JP2009518004A - 核酸ハイブリダイゼーションにおけるCot−1DNAの歪みの低減 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2005年11月18日に提出の、先に出願された、同時係属中の仮出願番号60/737,986の利益を主張し、それは参照によって本明細書に組み込まれる。
印刷された配列表は、参照によって本明細書に組み込まれ、本出願に随伴し、かつ、同一の内容で、コンピュータに可読なASCIIファイルの形式で、米国特許商標庁の電子申請システムに提出されている。
1.発明の分野
本発明は、ターゲットのゲノム又はトランスクリプトームに存在する反復因子と核酸プローブの対応する反復因子との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを、プローブのシングルコピー配列と抑制DNAの偶発的なシングルコピー配列との間の偶然のハイブリダイゼーションを防ぎながら、抑制するための物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、シングルコピー因子を実質的に含まない抑制合成反復DNAの開発及び使用に加えて、反復配列を実質的に含まないプローブの開発及び使用に関する。よりいっそう詳細には、そのような反復DNAは、1又は2以上の代表的なゲノム領域内のシングルコピー因子に近接した中程度から高コピーの反復因子に対応する反復配列を含む。
マイクロアレイ及びアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションによって、遺伝子発現及びローカスのコピー数についてのゲノムワイドの分析が容易になった。異なる研究室での相互検証研究によって、これらの技術の再現性に関する永続的な論議が起こっている1−5。反復試験から得られた、結果のばらつきを低減するための対策は、アレイの製造、RNA合成、標識、ハイブリダイゼーション、スキャン、及びデータ分析のような、技術的要因を標準化することに焦点を合わせている6−8。Zakharkinら9は、サンプル間の生物学的な相違がこのばらつきの最大の原因であり、その他の要素はそれほどまでは寄与しないことを示唆する。
本発明は、Cot−1を反復因子を多く含みながら実質的にシングルコピー又は低コピーの因子を含まないように合成される抑制性核酸で置き換えることによって、上に概要が述べられた諸問題を解決し、そして、Cot−1 DNAの結果を不正確にする効果を抑制する新規の方法及びプロダクトを提供する。概して言えば、本発明の方法は、合成の抑制DNAを合成するステップ、及びターゲットの反復配列をブロックするために、プローブのターゲットとのハイブリダイゼーションの前に、抑制DNAをターゲットのゲノムDNAにハイブリダイズするステップを含む。好ましくは、プローブは反復因子を含まない若しくは実質的に含まない及び抑制DNAはシングル又は低コピーDNAストレッチを含まない若しくは実質的に含まないものである。いくつかの好ましい態様では、その方法は、スペクトル符号化されたポリスチレンマイクロスフェアを、選ばれた低コピー合成DNA配列とカップリングすることによってハイブリダイゼーションプローブを準備するステップ;ターゲットのゲノムDNAを、本発明の合成の抑制若しくはブロッキングDNAとプレハイブリダイズするステップ;プローブをターゲットのゲノムDNAにハイブリダイズするステップ;及びハイブリダイゼーションのプロダクトをフローサイトメトリによって検出するステップを含む。ハイブリダイゼーションアッセイでCot−1によって引き起こされる実証されたシグナル歪みは、それについて、シングルコピー配列を含まない若しくは実質的に含まない、及び低コピー配列を好ましくは含まない若しくは実質的に含まない合成反復因子へのターゲットのプレハイブリダイゼーションによって、クロスハイブリダイゼーションを抑制することにより、低減される。
他で定義されなければ、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、この発明が属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味をもつ。全ての特許、出願、公開された出願及び他の刊行物及びジーンバンク(GenBank)からの配列及びここに引用される他のデータベースはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。このセクションで説明される定義が、参照により組み込まれた出願、公開された出願及び他の刊行物及びジーンバンク(GenBank)からの配列及び他のデータベースで説明される定義と反対又は一致しないときは、このセクションで説明される定義が参照により組み込まれた定義に優先する。
ここで使用されるように、“核酸”は、とりわけ一本鎖、二重、三重、線形及び環状形態を含む、任意の態様のデオキシリボ核酸(DNA)及び/又はリボ核酸(RNA)のことをいう。
ここで使用されるように、“リファレンス・プローブ”という用語は、ゲノム内のローカスに特異的なプローブを意味し、好ましくは、2以外のコピー数では重度に有害であるか又は、好ましくは、致命的である常染色体の配列に由来する。リファレンス・プローブは、患者サンプル中に正常なクロモソーム上の対になる部分がある限り、任意の低コピー又はシングルコピーのクロモソーム上のローカスに由来してよい。先天的な病気を診断するためにゲノムのコピー数を決定するとき、リファレンス・プローブは、典型的に、正常な成長の間に2つのアレルから発現されることが必要な1又は2以上の遺伝子からの常染色体の由来である。新生物性の疾患を診断するためにゲノムのコピー数を決定するために、リファレンス・プローブはクロモソームの発癌遺伝子の少ない領域から選ばれ、それは正常なクロモソーム上の対になる部分がある。
ここで使用されるように、“配列同一性”とは、2又は3以上のポリヌクレオチド配列、つまり、リファレンス配列とリファレンス配列と比較されるために与えられる配列との間の関係のことをいう。配列同一性は、与えられる配列をリファレンス配列と、最も高い度合いの、配列のストリング間の一致によって決定される、配列類似性を生じるように配列を最適に整列した後に、比較することにより決定される。そのようなアラインメント上で、配列同一性がポジションごとを基本に確定される。例えば、特定のポジションでヌクレオチドが同一ならば、そのポジションで配列は“同一”である。そのようなポジションの同一の総数が、それからリファレンス配列内のヌクレオチド又は残基の数で割られて、%配列同一性を与える。配列同一性は、Lesk, A. N.編集、Computational Molecular Biology、1998年、オックスフォード大学出版、ニューヨーク;Smith, D. W.編集、Biocomputing: Informatics and Genome Projects、1993年、アカデミックプレス、ニューヨーク;Griffin, A. M.及びGriffin, H. G.編集、Computer Analysis of Sequence Data, Part I、1994年、ヒューマナプレス、ニュージャージー;von Heinge, G.、Sequence Analysis in Molecular Biology、1987年、アカデミックプレス;Gribskov, M.及びDevereux, J.編集、Sequence Analysis Primer、1991年、M.ストックトンプレス、ニューヨーク;並びにCarillo, H.及びLipman, D.、SIAM Journal of Applied Mathematics、1988年、第48巻、p.1073に記載されたものを含むが、これらに限定されない、公知の方法によって容易に計算することができる。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列の間の最大の一致を与えるように設計されている。配列同一性を決定する方法は、与えられた配列の間の配列同一性を決定する、公衆に利用可能なコンピュータプログラムに分類される。そのようなプログラムの例は、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research、1984年、第12巻、第1号、p.387)、BLASTP、BLASTN及びFASTA(Altshul, S. F.ら、Journal of Molecular Biology、1990年、第215巻、p.403410)。BLASTXプログラムはNCBI及び他の情報源から公衆に利用可能である(BLASTマニュアル, Altshule, S.ら、NCBI、NLM、NIH、ベテスダ、マサチューセッツ、20894;Altshul, S. F.ら、1990年、Journal of Molecular Biology、1990年、第215巻、p.403410)を含むが、これらに限定されない。これらのプログラムは、与えられた配列及びリファレンス配列の間の最も高いレベルの配列同一性を生成するために、デフォルトのギャップウェイトを使用して、配列を最適に整列する。ひとつの説明として、少なくとも、例えば、95%の“配列同一性”をリファレンス配列に対してもつヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドによって、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、与えられたポリヌクレオチド配列がリファレンスヌクレオチド配列の100ヌクレオチドについて5個までの相違を含むかもしれないということを除き、リファレンス配列と同一であることが意図される。言い換えれば、リファレンスヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性をもつヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドにおいては、リファレンス配列のヌクレオチドの5%までが欠失し、若しくは他のヌクレオチドに置換されてもよく、又はリファレンス配列内の総ヌクレオチドの5%までの数のヌクレオチドがリファレンス配列に挿入されてもよい。一方の配列におけるインバージョンは、これらのコンピュータプログラムによって、ホモロガスなテスト配列のアンチセンス鎖に対するリファレンス配列の類似性に基づいて、検出される。リファレンス配列のこれらの変異は、リファレンスヌクレオチド配列の5’若しくは3’末端のポジション又はこれらの末端ポジションの間のどこにでも、リファレンス配列内のヌクレオチドの間に別個に又はリファレンス配列内の1若しくは2以上の連続したグループで点在して、起きるかもしれない。
下記の実施例は本発明の好ましい実施態様を説明する。これらの実施態様は、シングル(又は低)コピーのプローブの、反復因子を含むもののシングル又は低コピー因子を含まない合成DNAに前もってハイブリダイズしたゲノムのターゲットへのハイブリダイゼーションを説明する。しかしながら、これらの実施態様は、説明の目的のためのみであり、ここでの開示が本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
材料及び方法
定量マイクロスフェア・ハイブリダイゼーション(QMH)
プローブの選択、合成、及びマイクロスフェアの結合
プローブは、ターゲット配列へのハイブリダイゼーションを検出することができる、標識された核酸フラグメント又は標識された核酸フラグメントの集合の態様である。標識されたプローブは、プローブ内の配列にホモロガスな配列を含むいかなる核酸ターゲットとともに使用されてもよい。これらのターゲット配列は、クロモソーム若しくは精製された核DNA、異核RNA、又はシングルコピー配列を転写プロダクトの構成要素として含むmRNA分子種を含んでもよいが、それらに限られない。続く詳細な説明では、DNAターゲット配列及びDNAプローブの普通の場合が考察される;しかし、当該技術分野おける通常の知識を有する者は、その考察が他の核酸分子種に対しても(ターゲット配列及びプローブの特性による技術的に認知される相違とともに)等しく適用可能であることを理解する。
先に記載されたようにプローブは合成され、マイクロスフェアにカップリングされた13,20。合成中に、プローブは、スペクトル的に異なるマイクロスフェアに結合するために、特定の結合反応に依存して、アミン標識されることができる。好ましくは、プローブは改変カルボジイミド反応によってマイクロスフェアにカップリングされる。
ゲノムのテンプレート(ターゲット核酸配列)が、先に記載されたように、骨髄サンプルの細胞遺伝学的な調製物に由来する、メタノール−酢酸固定された細胞ペレットを使用して調製された13,20。他の方法とは異なり、ターゲット配列は事前選択又は増幅されない。従って、本発明では、ゲノム(又はトランスクリプト)の全コピーが分析のためにハイブリダイズされることができる。DNA(又はRNA)は、サンプルの提供元と状態に依存して、細胞から抽出され、そして、必要ならば、任意のコンベンショナルな方法を使ってイン・ビトロ(in vitro)で複製されることができる。好ましくは、核酸は、GenomiPhiキット(Qiagen、バレンシア、CA)を使用して、イン・ビトロ(in vitro)で複製されるが、これは1ng未満のサンプル核酸しか使用せず、20分未満のハンズオンタイムしか必要としない。DNAはそれから任意のコンベンショナルな方法によって、好ましくは、イン・ビトロ(in vitro)の複製中の直接的な標識ステップによって、又は標識及びその標識に対してアフィニティを持つレポーター分子からなる間接的な標識システムによって、標識される。核酸ターゲットは、フルオロフォア、酵素コンジュゲート、又はビオチン若しくはアビジン、ストレプトアビジン、若しくは特異的抗体によって認識される部分からなる群から選ばれるひとつのもののような識別標識で標識される。数タイプの非アイソトープ性識別標識がある。ひとつのタイプは核酸ターゲットに化学的に結合し、直接的な同定の方法に使える標識である。これの一例は蛍光色素部分であり、適切な波長の放射を受けると励起して高エネルギー状態となり、蛍光を発する。Cy3−dUTPのような直接標識された蛍光ヌクレオチドは当該技術分野において知られており、本発明で使用するのターゲットDNAの標識の好適な態様である。DNAの直接的な標識をする他の方法もまた好適である(一例はユリシーズ(Ulysses)法(Kreatech、オランダ)として販売されるアミノ−アリル標識であろう)が、そのような事例では、標識されたターゲットをプローブ結合マイクロスフェアに加える前に、標識ゲノムDNAがハイブリダイゼーションに適したサイズまで断片化されなければならないだろう。好ましい実施態様では、核酸はビオチン−dUTP又はジゴキシゲニン−dUTPを使用してイン・ビトロ(in vitro)の複製中に直接的に標識され、得られる標識されたサンプルは超音波処理されて〜300bpから1kbpの長さのフラグメントを得る。核酸ターゲットは、改変された又は直接標識されたヌクレオチド(Rigbyら、Journal of Molecular Biology、1977年、第113巻、p.237-251)を、dUTP又はdATPのようなヌクレオチドに結合した一般に好まれる(がこれらに限定されない)識別標識を含む反応物を用いるコンベンショナルな方法で使用して、ニックトランスレーションによって標識されることもできる。フラグメントは、フルオロフォアで標識された核酸で直接標識されるか、又は、下に記載するように、フラグメントに取り込まれている改変ヌクレオチドを認識する蛍光標識された抗体に、標識された重複部位を結合することによって間接的に標識されるかのいずれかである。ニックトランスレーション(100μL)では、エンドヌクレアーゼフリーのDNAポリメラーゼI(Roche Molecular Biochemicals)及びDNase I(Worthington Chemical)を使用する。各フラグメントは、DNAポリメラーゼI(4ユニット/マイクログラムDNA)、DNase(0.01−3マイクログラム/100μL反応液)、標識ヌクレオチド(0.05mmファイナル)及びニックトランスレーションバッファーと組み合わせられる。反応は15℃で60分間行われ、〜300から100bpのサイズの範囲で異なるヌクレオチドのサイズの、様々な標識されたプローブのフラグメントを得る。または、ビオチン−dUTP又はヂゴキシゲニン−dUTPがイン・ビトロ(in vitro)の複製処理中に取り込まれることができ、そしてできあがる標識されたサンプルはDNAse Iで処理されるか、又は長さ〜300bpから1kbのフラグメントを得る他の方法によってせん断されることができる。核酸を標識する、及び検出する、普通に使われる方法が、本方法の低コピーDNAが結合したマイクロスフェアの検出に適用されてもよい。これらは、蛍光色素標識及びエネルギー転移団、タンパク質コンジュゲート、抗体、若しくは抗原のような蛍光化合物を含む。
標識されたDNA(50ng)が、10,000個のプローブ結合マイクロスフェアを含む、40μLの1.5×TMACハイブリダイゼーションバッファー(3〜mol/L テトラメチル塩化アンモニウム、50mmol/L Tris−HCl pH8.0、1g/L サルコシルで希釈された。反応は表1に掲げられた構成部分で組み立てられた。
ABL1aとのゲノムハイブリダイゼーションの試料(35μL)(表1:反応19及び20)が、250μLの1%SDSを含む0.1×SSCで洗われ、遠心(13,000×g)でペレット化され、そして、これは2回繰り返された。ハイブリダイズされたゲノムの配列は、95℃で5分間熱変性され、急速冷却され、続いて4℃で3分間、遠心(13,000×g)された。回収された配列は、QPCRのための、及びマイクロスフェアがカップリングしたABL1AluMER1へのハイブリダイゼーションのためのターゲットとして使用された(表1:反応21及び22)。
合成反復DNAが、内部に含まれる反復配列のファミリーに基づいて、ゲノム領域から調製されたが、それはそれぞれがCot−1製造工程で増加されるからである。しかし、中程度〜高コピー数の反復因子に近接したsc領域を含む任意の反復ゲノム領域が使用されることができた。ゲノムのプローブ内の反復因子が所望のターゲット間隔以上の場所で抑制されたことを示すために、1.1kbのLTR因子をC1QTNF遺伝子の上流に位置するクロモソーム4p上の2つの400bpのsc領域(chr4:15139704−15141581)の中間に含むプローブが調製された(図4、A)。続いて、反復因子をブロッキングするためのABLaプローブ領域内に位置する反復配列が合成された;クロモソーム9のABL1aは、280bpのAluJoリピート、300bpのAluSxリピート、及び830bpのL2因子セグメントを含む(図4、C)。クロモソーム17q上の、306bpのAluSxリピート及び154bpのL1短縮配列(chr17:43963396−43965681)を含むHOXB1の5’に位置する2286bpのセグメントもまたプローブとして使用された(図4、B)。これらの反復因子(表2;HOXB1AluL1及びC1QTNF7LTR)を直接にフランキングするユニークな配列を増幅するプライマーは各反復配列及びターゲットの産物(表2:HOXB2b及びC1QTNF7)をPCR増幅するために開発された。ゲノムDAN(Promega)プローブがPfx(Invitrogen)を使用して増幅された。増幅産物はそれから電気泳動され、マイクロスピンカラムの遠心によって抽出された。プローブは改変カルボジイミド反応によって、以前に記載13,20されたように、マイクロスフェアに結合された。ハイブリダイゼーション反応(表1;反応23−33)は、ホモロガスなPCR産物に結合した合成反復PCR産物、及び/又はゲノムDNAの効果をCot−1 DNAの存在下及び不存在下で評価した。反応は、ハイブリダイズされ、洗われ、SPEで染色され、そしてそれからフローサイトメトリによって分析された。
QPCR及びデータ分析は、Chromo4定量PCRシステム(Bio−Rad Laboratories、ヘラクレス、カリフォルニア)を使用して行われた。プライマー及び増幅されたインターバルは、ユニークなゲノムのリプレゼンテーションのためにBLAT18(インターネット上のgenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatでみつけられる)及びBLASTを使用して検証された(表2)。BLATは、配列アラインメントアルゴリズム及びクエリー配列に対してホモロジーを示しそうなヒトゲノム内の領域を同定するための脊椎動物の配列のインデックスを含むコンピュータソフトウェアツールである。BLATはBLASTに似たアラインメントツールであり、BLASTのターゲットデータベースがGenBankの配列の集まりを含むのに対して、BLATは全ゲノムのインデックスをメモリ中に保持することによって機能するので、少ししか相違しない。各50μLの反応は、0.5μMの各プライマー、50ngのCot−1テンプレート又はポジティブコントロールのヒトゲノムDNA(Promega)、及び25μLの2×QTSybrGマスターミックス(Qiagen)を含んだ。ゲノムDNAはDNAseを使用してニックが入れられ、50bp−300bpの断片を生じ、ネガティブコントロールはDNAを除く全ての反応要素を含んだ。サーマルサイクル条件は、95℃で15分間、45サイクルの増幅(94℃で15秒間、61℃で30秒間、(データ取得)、72℃で30秒間)、続いて72℃で5秒間であり、そして融解曲線を作成するために20℃まで毎秒温度を下げた。回収されたゲノムのテンプレート中のインプットのターゲット配列の量を測定するために使用される較正曲線は、正常なゲノムのテンプレートの量を変化することによって(1ng、2ng、4ng、10ng、及び20ng)、及び各反応のCT値を測定することによって作成された。
本発明の方法は、蛍光イン・ザイチュ(in situ)ハイブリダイゼーション(FISH)実験においても使用されることができる。FISHプローブのターゲット領域は、クロモソーム全域であっても、その一部であってもよい。プローブの合成及び標識15,16の後、FISHハイブリダイゼーションプローブは、スライドに固定されたクロモソームへのハイブリダイゼーションの前に、Cot−1 DNAの代わりに、リピートを抑制するために合成反復DNAとインキュベートすることができる。しばしば、Cot−1 DNAを使用してプローブのプレハイブリダイゼーションをして又はしないで準備した比較実験は、異なるプローブハイブリダイゼーションシグナルを示す14。Cot−1 DNAプローブのプレハイブリダイゼーションを行わないFISHは、Cot−1 DNAのプレハイブリダイゼーションを行わないFISH実験と比較して、クロモソームについて弱いシグナルを示す14。そのより弱いシグナルは、プローブ内のシングルコピー配列のCot−1 DNA内にあるシングルコピー配列とのハイブリダイゼーションが原因である。これは、クロモソーム上のターゲット配列とのハイブリダイゼーションに利用可能なプローブの量を減少させ、従って、弱いシグナルとなる。しかし、結果として、Cot−1 DNAのプレハイブリダイゼーションを行わない実験は、プローブのシグナル強度はより明るいのだけれども、例によってより偽陽性のプローブハイブリダイゼーションを呈し、そして、それによって分析をより労力の要るものにするより高いバックグラウンドレベルという結果になる。シングルコピー配列を含まない純粋な合成反復DNAフラクションでプローブをプレハイブリダイズすることによって、プローブ内にみられるあらゆる反復配列は、クロモソームとのハイブリダイゼーションに利用可能なシングルコピー配列を残しながら、有効に抑制される。従って、クロモソーム上でのプローブのシグナル強度は影響を受けず、かつバックグラウンド(偽陽性のハイブリダイゼーションシグナル)は有効に低減される。
Cot−1 DNAによる定量マイクロスフェアハイブリダイゼーション
FISHでバリデートした、混合されたsc及び反復配列プローブ、ダイバージェントなAluJo/Sx/L2リピート(chr9:130623551−130625854)を含むABL1遺伝子のIVS1bの5’末端に由来するABL1aがビオチン標識されたゲノムDNAとハイブリダイズさせられた13,20。商業的に調製されたCot−1 DNAが反復配列のハイブリダイゼーションを抑制することが期待されたが、Cot−1がABL1aのニックトランスレートされたゲノムDNAとの繰り返し行われたハイブリダイゼーションに含まれたとき、標識されたゲノムのターゲットの平均蛍光(又はハイブリダイゼーション)強度は確実にかつ著しく2.2倍まで増大した(表1:反応1及び2)。クロモソーム17の遺伝子、PMP22(Chr17:15073475−15073576)及びTEKT3(Chr17:15149108−15149206)に由来するscプローブは、Cot−1 DNA存在下で、ハイブリダイゼーション強度においてより小さいが再現性のある1.08及び1.14倍の増大を示した(表1:反応3−6)。これらの実験はCot−1による影響はこれらのscインターバルを囲む反復配列の組成に関係することを示唆する。HOXB1(Chr17:43964237−43964330)に由来するscプローブは、Cot−1 DNA(表1、反応7−12)を追加したハイブリダイゼーション強度において、試験されたゲノムのサンプルに対するハイブリダイゼーション強度において0.84−0.92倍に減少し、確実に小さな減少を呈する。HOXB1インターバルは、実際には反復配列を含まない(UCSC Genome Browser、2004年5月)。ABL1aを囲む領域は、高い密度の、保存された、十分に散在性のSINE(AluJo、AluSx)及びLINE(L2)因子を含む。TEKT3及びPMP22インターバルは、より短い、より十分でない、よりダイバージェントなクラスの反復因子(MIR、MER、及びL2)を含む。
我々のプローブにホモロガスなCot−1内のsc配列の含有量がQPCRによって測定された。その研究で使用されたプローブ及びプライマーは表2に識別される。分析の結果は表3に示される。
Cot−1 DNAのハイブリダイゼーションの効果は、3つの異なるゲノム上のローカスで、sc因子に近接した反復因子から調製された精製合成DNAの過剰量を置換することによって、なくなった(図4)。1.9kbの増幅プロダクトが、クロモソーム4上のC1QTNF7の上流のLTR様反復因子及びシングルコピー配列を含みながら、合成された。精製された合成LTR様因子、C1QTNF7LTRを加えることは、このプロダクトのカップリングされたマイクロスフェアへの自己ハイブリダイゼーションに何の影響も及ぼさなかったが、しかしCot−1 DNAを加えることは平均蛍光を1.2倍まで増加した(表1:反応23−25)。C1QTNF7LTRは、Cot−1 DNAの存在及び不存在下で、反復配列のニックトランスレートされたゲノムDNAへのハイブリダイゼーションをブロックするために使用され、そして同様の結果を得た(表1:反応26−28)。AluSx及びL1反復配列のハイブリダイゼーションは、クロモソーム17のHOXB1ローカス(HOXB1b)の上流の〜2.3kbの領域内で、これらの配列を含む合成PCRプロダクト、HOXB1AluL1を使用して抑制された。HOXB1bのPCRプロダクト及び対応するマイクロスフェアがカップリングしたプローブのHOXB1AluL1の存在下でのハイブリダイゼーションは、増幅されたターゲット内の反復配列を効果的にブロックし、実際、おそらくターゲットの長さの減少のために、ハイブリダイゼーション強度を0.3倍まで減少した(表1:反応32及び33)。反復配列のハイブリダイゼーションもまた、マイクロスフェアにカップリングしたABL1aへの比較ゲノムハイブリダイゼーションにおいて、このターゲット領域内からの合成Alu及びL2因子を加えることによって、効果的に抑制された(表1:反応29−31)。
パブリッシュされたハイブリダイゼーションの研究にほとんど必ずCot−1を反復配列の抑制のために含むことは、どれほどこの試薬が発現及び/又はゲノムのコピー数の定量測定に影響するかという疑問を提起する。二重標識ハイブリダイゼーション強度における変わりやすさが、Cot−1を使用する発現研究でのクローンされたプローブのアレイにハイブリダイズした反復ターゲットサンプルの1セットについてくまなく評価された。結果は、マイクロスフェアハイブリダイゼーションアッセイで使用された遺伝子(ABL1a、HOXB1、及びTEKT3を含む)のcDNAプローブから、その後続いて、反復配列の構成によって区別される、つまり反復因子が稠密に(表4、下)、又は疎に(表4、上)存在するゲノム環境に位置するいくつかの遺伝子配列に対するハイブリダイゼーションプロファイルから分析された。
上に記載された分析は、Cot−1 DNAに存在する非反復配列は、ホモロガスなプローブとのハイブリダイゼーションで検出される標識されたゲノムのターゲットの量を著しく変化させる。クロスハイブリダイゼーションを抑制するよりもむしろ、Cot−1は、反復配列を含むプローブへのハイブリダイゼーションを3倍にも増加させた。その結果は、非標識のCot−1 DNA配列が、配列特異的なプローブ及び相補的なターゲット配列において、lc及び反復配列を架橋することを示唆した。Cot−1フラクション中のホモロガスなlc配列に結合した反復配列は、続いて起こるゲノムのターゲット内の標識された反復配列のハイブリダイゼーションの核となりうる。プローブの標識されたゲノムのテンプレートとのハイブリダイゼーションにCot−1 DNAを加えることは、プローブ及びゲノム内のどこかの場所にホモロガスなヘテロ二重鎖のネットワークの形成を触媒する(図3、例2)。lc及び反復配列の両方を含む“部分的な”二重鎖(図3、例3)は、Cot−1 DNAを標識されたlcゲノムのターゲットを通じて、結合した反復因子に加えることによって、促進される(図3、例4)。lcゲノムのターゲットに結合した標識された反復配列もまたハイブリダイゼーション強度を変化させうるが、lc及び散在反復配列に対する増強(エンリッチメント)のために、Cot−1がするのと同じ程度までではない。
以下の文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
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Claims (30)
- 次のステップを含む、核酸プローブ中に存在する反復因子とターゲットのゲノム核酸中のホモロガスな反復因子との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する方法:
代表的なゲノム領域内の反復配列を同定するステップ;
該同定された反復配列を実質的に含み、かつ、低コピー配列を実質的に含まない抑制性核酸を、該同定された反復配列をもとに、合成するステップ;及び
該抑制性核酸をターゲット核酸と反応させ、それによって該抑制性核酸内の反復配列を該ターゲット核酸内のホモロガスな反復配列とハイブリダイズさせ、
そしてそれによって、該ターゲット核酸内の該反復配列は、続いて反応する核酸プローブ内のホモロガスな反復配列とのハイブリダイゼーションを実質的に妨げられ、それによって、該プローブ内の該反復配列と該ターゲット核酸内のホモロガスな反復配列との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制するステップ。 - 前記ターゲット核酸が低コピー配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抑制性核酸が、1又は2以上の代表的なゲノム領域内の低コピー配列に近接して存在する反復配列に対応するように選ばれる複数の反復配列を含むように合成される、請求項1に記載の方法。
- 前記抑制性核酸が低コピー配列を完全に含まないように合成される、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸を、該ターゲット内の低コピー配列にホモロガスな低コピー配列を含む1又は2以上のプローブとハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブが反復配列を実質的に含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブが反復配列を完全に含まない、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブをスペクトル符号化されたポリスチレンマイクロスフェアに結合するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブを検出可能な部分で標識するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記部分が、フルオロフォア、酵素コンジュゲート、フルオロフォア標識されたヌクレオチド、抗原担持ヌクレオチドに結合した蛍光標識された抗体、ビオチン−dUTP、ジゴキシゲニン−dUTP、及びそれらの組合せからなる群から選ばれる、請求項9に記載の方法。
- 前記抑制性核酸が、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、蛍光イン・ザイチュハイブリダイゼーションアッセイ、及びマイクロスフェアハイブリダイゼーションアッセイからなる群から選ばれるアッセイにおいて反復配列をブロックするために使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記抑制性核酸が、短鎖散在因子、長鎖散在因子、長末端反復、Alu因子、L1因子、及びDNAトランスポゾンからなる群から選ばれる1又は2以上の配列が確定したPCR産物を含む、請求項1に記載の方法。
- 下記のステップを含む、抑制性核酸を合成する方法:
代表的なゲノム領域内の反復配列を同定するステップ;及び
該同定された反復配列とハイブリダイズできるが、該代表的なゲノム領域の近傍又は内部の低コピー配列とはハイブリダイズできない配列を合成することによって、該抑制性核酸を合成するステップ。 - 前記合成された抑制性核酸が低コピー配列を実質的に含まない、請求項13に記載の方法。
- ある同定された反復配列を、関心ある低コピー配列との距離的な近さに基づいて、抑制性核酸として合成するために選ぶステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記ある同定された反復配列が前記関心ある低コピー配列と距離的に最も近い、請求項15に記載の方法。
- 前記合成された抑制性核酸が、前記関心ある低コピー配列とハイブリダイズできる配列を含まない、請求項15に記載の方法。
- 前記合成された抑制性核酸をハイブリダイゼーションアッセイで使用するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーションアッセイが、蛍光イン・ザイチュハイブリダイゼーション・アッセイ、マイクロアレイアッセイ、及びマイクロスフェアハイブリダイゼーションアッセイからなる群から選ばれる、請求項18に記載の方法。
- 下記のステップを含む、低コピー数の核酸プローブとターゲット核酸内のホモロガスな領域との間のハイブリダイゼーションの特異性を増す方法:
該ターゲット核酸内の反復因子を、複数の反復因子を含み、かつ、低コピー数の因子を実質的に含まない抑制性核酸内のホモロガスな反復因子とハイブリダイズさせるステップ;及び
該ターゲット核酸内の低コピー数の因子を、1又は2以上の該核酸プローブ内のホモロガスな低コピー数の因子とハイブリダイズさせるステップ。 - 前記抑制性核酸内の前記反復因子が、1又は2以上の代表的なゲノム領域内の低コピー因子をフランキングする反復因子と実質的なホモロジーをもつことを理由として選ばれる、請求項20に記載の方法。
- 前記フランキングする反復因子が中程度から高コピー数である、請求項21に記載の方法。
- 前記低コピー因子がシングルコピー因子を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記プローブが反復因子を実質的に含まない、請求項20に記載の方法。
- 下記のステップを含む、核酸配列のコピー数を正確に定量する方法:
第一のスペクトルアドレスを持つ、スペクトル符号化された、第一の蛍光マイクロスフェア、及び第二のスペクトルアドレスをもつ、スペクトル符号化された、第二の蛍光マイクロスフェアを準備するステップ;
ターゲットのゲノム核酸プローブの配列を、関心ある配列であることが疑われるターゲット核酸配列のヌクレオチド毎の配列を確定することによって、同定するステップ;
該同定されたターゲットのゲノム核酸プローブ配列に由来する、少なくとも1つの低コピー因子を含み、かつ、反復因子を実質的に含まない、低コピーのターゲットプローブを合成するステップ;
該ターゲットプローブを該第一のマイクロスフェアにコンジュゲートするステップ;
該ターゲット核酸配列のリファレンス核酸配列とハイブリダイズするように選ばれるリファレンスプローブを合成するステップ;
該リファレンスプローブを第二のスペクトルアドレスをもつマイクロスフェアにコンジュゲートするステップ;
代表的なゲノム領域内の反復配列を同定するステップ;
該同定された反復配列にハイブリダイズするための十分なホモロジーをもつ配列を含み、反復因子を実質的に含み、かつ、低コピー因子を実質的に含まない、抑制性核酸を合成するステップ;
該抑制性核酸をクロモソームのターゲット配列と反応し、それによって該抑制性核酸中の反復因子を該クロモソームのターゲット配列内のホモロガスな反復因子とハイブリダイズさせるステップ;
該ターゲットプローブを該クロモソームのターゲット配列と反応し、それによって該ターゲットプローブ内の低コピー因子を該クロモソームのターゲット配列内のホモロガスな低コピー因子にハイブリダイズさせるステップ;
該抑制性核酸をクロモソームの該クロモソームのターゲット配列を含むリファレンス配列と反応し、それによって該抑制性核酸内の反復因子を該クロモソームのリファレンス配列内のホモロガスな反復因子にハイブリダイズするステップ;
該リファレンスプローブを該クロモソームのレファレンス配列と反応し、それによって該リファレンスプローブを該クロモソームのリファレンス配列にハイブリダイズするステップ;
ハイブリダイズされたターゲットプローブを該第一のスペクトルアドレスによって検出するステップ;
ハイブリダイズされたリファレンスプローブを該第二のスペクトルアドレスによって検出するステップ;及び
検出されたハイブリダイズしたターゲットプローブのレスポンスをリファレンスプローブのレスポンスと比較することによって、検出されたターゲットプローブを定量するステップ。 - 前記抑制性DNAが反復因子を含み、該反復因子が前記ターゲット内の低コピー因子に近接したゲノム反復因子に対応する、請求項25に記載の方法。
- 下記のステップを含む、核酸プローブに存在する反復因子とターゲット核酸内のホモロガスな反復因子との間の非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する方法:
中程度〜高コピー数の反復因子に近接したシングルコピー領域を含む1又は2以上の代表的なゲノム領域に対応するように選ばれる複数の反復因子を含むように合成され、かつ、低コピー因子を実質的に含まないように合成される抑制性核酸を、1又は2以上の低コピー因子を含むターゲット核酸内のホモロガスな反復因子とハイブリダイズさせるステップ、
該ターゲット核酸を、該ターゲット中の低コピー因子にホモロガスな低コピー因子を含むが、実質的に反復配列を含まない1又は2以上のプローブとさらにハイブリダイズさせるステップ。 - 下記のステップを含む、抑制性核酸に存在する低コピー因子と核酸プローブ又はターゲット核酸内のホモロガスな低コピー因子との非特異的なクロスハイブリダイゼーションを抑制する方法:
該ターゲット核酸内部及び近傍の反復かつ低コピーの因子を同定する;
合成プロセス中に低コピー配列を含むことを実質的に防ぎながら、抑制性核酸内に含ませるために該ターゲット核酸から反復配列を選択することによって該抑制性核酸配列を合成するステップ;及び
該合成される抑制性核酸を、それぞれのホモロガスな抑制性核酸及びターゲット核酸因子がお互いにハイブリダイズするような該ターゲット核酸と、反応させるステップ。 - 下記のステップを含む、Cot−I DNAを使用するアッセイの精度及び再現性を増す方法:
複数の反復因子を含むが低コピー配列を実質的に含まない抑制性核酸を選択又は合成するステップ;及び
該選択又は合成される抑制性核酸をCot−I DNAの代わりに使用するステップ。 - 次のステップを含む、ゲノムのターゲット核酸の核酸プローブとの偶発的なハイブリダイゼーションを抑制する方法:
関心ある配列に相当する1又は2以上のゲノム中の配列を選択することによって、ゲノムのターゲット核酸をハイブリダイゼーションのために準備するステップ;
該関心あるターゲット配列中の低コピー配列を同定するステップ;
該同定された低コピーターゲット配列にホモロガスな、実質的に反復配列を含まない低コピープローブを合成するステップ;
該ターゲット低コピー配列の近くの反復配列を同定するステップ;
該ターゲット反復配列にホモロガスな、実質的に反復因子を含む抑制DNAを合成するステップ;
抑制DNA中の該反復因子がターゲット核酸中のホモロガスな反復因子にハイブリダイズするように該ターゲット核酸を該抑制DNAと反応させるステップ;
ターゲット核酸を該低コピープローブと反応して、該プローブ内の低コピー因子を該ターゲット核酸内のホモロガスな低コピー因子にハイブリダイズさせるステップ;及び
該プローブの該ターゲットへのハイブリダイゼーションを定量するために該低コピープローブを検出し、それによって該ターゲット核酸内部の低コピー因子の実数が確定されるステップ。
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