコシラーゼによる不一致の認識、そして
その結果おこるアルデヒドを含む反応性部位への転換後、酵素は不活性のままま
でなければならず、そうでなければ続くリガンド化合物の共有結合を妨害するこ
とが発見された。結果として、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはアミンと
酵素的に産生されたアルデヒドを含む反応性部位との反応条件は、４℃−１５℃
の温度、およびｐＨ６−７である。（Ｙ＝ＮＨ₂（アミン）である特定の場合、
４℃−１５℃で１−３時間のホウ化水素のような還元剤の存在も、反応性部位へ
の結合の間に必要である。）リガンド化合物の反応性部位への共有結合後、次い
で７０℃、１０分間加熱することによって酵素を不活性化させる。あるいは、酵
素を除去するために、標準的なフェノール−クロロホルム抽出イオン、またはＫ
を使用するタンパク質を用いた処理を採用し得る。

【００５３】 Ｘ＝ＮＨ₂（アミン）である場合、共有結合したリガンドが抗体によって認識
されるために、フリーのＮＨ₂基を最初に認識可能な基を有するアミン結合化合
物（例えばビオチン−ＬＣ−スクシンイミジルエステル；ビオチン−ＬＣ−ＳＳ
−スクシンイミジルエステル［Ｐｉｅｒｃｅ］；フルオレセイン−スクシンイミ
ジルエステル等のようなスクシンイミジルエステル化合物）に共有結合させる。
ＮＨ₂を含む化合物を有するそのようなスクシンイミジルエステルの反応および
精製条件は周知である。

【００５４】 Ｘ＝ＳＨ（メルカプト基）である場合、共有結合したリガンドが抗体によって
認識されるために、フリーのＳＨ基を最初に認識可能な基を有するメルカプト基
結合化合物（例えばビオチン−ＬＣ−マレイミド；ビオチン−ＬＣ−ＳＳ−マレ
イミド［Ｐｉｅｒｃｅ］；フルオレセイン−マレイミド等のようなマレイミド化
合物）に共有結合させる。ＳＨを含む化合物を有するそのようなマレイミドの反
応および精製条件は周知である。

【００５５】 小さいヒドロキシルアミン（例えばＡＥＤ）を使用する場合、反応性部位への
結合がより効率が良くなることが発見された。従って、式Ｘ’−（ＣＨ₂）ｎ−
（ＣＨ₂−Ｗ）ｎ’’−（ＣＨ₂）ｎ’−Ｙ、および分子量が２００未満である、
小さい化合物の使用が好ましい。これらの化合物は水溶性であり、高いモル濃度
（例えば１０ｍＭ）でＤＮＡとインキュベートでき、そしてより高い分子量を有
し、そしてより水溶性の低いほかの化合物（例えばＦＡＲＰ、ＢＡＲＰ）よりも
、さらにより高いレベルの効率で反応性部位に結合するのに十分迅速に拡散し得
る。

【００５６】 不一致を含むＤＮＡの精製は、好ましくはこれらアルデヒドへの標識分子の共
有結合を引き起こす、アルデヒドの不一致認識部位としての利用による。従って
、ＤＮＡを切断しそして３’ヒドロキシル基を含む鎖の裂け目を作る混入ヌクレ
アーゼの存在（同様のアッセイにおける共通の問題）は、標識分子の結合部位を
産生しない。この方法は、ＤＮＡ鎖をその長さと大きさで比較するゲル電気泳動
の使用を必要としない。従って、混入ヌクレアーゼによって産生される鎖の裂け
目由来の、偽陽性の産生はこれによって避けられる。本発明の方法は、そのよう
なアルデヒドとリガンド化合物の共有結合、および続く固体支持体、例えばマイ
クロプレートへの固定化後、標識ＤＮＡのみを検出する。それに加えて、ＤＮＡ
フラグメントの長さおよび多様性はアッセイに関係がなく、それはゲル電気泳動
法に対する別の利点である。

【００５７】 もしホウ化水素（ナトリウム−またはシアノ−ホウ化水素）が酵素的リアーゼ
工程の間存在するなら、酵素およびＤＮＡの間に共有結合的な架橋が起こる。代
替的実施形態では、酵素によって認識される位置に共有結合した標識分子（ビオ
チン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、または他の蛍光または化学ルミネセン
ス指標）を導入し得る。

【００５８】 これを達成するために、ＤＮＡ結合の前あるいはＤＮＡ結合および架橋が起こ
った後いずれかに、グリコシラーゼ酵素を指標分子で共有結合的に標識する。例
えば、ビオチンを指標分子として、そしてＭｕｔ Ｙ（ｔｒｅｖｉｇｅｎ）をグ
リコシラーゼ酵素として使用して、以下の手順を使用し得る。

【００５９】 Ｍｕｔ Ｙをビオチンでプレ標識するために（すなわち、ＤＮＡ結合の前に）
、酵素をビオチンの反応性アナログ（例えば、ビオチンのスクシンイミジルエス
テル、またはビオチン−ｌｃ−スクシンイミジルエステル（Ｐｉｅｒｃｅ）、ま
たはビオチンマレイミド等）とインキュベートする。グリコシラーゼはその表面
の−ＮＨ₂基によって陽性に荷電した酵素である。これらのＮＨ₂基を、ビオチン
指標の共有結合的な架橋に利用し得る。Ｍｕｔ Ｙとビオチン−ｌｃ−スクシン
イミジルエステルとの反応は、ビオチン：Ｍｕｔ Ｙのモル比が５：１、または
２：１、または１：１で（Ｍｕｔ Ｙがその生物学的活性を保持するなら、より
高い過剰なビオチンは避けなければならない）、ｐＨ７．５−８．０、１ｈ、４
℃で起こる。その次に、反応しなかったビオチンを、標準的なクロマトグラフィ
ーによって、またはＧ２５ろ過によって除去する。現在、ビオチン化Ｍｕｔ Ｙ
を、不一致を認識、架橋、そして標識するために、試験ＤＮＡに対して、酵素的
活性のために使用し得る。

【００６０】 アッセイを以下のように行う：最初に、変異に関して試験するＤＮＡ（テスト
ＤＮＡ）を、変異の位置で不一致を産生するために、変異を含まないＤＮＡ（コ
ントロールＤＮＡ）と混合およびクロスハイブリダイズさせる。２番目に、ビオ
チン化Ｍｕｔ Ｙを、１００ｍＭの水素化ホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂ
ｏｒｏｈｙｄｒｉｔｅ）の存在下で、１００：１のＭｕｔ Ｙ：ＤＮＡモル比で
加える。他の反応条件および反応緩衝液は、Ｍｕｔ Ｙの供給業者によって推奨
されるように標準的である。ビオチン化Ｍｕｔ ＹのＤＮＡ不一致（ａ／ｇまた
はａ／ｃ不一致）への架橋後、ビオチン化部位（すなわち変異）を含むＤＮＡ分
子を単離するために、ＤＮＡをストレプトアビジンでコートした固体支持体（例
えばストレプトアビジンでコートした磁気マイクロスフィア）に接触させる。単
離したＤＮＡを次いで、変異遺伝子を同定するために、ＰＣＲ増幅および／また
は適当な変異走査アレイでスクリーニングし得る。あるいは、未修飾のＭｕｔ
Ｙを最初に、ホウ化水素によってＤＮＡに架橋し、そして次いで利用可能な−Ｎ
Ｈ₂グループのいずれかを介してビオチンで標識し得る。反応しなかったビオチ
ンを、次いでＤＮＡ−酵素混合物から、クロマトグラフィーまたはＧ１２５ろ過
のような公知の方法によって除去する。この代わりのアプローチは、ＤＮＡ結合
過程の間、酵素が完全にその活性を保持することを可能にする。

【００６１】 リアーゼ活性を有し、そしてホウ化水素によってＤＮＡに架橋し得る他のグリ
コシラーゼは、当該分野で公知であり、そしてエンドヌクレアーゼＩＩＩ；エン
ドヌクレアーゼＶＩＩＩ；およびｈｍｕ−ＤＮＡグリコシラーゼを含む。

【００６２】 リアーゼ活性を持たないが、塩基削除活性のみを有するグリコシラーゼ（例え
ばＡｐグリコシラーゼ；ウラシルグリコシラーゼ；チミン不一致グリコシラーゼ
、３−ｍａ−ＤＮＡグリコシラーゼＩまたはＩＩ；ｐｄ−ＤＮＡグリコシラーゼ
；ｍ−ｌｕｔｅｕｓ ｕｖ グリコシラーゼ等）も、本発明において機能するた
めに採用し得る。これは、最初のａｐグリコシラーゼによる塩基の削除の後、続
くエンドヌクレアーゼＩＩＩグリコシラーゼの使用によって行われる。エンドヌ
クレアーゼＩＩＩは、ＡＰグリコシラーゼによって産生された無塩基部位を認識
し、そしてその部位でリアーゼ活性を発揮する。ホウ化水素が存在するなら、ｅ
ｎｄｏＩＩＩはＤＮＡのその位置で架橋される。

【００６３】 上記で記載したアプローチに従って、ビオチン（または他の標識）を、ＤＮＡ
のグリコシラーゼ反応性部位（不一致；変異；多型；損傷塩基；メチル化塩基等
）に導入し得る。

【００６４】 一旦これらの化合物のいずれかが反応性部位に共有結合すれば、抗体のような
検出可能なグループ（例えばアビジン、抗フルオレセインなど）との反応、およ
び続く検出（例えば化学ルミネセンスによる）および単離（例えば免疫沈降、ア
ビジンでコートしたマイクロプレート、またはマイクロスフィア）は、当該分野
で周知である。例えば、Ｘ＝ＮＨ₂である場合、不一致を含むＤＮＡの直接固定
化および精製が、活性化スクシニミジルエステル（Ｃｏｓｔａｒ）またはＤＮＡ
結合リンカーのＮＨ₂基に共有結合する無水マレイン酸（Ｐｉｅｒｃｅ）でコー
トしたマイクロプレート上で可能である。Ｘ＝フルオレセインである場合、直接
固定化および単離は、抗フルオレセインでコートしたマイクロプレート（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ）によって達成される。そしてＸ＝ビオチンである場合、直接固
定化および単離は、ストレプトアビジンでコートしたマイクロプレート（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）によって達成される。全ての場合で、固定化ＤＮＡをアルカリホスファ
ターゼまたはペルオキシダーゼに基づいた化学ルミネセンスアッセイによって検
出し得る。

【００６５】 当業者は、本発明において、多様な他の可能性のある検出可能な部分も、不一
致の位置でＤＮＡ結合リンカーに結合するために使用する抗体に結合させ得るこ
とを認識する。それによって、ＤＮＡの抗体に結合した不一致を検出するさらな
る方法を提供する。例えば、「結合ワクチン」Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔ
ｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒ
ｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（編）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。

【００６６】 本明細書中で使用される場合、「置換された」という用語は、コア分子から区
別できる部分または複数の部分による、分子の単一または複数の置換を指す。置
換基は、制限なしに、ハロゲン、ヘテロ原子（すなわちＯ、ＳおよびＮ）、ニト
ロ部分、アルキル（好ましくはＣ₁−Ｃ₆）、アミン部分、ニトリル部分、ヒドロ
キシ部分、アルコキシ部分、フェノキシ部分、他の脂肪族または芳香族部分を含
む。好ましくは、脂肪族または芳香族部分は、低級脂肪族または芳香族部分、す
なわち１２またはそれより少ない炭素、より好ましくは６またはそれより少ない
炭素原子である。置換化合物は、コア構造の誘導体と呼び得る。

【００６７】 本発明の抗体は、直接結合アッセイ、および他の伝統的な型のイムノアッセイ
のような適当なアッセイによって検出し得る。例えば、レセプターまたはそのフ
ラグメントが固相に付着されたサンドイッチアッセイを行い得る。サンプル中の
抗体が、固相の固定化標識ＤＮＡに結合するのを可能にするのに十分な時間、イ
ンキュベーションを維持する。この最初のインキュベーション後、固相をサンプ
ルから分離する。固相を洗浄して、結合していない材料および、それもサンプル
中に存在し得る非特異的タンパク質のような妨害物質を除去する。本発明の固定
化標識ＤＮＡに結合した、関心のある抗体を含む固相を、続いて標識抗体または
ビオチンもしくはアビジンのような結合剤と結合した抗体とインキュベートする
。抗体の標識は当該分野で周知であり、そして放射性ヌクレオチド、酵素（例え
ばマレイン酸デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、カタラーゼ）、蛍光団（フルオレセインイソチオシアネート、ローダ
ミン、フィコシアニン、フルオレサミン）、ビオチン等を含む。標識抗体を固体
とインキュベートし、そして固相に結合した標識を測定する。検出した標識の量
が、例えばサンプル中に存在する抗ＦＡＲＰ抗体の量の測定値となる。これらお
よび他のイムノアッセイは、当業者によって容易に行われ得る。

【００６８】 本方法は、多様なＤＮＡフラグメントにおける非常に高感度な不一致走査を可
能にし、それによって一度に数百または数千の遺伝子に対する高感度およびハイ
スループット変異スクリーニングを引き起こす。例えば、腫瘍サンプルにおける
新規変異のスクリーニングおよび発見が可能になり、それは癌の病因を確立する
のに、および変異と癌または他の疾患との間に新しい関係を確立するのに助けと
なる。上記で記載した新規化合物および方法も、あらゆる個体の遺伝的背景（多
型、変異）の分析に有用である。本方法によって、ハイスループット遺伝子型決
定および遺伝子型選択を行い得る。

【００６９】 １つの実施形態では、ＳＮＰまたは変異の検出を、付随する図１３で説明する
。この実施形態では、以下のプロトコールを使用し得る： １．スクリーニングするＤＮＡ（例えば個体のリンパ球由来のｃＤＮＡ）を、
本明細書中で詳述したようにより小さいフラグメント（５０−３００塩基対）に
消化する。

【００７０】 ２．消化したフラグメントを、自己ハイブリダイズさせてＳＮＰおよび変異の
位置で不一致を作る。加熱（例えば２分、９６℃）、次いで６５℃で１時間冷却
することによって、自己ハイブリダイズを行い得る。あるいは、望まない無塩基
部位を産生し得る加熱を避けるために、ホルムアミドの追加プラス中程度の加熱
（４０−７０℃）を、自己ハイブリダイゼーションを行うために使用し得る。

【００７１】 ３．望まない無塩基部位を除去するために、好ましくはヒドロキシルアミンに
よる処理が続く。

【００７２】 ４．不一致をアルデヒドに転換するために、不一致修復グリコシラーゼ（Ｍｕ
ｔ ＹおよびＴＤＧ、別々にまたは一緒に）による処理が続く。

【００７３】 ５．産生されたアルデヒド（ＳＮＰ／変異に対応する）を標識、例えばフルオ
レセイン化するために、ＡＥＤ、ＦＡＲＰ、ＢＡＲＰによる処理が続く。

【００７４】 ６．サンプルを変性させ、そしてＤＮＡアレイ、例えばＤＮＡチップまたはビ
ーズに直接適用し、そこでハイブリダイゼーションが起こる。

【００７５】 ７．ハイブリダイズしなかったＤＮＡ、または結合しなかったＦＡＲＰを除去
するために、徹底的な洗浄が続く。

【００７６】 ８．ＤＮＡチップの全エレメント由来の標識、例えば蛍光を、適当な装置（例
えば走査レーザー）によって読む。蛍光を示すこれらのエレメントは、ＳＮＰお
よび変異を含む遺伝子フラグメントに対応する。

【００７７】 本方法では、不一致が存在する遺伝子を同定するためにＤＮＡアレイを使用し
得る。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）
ＨＵ６８００ ＤＮＡチップ、ｔｈｅ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｔｌａｓ^TM ＤＮ
Ａアレイ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）；ｔｈｅ Ｔｅｌｅｃｈｅｍ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｒｒａｙ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；ｔｈｅ Ｇｅｎ
ｅｔｉｘ Ｌｔｄ．アレイ（Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）；およびｔｈｅ ＢｉｏＲｏ
ｂｏｔｉｃｓ Ｌｔｄ．アレイ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。Ａｆｆｙｍｅｔ
ｒｉｘ ＤＮＡチップのようなチップは、高密度に詰め込まれたＤＮＡまたはＲ
ＮＡエレメントを含む。最も高い解像度のために、チップ上のオリゴマーは小さ
くなければならない。好ましくは８−５０ヌクレオチド、より好ましくは８−２
５ヌクレオチド。これは最も高い解像度を提供する。しかし、チップ上のＤＮＡ
またはｍＲＮＡは、不一致を含むＤＮＡフラグメントと同じくらいの大きさ、例
えば５０−３００ヌクレオチドであり得る。

【００７８】 例えば、伝統的なアレイ（例えば遺伝子発現を検出するためのＡｆｆｙｍｅｔ
ｒｉｘチップ）を用いて、アレイは高密度に詰め込まれた、それぞれ固体支持体
に固定化された２５マーのオリゴヌクレオチドを含む、複数のＤＮＡまたはＲＮ
Ａエレメントを有する。チップ上に代表された６，８００遺伝子のそれぞれに関
して、それぞれｍＲＮＡ配列の別々の部分を有する２５マーのオリゴヌクレオチ
ドを含む２０エレメントが存在する。それによって２０エレメントは遺伝子のｍ
ＲＮＡ配列を、「標本抽出」する。現在のバージョンでは、固定化プローブはｍ
ＲＮＡの３’末端に偏っており、従って５’末端への配列はよく代表されていな
い。遺伝子発現を検出するためのアレイを使用するために、使用者は試験サンプ
ル（典型的には１：ｇ）中のスクリーニングする遺伝子由来のｃＤＮＡを産生し
、そして次いでインビトロ転写を実施してｃＲＮＡを回収し、そしてそれをビオ
チン化する（〜５０：ｇ）。それの１２：ｇをチップ上でハイブリダイズさせる
（あるいは、インビトロ転写無しに、ｃＤＮＡを直接チップ上に適用し得る）。
遺伝子が試験サンプル中に存在するなら、それは適当なアレイエレメントにハイ
ブリダイズする。アレイは既知の位置に既知の遺伝子配列を含むように構築され
るので、全ての転写された遺伝子を、単一の工程で検出する。検出過程は、蛍光
スキャナーのような、標識を同定するものの追加を利用する。各エレメントから
のシグナルの大きさが、特定の遺伝子に関して遺伝子発現の程度を意味する。

【００７９】 本発明は同じアレイを利用するが、遺伝子発現（すなわち、アレイエレメント
間のシグナルの違い）はもはや検出せず、シグナルの存在または欠如の検出（捕
獲された特定の遺伝子フラグメントにおける多型／変異を示す）のみを必要とす
る変異を検出し、それによって検出の仕事をより単純にすることに言及しなけれ
ばならない。

【００８０】 遺伝性単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）および変異が、癌、心血管、神経変性
などを含むいくつかの疾患に対する遺伝的素因を定義し得る。実際、獲得したＳ
ＮＰ、変異および異型接合性の損失が、癌の発達および初期の癌の検出に特に直
接関係がある。上記の全てを、上記で記載した方法論によって単一の工程で同時
に検出し得る。

【００８１】 例えば、単一個体の腫瘍および正常組織のｃＤＮＡを調製する。（図１１を参
照のこと）遺伝性多型は頻繁に起こる（平均１０００塩基ごとに１ＳＮＰ）ので
、いくつかの遺伝子は１つ以上のＳＮＰを有する。また、腫瘍遺伝子は１つ以上
の遺伝性ＳＮＰおよび時折獲得性ＳＮＰ／変異を含む。次に、ｃＤＮＡを酵素に
よって小さいフラグメント（〜１００−２００ｂｐ）に消化し、それによって１
つのみ−または０個−の遺伝的変化を含む可能性のあるフラグメントを産生する
。次いで、それぞれのサンプルを融解および自己ハイブリダイズさせて、ＳＮＰ
／変異の位置で不一致を作る。Ｘ−Ｚ−Ｙ化合物を用いる上記で記載した方法論
を、上記で記載したように適用し、不一致を含むｃＤＮＡのみを単離する。

【００８２】 不一致を含むｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅し、標識、例えばビオチン化し、そして
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップのようなアレイに適用する。不一致を含むフラグメ
ントはそれぞれ、アレイ上の相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、
それによってどの遺伝子、およびどの遺伝子領域（１００−２００塩基対以内）
にＳＮＰ／変異が属するか明らかにする。アレイＡおよびＢを比較することによ
って、遺伝性および獲得性ＳＮＰ／変異をどちらも誘導し得る。異型接合性の損
失は、遺伝性ＳＮＰ／変異を有する同じ遺伝子で獲得性ＳＮＰ／変異が起こった
時に起こり得る。そのような遺伝子は、ＡおよびＢを比較することによって容易
に同定し得る。

【００８３】 Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップを含む、遺伝子発現の検出を意図する現在のチッ
プアレイは、ｍＲＮＡの３’末端に偏った固定化オリゴヌクレオチドを利用する
。よって、遺伝子の５’末端は十分に代表されていない。さらに、現在の変異検
出技術は、既存のチップを適当に利用できない。それに対して、本発明者らの方
法論は、チップ技術を用いてゲノムの多様な部分に対して不一致を同定すること
を可能にする。

【００８４】 好ましい変異走査アレイは、好ましくは８−２５塩基長の、アレイに代表され
る遺伝子それぞれの全ｍＲＮＡ配列にまたがり、そして一方または他方のｍＲＮ
Ａ末端に偏っていない、固定化ヌクレオチドを含まなければならない。むしろそ
れらは研究する遺伝子全体をカバーしなければならない。いくつかの好ましい例
では、アレイを作るのにゲノムＤＮＡを使用し、そしてコード、および非コード
部分をいずれも使用する。述べたように、オリゴヌクレオチドはより長くあり得
るが、大きさが増加すると、解像度が失われる。オリゴヌクレオチドは、本方法
で単離されたＤＮＡフラグメントより大きくない間隔でｍＲＮＡを標本抽出しな
ければならず、好ましくは５０−１００塩基であるが、５０−３００塩基にわた
り得る。この様式で、不一致を含むフラグメントは、アレイ上に相補的な配列を
見つけることが保証される。アレイ上の固定化オリゴヌクレオチドが、ｍＲＮＡ
を小さい間隔（例えば２０塩基）で標本抽出するように配置される場合、それぞ
れのフラグメントが２つ以上の固定化オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイ
ズし得るので、変異フラグメントのＤＮＡチップへのハイブリダイゼーション時
に情報の余剰が存在する。この場合、全てのアレイエレメントからの情報を組み
合せて使用することによって、変異位置のより良い解像度が達成される。

【００８５】 この変異走査アレイは、現在のアレイと同じ技術を用いて構築し得る。上記で
記載した修飾が、同定する固定化遺伝子の全長にわたるＳＮＰ／変異検出を可能
にする。固定化遺伝子は、全ゲノムｃＤＮＡライブラリー、またはその任意の画
分、あるいは特定の疾患に関連していることが公知の、特定の遺伝子集団（すな
わち、疾患特異的アレイ）のいずれかであり得る。

【００８６】 本変異走査チップ技術の大きな利点は、その方法論は最初に変異体を単離し、
そして続いてアレイが遺伝子を同定するので、最初のサンプル中で過剰の正常対
立遺伝子の存在下でＳＮＰ／変異を検出し得ることである。これは既存の技術を
用いては現在行うことが不可能である。

【００８７】 好ましいキットは、ｍＲＮＡを組織から単離し、ｃＤＮＡを合成し、ＤＮＡを
１００−２００マーにフラグメント化し、そしてＰＣＲを加え、ヘテロ二本鎖を
形成し、不一致を切断するためにＭｕｔ ＹおよびＴＤＧ酵素を使用し、自然発
生的なアルデヒドを除去し、Ｘ−Ｚ−Ｙ化合物、例えばＦＡＲＰ／ＢＡＲＰ／Ａ
ＥＤを適用して不一致を検出し、マイクロプレートへの固定化によって変異／多
型フラグメントを単離し、変異／多型を回収およびＰＣＲし、そして最後に特定
のゲノム位置でＳＮＰ／変異を検出するためにアレイに適用するための試薬を含
む。

【００８８】 そのキットを、全ゲノムまたは遺伝子の選択された画分において異型接合性お
よびＳＮＰの位置をマッピングすることによって、癌、心血管系疾患、神経変性
疾患等への遺伝性罹病性に関して個体をスクリーニングするために使用し得る。

【００８９】 本方法論はまた、組織生検または排泄物から、癌の初期発症（獲得性ＳＮＰ／
変異）を検出することを可能にする。本技術はまた、研究室が新規変異を検出し
、それらの他の疾患との相互関係を明らかにすることを可能にする。

【００９０】 記載したリガンド化合物は、ＤＮＡ不一致修復認識部位の優秀な検出を示した
。それに加えて、小さな（ＭＷ＜２００−２５０）化合物が、ＤＮＡ反応性部位
への高い結合効率（＞５０％）を可能にするという本発明者らの発見に基づいて
、新規化合物（ＡＥＤのような）を設計、合成、および試験した。これらはＭｕ
ｔ Ｙによって産生された反応性部位に、より高い（＞２５０）分子量を有する
化合物よりも有効に結合することが示された。好ましい化合物は、小さく、水溶
性で、ＤＮＡとの有意な立体的相互作用に出会わず、そしてＤＮＡの酵素的に産
生された反応性部位に迅速に拡散し得る。この種類の新規な二官能性化合物はま
た、独特に設計されて、鎖の長さが伸長するときにその水溶性を保持する。メチ
レン基と共に内部極性官能基を同時に付加することが、分子の増加した長さにも
かかわらずこれら化合物の水溶性を保持する。しかし、最終的な化合物に関して
全体的に低い分子量を保つように気をつけなければならない。有用な極性官能基
は、アルコール、エステル、エーテル、チオエーテル、アミンおよびアミドを含
む。これは、この方法の使用者に、欠くことのできない水溶性を失うことなく、
特定のニーズに合うように化合物の鎖の長さを調整する融通性を可能にする。

【００９１】 腫瘍サンプルから不一致を含むＤＮＡを得る１つの方法において、ｍＲＮＡを
悪性細胞から単離する。健康なまたは正常組織サンプルからの対応するｍＲＮＡ
も単離する。正常組織からのｍＲＮＡが野生型コントロールとなる。それぞれの
ｍＲＮＡサンプル、癌および野生型に関してｃＤＮＡライブラリーを作成し得る
。２つのｃＤＮＡライブラリーを、例えば１：１の比で共に加え、そしてハイブ
リダイズさせる。（図１を参照のこと）ハイブリダイゼーションは、二本鎖ＤＮ
Ａの混合物を産生する。野生型ＤＮＡの鎖とハイブリダイズした悪性細胞由来の
ｃＤＮＡからなるＤＮＡの二本鎖は、ここで代表的には悪性腫瘍と関連するいく
つかの不一致を含む。

【００９２】 ハイブリダイズしたｃＤＮＡの混合物を次いで、ヒドロキシルアミンで処理し
てあらゆる自然発生的なアルデヒドを除去し、そして次いでサンプルのＧ２５フ
ィルター遠心分離によってヒドロキシルアミンを除去する。先に存在したアルデ
ヒドを今は欠く二本鎖ｃＤＮＡを、次いでＭｕｔ ＹまたはＴＤＧのような不一
致修復グリコシラーゼで処理する。Ｍｕｔ Ｙは、不一致アデノシンヌクレオチ
ドを認識するＤＮＡ修復酵素であり、そしてＴＤＧは不一致チミンを認識する。
認識時に、Ｍｕｔ ＹまたはＴＤＧは、デオキシリボース糖の結合部位で切断す
ることによって塩基を除去する。この切断方法による塩基の除去は、アルデヒド
の形成と共にデオキシリボース環の開裂を引き起こす。前に存在するアルデヒド
はヒドロキシルアミン処理によって除去されたので、アルデヒドは変異の位置で
産生されたもののみである。

【００９３】 得られるｃＤＮＡの鎖は、今不一致それぞれの部位に位置するアルデヒドを含
む。これらの得られるアルデヒドを、次いで化合物の１つ、例えば２−（アミノ
アセチルアミノ）エチレンジアミン（ＡＥＤ）またはそのアナログの１つで、Ｍ
ｕｔ Ｙ／ＴＤＧ酵素のさらなる活性が抑制されるように低温度で処理する。次
いで、ＡＥＤで標識したＤＮＡを、本文中で前に記載したように、マイクロプレ
ートに選択的に固定化する。標識されなかったＤＮＡを次いで洗浄して除去し、
マイクロプレートに結合したＡＥＤ標識ＤＮＡのみを残す。標識された変異を有
するＤＮＡを、マイクロプレートに固定化されている間に、次いでビオチン化し
、そして例えば化学ルミネセンスによって変異を検出し得る。変異を含むＤＮＡ
を次いで、ＰＣＲおよび本変異検出アレイを用いた大規模ハイブリダイゼーショ
ン技術によって、関与する遺伝子を同定するためにマイクロプレートから回収し
得る。従って、全ての不一致を含む遺伝子は１度に捕獲され、そして同時にスク
リーニングし得る遺伝子の数は、作成されたＤＮＡアレイが、本発明によって同
定される各特定の遺伝子において、不一致の正確な位置を立証および同定しなけ
ればならない全遺伝子によってのみ制限され、配列決定のような伝統的な手順を
使用し得る。

【００９４】 本方法はまた、グリコシラーゼ酵素または他の化学的手段によって反応性部位
に変換される様々な他のＤＮＡ損傷（例えば密集ＤＮＡ損傷部位；無塩基部位；
発癌性物質−ＤＮＡ付加生成物；損傷ＤＮＡ塩基）を検出するために使用し得る
。これらの実施形態では、例えば標的ＤＮＡと野生型ＤＮＡを混合して不一致を
作ることは必要でない。酵素は損傷を認識し、そして標的ＤＮＡで直接反応性部
位を産生する。そのような酵素としては、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ４エン
ドヌクレアーゼＶ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−または７−
メチルグアニンＤＮＡグリコシラーゼ、ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコ
シラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ、Ｍ．Ｌｕｔｅｕｓ ＵＶ−ＤＮＡ
グリコシラーゼのような、全ての公知のグリコシラーゼが挙げられる。また、ブ
レオマイシン、アルキル化剤のような化学的薬剤または単純な酸加水分解も、酵
素無しに標的ＤＮＡで自動的に反応性部位を産生し得る。しかし決定的な工程は
再び同じ、すなわちＤＮＡ損傷の反応性部位へ化合物を共有結合的に付加するこ
とであり、それは続く高感度検出を可能にする。

【００９５】 記載した技術を変異のスクリーニングおよび研究のために使用し得る。例えば
、アッセイの全ての段階で固体支持体を使用することは、腫瘍サンプルをスクリ
ーニングするのに必要な時間を本質的に短縮し、人的資源に関する費用効果なら
びにその信頼性および再現性を改善する。

【００９６】 チップアレイに代わる変異走査アレイは、ビーズの使用であり、マイクロビー
ズまたはマイクロスフィアと呼ばれることもある。例えば、磁気マイクロスフィ
ア技術を、ヘテロ二本鎖をアッセイの初期の段階で固定化するために利用し得る
。例えば癌および正常サンプルのような宿主細胞からのｍＲＮＡの抽出後、例え
ば５８８遺伝子のｃＤＮＡを産生し得る。その後、切断可能な（Ｓ−Ｓ）ビオチ
ンを含むＰＣＲプライマーを加える。癌ｃＤＮＡと野生型対立遺伝子とのハイブ
リダイゼーションは、塩基置換変異の位置でヘテロ二本鎖を産生し、そしてＤＮ
Ａサンプルを例えばストレプトアビジンでコートした磁気マイクロスフィア（Ｄ
ｙｎａｌ Ｉｎｃ．から入手可能）に固定化する。この点以後、ＡＬＢＵＭＳア
ッセイの全ての続く工程を、固体支持体上で行い得る。

【００９７】 マイクロスフィアは、固定化ＤＮＡの化学的／酵素的処理、および洗浄の間マ
イクロスフィアの磁気固定化による化学物質のＤＮＡからの効率的な迅速な分離
を可能にする。例えば、１つの実施形態では、アッセイは微量のアルデヒドを除
去するためにヒドロキシルアミン処理、そして反復する（×３）Ｇ２５フィルタ
ーを通した超遠心によるヒドロキシルアミンの続く完全な除去を使用する。これ
は時間がかかり、そして避けられないサンプルの損失を引き起こし得る。このこ
とは、組織サンプルが限られている場合に重大であり得る。対照的に、ＤＮＡを
磁気マイクロスフィアに固定化することによって、全ての続く工程がより迅速、
容易になり、ＤＮＡの損失が無い：ヒドロキシルアミン処理および除去、酵素的
処理および洗浄、Ｘ−Ｚ−Ｙ処理および洗浄、例えばＡＥＤ−捕獲不一致への抗
フルオレセイン−ＡＰの結合および洗浄、ならびに最後に不一致の化学ルミネセ
ンス検出を、磁気マイクロスフィア形式で行う。

【００９８】 あるいは、ＤＮＡを磁気マイクロスフェアから回収し、そしてＸ−Ｚ−Ｙ、例
えばＦＡＲＰを含むＤＮＡを単離するために、抗フルオレセイン−ＡＰを加える
代わりに、還元剤への中程度の曝露（ＤＴＴ、５０ｍＭ、約１０分、２５℃）に
よるビオチンのジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の切断によって、固定化ＤＮＡを回
収し得る。

【００９９】 ビオチンのような切断可能な部分で末端標識したプライマーを構築するために
、末端の脂肪族アミンを含むオリゴヌクレオチドを注文し、そして例えばビオチ
ン−Ｓ−Ｓ−スクシニミジルエステル（Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）と反応させ
る。アミノ−オリゴヌクレオチドとスクシニミジルエステルの反応、および続く
逆相Ｃ１８カラムクロマトグラフィーによる精製は、本発明者らのグループが以
前に経験した標準的な手順である。

【０１００】 磁気マイクロスフェアからのＤＮＡサンプルの除去後、サンプルを、例えば抗
フルオレセイン−マイクロプレートに適用して、例えばＦＡＲＰ含有ヘテロ二重
鎖を単離する。次いで、それを回収し、ＰＣＲ増幅し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ
ＤＮＡハイブリダイゼーションアレイでスクリーニングする。上記の手順を使
用して、塩基置換変異をＡＬＢＵＭＳによって単離し、ＰＣＲによって増幅し、
そして２４時間以内にＤＮＡアレイでスクリーニングし得る。従って、この技術
は、癌サンプルのような標的サンプルの、費用効果の高い大規模変異スクリーニ
ングのための、研究者および臨床医が利用しやすい標準化手順を生じる。

【０１０１】 米国特許第５，７３６，３３０号および第５，９８１，１８０号ならびにＬｕ
ｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）の製品も参
照のこと。血液学、腫瘍学、細胞生物学などにおける多様な適用のために、フロ
ーサイトメトリーを使用し得る。培養細胞に加えて、蛍光プローブ、または蛍光
プローブを有する生体分子でタグ化したビーズ（「マイクロビーズ」、「マイク
ロスフェア」としても知られる）を通常使用する。フローサイトメトリーの間、
そのような蛍光マイクロビーズは細い管を流れさせられ、そして１つ以上のレー
ザービームで個々に励起される。次いで、各マイクロビーズから放射された光は
、個々にフィルターにかけられ、そして連結した光検出器で測定される。得られ
たシグナルに依存して、個々のマイクロビーズを残りのマイクロビーズ集団から
分離（分別）し得る。通常のフローサイトメーターは、個々の光シグナルを収集
し、そして１秒あたり１０，０００〜３０，０００のマイクロビーズを分別し得
る。結果として、１０⁸のマイクロビーズを１時間以内に分別し得る。専門化さ
れたフローサイトメーターは、より高い速度で個々のマイクロビーズを計数し得
る。多パラメーターのフローサイトメトリーは、個々のマイクロビーズそれぞれ
が、１度にいくつかのレーザーで励起されることを可能にし、そしてそれぞれの
レーザーによる照度は、マイクロビーズに結合した蛍光標識化生体分子の型およ
び量にも依存して、いくつかの別々の波長および強度での発光を産生する。結果
として、フローサイトメーターを通る個々のマイクロビーズそれぞれの通過は、
大きなセット（５−７）のシグナルの放射を引き起こし得、それは個々にコンピ
ューター上で検出および分別される。収集された並列光学的シグナルに依存して
個々のマイクロビーズを迅速に分別する能力は、フローサイトメトリーを、非常
に短い時間に多くの遺伝子を分析するための強力な道具にする。

【０１０２】 特定の遺伝子でタグ化されたマイクロビーズが、蛍光プローブの組合せでもタ
グ化される場合、これは、フローサイトメトリーで使用され得る。ビーズがタグ
化される蛍光プローブは、種々の異なる蛍光強度を有し得る。従って、各ビーズ
について、強度／蛍光プローブの独特な組合せが存在し、その結果、フローサイ
トメーターを通る個々のビーズの通過は、固定化遺伝子を独特に同定する。さら
に、ビーズに固定化された遺伝子を「標的ＤＮＡ」にハイブリダイズさせた場合
、ハイブリダイゼーションは独特な蛍光シグナルを産生し、これもまた、ビーズ
が通過する際にフローサイトメーターによって検出され得る。従って、数百また
は数千の多様な遺伝子におけるハイブリダイゼーションを、この手順によって迅
速に検出し、定量し、そして分析し得る。

【０１０３】 フローサイトメトリーのためのマイクロビーズは、いくつかの製造業者（例え
ば、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって
市販されている。代表的なマイクロビーズは、直径０．１〜２０μｍの、ほぼ球
形のポリスチレン「コア」からなる。マイクロビーズを、適切な波長の蛍光プロ
ーブのような指標分子でタグ化し得、これは、マイクロビーズ表面に直接結合す
るか、またはマイクロビーズ表面をコートする核酸に結合するかのいずれかであ
るか、あるいはマイクロビーズの「内部体積」を満たす。マイクロビーズがフロ
ーサイトメーターのレーザービームを通過する場合、強力な蛍光シグナルが放射
され、それはフィルターにかけられ、そして光電子増倍管で計数される。使用者
によって設定された制約（例えば、観察されるシグナルの特定の強度；または放
射される蛍光波長の特定の組合せ）によって、マイクロビーズはサイトメーター
のレーザービームを通過した後、別の容器に分別され得る。

【０１０４】 マイクロビーズは、特定のＤＮＡフラグメントで容易にタグ化され得る。これ
を達成する標準的な方法は、「機能付与表面」を有する、例えばカルボキシル基
もしくはアミノ基で、またはアビジンなどでコートされたマイクロビーズを製造
することである。このようなマイクロビーズは広く入手可能である。核酸の機能
付与表面への結合は、核酸の末端標識、次いでそれをマイクロビーズ表面へ結合
させることによって達成される。例えば、１級アミンが核酸に結合している場合
、カルボジイミド媒介性反応は、核酸をカルボキシルでコートされたマイクロビ
ーズに結合させ得る。ビオチンが核酸に結合している場合、これは、アビジンで
コートされたマイクロビーズに結合する、など。マイクロビーズに結合した一本
鎖ＤＮＡを、本明細書中で以後「コントロールＤＮＡ」と呼ぶ。

【０１０５】 コントロールＤＮＡでコートされたマイクロビーズを、遺伝子発現、多型また
は変異に関して分析される一本鎖「標的ＤＮＡ」と混合し、そしてハイブリダイ
ズさせる場合、コントロールＤＮＡ配列に対して相補的な配列が存在する場合に
ハイブリダイゼーションが起こる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、少
なくとも中程度のストリンジェンシー、より好ましくは高いストリンジェンシー
の条件下であるべきである。これらの条件は、塩、温度などを変えることによっ
て得ることができ、そして当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 第２版を参照のこと。次いで、所望で
あれば、ハイブリダイズしないＤＮＡを、例えば遠心分離によって、この溶液か
ら除去し得る（フローサイトメトリーはマイクロビーズに結合した蛍光のみを計
数し、そして溶液中の蛍光は計数しないので、これは絶対的な必要条件ではない
）。マイクロビーズ形式におけるＤＮＡのこのようなハイブリダイゼーションは
、当業者に周知である（例えば、ｍＲＮＡを単離するために、ポリ−ｄＴでコー
トしたマイクロビーズを使用する）。ハイブリダイズした二本鎖配列を含むマイ
クロビーズからのシグナルを検出するために、標的ＤＮＡを蛍光プローブで予め
標識し得る。従って、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたコントロールＤＮＡを有
するマイクロビーズからの蛍光シグナルを、フローサイトメトリーによって容易
に検出し得る。

【０１０６】 １つの実施形態では、ビーズを、各蛍光プローブが特定の発光強度を有する蛍
光プローブの「カクテル」でも標識し得る（そのようなプローブは、しばしば較
正の目的で使用される）。通常の適用である多パラメーターのフローサイトメト
リーは、ビーズに結合した全ての蛍光プローブからのシグナルを同時に獲得し得
、そしてその強度を測定し得る。

【０１０７】 例えば、フローサイトメーターは、同時に６つの蛍光発光波長をモニターし得
る（例えば、それぞれ２つの異なるフィルターを有する３つの励起レーザーを用
いることによって）。例えば、このビーズは、最小の重複領域を有する、区別で
きる励起または区別できる発光波長を有するかのいずれかのように選択された蛍
光プローブ１−５で標識され得る。プローブあたり少なくとも２０の区別できる
蛍光強度が生じ得るように、異なる量の各蛍光プローブをビーズに組込み得る（
例えば、図１４を参照のこと。ここでフルオレセインの５つの異なる蛍光強度で
標識されたビーズを示す）。

【０１０８】 従って、この例では、構築され得る、それぞれが他のものとは異なる３，２０
０，０００までのビーズの組合せが存在し、それはフローサイトメーターを通過
する際に独特の光学的特徴を与える。（実際には、約７０，０００のヒト遺伝子
しか存在せず、それらのほとんどは特定の適用で計数する必要が無い可能性があ
るので、そのように多くの組合せを使用する必要は無い。代表的な適用は、各ビ
ーズが遺伝子の異なる部分を含む、１，０００〜２０，０００の異なるビーズに
よって示される１，０００のヒト遺伝子を利用し得る）。

【０１０９】 各ビーズが異なる遺伝子、または遺伝子フラグメントでタグ化される場合、あ
らゆる望ましい数の遺伝子を、フローサイトメトリーによって一回の実験で分析
し得る。また、「コントロールＤＮＡ」でタグ化された公知の光学的特徴のビー
ズにハイブリダイズされる「標的ＤＮＡ」を、独特のシグナル（プローブ１−５
によるシグナルと明らかに区別できるシグナル）を与える６番目の蛍光プローブ
でタグ化すると仮定する。多パラメーターのフローサイトメーターを通過する際
に、各ビーズは、（ａ）プローブ１−５からの発光強度をモニターすることによ
ってその光学的特徴、そしてそれによってビーズに結合したコントロール遺伝子
の同一性；および（ｂ）標的ＤＮＡがコントロール遺伝子にハイブリダイズした
かどうか、およびどの程度したかを決定する、プローブ６からの発光強度、を生
じる。

【０１１０】 使用するフローサイトメーターは、好ましくは、「まれな事象」を検出する能
力を有する。各Ｂ．Ｕ．Ｓ．は、他のビーズがほとんどの時間計数されるので、
その独特の光学的シグナルをまれにしか放射しない。１０，０００の別々のＢ．
Ｕ．Ｓ．がアリコートに含まれている場合（１，０００のヒト遺伝子を示す）、
フローサイトメーターは、「ノイズ」無しに１０４のビーズのうち１つを検出お
よび区別できなければならない。これは、十分に通常のフローサイトメーターの
能力の範囲内であり、これは代表的には１０５の事象のうち１つを区別し得る。

【０１１１】 ある実施形態では、各事象を別々に記録し、そしてそれを適切な「バーヒスト
グラム」（各バーが独特の遺伝子を表す）で保存するために、増強されたソフト
ウェアおよびコンピューターの記憶スペースが必要であり得る。このようなソフ
トウェアは現在、限られた数の独特に標識されたビーズ／細胞を扱う適用のため
に存在する。本発明は、全体で１０７〜１０８のビーズからの独特な特徴の光学
的検出の後、ソフトウェアが数千の異なるパラメーターを扱うことを必要とする
。本適用の要求を満たすための、現在のソフトウェアおよびディスク記憶スペー
スの拡張は、容易に達成され得る。

【０１１２】 方法が最適に行われていることを保証するために、いくつかのコントロール遺
伝子およびビーズをフローサイトメトリーによる決定に含み得る。

【０１１３】 ＳＮＰおよび変異の検出のために、上記の方法を採用し得る。このアプローチ
では、中間の工程を使用して、ＳＮＰまたは変異を含むＤＮＡフラグメントのみ
を単離および精製し得る。このプロセスを、本明細書中で詳述した化合物および
方法論を用いて行い得る。

【０１１４】 ＳＮＰまたは変異を含むそれらのｃＤＮＡフラグメント（代表的には、５０〜
２００塩基対長のフラグメント）の単離後に、標的ＤＮＡを、コントロールＤＮ
Ａを含むＢ．Ｕ．Ｓ．アリコートにハイブリダイズさせ、そしてフローサイトメ
トリーによって処理する。プローブ６からの陽性シグナルを示すビーズの光学的
特徴は、集団の中でＳＮＰおよび変異を含む遺伝子を定義する。

【０１１５】 ＳＮＰおよび変異を検出するために、ＳＮＰ／変異を含む対応するフラグメン
トの捕獲後、遺伝的変化を含むゲノム領域が良好な解像度（約１００塩基対）で
自動的に定義されるように、ビーズに結合したコントロールＤＮＡは、比較的短
くなければならない（例えば１０〜１００塩基対の範囲）。さらに、試験される
各遺伝子に関して、遺伝子全体（３’から５’末端まで）が規則的な間隔で適切
に表されるように、遺伝子の十分な領域が固定化されなければならない（別々の
Ｂ．Ｕ．Ｓ．に各領域）。この様式では、単離され、そして遺伝的変化を含む各
標的ＤＮＡフラグメントが、Ｂ．Ｕ．Ｓ．アリコート中でハイブリダイズするた
めの相補的な配列を発見することが保証される。

【０１１６】 Ｂ．Ｕ．Ｓ．は、最適化した性質で構築され、そして、キット（例えば、市販
の供給業者によるひとまとめの製品）で販売され得る。キットは、ストレプトア
ビジン結合部位への結合のための、ビオチン末端標識化オリゴヌクレオチドを使
用するために、ストレプトアビジンでコートされたビーズ上に複数の蛍光団およ
び特定のＤＮＡ配列を結合させる試薬、およびストレプトアビジンの遊離の１級
アミンへの同時結合のためにアミン反応性蛍光プローブのカクテル（例えば蛍光
プローブのスクシニミジルエステル）を有し得る。あるいは、カルボン酸でコー
トしたビーズ上に、蛍光化合物およびアミン末端標識化核酸の両方を結合し得る
。

【０１１７】 使用者は、どの、およびいくつの遺伝子およびどのコントロールを個々の実験
それぞれに含むかを決定し得、そして次の実験で「すぐに」含まれる遺伝子を変
更し得る。これは、チップマイクロアレイ技術では現在不可能である。さらに、
ビーズの製造および判断は洗練された手順を必要としないので、その技術は現在
のチップマイクロアレイ技術よりも有意に安価であるべきであり、一方需要は非
常に高いと予想される。

【０１１８】 さらに別の実施形態では、各サブセットが別個の一本鎖ＤＮＡの多くのコピー
でタグ化された、非蛍光マイクロビーズの複数のサブセットが、作製される（「
コントロールＤＮＡ」、例えば遺伝子；もしくは特定の遺伝子フラグメント；ま
たは遺伝子フラグメントを示すオリゴヌクレオチド）。各特定の遺伝子由来の、
コントロールＤＮＡの多くの一本鎖は、上記で記載したように、マイクロビーズ
の機能付与表面に結合され得る。あるいは、特定の配列のオリゴヌクレオチドは
、マイクロビーズに結合され得るか、またはＤＮＡ合成の分野で確立されるホス
ホロアミダイト化学を用いて、マイクロビーズ上で直接成長され得る。マイクロ
ビーズ表面上のこの「コントロールＤＮＡ」の大きさは、任意の長さであり得る
が、好ましくは相補的配列を有する対応する「標的ｃＤＮＡ」との最大限のハイ
ブリダイゼーションを保証するものである。次いで、単一のＤＮＡ配列を有する
大量の同じマイクロビーズを製造し得る。次に、第２のマイクロビーズを選択し
、そして目的の第２の遺伝子／フラグメントについてこのプロセスを反復する。
この手順を数回（例えば１，０００回）反復することによって、それぞれ独特の
ＤＮＡ配列を有するマイクロビーズのストックを製造する。このプロセスは容易
に自動化され得る。

【０１１９】 上記で説明したように、マイクロビーズ上に固定化された遺伝子は、標識化Ｄ
ＮＡ、例えば「蛍光標識化標的ＤＮＡ」にハイブリダイズし、このハイブリダイ
ゼーションは、マイクロビーズが通過する場合にフローサイトメーターによって
検出され得る独特の蛍光シグナルを産生し、次いで、このマイクロビーズは適切
に分別される。従って、蛍光シグナルを放射し、標的ＤＮＡの数百または数千の
多様な遺伝子を示す数百万のマイクロビーズを、この手順によって非蛍光マイク
ロビーズから容易に検出および分離し得る。

【０１２０】 本発明は、患者集団において共通に現れる遺伝子のみの単離および同定を可能
にするので、特定の病状を有する個体の集団を、共通の遺伝的特性（例えば、未
知の遺伝子のセットにおける未知の変異／多型の共通のセット）に関してスクリ
ーニングし得る。例えば、若年肺癌を有する５人の患者のセットに関して、およ
び遺伝性の未知の変異遺伝子がセットの仮定され得る人に関して。

【０１２１】 各患者由来の組織サンプル（例えば、リンパ芽球）からＤＮＡを抽出する。次
いで、このＤＮＡを小さなフラグメント（例えば、５０〜２００塩基対）へ酵素
的に消化する。３番目に、２つの対立遺伝子間のヘテロ接合性として現れる多型
（変異）を含むフラグメントを選択し、そして変異していないＤＮＡフラグメン
トの集団から単離する。この仕事を達成するための１つの好ましい手順は、アル
デヒド−リンカーに基づいた方法を用いる、上記で記載した手順であり、ここで
さらには述べない。別のあまり好ましくない可能性は、非変異体配列を廃棄する
一方、ヘテロ接合性配列を「捕獲」および単離し得る、任意の他の記載された技
術を利用することである。上記の技術の組合せもまた可能である。多型のスクリ
ーニングについて、罹患した各個体から選択された「標的」ＤＮＡは、１つの遺
伝子由来のみ、または好ましくはいくつかの遺伝子由来、またはｃＤＮＡライブ
ラリー全体由来、またはゲノム全体由来であり得る。

【０１２２】 各個体からの変異体フラグメントの単離後、フラグメントを蛍光プローブ、ま
たはプローブの組合せで標識したプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。例えば、
５人の個体の変異体ＤＮＡの各々を、フローサイトメトリーに適切な、グループ
の別のメンバーのものとは異なる蛍光プローブ、またはそれらのプローブの組合
せで標識する（７−ヒドロキシクマリン；フルオレセイン；ローダミン；テキサ
スレッド；Ｂｏｄｉｐｙなど）。

【０１２３】 次いで、５人の個体由来の蛍光標識化ＤＮＡを、一緒に混合し、そして上記で
記載されるように作製したマイクロビーズとハイブリダイズさせる。上記で記載
されるように、マイクロビーズの各サブセットは、「コントロール」ＤＮＡとし
て特定の遺伝子（または遺伝子フラグメント）を有する。単純さのために、１つ
の遺伝子フラグメントのみを示す、マイクロビーズの１つのサブセットのみが含
まれると仮定する。このようなマイクロビーズの各々は、対応する遺伝子フラグ
メントが５人の個体全てにおいて同時に変異している場合、５人の個体全て由来
の標的ＤＮＡがそれに結合することを可能にする。このマイクロビーズは、フロ
ーサイトメトリーでスクリーニングした場合に、５つの蛍光波長全てを放射し、
従って４、３、２、１、または０個の蛍光発光を有するマイクロビーズから分別
および分離され得る。

【０１２４】 １つではなく、多くの遺伝子を示すマイクロビーズのいくつかのサブセットを
利用する場合、この手順は変化されないままである。フローサイトメーターは、
同じ容器中で、設定パーセンテージ、例えば５つの蛍光プローブ全て（すなわち
、５人の個体全てからの遺伝子）からの蛍光シグナルを示す、全てのマイクロビ
ーズ（すなわち、その同一性とは無関係に全ての遺伝子）を分別する。これらが
、目的の遺伝子、すなわち患者集団において共通の疾患を引き起こす可能性のあ
る変異遺伝子である。

【０１２５】 これら共通遺伝子の同一性を発見するために、フローサイトメトリーの後、分
別したマイクロビーズをＰＣＲ反応において使用して、このマイクロビーズ上に
固定化されたＤＮＡフラグメントを増幅する。変異フラグメントの単離のために
従う手順の設計によって、各フラグメントは同じ、公知のＰＣＲプライマーに隣
接している（以前に提出されたＤＦＣＩ特許を参照のこと）。最後に、ＰＣＲの
後、増幅されたフラグメントを、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、現在市販され
ているアレイ、または好ましくは上記で記載されるアレイ）上での１回の適用に
よって同定し得る。

【０１２６】 従って、本手順は、罹患した患者集団に共通に現れ、従って特定の疾患に関連
する（またはその原因となる）増加した見込みを有する、変異／多型遺伝子の単
離および同定を可能にする。任意の１人の個体における変異／多型遺伝子は、お
そらく多いが（例えば、全ｃＤＮＡにわたって１００，０００の多型）、共通の
遺伝子は、おそらく数がより少ない。なぜなら、５人の個体全てにおいて共通に
現れなければならないからである。より多くの個体を本方法を用いて同時にスク
リーニングすれば、「共通」変異遺伝子はより少なくなり、従って、「疾患遺伝
子」がより迅速に同定される。

【０１２７】 本方法を用いて、５人より多い個体を共通変異遺伝子に関してスクリーニング
しようとすると、再びフローサイトメトリー法は、以下のように適用され得る：
最初に、５人の個体由来のＤＮＡを蛍光標識し、そして上記で記載されるように
スクリーニングする。次いで、５人の個体全てで変異している遺伝子に対応する
分別されたマイクロビーズを、蛍光を除去するために簡単に処理する（例えば、
蛍光鎖を除去するために２分間、９６℃で加熱することによって；または蛍光プ
ローブを含むＤＮＡセグメントを除去する酵素によって；など）。次いで、これ
らのマイクロスフェアを、さらに５人の個体をスクリーニングするために、再び
同じ手順によって処理する：それらを、これら個体由来の標識化ＤＮＡと混合し
、変異遺伝子とハイブリダイズさせる；次いでそれらをフローサイトメトリーに
よって分別し、５つの蛍光シグナル全てを放射するマイクロビーズを選択する。
これらは、最初および２番目の５人の個体のセット両方で、変異遺伝子を捕獲し
たマイクロビーズを示し、そしてこれらは今や１０（５＋５）人の個体全てで変
異した遺伝子を示す。この手順を反復することによって、より多くの個体をスク
リーニングし得る。最終的に、分別されたマイクロビーズの数は有意に減少し、
そして探索している少しの「疾患特異的遺伝子」に対応するはずである。

【０１２８】 しかし、変異遺伝子がほとんどの個体で癌の原因に関与し得るが、これは癌の
形成に必要でない可能性がある。従って、これは、癌の８０％で変異遺伝子とし
て単に現れ得る。本発明の重要な特徴は、全ての個体で変異した遺伝子を同定す
ることに加えて、ほとんどの個体で現れるが全ての個体では現れない変異遺伝子
を同定することも可能にすることである。例えば、マイクロスフェアのフローサ
イトメトリー分別を、シグナルのうち２つ、より好ましくは５つのシグナルのう
ち３つが、単一のマイクロスフェアに存在する場合に、それも別の容器に選択さ
れるように、調節し得る。特定のカットオフパーセントを容易に選択し得る。同
様に、変異遺伝子が５人の個体のうち４人に存在する場合、それも分別し得る、
など。この様式では、１００％の患者で変異している遺伝子だけでなく、好まし
くは５０％、またはより好ましくは６０％などで変異している遺伝子もまた、同
定される。さらにより好ましくは、この変異はメンバーの８０％に存在する。グ
ループが関連する個体で構成される場合、より高いパーセンテージが見られる。

【０１２９】 本アプローチのためにフローサイトメトリーおよびマイクロビーズを利用する
実用的な利点は、ＤＮＡが、「可撓性でない」ＤＮＡチップ上に固定化されるの
ではなく個々のマイクロビーズ上に固定化されているので、使用者はどの遺伝子
およびコントロールを研究に含むかについての完全な支配を有し、それによって
、この方法を、特定の適用の必要性に対して、実験ごとに調整し得ることである
。

【０１３０】 代替の適用では、患者集団で共通の変異／多型を探索する代わりに、特定の遺
伝子セットの共通な発現を探索する（例えば、癌組織、または肺癌にかかりやす
い患者のセットなどにおいてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ
ている共通の遺伝子など）。

【０１３１】 この目的のために本発明を利用するために、同様のフローサイトメトリー分析
を適用し得る。簡単には、各個体から生成されたｃＤＮＡを酵素的に断片化し、
変性し、そして独特の蛍光プローブまたはプローブの組合せでタグ化したＰＣＲ
プライマーに連結する。次いで、いく人かの個体由来の標識された一本鎖ｃＤＮ
Ａ分子を、共に混合し、そして上記で設計および記載されるマイクロビーズとイ
ンキュベートする。次いで、記載されるフローサイトメトリー過程を適用して、
全ての個体における特定遺伝子の組合せたアップレギュレーションを意味する、
全ての個体からのシグナルを同時に示すマイクロスフェアを分別する。特定のシ
グナル強度を、「閾値」（それより上は、遺伝子がアップレギュレートされてい
る（すなわち、多くのコピーがマイクロビーズに結合される）、またはダウンレ
ギュレートされているとみなされる）として選択し得る。この手順では、集団の
中で共通にアップレギュレートされている、およびダウンレギュレートされてい
る遺伝子をどちらも、一緒に集めてそして別の容器に分別する。従って、集団に
おける共通の変異を得るための、上記に記載されるプロトコールに従うことによ
って、共通にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされている遺伝子も
また同定され得る。

【０１３２】 フローサイトメトリーは、本発明の好ましくかつ非常に便利な実施形態である
が、いくつの蛍光シグナルがマイクロスフェアを測定するたびに同時に検出され
得るか、およびいくつの異なる蛍光団が使用され得るかに関して制限を有する。
代表的なフローサイトメーターでは、５〜７のシグナルが同時に測定され得る；
従って、それぞれのフローサイトメトリー測定は５〜７人の個体における共通遺
伝子を容易に検出し得、そしてこの手順を、さらなる個体をスクリーニングする
ために反復し得る。５０人の患者集団をスクリーニングするために、この手順を
、代表的には７〜１０回反復する必要がある。５〜７のシグナルより多くを同時
にスクリーニングし得る専門化されたフローサイトメーターもまた存在し、そし
てこれらはこの手順の効率を増大させ得る。

【０１３３】 あるいは、マイクロスフェアからの組合せたシグナルを、異なる検出システム
（例えば、ＩＣＣＤカメラ、顕微鏡、またはいくつかの波長を同時に検出する光
電子増倍管）を用いて検出し得る。

【０１３４】 この方法が、毎回最適に行われていることを保証するために、いくつかのコン
トロール遺伝子およびマイクロビーズを、好ましくはフローサイトメトリーによ
る決定に含み得る。

【０１３５】 １つの実施形態において、これらのビーズを用いたこれらのＤＮＡ不一致の同
定を実行するためのキットは、販売され得る。このキットは、修復グリコシラー
ゼ、Ｘ−Ｚ−Ｙ化合物および好ましくは使用説明書を含む。これらの材料は、任
意のバイアルに存在し得る。この材料は、凍結乾燥された形態で存在し得る。

【０１３６】 好ましい実施形態において、ＰＣＲプライマーもまた、含まれる。

【０１３７】 １つの好ましい実施形態において、次のキット材料および使用説明所が含まれ
得る。

【０１３８】 （キット処方） １、標的ｃＤＮＡおよびコントロールｃＤＮＡを単離する。

【０１３９】 ２、末端で切断可能なビオチンを含むＰＣＲプライマーを加える。

【０１４０】 ３、標的物とコントロールとを混合し、交差ハイブリダイズさせる。

【０１４１】 ４、サンプルをストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔｒａｖｉｄｉｎ）で覆われ
た磁気ビーズに結合する。（あるいは、ストレプトアビジンで覆われたマイクロ
プレートが使用され得る。） ５、固体支持体上で固定されたサンプルを用いて、以下を実施する。：ヒドロ
キシアミン処理／洗浄；Ｍｕｔ Ｙ／ＴＤＧ処理／洗浄；ＦＡＲＰ／ＢＡＲＢ／
ＡＥＤ標識／洗浄。抗体標識／洗浄；不一致の化学発光検出。これらの全ての工
程は、固定化したＤＮＡを用いて実施するのに非常に容易であり、そして簡便で
ある。

【０１４２】 ６、サンプルを回収し、そして変異を含むＤＮＡを単離するために、ＤＴＴ（
下を参照のこと）を添加し、切断可能なビオチン上のＳ−Ｓ結合を切断する。

【０１４３】 ７、すぐに、選択されたリガンド化合物について適切な固体支持体上へこの調
製物を適用する：（ＦＡＲＰ、ＢＡＲＰおよびＡＥＤそれぞれについて抗フルオ
レセイン、ストレプトアビジン、スクシンイミジルエステルで覆われたプレート
）非結合性のＤＮＡを除去し、変異したＤＮＡのみを捕獲する。

【０１４４】 ８、すぐに、マイクロプレートから変異したＤＮＡを収集する。これを、いく
つかの方法でなし得る；例えば、１Ｍのヒドロキシルアミンを添加し、リガンド
とＤＮＡとの間の結合を切断する；または、温度を上昇させ、捕獲したＤＮＡを
変性させそして非改変の鎖を収集する；または、切断可能な−Ｓ−Ｓ−含有プロ
ーブの場合において、単にＤＴＴを添加し、マイクロプレートへの結合を切断す
る。

【０１４５】 ９、工程２で挿入されたプライマーを用いてＰＣＲを適用する。

【０１４６】 １０、ハイブリダイゼーション技術を使用する上記の変異検出アレイを用いて
変異された遺伝子を検出する。 代替の実施形態において、次のプロトコルが使用され得る： １、標的ＤＮＡおよびコントロールＤＮＡを混合する（例えば、１：１の比で）
。コントロールＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡ配列に対応する野生型ＤＮＡである。
ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの全体または一部であり得；または、ＰＣＲ増幅された
ゲノムＤＮＡの一部；またはＤＮＡのコード部分に対応するｃＤＮＡライブラリ
ーであり得る。単一固体の細胞中における２つの対立遺伝子の間のｓｎｐが、試
験される場合において、１つの対立遺伝子由来のＤＮＡは、「標的物」としてみ
なされ、一方、２番目の対立遺伝子由来のＤＮＡは、「野生型」としてみなされ
る。 ２、この混合物を二重鎖小フラグメント（例えば、５０〜２００塩基対）へ消化
する。消化を、標準状態（１時間、３７℃）で１以上の制限エンドヌクレアーゼ
（例えば、ｓａｕｉ，ａｌｕｉ，ｈｅｐａ−２など）を用いてなし得る。オーバ
ーハング（「突出末端」）を生成する酵素を用いる消化が、好まれる。 ３、標的ＤＮＡをコントロールＤＮＡ配列とハイブリダイズさせ、二重鎖を作製
する。このハイブリダイゼーションの結果として、不一致がＳＮＰおよび変異の
位置で起こる。単一固体由来のＤＮＡのセルフハイブリダイゼーションは、自動
的に２つの対立遺伝子由来のフラグメントの間で不一致を生成する。 ４、二重鎖リンカーをＤＮＡフラグメントの両端へ連結する。連結を、標準条件
下、ＤＮＡフラグメントの突出末端を用いて、リガーゼを介してなすか、または
確立された５’末端連結方法を介してなす。 ５、ビオチン標識化不一致修復酵素（Ｍｕｔ Ｙ）を、上記の手順に従って、Ｄ
ＮＡ上の不一致の位置で架橋する。 ６、アビジンで覆われた磁気ビーズ上のビオチン標識されたＤＮＡフラグメント
を単離する。 ７、工程４において連結された公知のプライマーを使用して、ビーズから直接に
、単離されたＤＮＡフラグメントをＰｃｒ増幅する。チップＤＮＡアレイが、最
後の工程で使用されるならば、このプライマーをビオチン標識化し得る。 ８、生じた、末端でビオチン標識化されたＤＮＡサンプルを、チップ変異スキャ
ニングアレイ上で直接ハイブリダイズし得る。次いで、認識可能な部分を、ＳＮ
Ｐ／変異を含む遺伝子領域を明かにするために使用し得る（例えば、ビオチン標
識化されたＤＮＡの次に、フルオレセイン化されたストレプトアビジンが続き得
る、など）。

【０１４７】 以下の実施例は、本発明の例示であるが、それに限定されない。

【０１４８】 （実施例１ Ｘ−Ｚ−Ｙ化合物の１つであるＦＡＲＰマーカー分子を用いた、
癌性のサンプルにおける塩基置換変異の大規模な検出のための方法（図１を参照
のこと）） 癌組織から単離したｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへ転写する。後の段階でのＰＣＲ増
幅のために、プライマーをこの段階でＤＮＡへ添加し得る（図１参照のこと）。
次いで、このサンプルを、対応する野生型ＤＮＡサンプルとハイブリダイズさせ
、変異の位置で不一致対形成を生成させる。このハイブリダイズされたＤＮＡサ
ンプルをヒドロキシルアミンで処理し、自発的に形成され得る任意のアルデヒド
を除去する。次いで、このハイブリダイズされたＤＮＡサンプルを、Ｍｕｔ Ｙ
酵素を用いて処理する。酵素処理は、Ａ／Ｇ不一致を認識し、そして認識のとき
に、ＤＮＡを脱プリン化し、かつ不一致の部位でアルデヒドを同時に生成する。
次いで、このＤＮＡを標識化合物であるＡＥＤまたはＦＡＲＰまたはＢＡＲＰを
用いて処理し、不一致の位置で共有結合的オキシム結合を生成する。標識化のと
きに、このＤＮＡを、特異的な標識化合物に適切なマイクロプレート上で固定化
し、そして過剰の非標識のＤＮＡを洗い流す。ここで、不一致部位で標識された
ＤＮＡを、ＤＮＡアレイを介する標識遺伝子の化学発光または同定による全変異
の検出を含む種々の方法によって分析し得る。

【０１４９】 （材料および方法） １）ＤＮＡ，オリゴマーおよび化学物質：ＦＡＲＰ［５−（（（２−（カルボ
ヒドラジノ）−メチル）チオ）アセチル）−アミノフルオレセイン，アミノキシ
アセチルヒドラジド，蛍光性アルデヒド反応性プローブ］を（Ｍａｋｒｉｇｉｏ
ｒｇｏｓ ＧＭ，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ＳおよびＭａｈｍｏｏｄ Ｓ．Ｉｎ
ｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ，７４：９９−１０９，１９９８）に記載のよ
うに合成した。高純度ゲノムの仔ウシ胸腺ＤＮＡおよび二重鎖ラダー（ｐＵＣ１
８ Ｍｓｐ Ｉ 消化物，２７−５００塩基対）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌから購入し、そしてさらなる精製なしで使用した。一本鎖（＋鎖）Ｍ１３
ＤＮＡを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し、そしてｐＧＸＩｓ
１４プラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ ＭａｃＬｅｏｄ，ＭＤ（Ａｎｄ
ｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）からの贈り物）を、以前に記載（Ｍ
ａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ ＧＭ，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ＳおよびＭａｈｍｏ
ｏｄ Ｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ，７４：９９−１０９，１９９
８）されたように宿主細菌から単離した。アガロースゲル電気泳動および２６０
ｎｍ〜２８０ｎｍでの吸光度比の両方を、プラスミドの純度を決定するために実
施した。ＴＦＩＩＩＡ転写因子が結合したＸｅｎｏｐｕｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配
列を示す、ゲル精製された４９マーのオリゴヌクレオチド（本実施例の最後で、
表１中に列挙される）は、Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ Ｉｎｃによって供給された。
酵素 Ｍｕｔ Ｙ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ Ｉｎｃ．から購入し
、そして製造業者の推奨の通りに保存した。Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌから
購入したヒドロキシルアミンを、すでに、実験の前に新鮮に作製した。ＧＴＧア
ガロースを、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから得、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動試薬を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから得、一方、Ｓ
ＹＢＲ ＧＯＬＤ核酸ゲル染色およびＰｉｃｏｇｒｅｅｎθ ＤＮＡ定量化色素
は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから供給された。化学発光研究のために
、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎで覆われたポリスチレンプ
レート（ウシ血清アルブミンを用いて予めブロックした）は、Ｐｉｅｒｃｅによ
って供給された。抗フルオセインＦａｂフラグメント（ヒツジ）−アルカリ性ホ
スファターゼ結合体（抗Ｆ−ＡＰ）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍから購入した。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ、すなわち、１，２ジオキセタン化学発光酵
素基質およびＣＤＰ−Ｓｔａｒとともに使用したＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩθエンハ
ンサーをＴＲＯＰＩＸから購入した。Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ Ｇ２５ク
ロマトグラフィーカラムを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ研究室から得た。Ｌａｂｅｌ ＩＴ
θ核酸ビオチン化キットを、Ｐａｎ Ｖｅｒａ Ｉｎｃ．から購入した。すべて
の試薬および緩衝液は、分析等級であり、そしてα−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）によって送達された高純度の水（それぞれ１８００Ｍｏｈｍ ｍ^-1 ）
を用いて作製した。

【０１５０】 ２）子ウシ胸腺ＤＮＡの、酸性または生理学的デプリネイション。ヒドロキシ
ルアミンを使用する処置。

【０１５１】 アルデヒド含有無プリン／無ピリミジン（ＡＰ）部位を、記載されるように（
Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ ＧＭ，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ＳおよびＭａｈｍ
ｏｏｄ Ｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ，７４；９９−１０９，１９
９８）、３８℃の温度で、設定時間にわたる酸性条件（ｐＨ＝３．５）への短時
間の曝露（０〜６０秒）により、子ウシ胸腺またはプラスミドＤＮＡに化学的に
導入した。サンプルを速やかに氷の上に置き、そして中和溶液（３Ｍ酢酸ナトリ
ウムおよび１Ｍリン酸カリウム（それぞれｐＨ７およびｐＨ７．５）の１０％緩
衝液）を５０ｌの最終容量まで添加することで、反応を停止した。ＡＰ部位をま
た、３７℃、ｐＨ＝７．０で、数日間にわたって、自発的なデプリネイションを
介して、子ウシ胸腺ＤＮＡにおいてゆっくりと生成し、そしてこれらを本発明の
アッセイでモニターした。３７℃でインキュベートする前に、潜在的なＦＡＲＰ
結合部位のプールから、存在するアルデヒドの痕跡を除去するために、ＤＮＡを
、５ｍＭのヒドロキシルアミンで、室温で１時間処理した。次いで、ヒドロキシ
ルアミンをＧ２５超遠心分離を介して除去し、そしてサンプルをリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７）において再懸濁した。

【０１５２】 ３）アルデヒドのＦＡＲＰ捕獲、およびそれに続くＤＮＡビオチン標識 ＤＮＡにおいてＡＰ部位の位置で産生した鎖状アルデヒドを、共有結合的に捕
獲するために、５００Ｍ ＦＡＲＰを、４０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７
．０）において、１５〜２２℃で、３０分間、０．０５〜２．５ｇのＤＮＡと反
応させた。非共有結合的に結合したＦＡＲＰを、Ｇ２５超遠心分離により除去し
た。ＦＡＲＰ−標識ＤＮＡは、同じ日に使用するか、またはさらなる実験の前に
４℃または−２０℃で２〜３日保管した。ＦＡＲＰ−標識ＤＮＡを中性アビジン
（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）マイクロプレート上に固定するために、ＤＮＡを市
販のビオチン標識試薬に１時間曝露した（Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌ ＩＴ^TM試
薬、ＤＮＡ１ｇにつき試薬１ｌ、ＭＯＰＳ緩衝剤中、ｐＨ７．５、３７℃）。次
いで、過剰な試薬をＧ２５超遠心分離により除去した。サンプルは、速やかに使
用するか、または化学発光法の研究の前に４℃で２〜３日保管した。

【０１５３】 ４）子ウシ胸腺またはプラスミドＤＮＡにおけるＦＡＲＰ−捕捉アルデヒドの
化学発光測定 ＦＡＲＰおよびビオチンで二重に標識された二本鎖ＤＮＡを、５ｎＭ 抗Ｆ−
ＡＰ存在下で、中性アビジン被覆したマイクロプレート片上に固定した。全体で
５０ｌの、３０〜５０ｎｇの二重に標識されたＤＮＡおよび５ｎＭ 抗Ｆ−ＡＰ
を、ＴＥ（ｐＨ７．５）中で、１時間、室温でインキュベートした。結合してい
ないサンプルおよび抗Ｆ−ＡＰを、ピペットを使用すること（ｐｉｐｅｔｉｎｇ
）により除去し、そして少なくとも４回、ＴＥで洗浄した。次いで、マイクロプ
レート片を５０ｍｌのポリプロピレンチューブ中に移し、そして３０ｍｌ〜５０
ｍｌのＴＥ緩衝液中で、１０分間、一定に撹拌しながら４回洗浄した。次いで、
化学発光物質（ＣＤＰ−ＳｔａｒおよびＥｍｅｒａｌｄＩＩ機能剤）を０．１Ｍ
ジエタノールアミン（ｐＨ８．５）に添加して、抗Ｆ−ＡＰ−触媒による反応
を室温で１時間行い、その後、最大発光を達成した。別の実験において、マイク
ロプレート上に捕獲されたビオチン標識したＤＮＡの割合を定量するために、Ｐ
ｉｃｏｇｒｅｅｎθ染料を使用して、中性アビジン被覆したプレートからの除去
のすぐ前後に、二本鎖ＤＮＡを測定した。

【０１５４】 ５）化学発光装置 化学発光反応からの微光を、増幅荷電結合デバイス（ＩＣＣＤ）システム（Ｐ
ｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して検出した。このＩＣＣ
Ｄカメラは、光ファイバーによりＣＣＤアレイに連結された、近接結像マイクロ
チャネルプレート（ＭＣＰ）画像増幅装置を利用する。ＩＣＣＤの全面積は、光
検出が可能であり、Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）ＰＣコンピュータースクリーン
上に、５７６×３８４の総画素を与える。増幅装置およびＣＣＤの両方を、熱電
気的に−３５℃まで冷却すると、暗電流は毎分５０回よりも少ない。ＩＣＣＤを
使用して、マイクロプレート片の各細胞からの発光総量を検出した。細胞を、そ
れぞれＩＣＣＤから約２ｍｍの距離で、再現可能な相対位置（ｇｅｏｍｅｔｒｙ
）に配置し、毎秒の発光総量を測定した。バックグラウンド化学発光（ＦＡＲＰ
が手順から省略された場合に測定されるシグナル）を、全てのサンプルから差し
引いた。全ての測定を少なくとも３回繰り返した。

【０１５５】 ６）ホモ二重鎖オリゴヌクレオチドおよびヘテロ二重鎖オリゴヌクレオチドの
形成 ４９マーオリゴヌクレオチド、およびそれらの相補鎖を、中央に位置するＴか
らＧへの塩基置換を伴うか、または伴わないで、合成した。同じオリゴマーの別
の合成において、５’をビオチン標識した４９マー、およびそれらの相補的な、
ビオチン標識していない鎖を合成した（表１）。ハイブリダイゼーションのため
に、当モル量（〜約０．５ｇ）の各オリゴヌクレオチドを、４０ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、および５０ｍＭのＮａＣｌ中
でアニーリングし、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成した。その混合物を、まず
、９５℃まで２分間加熱し、次いで、６５℃で３時間ハイブリダイズさせ、そし
て室温までゆっくり冷却した。ハイブリダイゼーションに続いて、二重鎖４９マ
ーをヒドロキシルアミン（５ｍＭ、ｐＨ７．０のクエン酸中、３０分間、２５℃
）で処理し、ＦＡＲＰ反応性部位のプールから、自発発生的なまたは熱発生的な
アルデヒドの痕跡を除去した。

【０１５６】 ７）Ｍｕｔ ＹおよびＴＤＧを用いる、Ｍ１３ＤＮＡ、ラダーＤＮＡ、および
二重鎖オリゴヌクレオチドの処理、ならびにゲル電気泳動 ５０ｎｇの試験ＤＮＡ（一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ、ラダーＤＮＡ、または二本鎖オ
リゴヌクレオチド）を、１時間、３７℃で、４０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）中の１．０単位Ｍｕｔ Ｙと共にインキュベートし、次いで、ア
ルカリ処理し、損失アデニンの位置を鎖の切れ目に一致させた。一本鎖Ｍ１３Ｄ
ＮＡについて、１Ｘ ＴＢＥ緩衝液中、２０Ｖで一晩行う、０．９％アガロース
のアガロースゲル電気泳動により切断の産物の分析を行い、そして１ｇ／ｍｌの
臭化エチジウムで染色した。ラダーＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドについて、
２０Ｖ／ｃｍで、７．５Ｍ尿素の存在下での、１６％の変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により、フラグメント分析を行った。ＤＮＡフラグメントを、ＳＹ
ＢＲ Ｇｏｌｄ染色、またはエチジウム染色により検出し、そしてＥａｇｌｅ
Ｅｙｅ^TMＳｔｉｌｌ Ｖｉｄｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により写真を撮った
。

【０１５７】 ８）オリゴヌクレオチド、ラダーＤＮＡ、およびＭ１３ＤＮＡ中のＦＡＲＰ捕
獲不一致の化学発光測定 ヒドロキシアミンで処理した、Ｍ１３ＤＮＡ、ラダーＤＮＡ、または５’ビオ
チン標識オリゴヌクレオチド二重鎖を、上述のプロトコルを用いてＦＡＲＰ標識
およびビオチン標識したＭｕｔ Ｙに曝露した。オリゴヌクレオチドについては
、事前にビオチン標識されているので、ビオチン標識工程を省略した。いくつか
の実施例において、サンプルを７０℃で８分間保持し、この段階で酵素を不活性
化した。代表的には二重（ビオチンおよびＦＡＲＰ）標識核酸からの５０ｎｇを
、中性アビジン被覆したマイクロプレート上にアプライし、そしてそれらの化学
発光を測定した。

【０１５８】 （結果） １）本発明のプロトコルを使用したＤＮＡの二重標識および化学発光検出 図２は、連続的なフリーアルカリホスファターゼの希釈液を、ＣＤＲ−Ｓｔａ
ｒ（登録商標）基質およびＥｍｅｒａｌｄＩＩ機能剤に添加し、そして冷却した
ＩＣＣＤを用いて測定した場合に、本発明の機構を用いて得られた化学発光を示
す。本装置の化学発光検出限界は、０．０１ａＭアルカリホスファターゼより低
い。室温での基質および機能剤との混合に続く、溶液中のアルカリホスファター
ゼ化学発光シグナルの増大の調査は、６０分後に比較的一定な値が達成されてい
ることを示す（図２、挿入図）。従って、報告された全ての測定は、基質の添加
に続いて６０〜８０分で行った。中性アビジン被覆マイクロプレート上に捕獲さ
れたビオチン標識ＤＮＡの割合を評価するため、そのアプライの前に、そして結
合していないＤＮＡのマイクロプレートからの除去の直後に、Ｐｉｃｏｇｒｅｅ
ｎ^TM染料の蛍光を使用してビオチン標識ＤＮＡを定量した（示されない）。５０
〜１００ｎｇの高分子量の子ウシ胸腺ＤＮＡのうち、おそらく２次構造および付
随する立体障害のために、２％未満がプレート上に固定される一方で、４９−マ
ーオリゴヌクレオチドは、プレート上で約１０％の捕獲を生じた。

【０１５９】 ２）ＤＮＡ中のアルデヒドの超高感度検出 クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）中で、３８℃で６０秒間までの脱プリン化
の後に、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ中で生成したアルデヒド含有ＡＰ部位の
化学発光検出、およびＦＡＲＰによるＡＰサイトのトラップを、図３に図示する
。発光の誘導は、脱プリン化暴露に関して線形である。挿入図（先の研究（Ｍａ
ｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ ＧＭ，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ＳおよびＭａｈｍｏｏ
ｄ Ｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ，７４：９９−１０９，１９９８
）から）は、より長い脱プリン化時間（０〜６０分）と同じ条件下で曝された、
この同じプラスミドのＦＡＲＰ標識後の蛍光の検出を示した。この蛍光に基づく
アプローチは、本方法よりも感度が低いが、これは、１ＤＮＡ塩基対あたりのＦ
ＡＲＰ分子の数の直接的な定量化を可能にする。同じプロトコル下での５分間の
脱プリン化は、３４，０００塩基当たり約１つのＡＰ部位を生じる（Ｍａｋｒｉ
ｇｉｏｒｇｏｓ ＧＭ，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ＳおよびＭａｈｍｏｏｄ Ｓ
．Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ，７４：９９−１０９，１９９８）。よ
り低い脱プリン化暴露についてＡＰ部位の線形減少を仮定すると、図３において
１５秒の暴露は、約７×１０⁵塩基あたり１つのＡＰ部位に対応する。このシグ
ナルを発生する、マイクロプレート捕獲ＤＮＡの量は、約１〜２ｎｇである。従
って、１５秒間の脱プリン化後に記録されるＡＰ部位の絶対数は、約５アットモ
ルである（図３の右軸を参照のこと）。

【０１６０】 検出可能なＡＰ部位の最も低い数を推定するために、まず、仔牛胸腺ゲノムＤ
ＮＡのヒドロキシルアミン処理を、微量の自発的に発生したＡＰ部位（例えば、
ＤＮＡ抽出前に哺乳動物細胞由来のゲノムＤＮＡ中に存在すると予測されるＡＰ
部位、および操作の間に発生したＡＰ部位）を取り除くために行った。ヒドロキ
シルアミンは小分子であり、メトキシアミンについて先に示された（Ｔａｌｐａ
ｅｒｔ−Ｂｏｒｌｅ Ｍ、およびＬｉｕｚｚｉ Ｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，７４０：４１０−４１６，１９８３）ように、
アルデヒドと素早く反応し、それによって、後に加えられたＦＡＲＰが同じ位置
に反応することを妨げると予想される。図４Ａは、１５秒間脱プリン化した仔牛
胸腺ゲノムＤＮＡのヒドロキシルアミン処理後に得られた化学発光シグナルの減
少を図示する。ヒドロキシルアミンの除去およびＦＡＲＰとの反応の後、化学発
光は、ほとんどバックグラウンドレベルまで減少した。ヒドロキシルアミン処理
した仔牛胸腺ＤＮＡを、３７℃、リン酸塩緩衝液ｐＨ＝７で保ち、そして時間の
関数としてのＦＡＲＰを介して、ＡＰ部位についてアッセイした場合、自発的に
発生したアルデヒドＡＰ部位の線形増加を検出した（図４Ｂ）。同様の条件下で
４℃で保ったＤＮＡは、何ら発光シグナルを現さなかった（図４Ｂ）。図４Ｂに
従って、このマイクロプレートに基づく方法による検出の限界は、約１００ｎｇ
の出発ＤＮＡ材料を用いて、約０．２アットモルＡＰ部位（すなわち、２×１０ ⁷ 塩基あたり１ＡＰ部位）である。

【０１６１】 ３）Ｍｕｔ Ｙ処理したオリゴヌクレオチドおよび一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡのゲ
ル電気泳動 ハイブリダイゼーションの際に中心に配置されたＡ／Ｇ不一致ありまたはなし
で、二重鎖構造を形成するように操作した４９マーのオリゴマーを、Ｍｕｔ Ｙ
に曝し、アルカリ処理し、そして変性ゲル電気泳動で検査した。２つの予想した
フラグメントの生成がヘテロ二重鎖オリゴマーについて観察されたが、ホモ二重
鎖において存在するような切断は観察されなかった（図５Ａ）。適用された条件
下で、このフラグメント化されたＤＮＡは、１レーンあたり全ＤＮＡの５０％未
満であるようであり、これは、全てのＡ／Ｇ不一致が反応する場合、Ｍｕｔ Ｙ
による結果である。このホモ二重鎖含有二重鎖ＤＮＡラダー（２７〜５００塩基
対フラグメント）は、酵素処理後にさらなるフラグメント化を示さなかった（図
５Ｂ）。対照的に、７２４９塩基長のＭ１３一本鎖ＤＮＡのＭｕｔ Ｙ処理は、
約６フラグメントの生成をもたらし、このうち最も長いものは、図４Ｃのレーン
５において示されるように、約１０００塩基長である。高分子量の一本鎖ＤＮＡ
におけるＭｕｔ Ｙ認識部位の生成は、過渡の不一致を生成する配列の自己相補
性に起因する。６つの別のフラグメントを生成し、そして各々の部位の切断にお
けるＭｕｔ Ｙの１００％未満の有効性を想定して、各７２４９塩基長のＭ１３
分子あたり平均３つのＭｕｔ Ｙ認識切断部位が生成することが推測され得る。

【０１６２】 ４）高分子量ＤＮＡおよび低分子量ＤＮＡにおける不一致のＦＡＲＰに基づく
化学発光検出 １００ｎｇのビオチン化４９マーホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖から開始し、
この核酸を、ヒドロキシルアミン、Ｍｕｔ Ｙ、次いでＦＡＲＰで連続的に処理
し、そして不一致の化学発光検出のために中性アビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉ
ｎ）マイクロプレート上に適用した。Ａ／Ｇ不一致含有オリゴヌクレオチドに対
する強力なシグナルが得られた（図６）が、Ｍｕｔ Ｙを省略した場合、または
不一致を有さないオリゴヌクレオチドをＭｕｔ Ｙ処理した場合は、シグナルは
得られなかった。同じ様式で処理した二重鎖ホモ二重鎖（ＤＮＡラダー）の混合
物もまた、化学発光シグナルの非存在を示した（図７）。対照的に、一本鎖Ｍ１
３は、Ｍｕｔ Ｙなしで得られたシグナルの約１００倍の化学発光シグナルを示
し、このことは、Ｍｕｔ Ｙ処理後のＦＡＲＰ反応性部位の生成を示す（図７）
。この化学発光の結果は、ゲル電気泳動により得られたフラグメント化の結果と
一致する（図５）。 （表１：合成オリゴヌクレオチドの配列）

【０１６３】

【表１】 １および２は相補的であり、ホモ二重鎖を形成する。１および３は、２０位に
Ａ／Ｇ不一致を有するヘテロ二重鎖を形成する。オリゴヌクレオチドの別々のセ
ットにおいて、ビオチン分子（Ｂ）は、合成の間に５’末端で組み入れられた。

【０１６４】 （実施例２） （一本鎖Ｍ１３ＤＮＡの自己相補性を介して形成された不一致のＢＡＲＰに基
づく検出） ２，５００塩基あたり約１つのＭｕｔ Ｙ認識可能な不一致を含む、Ｍ１３一
本鎖ＤＮＡのサンプルをＭｕｔ Ｙで処理し、ＢＡＲＰとの反応に対して適切な
、アルデヒド含有反応部位を生成した。次いで、名目上のゲル電気泳動研究およ
びＢＡＲＰに基づく化学発光研究を行った。用いたコントロールサンプルは、以
下であった：酵素処理なしの一本鎖Ｍ１３；不一致なしの二重鎖Ｍ１３ＤＮＡお
よび酵素処理なし；ならびに不一致なしの二重鎖Ｍ１３ＤＮＡおよび酵素あり。
図８（ＡおよびＢ）は、両方の検出方法の結果を示す。図８Ａ（発光研究）は、
不一致が存在する場合（一本鎖Ｍ１３）およびＭｕｔ Ｙが使用される場合にの
み、化学発光シグナルがあることを示す。一致して、ゲル電気泳動（図８Ｂ）は
、Ｍ１３における切断が同じ条件下でのみ生成することを示す。２つの方法の間
に良好な一致が存在することが示され得る。記載したように、この方法は、不一
致含有ＤＮＡに対して非常に特異的である（すなわち、不一致を有さないＤＮＡ
、または不一致を有するがＭｕｔ Ｙを有さないＤＮＡはシグナルを発生しない
）。

【０１６５】 （実施例３） （塩基置換変異を含むＤＮＡの検出および単離：７０９１長プラスミド内のｐ
５３遺伝子において操作された、単一のＡからＣへの塩基変換の検出） 本技術（Ａ．Ｌ．Ｂ．Ｕ．Ｍ．Ｓ）の塩基不一致を検出する能力（上記の実施
例において示した）は、塩基置換変異の検出に直接的に適用可能である。例えば
、ＤＮＡにおける変異の位置で不一致を生成する標準的な手順は、変異含有ＤＮ
Ａと野生型ＤＮＡを混合することである。この混合物の加熱および再ハイブリダ
イゼーションにより、不一致を有するヘテロ二重鎖を変異の位置で生成し（図１
）、次いでこれは、実施例１で示したような高い感度および特異性で検出され得
る。

【０１６６】 正常なＤＮＡから変異体を含むＤＮＡを単離するために、不一致の位置で生成
されたアルデヒドのＢＡＲＰ−標識化（図１）後、このＤＮＡを中性アビジン（
ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）でコートしたマイクロプレート上に固定化し、続いて
徹底的に洗浄し、ホモ二重鎖ＤＮＡを除去する。結果として、ＢＡＲＰを含むＤ
ＮＡのみが、プレートに残存し、これにより変異体ＤＮＡを単離する。

【０１６７】 このマイクロプレートから変異を含む精製したＤＮＡを回収するために、この
サンプルを２分間９６℃にて加熱するか、またはＮａＯＨで１分間処理するかの
いずれかにより、ＤＮＡを変性し得、そして非共有結合的に改変された鎖を回収
し得、次いでこれをＰＣＲを介する増幅に使用する。以下の節は、この手順を詳
細に述べる。

【０１６８】 全長ヒトｃＤＮＡ ｐ５３配列（１，６９１ｂｐ）を組み込んだ７，０９１ｂ
ｐの長いプラスミドを、部位特異的変異誘発を介して、塩基置換を含むように操
作した。プラスミドに組み込まれたｐ５３中のコドン３７８において操作した、
ＡからＣへの既知の塩基置換変異体を検出するために、本発明の技術を使用した
。変異体ｐ５３遺伝子を含む環状プラスミド（１μｇ）は、５’−ＣＧ／ＣＧ−
３’切断酵素（ＢｓｔＵ Ｉ、Ｓｉｇｍａ、１ユニット、１時間、３７℃）で処
理し、直鎖状フラグメント（約４００〜２，５００ｂｐ）を生成し、次いで７０
℃で１０分間処理し、酵素を不活性化した。同様に処理した正常ｐ５３を含むサ
ンプルと、この変異を含むサンプル（１μｇ）を混合（１：１）し、加熱し（９
６℃、２分間）、そして一晩６５℃にてハイブリダイズし、ｐ５３コドン３７８
、ならびにホモ二重鎖ｐ５３およびプラスミドフラグメントでＡ／Ｇ（２５％）
不一致およびＴ／Ｃ（２５％）不一致を生じさせた。

【０１６９】 ＡＬＢＵＭＳを介して変異体の存在を検出するために、１００ｎｇの不一致を
含むＤＮＡ混合物（ｐ５３およびプラスミドフラグメント）を、実施例２でＭ１
３の処理について記載されるように正確に処理した：（ａ）ヒドロキシアミン処
理および除去、（ｂ）Ｍｕｔ Ｙ処理およびＢＡＲＰ結合、（ｃ）フルオレセイ
ン化および（ｄ）中性アビジンプレートへの結合および化学発光検出。図９Ａは
、変異体が存在する場合に強いシグナルが観察され、一方バックグラウンドのシ
グナルは、正常なｐ５３を含むプラスミド（すなわち、偽陽性の完全な欠如）か
ら得られることを実証する。図９Ｂは、シグナル対マイクロプレート上に適用し
たＤＮＡ量の変動を示す。これらのデータは、４つの独立した実験の平均を示す
。

【０１７０】 結論として、本発明の技術（Ａ．Ｌ．Ｂ．Ｕ．Ｍ．Ｓ）は、７，０９１塩基対
長（偽陽性が見かけ上存在しないｐ５３を含むプラスミド（不一致が存在しない
場合のシグナルとして定義される、図９Ａ））における一塩基置換変異体の高感
度かつ特異的な検出を可能にする。７，０９１長のプラスミドにおける一塩基置
換の明確な検出は、既存の方法（Ｎｏｌｌａｕ ＰおよびＷａｇｅｎｅｒ Ｃ．
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１１１４−１１２８，１９９７
）のいずれでも容易に実施され得ない。一方、ＡＬＢＵＭＳは、必要とされる最
少限のサンプル（＜１００ｎｇ）および労力で、マイクロプレート上の変異体を
検出し得る。ヘテロ二重鎖の形成後、現在、この手順は、６時間内に完了し、特
別な装置または面倒な取扱いを必要とせず、そして９６のサンプルを一度に試験
し得るようにマイクロプレート上で自動化され得る。従来の配列決定を使用して
同様の結果を達成することは、可能ではなかった（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ ＳＢ，Ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，第５章，Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，１２５頁，
第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ
）。

【０１７１】 （実施例４：ＤＮＡ中のＭｕｔ Ｙ−生成反応部位またはＴＤＧ−生成反応部
位への結合における小リガンド化合物 対 大リガンド化合物の比較：ＡＥＤウ
イルスＢＡＲＰ 対 ＦＡＲＰの合成および利点。ＡＥＤによる化学発光シグナ
ル） （ａ）ＡＥＤを合成するために、カップリング剤として１−エチル−３−［３
−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を使用して蒸留水
中で、Ｏ−（カルボキシメチル）ヒドロキシルアミンヒドクロリドをエチレンジ
アミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合体化した。カルボキシル基にエチレンジアミン
を優先的にカップリングさせる反応の間、Ｏ−（カルボキシメチル）ヒドロキシ
ルアミンヒドクロリドを超える１００倍過剰のエチレンジアミンを使用した。Ｅ
ＤＡＣによるこの反応の触媒のための条件は、当業者に周知である。ＴＬＣ分析
および７０：２０：５の割合のＣＨＣｌ₃：ＣＨ₃ＯＨ：ＣＨ₃ＣＯＯＨを用いる
シリカゲル上での精製は、０．２〜０．２５のＲ_fで生成物を示した。この分析
の証明は、初期に提供されたＡＥＤ構造と一致した１Ｈ ＮＭＲデータを提供し
た。

【０１７２】 （ｂ）ヒドロキシルアミンベースの化合物（例えば、ＦＡＲＰ、ＡＥＤ、ＢＡ
ＲＰまたはメトキシアミン）が、ＤＮＡの反応部位に結合する能力は、単純な実
験で試験され得る。ヒドロキシルアミン−化合物（例えば、メトキシアミン）が
、ＤＮＡ中のアルデヒドを含む無塩基部位に共有結合する場合、アルカリ（Ｎａ
ＯＨ）を用いる処理が、塩基欠失の位置（さもなくば、切断が生じる）で鎖破断
を生じ得ないことは、周知である。この単純な観察は、核酸のＭｕｔ Ｙ−処理
（図１０Ａ）、または核酸のＴＤＧ−処理（図１０Ｂ）後の、ＤＮＡへのリガン
ド結合の直接的な試験を可能にする。不一致を含む一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡをアル
デヒドを含む無塩基部位を生成するためにＭｕｔ Ｙに供し、次いで、不一致の
位置でフラグメントを生成するためにアルカリ処理した。図１０Ａにおけるレー
ン２（エチジウムブロミドを用いて染色し、ＵＶ光下で撮影したアガロースゲル
）は、生成したフラグメントを実証する。レーン３、４、５および６では、Ｍｕ
ｔ Ｙインキュベーションの間に、以下のリガンド化合物もまた含めた：それぞ
れ、５ｍＭのメトキシアミン、５ｍＭのＡＥＤ、１０ｍＭのＡＥＤまたは５ｍＭ
のＢＡＲＰ。予想どおり、非常に低い分子量の化合物（メトキシアミン）は、い
かなるフラグメントの形成をも妨げ、全ての形成された反応部位に１００％結合
することを示す。また、ＡＥＤ（バンドＤおよびバンドＥ）は、特に１０ｍＭを
使用した場合（レーンＥ）に、反応部位へのほぼ完全な結合を実証する。対照的
に、ＢＡＲＰは、バンドの形成を非常に低い程度まで妨げ得るのみであり、反応
部位への非常に低い（＜５％）結合親和性を示す。

【０１７３】 同様に、図１０Ｂにおいて、ＴＤＧ酵素を使用した（ＴＤＧは、不一致のチミ
ンを認識し、そしてチミンの除去後に、この位置でアルデヒドを生成する）。Ｇ
／Ｔ不一致を有するオリゴヌクレオチドを合成し（レーン１、２、オリゴ単独）
、そして不存在下（レーン３）、または５ｍＭメトキシアミン存在下（レーン４
）、５ｍＭ ＢＡＲＰ存在下（レーン５）、５ｍＭ ＡＥＤ存在下（レーン６）
もしくは０．５ｍＭ ＦＡＲＰ存在下（レーン７）で、ＴＤＧに曝した。ＴＤＧ
により生じるこの切断（レーン３のより低いバンド）が、メトキシアミン（レー
ン４）またはＡＥＤ（レーン６）を反応において含む場合には存在しないことが
観察され得、これらの化合物の不一致への結合を実証する。一方、ＢＡＲＰおよ
びＦＡＲＰ（レーン５およびレーン７）は、このより低いバンドが存在するので
、有意により低い結合を実証する。

【０１７４】 結論として：（ａ）ＡＥＤは、Ｍｕｔ Ｙが生成する反応部位結合する際に、
メトキシアミンとほぼ同じ程度に（１００％）効率的である。（しかし、メトキ
シアミン自体は、本発明の適用では使用され得ない。なぜなら、ＡＥＤと異なり
、メトキシアミンは抗体結合に利用可能な第２の結合部位を有しないので、結合
後にメトキシアミンは、さらに誘導体化されないからである）。（ｂ）ＢＡＲＰ
は、わずかな（＜５％）結合のみを示す；このことにも関わらず、そして本発明
の方法が、極めて高感度であるので、前述の実施例に示されるように、不一致が
存在する場合、ＢＡＲＰを用いて高い化学発光シグナルがなお生成される。同じ
ことが、ＦＡＲＰに当てはまる。

【０１７５】 （ｃ）本発明の詳細な説明の節に記載されるように、ＤＮＡ−結合ＡＥＤが、
第２のリガンドにより、次いで抗体により認識される能力を、以下により実証し
た。ＡＥＤの遊離一級アミン（−ＮＨ₂基）を、二時間にわたる０．１Ｍの炭酸
水素ナトリウム（ｐＨ＝８．５）中の１ｍＭのビオチン−ＬＣ−スクシニンイミ
ジルエステル（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加により、ビオチンに共有結合させた。２
Ｇ２５フィルター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通す超遠心分離、Ｍｉｒｕｓフルオ
レセイン化試薬（Ｐａｎｖｅｒａ Ｉｎｃ、実施例１を参照のこと）を用いるこ
とによるフルオレセイン化、次いで、中性アビジンマイクロプレート上に適用す
ることにより、この結合体を精製した。抗フルオレセイン−ＡＰ抗体の添加は、
Ｍｕｔ Ｙを用いて処理していない（アルデヒドは、生成されていない）サンプ
ルではなく、Ｍｕｔ Ｙ酵素を用いて処理した（すなわち、アルデヒドが生成さ
れた）サンプルにおいて強い化学発光シグナルを生じた（図１２）。

【０１７６】 （実施例５：ＦＡＲＰ、ＢＡＲＰまたはＡＥＤを用いる不一致の標識化：標識
化の間の、酵素的作用の不活性化） 緩衝化溶液に不一致を含むＤＮＡサンプルを溶解し、そして修復グリコシラー
ゼ（Ｍｕｔ ＹまたはＴＤＧ（１μｇのＤＮＡあたり１ユニット酵素）のいずれ
か）を用いて処理する。３７℃にて１時間、この反応物をインキュベートした。
Ｍｕｔ ＹまたはＴＤＧを使用する反応の完了に際して、この溶液を１５℃まで
冷却し、酵素活性を停止する。サンプルにＦＡＲＰを添加し、１５℃にて３０分
間反応させる。ＦＡＲＰとの３０分間のインキュベーションの終わりに、この反
応溶液を急激に７０℃まで２分間加熱し、酵素を不活性化する。このＤＮＡサン
プルは、前記のように、これで精製および検出のための準備が整う。あるいは、
７０℃までの加熱の代わりに、この酵素を可溶化し得、そして標準的なフェノー
ル−クロロホルム抽出を介してか、またはプロテイナーゼＫの添加（０．１ｍｇ
／ｍｌ、２時間、３７℃）を介して除去し得る。

【０１７７】 （実施例６） （遺伝性多型および遺伝性変異の両方、ならびに癌サンプル由来の獲得性変異
の検出のためのＤＮＡチップを利用するストラテジー） Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ アレイを使用する、本発明の手順を用いて、６８００
遺伝子にわたり、１工程において遺伝性および獲得性遺伝的変更の両方を誘導す
る能力を実施例として以下に記載する。

【０１７８】 遺伝性の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、約１：１０００塩基の頻度で、
各々の遺伝子の２つの対立遺伝子において存在すると推定される。コード配列に
おけるＳＮＰが、タンパク質において衰弱変化を引き起こす場合、癌の早期発症
（例えば、リー−フラウメニ症候群）を生じ得る、ヘテロ接合性変異が発生する
。正常な細胞由来のｃＤＮＡが融解され、そして自己ハイブリダイズされる場合
に、不一致は、両方の対立遺伝子が発現される場合には必ず、ヘテロ接合性およ
びＳＮＰの位置で生じ、これは、本技術（Ａ．Ｌ．Ｂ．Ｕ．Ｍ．Ｓ）によって検
出可能であり、そしてＤＮＡアレイにおいて陽性を示す。対立遺伝子間のＳＮＰ
が高頻度（約１：１０００ｂｐ）で生じるので、すべての単一の遺伝子内におい
て（平均約２，０００ｂｐ）１つ以上のＳＮＰが存在する可能性がある。従って
、父系の対立遺伝子および母系の対立遺伝子の両方が転写される場合、遺伝子全
体由来の自己ハイブリダイズ化ｃＤＮＡが、対立遺伝子の交差ハイブリダイゼー
ションの結果として、１つの遺伝子あたり、１つ以上の不一致を生じることが予
期される。次いで、すべてのアレイエレメントは、陽性を示し、取るに足らない
情報を生じる。ＡＬＢＵＭＳ遺伝子型選択（実施例３に記載されるような）の前
に、ｃＤＮＡを、約１００〜２００ｂｐの断片に消化することによって、この問
題が回避される：大半のフラグメントは、何も含まないか、または時折、１つの
遺伝性ＳＮＰを含む可能性がある。ＡＬＢＵＭＳは、不一致含有フラグメントを
選択し、そして陽性と評価されるアレイエレメントは、ＳＮＰを有する１００〜
２００マーの遺伝子フラグメントを捕捉するもののみである。

【０１７９】 獲得性変異は、同じストラテジーに従うことにより、および正常サンプルと同
じ個体由来の癌サンプルを用いることにより検出され得る。再び、癌サンプル由
来のｃＤＮＡを自己ハイブリダイズさせ、そして１００〜２００マーに断片化す
ることにより、大半のフラグメントは、何も含まないか、または時折、１つの遺
伝性ＳＮＰを含むか、あるいは非常に時折、１つの獲得性変異を含む可能性があ
る。陽性と評価されるアレイエレメントは、遺伝性変異または獲得性変異のいず
れかを含む（しかしまれに両方を含む）遺伝子に対応するアレイエレメントであ
る。

【０１８０】 並行して正常サンプルおよび癌サンプルにおける遺伝的変更を検出するための
、高分解能Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ（はじめの方に記載）の使用の例を、図
１２に示す。正常組織由来のｃＤＮＡを、融解し、そして自己ハイブリダイズし
、不一致を生成し（図１２）、次いで、１００〜２００マーを生成するために適
切な酵素で消化し、そしてプライマーを添加する；次いで、このプローブ（ＦＡ
ＲＰ、ＡＥＤまたはＢＡＲＰ）の１つを使用する本技術（ＡＬＢＵＭＳ）が、不
一致を選択し、これらをＰＣＲ増幅し、そしてこれらをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘア
レイに適用する：ＡＬＢＵＭＳを介して単離された、変異を含有する２００マー
が、特定の２５マーアレイエレメントに陽性を提示させ、それによって、２つの
対立遺伝子の間の遺伝性多型の遺伝子、およびその適切な（±１００〜２００ｂ
ｐ）位置の両方を同定する。

【０１８１】 次いで、癌サンプル由来のｃＤＮＡを融解し、自己ハイブリダイズし、そして
同様に処理した。獲得性変異は、正常組織アレイ上では陰性である陽性アレイエ
レメントとして現れる。遺伝性変異と同じ遺伝子上で評価された獲得性変異は、
既存の方法を用いて、ヘテロ接合性の欠失について試験されるべき候補遺伝子を
提供する。最終的に、癌性細胞由来のｃＤＮＡは、正常細胞由来のｃＤＮＡと交
差ハイブリダイズし、そしてこの手順を繰り返す（図１２には示さない）。これ
は、ｍＲＮＡにおいて単一の対立遺伝子を発現するそれらの遺伝子における獲得
性変異を検出する。これは、自己ハイブリダイゼーション単独によっては、検出
されない。

【０１８２】 Ｃｌｏｎｔｅｃｈアレイの使用は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイに対してと同
様の情報を提供する。しかし、このアレイは、より少ない遺伝子、およびより小
さな「分解能」を用いて使用される。なぜなら、このアレイエレメントは、５０
０塩基長のｃＤＮＡを含み、そして特定のエレメントが、遺伝性ＳＮＰおよび獲
得性変異の両方を捕捉し、これによって、不明瞭な情報を提供する可能性がある
からである。一方、これらのアレイは、使用するのにより簡単であり、そして蛍
光レーザースキャナーを必要とせず、よってこれらは、目下、よりユーザーに便
利である。

【０１８３】 （実施例７） （マイクロビーズ（Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ）変異スキャニングアレイの使用） ＡＬＢＵＭＳを、上記のように使用し、種々のＤＮＡフラグメントの混合物の
中から、変異含有ＤＮＡフラグメントを単離した。この系において、本発明者ら
は、ｐ５３遺伝子に変異を挿入し、次いで、本発明者らは、ＡＬＢＵＭＳを使用
して、変異含有フラグメントを選択した。次いで、変異を含有する公知の配列に
相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロビーズ
を構築し、そして検出を実証するために用いた。この方法および結果を、以下に
示す。 （ａ．カルボキシル化ミクロスフェア上へのオリゴヌクレオチドの結合体化） １．カルボキシル化ミクロスフェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから の）ストックを、ボルテックスする。

【０１８４】 ２．５，０００，０００のミクロスフェアを、１．５ｍｌの微量遠心管に分配 する。

【０１８５】 ３．３０秒間の超音波処理により、ミクロスフェアを分散させる。

【０１８６】 ４．８０００ｇで１分間、ミクロスフェアを遠心分離する。

【０１８７】 ５．上清を取り除く。

【０１８８】 ６．５０μｌの０．１Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 ）（ｐＨ ４．５）を添加する。

【０１８９】 ボルテックスする。

【０１９０】 ７．１ナノモルのオリゴヌクレオチド（５’−アミノ−ユニリンカー（ｕｎｉ ｌｉｎｋｅｒ）−２５マー−３’）を、ミクロスフェアに添加する。短期 間ボルテックスする。

【０１９１】 ８．使用の直前に、１ｍｌの滅菌水を、１０ｍｇのＥＤＣ（１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル（ｄｉｍｅｔｈｙａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ ）カルボジイミド−ＨＣｌ）に添加する。融解するまでボルテックスする 。

【０１９２】 ９．２．５μｌの新鮮なＥＤＣ溶液を、ミクロスフェアに添加する。直ちにボ ルテックスする。

【０１９３】 １０．３０分間室温でインキュベートする。

【０１９４】 １１．新鮮なＥＤＣを用いて、工程８〜１０を繰り返す。

【０１９５】 １２．１．０ｍｌの０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加する。ボルテックス
する。

【０１９６】 １３．８０００ｇで１分間、ミクロスフェアを遠心分離する。

【０１９７】 １４．上清を取り除く。

【０１９８】 １５．１．０ｍｌの０．１％ ＳＤＳを添加する。ボルテックスする。

【０１９９】 １６．８０００ｇで１分間、ミクロスフェアを遠心分離する。

【０２００】 １７．上清を取り除く。

【０２０１】 １８．１００μｌの０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ ４．５）に、ミクロスフェアを
再懸濁する。

【０２０２】 １９．調製物を、４℃で保存する。 （ｂ．ミクロスフェア上のＡＬＢＵＭＳ由来ＰＣＲフラグメントのハイブリダイ
ゼーションおよび捕捉） ＤＮＡハイブリダイゼーション １．１７μｌのＤＮＡ希釈液（ＴＥなど）を、コントロールチューブに添加す る。

【０２０３】 ２．１７μｌ容量のＤＮＡ（１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、２５ｎｇ）を、サン プルチューブに添加する。

【０２０４】 ３．すべてのチューブを、９６℃のヒートブロックで、１０分間インキュベー トする。

【０２０５】 ４．オリゴＬＧＡ−結合体化ミクロスフェアをボルテックスし、そして超音波 処理する。

【０２０６】 ５．ミクロスフェアを、１．５×のＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロ リド）で、３３μｌの１．５×のＴＭＡＣハイブリダイゼーション緩衝液 当たり１０，０００ミクロスフェアの濃度に希釈する。

【０２０７】 ６．ミクロスフェア／１．５×のＴＭＡＣ混合物を、ハイブリダイゼーション 温度（５０℃）に置く。

【０２０８】 ７．チューブを、９６℃のヒートブロックに入れたまま、ハイブリダイゼーシ ョン温度の３３μｌのミクロスフェア／１．５×のＴＭＡＣ混合物を、最 初のチューブに添加する。

【０２０９】 ８．最初のチューブを直ちに閉じ、取り出し、そしてボルテックスする。

【０２１０】 ９．最初のチューブを、ハイブリダイゼーション温度で置く。

【０２１１】 １０．すべての残りのチューブについて、工程７〜９を繰り返す。

【０２１２】 １１．すべてのチューブを、ハイブリダイゼーション温度で、１０分間インキ ュベートする。

【０２１３】 １２．ミクロスフェアを、ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で洗浄する。

【０２１４】 １３．チューブを、８０００ｇで５分間遠心分離する。上清を取り除く。

【０２１５】 １４．５０μｌのＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を、チューブに添加する。

【０２１６】 １５．ストレプトアビジン−アレクサ（ａｌｅｘａ）−４８８を、ＰＢＳ（ｐ Ｈ７．４）中で、１０μｇ／ｍｌに希釈する。

【０２１７】 １６．１２μｌのストレプトアビジン−アレクサ−４８８を、チューブに添加 する。

【０２１８】 １７．チューブを、室温で１５分間インキュベートする。

【０２１９】 １８．サンプルを、フローサイトメーターで分析する。 （ｃ．フローサイトメーター上でのミクロスフェア結合ＤＮＡ配列の測定） マイクロビーズ上の蛍光標識化ＡＬＢＵＭＳ由来のＤＮＡ配列のハイブリダイ
ゼーションの後に、サンプルをフローサイトメトリーについて処理し、マイクロ
ビーズに結合体化した配列に相補的な配列の存在を同定した。図１４は、ミクロ
スフェアへのハイブリダイゼーションに適用されたＤＮＡの量の関数として、４
つの異なるハイブリダイゼーション実験の結果を示す：曲線１〜３は、２３６塩
基対長、８６塩基対長および５７塩基対長である、ＡＬＢＵＭＳ由来のＤＮＡフ
ラグメントを示し、そしてすべてが、ミクロスフェア−配列に相補的な配列を含
む。曲線４は、ミクロスフェアに対して無関係の（非相補的な）ＤＮＡ配列のハ
イブリダイゼーションを示す。明らかなシグナルは、ハイブリダイズされたＤＮ
Ａ配列が、マイクロビーズに結合した配列に相補的である場合にのみ、観察され
る。

【０２２０】 従って、本発明者らは、この系が、サンプル中の特定の配列の存在または非存
在を特異的に検出する能力を実証した。上記に示された簡略化した実施例におい
て、このミクロスフェアは、「光学的にコード」されず、そしてミクロスフェア
の１セットのみが用いられた。完全なＭｕｔａｔｉｏｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ａ
ｒｒａｙを構築するために、光学的にコードされたミクロスフェアのうちのいく
つかのセットが用いられ得、各々のセットは、異なる配列を含む。ＡＬＢＵＭＳ
由来のＤＮＡフラグメントを、異なるミクロスフェアの混合物とハイブリダイズ
させることによって、異なるミクロスフェアからの読み出しが、フローサイトメ
トリーを介して、数百または数千もの配列にわたって、同時に得られ得る。ミク
ロスフェアに基づいたＭｕｔａｔｉｏｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ａｒｒａｙを構築
する方法の例示を、図１５に示す。

【０２２１】 本明細書中で議論されるすべての参考文献は、本明細書中で参考として援用さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、遺伝子の複合混合物における変異の同定（例えば数百または数千にわ
たる遺伝子の、ＣからＡへの転換のためのスクリーニング）に、どのように本技
術を適用するかという概略図を示す。

【図２】 図２は、冷却ＩＣＣＤカメラを用いたアルカリホスファターゼの化学発光検出
の感受性を示す。挿入図は、化学発光物質プラスエンハンサーを加えた後の、時
間依存的な化学発光の増大を示す。

【図３】 図３は、クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、３８℃で６０秒間までの脱プリ
ン化後の、プラスミドＤＮＡで産生されたアルデヒドを含むアプリン／アピリミ
ジン（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）（ＡＰ）部位の化学発光
検出を示す。挿入図は、同じ条件下での延長した脱プリン化が適用された場合の
蛍光検出を示す。挿入図のデータ（本発明者らより（Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓ
ＧＭ、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ＳおよびＭａｈｍｏｏｄ Ｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．、７４：９９−１０９、１９９８））を、化学発光単
位をＡＰ部位へ変換するために使用した（右軸、本文を参照のこと）。

【図４】 図４Ａおよび４Ｂは、ＦＡＲＰを用いたＡＰ部位の高感度検出を示す。図４Ａ
は、ヒドロキシアミンによる処理なし（バー１）または処理後（バー２）の、１
５秒間脱プリン化した子牛胸腺ゲノムＤＮＡにおけるＡＰ部位の検出を示す。図
４Ｂは、ｐＨ＝７．０、３７℃（曲線１）または４℃（曲線２）の温度における
、ヒドロキシアミン処理子牛胸腺ゲノムＤＮＡにおける、自然発生的に産生され
たＡＰ部位の検出を示す。

【図５】 図５Ａ〜５Ｃは、変性ゲルで試験した、Ｍｕｔ Ｙ処理ＤＮＡのゲル電気泳動
を示す。図５Ａは、Ｍｕｔ Ｙ処理およびＳＹＢＲ ＧＯＬＤ染色後ポリアクリ
ルアミドゲルで視覚化された、４９マーの二本鎖オリゴヌクレオチドを示す。レ
ーン１、不一致なし、Ｍｕｔ Ｙなし。レーン２、不一致なし、プラスＭｕｔ
Ｙ。レーン３、Ａ／Ｇ不一致、Ｍｕｔ Ｙなし。レーン４、Ａ／Ｇ不一致、プラ
スＭｕｔ Ｙ。図５Ｂは、Ｍｕｔ Ｙ処理およびＳＹＢＲ ＧＯＬＤ染色後ポリ
アクリルアミドゲルで視覚化された、二本鎖ホモ二重鎖混合物（ＤＮＡラダー、
２７〜５００塩基対）を示す。レーン１、Ｍｕｔ Ｙなし。レーン２、プラスＭ
ｕｔ Ｙ。図５Ｃは、酵素的に処理され、そしてエチジウム染色後アガロースゲ
ルで視覚化された一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡ（７，２４９塩基）を示す。レーン１、
Ｍ１３ ＤＮＡ、Ｍｕｔ Ｙなし。レーン２、Ｍ１３ ＤＮＡ、プラスＭｕｔ
Ｙ。レーン３〜６、分子量マーカー。

【図６】 図６は、単一の長さのＭｕｔ Ｙ処理ＤＮＡの、ＦＡＲＰベースの化学発光検
出を示す：４９マーのオリゴヌクレオチドを酵素的に処理、ＦＡＲＰ標識、そし
てマイクロプレートに捕獲する。バー１、Ａ／Ｇ不一致、Ｍｕｔ Ｙなし。バー
２、Ａ／Ｇ不一致、プラスＭｕｔ Ｙ。バー３、不一致なし、Ｍｕｔ Ｙなし。
バー４、不一致なし、プラスＭｕｔ Ｙ。

【図７】 図７は、異なる長さのＭｕｔ Ｙ処理ＤＮＡフラグメントの、ＦＡＲＰベース
の化学発光検出を示す：一本鎖Ｍ１３ ＤＮＡ（７２４９塩基）および二本鎖ホ
モ二重鎖混合物（ＤＮＡラダー、２７〜５００塩基対）を、酵素的に処理、ＦＡ
ＲＰ標識、およびマイクロプレートに捕獲する。バー１、Ｍ１３ ＤＮＡ、Ｍｕ
ｔ Ｙなし。バー２、Ｍ１３ ＤＮＡ、プラスＭｕｔ Ｙ。バー３、ラダーＤＮ
Ａ、Ｍｕｔ Ｙなし。バー４、ラダーＤＮＡ、プラスＭｕｔ Ｙ。

【図８】 図８Ａおよび８Ｂは、異なる長さのＭｕｔ Ｙ処理ＤＮＡフラグメントの、Ｂ
ＡＲＰベースの化学発光検出を示す：図８Ａは、Ｍｕｔ Ｙによって酵素的に処
理、ＢＡＲＰ標識、およびマイクロプレートに捕獲された、一本鎖Ｍ１３ ＤＮ
Ａ（７２４９塩基にわたって、約３不一致を形成する）および二本鎖ホモ二重鎖
Ｍ１３ ＤＮＡ（不一致なし）からの化学発光を示す。バー１、ｓ．ｓ．Ｍ１３
ＤＮＡ、Ｍｕｔ Ｙなし。バー２、ｓ．ｓ．Ｍ１３ ＤＮＡ、プラスＭｕｔ
Ｙ。バー３、ｄ．ｓ．Ｍ１３ ＤＮＡ、Ｍｕｔ Ｙなし。バー４、ｄ．ｓ．Ｍ１
３ ＤＮＡ、プラスＭｕｔ Ｙ。図８Ｂは、同じＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
そして、図８Ａの化学発光の結果に一致して、一本鎖Ｍ１３プラスＭｕｔ Ｙの
みがＤＮＡ消化を示すことを示すことを示す（レーン２のバンドを参照のこと）
。

【図９】 図９Ａおよび９Ｂは、変異の検出を示す。図９Ａは、７０９１塩基対のプラス
ミドに組み込まれたｐ５３遺伝子に遺伝子工学で操作された１つの変異（Ａから
Ｃへの転換）の化学発光検出を示す。変異を含むプラスミドを、最初にＲＳＡＩ
酵素へ曝すことによってより小さいＤＮＡフラグメント（４００〜２，０００ｂ
ｐ）に消化した。次いで、これらを溶解し、そして正常プラスミドとハイブリダ
イズさせて、変異の位置で不一致を形成した。次いでＤＮＡをＭｕｔ Ｙで酵素
的に処理して不一致をアルデヒドに変換し、ＢＡＲＰ標識およびマイクロプレー
トに捕獲した。バー１、不一致を有するプラスミド、Ｍｕｔ Ｙなし。バー２、
不一致を有するプラスミド、プラスＭｕｔ Ｙ。バー３、正常プラスミド、Ｍｕ
ｔ Ｙなし。バー４、正常プラスミド、プラスＭｕｔ Ｙ。図９Ｂは、Ｍｕｔ
ＹおよびＢＡＲＰで処理される、異なる量の不一致を含むプラスミドがマイクロ
プレートに適用された場合に得られる化学発光シグナルの変動を示す。

【図１０】 図１０Ａおよび１０Ｂは、異なる化合物によるＤＮＡ結合を比較する。図１０
Ａは、化合物、ＡＥＤ（２−（アミノアセチルアミノ）エチレンジアミン）の、
酵素Ｍｕｔ ＹによってＤＮＡ中の不一致位置に産生された反応性部位への結合
を示す。図は、酵素および種々の化合物で処理し、エチジウムブロミドで染色し
、そしてゲル電気泳動で試験した、不一致を含むＭ１３ ＤＮＡのサンプルを示
す。酵素処理なしのＭ１３ ＤＮＡのサンプルは、レーンＡで単一の明るいバン
ドを示す。酵素Ｍｕｔ Ｙで処理したプラスミドＤＮＡのサンプルは、レーンＢ
で複数のバンドを示し、予期されたＭｕｔ Ｙによる不一致塩基の認識および切
断を示す。レーンＣ、Ｄ、およびＥにおいては、Ｍｕｔ Ｙ処理を５ｍＭのメト
キシアミン（Ｃ）の存在下、または新規化合物ＡＥＤ（それぞれＤ、５ｍＭおよ
びＥ、１０ｍＭのＡＥＤ）の存在下で実施する。レーンＣ、Ｄ、およびＥにおけ
るバンドの消失は、Ｍｕｔ Ｙによって産生された反応性部位の位置における、
メトキシアミンまたはＡＥＤによるＤＮＡの共有結合的な高い標識を示す。レー
ンＦにおいて、ＤＮＡの処理は、レーンＥおよびＤと同様であったが、別のアル
デヒド反応性化合物（ＢＡＲＰ）をＡＥＤの代わりに使用した。レーンＦは、依
然として化合物の非存在下で産生されたもの（レーンＢを参照のこと）と同じ複
数のバンドを示し、ＢＡＲＰによるアルデヒド部位の標識が無効であることを示
す。 図１０Ｂは、反応性部位が酵素ＴＤＧによってＤＮＡにおける不一致の位置に
産生される場合、ＢＡＲＰまたはＦＡＲＰに対してＡＥＤのＤＮＡ結合が優って
いることを示す。レーン１および２、Ｇ／Ｔ不一致を含むオリゴヌクレオチド、
酵素なし。レーン３、Ｇ／ＴオリゴヌクレオチドとＴＤＧ酵素。レーン４、５ｍ
Ｍのメトキシアミン存在下のＧ／ＴオリゴヌクレオチドとＴＤＧ酵素。レーン５
、５ｍＭのＢＡＲＰ存在下のＧ／ＴオリゴヌクレオチドとＴＤＧ酵素。レーン６
、５ｍＭのＡＥＤ存在下のＧ／ＴオリゴヌクレオチドとＴＤＧ酵素。レーン７、
０．５ｍＭのＦＡＲＰ存在下のＧ／ＴオリゴヌクレオチドとＴＤＧ酵素。

【図１１】 図１１は、不一致を含むｓ．ｓ．Ｍ１３ ＤＮＡを５ｍＭのＡＥＤ存在下でＭ
ｕｔ Ｙ処理した場合に得られる不一致の、ＡＥＤベースの化学発光検出。バー
１、Ｍｕｔ Ｙ酵素なしのＭ１３ ＤＮＡ。バー２、Ｍ１３ ＤＮＡとＭｕｔ
Ｙ酵素。

【図１２】 図１２は、どのように不一致同定方法をＤＮＡチップと共に使用して、癌に対
する遺伝性および獲得性の素因を検出し得るかを示す概略図である（本文を参照
のこと）。

【図１３】 図１３は、多型および変異を検出する手順である。

【図１４】 図１４は、４つの異なるハイブリダイゼーション実験の結果を示す。

【図１５】 図１５は、どのようにマイクロビーズ（マイクロスフィア）ベースの変異走査
アレイを構築するかを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＣＣＦ Ｆターム(参考） 4B024 AA12 AA19 AA20 CA03 HA12 HA19 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ08 QQ43 QQ58 QR08 QR32 QR42 QR56 QR66 QS25 QS34 QS39 QX02 QX07

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的ＤＮＡ配列内の変異を同定するために、変異走査アレイ
   を使用する方法であって、ここで該変異走査アレイは、複数のエレメントを含み
   、ここで該エレメントは、少なくとも１０個の異なる遺伝子全体に集合的にわた
   る、固定されたオリゴヌクレオチド８〜５０塩基長を含み、以下： （ａ）該標的ＤＮＡをコントロールＤＮＡ配列とハイブリダイズして、二重鎖
   を生成する工程であって、ここで該コントロールＤＮＡ配列が、該標的ＤＮＡ配
   列に対応する野生型ＤＮＡである、工程； （ｂ）検出可能な部分を用いて、該二重鎖内の任意の不一致をタグ化する工程
   ； （ｃ）該二重鎖を５０塩基〜３００塩基のセグメントに切断する工程； （ｄ）該検出可能な部分を用いてタグ化したセグメントを取り出す工程； （ｅ）該検出可能な部分を用いてタグ化したセグメントを該変異走査アレイと
   接触させる工程；ならびに （ｆ）該選択された不一致が、いずれの遺伝子および遺伝子セグメントに属す
   るかを同定する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記検出可能な部分を用いてタグ化したセグメントが、前記
   変異走査アレイ上で使用される前に、増幅される、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の方法であって、ここで前記遺伝子
   全体は、アレイエレメントによって表わされ、各エレメントが、表わされた各遺
   伝子の３’〜５’ｍＲＮＡ配列全体について２５〜３００塩基においてサンプリ
   ングする固定されたオリゴヌクレオチドを含む、方法。
4. 【請求項４】 前記遺伝子全体の各々が、該遺伝子のコードゲノム部分によ
   って表わされる、請求項１または２に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記遺伝子全体の各々が、遺伝子のコードゲノム部分および
   非コードゲノム部分の両方によって表わされる、請求項１または２に記載の方法
   。
6. 【請求項６】 少なくとも１０個の異なる遺伝子が、個体を特定の疾患にか
   かりやすくすることが集合的に公知であるゲノムから選択される、請求項１また
   は２に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記疾患が、特定の種類の癌である、請求項６に記載の方法
   。
8. 【請求項８】 前記疾患が、心臓血管異常もしくは神経変性障害、または糖
   尿病である、請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 選択された前記遺伝子が、全て公知の腫瘍サプレッサー遺伝
   子またはオンコジーンである、請求項１または２に記載の方法。
10. 【請求項１０】 選択された前記遺伝子が、悪性細胞において過剰発現され
    ることが公知の遺伝子であり、ここで過剰発現が、対応する非悪性細胞における
    該遺伝子の発現との比較によって決定される、請求項１または２に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記アレイが、チップまたはミクロスフェアである、請求
    項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 長いＤＮＡ配列内の変異を同定するために変異走査アレイ
    を使用する方法であって、ここで該変異走査アレイは、複数のエレメントを含み
    、ここで、該エレメントは、少なくとも５個の異なる遺伝子に集合的にわたる、
    固定されたオリゴヌクレオチド８〜５０塩基長を含み、ここで該方法が、以下： （ａ）標的ＤＮＡ配列を、コントロールＤＮＡ配列とハイブリダイズさせる工
    程であって、ここで該コントロール配列が、二重鎖を生成するような、該標的Ｄ
    ＮＡ配列に対応する野生型ＤＮＡ配列である、工程； （ｂ）ＰＣＲプライマーの遺伝子付加を可能にする制限酵素を用いて、該二重
    鎖を５０〜３００塩基対のフラグメントに消化する工程； （ｃ）該二重鎖にＰＣＲプライマーを付加する工程； （ｄ）任意の自然発生アルデヒドを取り除くために、該二重鎖を処理する工程
    ； （ｅ）該二重鎖を、該二重鎖内の任意の不一致部位を、アルデヒド含有無塩基
    部位を含む反応性部位に転換するために、修復グリコシラーゼと反応させる工程
    ； （ｆ）該反応性部位に共有結合するために十分な時間および条件下で、該二重
    鎖を、式Ｘ−Ｚ−Ｙの化合物と反応させる工程であって、ここで、Ｘは、検出可
    能な部分であり、Ｙは、ＮＨＮＨ２、Ｏ−ＮＨ２またはＮＨ２であり、そしてＺ
    は、炭化水素、アルキルヒドロキシ、アルキルエトキシ、アルキルエステル、ア
    ルキルエーテル、アルキルアミドまたはアルキルアミンであり、ここで、Ｚは、
    置換されてもよいし、もしくは置換されなくともよく；またはここでＺは、切断
    可能な基を含み得る、工程； （ｇ）不一致の部位を同定するために、該結合化合物を検出する工程； （ｈ）不一致を伴わないＤＮＡから、不一致を含むＤＮＡを単離する工程； （ｉ）該不一致含有ＤＮＡをＰＣＲ増幅する工程； （ｊ）該変異走査アレイ上に該不一致含有ＤＮＡを適用して、不一致が生じる
    ゲノム位置を決定する工程；ならびに （ｋ）該不一致が、変異または多型であるかを決定する工程、 を包含する、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記検出可能
    な部分が、ＮＨ₂、ＳＨ、ＮＨＮＨ₂、フルオレセイン誘導体、ヒドロキシクマリ
    ン誘導体、ローダミン誘導体、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、ジゴキシゲニン誘導体およ
    びビオチン誘導体からなる群から選択される、方法。
14. 【請求項１４】 疾患を有する少なくとも５つの個体の群における共通の変
    異を同定するために、変異走査アレイを使用する方法であって、該方法は、以下
    ； （ａ）該個体の群からＤＮＡまたはｍＲＮＡを得る工程； （ｂ）該ＤＮＡまたはｍＲＮＡを５０〜２００塩基対のフラグメントに消化す
    る工程； （ｃ）それらのフラグメントを同定およびタグ化して、タグ化フラグメントを
    作製する工程であって、ここで該フラグメントが、コントロール野生型フラグメ
    ントと比較される場合に不一致が存在し、そして該群の各メンバーに由来するＤ
    ＮＡまたはｍＲＮＡを特異的に標識する、工程； （ｄ）該タグ化フラグメントを単離する工程； （ｅ）該タグ化フラグメントを、プローブで標識されたプライマーを使用して
    ＰＣＲ増幅して、標識化ＤＮＡを作製する工程； （ｆ）適度なストリンジェンシー下で、ハイブリダイゼーションを許容する条
    件下において、該標識化ＤＮＡをミクロスフェアと混合する工程であって、ここ
    で該ミクロスフェアは、目的の野生型遺伝子から得られた５０〜３００塩基対の
    一本鎖ＤＮＡを含む、工程； （ｇ）該群の少なくとも２つのメンバーに由来する変異に対する同一のシグナ
    ルを含むそれらのミクロビーズを、同じ容器内で区別するために、工程（ｆ）の
    該ハイブリダイズしたミクロスフェアをフローサイトメトリーに供する、工程；
    ならびに （ｈ）該共通の変異が、いずれの遺伝子および遺伝子セグメント内に生じたか
    を同定する工程、 を包含する、方法。
15. 【請求項１５】 前記フローサイトメトリーを使用して、前記個体の群の少
    なくとも５０％に由来する同一のシグナルを選択する、請求項１４に記載の方法
    。