BRPI0618721A2 - alìvio de distorção de dna de cot-1 em hibridização de ácido nucléico - Google Patents

Abstract

ALìVIO DE DISTORçãO DE DNA DE Cot-1 EM HIBRIDIZAçãO DE áCIDO NUCLéICO. Um novo método de supressão de hibridização cruzada não-específica entre elementos repetitivos presentes nas sondas de ácido nucléico e elementos repetitivos correspondentes no ácido nucléico alvo usando DNA sintetizado para conter uma pluralidade de elementos repetitivos, ao mesmo tempo em que se evita sequências com baixa e uma única cópia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ALÍVIO DE DISTORÇÃO DE DNA DE Cot-1 EM HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉI- CO".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório co- pendente anteriormente depositado No. de Série 60/737.986, depositado em 18 de Novembro de 2005, o qual é incorporado aqui por referência.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Uma Listagem de Seqüência impressa, aqui incorporada por re- ferência, acompanha o presente pedido e também foi enviada com conteú- dos idênticos na forma de um arquivo ASCII legível em computador no sis- tema de depósito eletrônico do U.S.P.T.O.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a materiais e métodos para su- pressão de hibridização cruzada não-específica entre elementos repetitivos presentes no genoma alvo ou transcriptoma e elementos repetitivos corres- pondentes em sondas de ácido nucléico, ao mesmo tempo em que evita hi- bridização incidental entre seqüências com uma única cópia nas sondas e seqüências com uma única cópia adventícias em DNA de supressão. Mais particularmente, a presente invenção refere-se ao desenvolvimento e uso de sondas carecendo substancialmente de seqüências repetitivas junto como desenvolvimento e uso de DNA repetitivo sintético supressivo substancial- mente desprovido de elementos com uma única cópia. Ainda mais particu- larmente, tal DNA repetitivo compreende seqüências repetitivas correspon- dendo a elementos repetitivos de cópia moderada a alta adjacentes a ele- mentos com uma única cópia em uma ou mais regiões genômicas represen- tativas.

2. Descrição da Técnica Anterior

Análise ampla de genoma de expressão de gene e numero de cópia de Iocus tem sido facilitada através de hibridização genômica compa- rativa baseada em microarranjo e arranho. Questões persistentes com rela- ção à reprodutibilidade dessas técnicas têm surgido através de estudos de validação cruzada em diferentes laboratórios1-5. Estratégias para atenuar a variabilidade nos resultados obtidos a partir de estudos repetidos têm se fo- calizado sobre a padronização de fatores técnicos, tal como produção de arranjo, síntese de RNA1 rotulação, hibridização, varredura e análise de da- dos6-8. Zakharkin e outros9 sugerem que diferenças biológicas dentre amos- tras é a maior fonte dessa variabilidade e esses outros fatores contribuem em um menor grau.

Quando de análise de DNA usando uma sonda de hibridização, seqüências repetitivas no DNA alvo devem, tipicamente, ser bloqueadas an- tes de hibridização da sonda ao alvo, de forma a evitar hibridizações com alta interferência entre elementos repetitivos na sonda e elementos repetiti- vos homólogos no alvo.

Seqüências repetitivas ocorrem em múltiplas cópias no genoma haplóide. O número de cópias pode oscilar de dois a centenas de milhares, em que a família Alu de DNA repetitivo é exemplificativa da última numerosa variedade. As cópias de uma repetição podem ser agrupadas ou interespa- çadas através do genoma. Repetições podem ser agrupadas em um ou mais locais no genoma, por exemplo, seqüências repetitivas que ocorrem próximo dos centrossomas de cada cromossoma e repetições aleatórias de número variável (VNTRs) Nakamura e outros, Science, 235: 1616 (1987); ou as re- petições podem estar distribuídas sobre um único cromossoma, por exem- plo, repetições encontradas apenas sobre o cromossoma X, conforme des- crito por Bardoni e outros,Cytogenet. Cell Genet., 46: 575 (1987); ou as re- petições podem estar distribuídas sobre todos os cromossomas, por exem- plo, a família Alu de seqüências repetitivas.

Repetições simples de baixa complexidade podem ser encontra- das dentro de genes, mas são mais comumente encontradas em seqüências genômicas de não-codificação. Tais elementos repetidos consistem em ele- mentos de seqüência central de mono-, di-, tri-, tetra- ou penta-nucleotídeos dispostos em unidades aleatórias. Freqüentemente, o número de unidades aleatórias compreendendo esses elementos repetidos varia em locais idênti- cos dentre genomas de diferentes indivíduos. Esses elementos repetitivos podem ser encontrados através de busca por trechos consecutivos de ele- mentos de seqüência central em seqüências genômicas.

Hibridização competitiva, também conhecida como hibridização de supressão, proporciona um meio para bloqueio de um sinal de DNA repe- titivo potencialmente devastador. O DNA competidor ou supressor não- rotulado contém altas incidências de elementos repetitivos os quais se ligam a elementos repetitivos homólogos no alvo, desse modo, impedindo porções repetitivas das sondas rotuladas de se ligarem a tais elementos repetitivos no alvo e aumentando a probabilidade de que as sondas se hibridizem subs- tancialmente à seqüência rotulada, tipicamente não repetitiva.

O uso de DNA seqüência repetitiva-enriquecido (Cot-1) para su- primir ou bloquear hibridização cruzada não-específica entre elementos re- petitivos presentes na sonda com outros locais no genoma (ou transcripto- ma) é um requisito comum para a maioria dos estudos de hibridização em microarranjo. Hibridização de DNA supressor, tal como Cot-1, ao DNA alvo antes de FISH é comumente praticada na técnica anterior para evitar interfe- rência, isto é, hibridização não-específica. Em seres humanos, a fração de Cot-1 é altamente concentrada em famílias de elementos repetitivos interes- paçados, tais como elementos repetitivos curtos e longos interespaçados, SINEs e LINEs10,11. Procedimentos comerciais para preparo de DNA Cot-1 reiteram desnaturação e re-anelamento de DNA genômico e são monitora- dos através de enriquecimento de elementos Alu (excesso de três vezes com relação ao nível correspondente no genoma normal) e elementos L1 (excesso de quatro vezes com relação ao nível correspondente no genoma normal). Procedimentos de controle de qualidade atuais não determinam a composição ou seqüência precisa de DNA Cot-1.

Ao mesmo tempo em que a fração de Cot-1 parece suprimir hi- bridização não-específica entre os elementos repetitivos da sonda e os ele- mentos repetitivos correspondentes ou homólogos do DNA alvo, ela também aumenta o ruído experimental12 (Fig. 1). Portanto, foi investigado se diferen- ças na composição de Cot-1 poderiam ser uma fonte principal de variabilida- de nos resultados de estudos de hibridização genômica. O papel de C0t-1 em hibridização genômica foi elucidado através de hibridização em microes- fera quantitativa (QMH)13'20 usando sondas genómicas com uma única cópia (sc), seqüência-definidas14 e sondas compostas de sc contínua e seqüên- cias genómicas repetitivas. Foi determinado que o C0t-1 promove a forma- ção de duplas estáveis (seqüências com uma única cópia na seqüência da sonda hibridizaram à seqüências com uma única cópia dentro do DNA C0t-1) contendo seqüências repetitivas parálogas adjacentes freqüentemente não relacionadas à sonda, desse modo, impedindo quantificação precisa de hi- bridização de seqüência com uma única cópia. Incidentes de elementos com uma única cópia dentro do C0t-1 hibridizado a elementos com uma única có- pia homólogos na sonda distorcem (amplificam falsamente) o sinal da sonda.

A Fig. 1 ilustra a hibridização de C0M 105 a um alvo de DNA genômico 100 para suprimir ou bloquear um elemento repetitivo 115 no alvo 100 que está disponível para hibridização com elementos repetitivos parálo- gos 120 nas sondas 110. O elemento repetitivo 115 é mostrado em relação paralela ao elemento repetitivo de supressão 117 no DNA C0M 105, desse modo, indicando a hibridização dos elementos 115 e 117. Conforme é típico na técnica anterior, sondas 110 incluem elementos com uma única cópia 135, bem como elementos repetitivos adventícios 120, os elementos com uma única cópia 135 sendo selecionados e sintetizados para se hibridizar seletivamente a elementos com uma única cópia homólogos 140 no alvo 100. Conforme ilustrado, as sondas 110 são conjugadas à microesferas 145 usadas para detecção e quantificação da sonda 110. A sonda 110' é mos- trada hibridizada ao alvo 100, conforme previsto pelo design de estudo. Além de hibridização ao elemento repetitivo no alvo 115, contudo, elementos com uma única cópia 130 no C0t-1 105 também se hibridizam a elementos com uma única cópia homólogos 135 na sonda 125, desse modo, aumentando o sinal da sonda em três vezes.

O pedido de patente PCT/US2006/032693 intitulado "Quantificati- on of Microsphere Suspension Hybridization and Uses Thereof", depositado em 16 de Agosto de 2006, descreve um ensaio de hibridização em suspensão de microesfera utilizando sondas de hibridização genômicas com uma única e baixo número de cópias que permite a análise direta de DNA genômico inteiro (ou RNA) usando citometria de fluxo e é aqui incorporado por referência.

Conseqüentemente, o que é necessário na técnica são métodos de supressão de distorção de sinal causada por hibridização de sondas de ácido nucléico a elementos presentes em DNA C0M; métodos de supressão de hibridização não-específica de sondas ao DNA alvo; métodos de supres- são de hibridização de DNA de supressão ou competitivo aa seqüências com uma única cópia no alvo, bem como nas sondas; métodos de identifica- ção e síntese de DNA supressivo repetitivo; produtos de DNA repetitivo sin- tetizados eficazes para uso como DNA supressor; e sistemas de hibridização de ácido nucléico utilizando tal DNA supressivo sintetizado em combinação com sondas com uma única cópia substancialmente desprovida de elemen- tos repetitivos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção supera os problemas esboçados acima e proporciona novos métodos e produtos para supressão dos efeitos de distor- ção de resultado de DNA C0t-1 através de substituição de C0t-1 por ácidos nucléicos supressivos sintetizados para serem ricos em elementos repetiti- vos, mas substancialmente desprovidos de elementos com uma única ou baixo número de cópias. De modo geral, o método da presente invenção inclui as etapas de preparo de DNA de supressão sintético e hibridização do DNA de supressão ao DNA genômico alvo de forma a bloquear seqüências repetitivas no alvo antes de hibridização de uma sonda com o alvo. De prefe- rência, a sonda será isenta ou substancialmente isenta de elementos repeti- tivos e o DNA de supressão será isento ou substancialmente isento de tre- chos de DNA com uma única ou baixo número de cópias. Em algumas for- mas preferidas, o método incluirá as etapas de preparo de uma sonda de hibridização através de acoplamento de uma microesfera de poliestireno es- pectralmente codificada a uma seqüência de DNA sintético com baixo núme- ro de cópias selecionada; pré-hibridização do DNA genômico alvo com DNA supressivo ou de bloqueio sintético da presente invenção; hibridização da sonda ao DNA genômico alvo; e detecção do produto da hibridização atra- vés de citrometria de fluxo. A distorção de sinal demonstrada causada por C0t-1 em ensaios de hibridização foi, assim, atenuada através de supressão de hibridização cruzada através de pré-hibridização do alvo a elementos re- petitivos sintéticos que são isentos ou substancialmente isentos de seqüên- cias com uma única cópia e, de preferência, isentas ou substancialmente isentas de seqüências com baixo número de cópias.

Diferente dos ensaios de hibridização atuais, um ensaio de a- cordo com a presente invenção substitui o DNA supressivo C0t-1 por DNA sintético desenvolvido para incluir elementos repetitivos selecionados sem incluir elementos com uma única (ou baixo número) cópia competitivos. De preferência, o DNA sintético da presente invenção é selecionado em virtude de sua homologia com regiões repetitivas de DNA alvo que flanqueiam a seqüência com uma única (ou baixo número) cópia de interesse, a qual cor- responde ou é homóloga com a seqüência da sonda de hibridização com uma única (ou baixo número) cópia, o qual é projetado para se hibridizar com a seqüência com uma única (ou baixo número) cópia de interesse.

Os métodos e produtos da presente invenção são eficazes para atenuação de hibridização cruzada adventícia (1) entre elementos repetitivos em DNA de supressão e elementos homólogos em sondas, (2) entre ele- mentos com uma única ou baixo número de cópias em sondas e elementos homólogos com uma única (ou baixo número) cópia em DNA de supressão e (3) entre elementos repetitivos na sonda e elementos homólogos nas se- qüências genômicas alvo. De preferência, de acordo com a presente inven- ção, sondas com uma única ou baixo número de cópias são substancialmen- te, ainda mais preferivelmente completamente desprovidas de elementos repetitivos e DNA de supressão é sintetizado para ser substancialmente, ainda mais preferivelmente completamente desprovido de elementos com uma única ou baixo número de cópias.

A Fig. 2 ilustra a hibridização de DNA supressivo sintético 205 a um alvo de DNA genômico 200 para suprimir ou bloquear um elemento repe- titivo 215 no alvo. Conforme mostrado, o DNA supressivo sintético 205 não apresenta elementos com uma única ou baixo número de cópias adventícios que poderiam se hibridizar com elementos com uma única ou baixo número de cópias 235 na sonda 210 ou elementos com uma única ou baixo número de cópias 240 no alvo 200, desse modo, reduzindo significativamente a hi- bridização cruzada de elementos com uma única ou baixo número de cópias no ensaio. A sonda 210 é, de preferência, sintetizada para compreender um ou mais elementos com uma única ou baixo número de cópias 235, mas é desprovida de elementos repetitivos que poderiam, de outro modo, se hibri- dizar a repetições homólogas no DNA supressivo 205 ou alvo 200. Na Fig. 2, o sinal da sonda teria uma correspondência de 1:1 direta com o elemento com uma única ou baixo número de cópias 240 no alvo 200.

Assim, um aspecto da invenção proporciona um método de su- pressão de hibridização cruzada não-específica entre seqüências repetitivas presentes em sondas de ácido nucléico e seqüências repetitivas homólogas em ácido nucléico genômico alvo. Geralmente, o método compreende identi- ficação de seqüências repetitivas em uma região genômica representativa, síntese de ácido nucléico supressivo derivado das seqüências repetitivas identificadas e reação de ácido nucléico supressivo com um ácido nucléico alvo. De preferência, o ácido nucléico supressivo compreende um ou mais produtos de PCR seqüência-definida selecionados do grupo consistindo em elementos interespaçados curtos, elementos interespaçados longos, repeti- ções terminais longas, elementos Alu, elementos L1 e transposons de DNA. Essa reação faz com que seqüências repetitivas no ácido nucléico supressi- vo se hibridizem a seqüências repetitivas homólogas no ácido nucléico alvo, desse modo, bloqueando substancialmente as seqüências repetitivas no á- cido nucléico alvo de se hibridizarem com seqüências repetitivas homólogas em uma sonda de ácido nucléico subseqüentemente reagida e, conseqüen- temente, suprimindo hibridização cruzada não-específica entre as seqüên- cias repetitivas na sonda e seqüências repetitivas homólogas no ácido nu- cléico alvo. Essa ação supressiva é grandemente intensificada por ter o áci- do nucléico supressivo substancialmente compreendido das seqüências re- petitivas identificadas, ao mesmo tempo em que também é substancialmente desprovido de seqüências com baixo número de cópias. De preferência, o ácido nucléico supressivo é sintetizado de modo a ser completamente des- provido de seqüências com baixo número de cópias. Em formas preferidas, o ácido nucléico alvo compreende seqüências com baixo número de cópias. De preferência, o ácido nucléico supressivo é sintetizado para conter uma pluralidade de seqüências repetitivas selecionadas para corresponder às seqüências repetitivas encontradas adjacentes a seqüências com baixo nú- mero de cópias em uma ou mais regiões genômicas representativas. Em algumas formas preferidas, o método incluirá a etapa adicional de hibridiza- ção do ácido nucléico alvo com uma ou mais sondas contendo seqüências com baixo número de cópias homólogas às seqüências com baixo número de cópias no alvo. Em formas preferidas, a sonda será substancialmente e, ainda mais preferivelmente, completamente desprovida de seqüências repe- titivas. Em outras formas preferidas, o método incluirá a etapa de conjuga- ção da sonda a uma microesfera de poliestireno espectralmente codificada. De preferência, a sonda será rotulada com uma porção detectável de forma a intensificar sua utilidade. Algumas porções detectáveis preferidas incluem fluoroforos, conjugados enzimáticos, nucleotídeos fluoroforo-marcado, anti- corpos fluorescentemente rotulados ligados a nucleotídeos trazendo antíge- no, biotina-dUTP, digoxigenina-dUTP e combinações dos mesmos. Esse método, bem como os outros descritos e ensinados aqui, podem ser usados em qualquer procedimento em que DNA C0t-1 foi usado ou poderia ser usa- do, incluindo qualquer ensaio selecionado do grupo consistindo em ensaios de hibridização em microarranjo, ensaios de hibridização por fluorescência in situe ensaios de hibridização em microesfera.

Outro aspecto proporciona um método de síntese de ácido nu- cléico de supressão. Tal método geralmente inclui as etapas de identificação de seqüências repetitivas em uma região genômica representativa; e síntese do ácido nucléico de supressão através de síntese de seqüências de ácido nucléico hibridizáveis com as seqüências repetitivas identificadas, mas não hibridizáveis com seqüências com baixo número de cópias próximas ou den- tro da região genômica representativa. De preferência, o ácido nucléico de supressão sintetizado é substancialmente isento de seqüências com baixo número de cópias. Em algumas formas preferidas, o método também pode incluir a etapa de seleção de determinadas seqüências repetitivas identifica- das para síntese como o ácido nucléico de supressão baseado em sua pro- ximidade a uma seqüência com baixo número de cópias de interesse. De preferência, essas determinadas seqüências repetitivas identificadas são aquelas em maior proximidade com a seqüência com baixo número de có- pias de interesse. De preferência, o ácido nucléico de supressão sintetizado é isento de seqüências que são hibridizáveis com a seqüência com baixo número de cópias de interesse. Naturalmente, um ácido nucléico supressivo sintetizado de acordo com a presente invenção pode ser usado em um en- saio de hibridização e, especialmente, em um ensaio de hibridização que poderia usar DNA C0t-1 ou de bloqueio. Alguns ensaios de hibridização pre- feridos incluem ensaios de hibridização por fluorescência in situ, ensaios em microarranjo e ensaios de hibridização ém microesfera.

Outro aspecto da presente invenção proporciona um novo méto- do de aumento da especificidade de hibridização entre sondas de ácido nu- cléico com baixo número de cópias e regiões homólogas em um ácido nu- cléico alvo. Geralmente, tal método inclui as etapas de hibridização de ele- mentos repetitivos no ácido nucléico alvo com elementos repetitivos homólo- gos em um ácido nucléico supressivo, em que o ácido nucléico supressivo compreende uma pluralidade de elementos repetitivos e é sintetizado ou se- lecionado para ser substancialmente e, mais preferivelmente, completamen- te desprovido de elementos com baixo número de cópias e hibridização de elementos com baixo número de cópias no ácido nucléico alvo com elemen- to com baixo número de cópias homólogos em uma ou mais das sondas de ácido nucléico. Em formas preferidas, os elementos repetitivos no ácido nu- cléico supressivo são selecionados para terem homologia substancial a ele- mentos repetitivos que flanqueiam elementos com baixo número de cópias em uma ou mais regiões genômicas representativas. Ainda mais preferivel- mente, os elementos repetitivos de flanqueamento são de um número mode- rado a alto de cópias e os elementos com baixo número de cópias compre- endem elementos com uma única cópia. Ainda mais preferivelmente, as sondas são substancialmente desprovidas de elementos repetitivos.

Outro aspecto da presente invenção proporciona um método para quantificação precisa do número de cópias da seqüência de ácido nu- cléico. Geralmente, tal método compreendendo as etapas de preparo de uma primeira microesfera fluorescente espectralmente codificada tendo um primeiro endereço espectral e uma segunda microesfera fluorescente espec- tralmente codificada tendo um segundo endereço espectral, identificação de uma seqüência de sonda de ácido nucléico genômica alvo através de deter- minação da seqüência nucleotídeo-por-nucleotídeo de uma seqüência de ácido nucléico alvo, em que a seqüência de interesse é suspeita de residir, síntese de uma sonda com baixo número de cópias derivada da seqüência da sonda de ácido nucléico genômica alvo identificada, a sonda alvo com- preendendo pelo menos um elemento com baixo número de cópias e sendo substancialmente desprovida de elementos repetitivos, conjugação da sonda alvo à primeira microesfera, síntese de uma sonda de referência selecionada para hibridizar a uma seqüência de ácido nucléico de referência da seqüên- cia de ácido nucléico alvo, conjugação da sonda de referência a uma micro- esfera tendo um segundo endereço espectral, identificação de seqüências repetitivas em uma região genômica representativa, síntese de ácido nucléi- co supressivo, o ácido nucléico supressivo compreendendo seqüências de homologia suficiente para se hibridizar às seqüências repetitivas identifica- das, o ácido nucléico supressivo compreendendo substancialmente elemen- tos repetitivos e sendo substancialmente desprovido de elemento com baixo número de cópias, reação do ácido nucléico supressivo com uma seqüência alvo cromossômica, desse modo, fazendo com que os elementos repetitivos no ácido nucléico supressivo se hibridizem com elementos repetitivos homó- logos na seqüência cromossômica alvo, reação da sonda alvo com a se- qüência cromossômica alvo, desse modo, fazendo com que elementos com baixo número de cópias na sonda alvo se hibridizem a elementos homólogos com baixo número de cópias na seqüência cromossômica alvo, reação do ácido nucléico supressivo com uma seqüência cromossômica de referência contendo a seqüência cromossômica alvo, desse modo, fazendo com que elementos repetitivos no ácido nucléico supressivo se hibridizem a elemen- tos repetitivos homólogos na seqüência cromossômica de referência, reação da sonda de referência com a seqüência cromossômica de referência, desse modo, fazendo com que a sonda de referência se hibridize à seqüência cro- mossômica de referência, detecção da sonda alvo hibridizada via o primeiro endereço espectral, detecção da sonda de referência hibridizada via o se- gundo endereço espectral e quantificação da sonda alvo detectada através de comparação da resposta da sonda alvo hibridizada detectada com a res- posta da sonda de referência hibridizada detectada. Em formas preferidas, o DNA supressivo compreende elementos repetitivos com os elementos repeti- tivos correspondendo a elementos repetitivos genômicos adjacentes a ele- mentos com baixo número de cópias no alvo.

Em outra modalidade da presente invenção, um método para supressão de hibridização cruzada não-específica entre elementos repetiti- vos presentes em sondas de ácido nucléico e elementos repetitivos homólo- gos no ácido nucléico alvo é proporcionado. Geralmente, o método compre- ende as etapas de hibridização de ácido nucléico supressivo com elementos repetitivos homólogos em um ácido nucléico alvo contendo um ou mais ele- mentos com baixo número de cópias. De preferência, o ácido nucléico su- pressivo é sintetizado ou selecionado de modo que ele contenha uma plura- lidade de elementos repetitivos selecionados para corresponder a uma ou mais regiões genômicas representativas contendo regiões com uma única cópia adjacentes a um elemento repetitivo com um número moderado a alto de cópias e é substancialmente desprovido de elementos com baixo número de cópias. Então, o ácido nucléico alvo é hibridizado com uma ou mais son- das contendo elementos com baixo número de cópias homólogos a elemen- tos com baixo número de cópias no alvo, as sondas sendo substancialmente desprovidas de seqüências repetitivas.

Em outro aspecto da presente invenção, um método de supres- são de hibridização cruzada não-específica entre elementos com baixo nú- mero de cópias presentes em ácido nucléico supressivo e elementos com baixo número de cópias homólogos em sondas de ácido nucléico ou ácido nucléico alvo é proporcionado. Geralmente, o método compreende as etapas de identificação de elementos repetitivos e com baixo número de cópias den- tro e próximo do ácido nucléico alvo, síntese de seqüências de ácido nucléi- co supressivas através de seleção de seqüências repetitivas a partir do áci- do nucléico alvo para inclusão no ácido nucléico supressivo ao mesmo tem- po em que evita substancialmente a inclusão de seqüências com baixo nú- mero de cópias no processo de síntese e reação do ácido nucléico supressi- vo sintetizado com o ácido nucléico alvo, de modo que os respectivos ele- mentos do ácido nucléico supressivo homólogo e ácido nucléico alvo se hi- bridizam uns com os outros.

A presente invenção também proporciona um método de aumen- to da precisão e reprodutibilidade de ensaios usando DNA supressivo ou de bloqueio (por exemplo, DNA C0t-1) compreendendo as etapas de seleção ou síntese de ácido nucléico de supressão que inclui uma pluralidade de ele- mentos repetitivos, mas é substancialmente isento de seqüências com baixo número de cópias e uso ou substituição do ácido nucléico de supressão se- lecionado ou sintetizado em lugar de DNA C0t-1.

Em outro aspecto da presente invenção, um método de supres- são de hibridização adventícia de ácido nucléico alvo genômico com uma sonda de ácido nucléico é proporcionado. Geralmente, o método compreen- de as etapas de preparo de ácido nucléico alvo genômico para hibridização através de seleção de uma seqüência ou seqüências no genoma correspon- dendo a uma seqüência de interesse; identificação de seqüências com baixo número de cópias dentro das seqüências alvo de interesse; síntese de son- das com baixo número de cópias homólogas às seqüências alvo com baixo número de cópias identificadas, com as sondas com baixo número de cópias sendo substancialmente desprovidas de seqüências repetitivas; identificação de seqüências repetitivas adjacentes às seqüências alvo com baixo número de cópias; síntese de DNA de supressão homólogos às seqüências alvo re- petitivas, o DNA de supressão compreendendo substancialmente elementos repetitivos; reação do ácido nucléico alvo com o DNA de supressão, de mo- do que os elementos repetitivos no DNA de supressão se hibridizam a ele- mentos repetitivos homólogos no ácido nucléico alvo; reação do ácido nu- cléico alvo com as sondas com baixo número de cópias para hibridização a elementos com baixo número de cópias dentro das sondas a elementos com baixo número de cópias homólogos no ácido nucléico alvo; e detecção de sondas com baixo número de cópias de forma a quantificar a hibridização da sonda ao alvo, pelo que casos de elementos com baixo número de cópias dentro do ácido nucléico podem ser determinados.

Definições

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme é comumente compreendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publica- ções e seqüências do GenBank e outros bancos de dados mencionados a- qui são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Se uma defini- ção apresentada nessa seção é contrária ou, de outro modo, inconsistente com uma definição apresentada em pedidos, pedidos publicados e outras publicações e seqüências do GenBank e outros bancos de dados que são aqui incorporados por referência, a definição apresentada nessa seção pre- valecerá sobre a definição que é incorporada aqui por referência.

Conforme usado aqui, "um" ou "uma" significa pelo menos "um(a)" ou "um(a) ou mais".

Conforme usado aqui, "ácido(s) nucléico(s)" se refere a ácido deoxirribonucléico (DNA) e/ou ácido ribonucléico (RNA) em qualquer forma incluindo, interalia, formas filamento simples, duplo, triplo, linear e circular.

Conforme usado aqui, "seqüência" se refere a uma seqüência de ácido nucléico.

Conforme usado aqui, o termo "sonda de referência" significa uma sonda específica para um Iocus no genoma, de preferência de uma se- qüência autossômica, que é tem graves danos e, de preferência, é letal em qualquer outro número de cópias que não 2. A sonda de referência pode ser derivada de qualquer Iocus cromossômico com uma única ou com baixo nú- mero de cópias, na medida em que ela tenha um complemento cromossômi- co normal na amostra do paciente. Na determinação do número de cópias genômicas para diagnóstico de doença constitucional, sondas de referência serão, tipicamente, de origem autossômica de um ou mais genes que se re- quer serem expressos a partir de dois alelos durante desenvolvimento nor- mal. Para determinação do número de cópias genômicas para diagnóstico de doença neoplásica, sondas de referência são selecionadas de domínios cromossômicos com uma escassez de oncogenes e as quais têm comple- mento cromossômico normal.

Conforme usado aqui, "rótulo" se refere a qualquer grupo quími- co ou porção tendo uma propriedade física detectável, tal como uma enzima que catalisa a conversão de um substrato em um produto detectável. O ter- mo "rótulo" também abrange compostos que inibem a expressão de uma propriedade física em particular. O "rótulo" pode também ser um composto que é um membro de um par de ligação, o outro membro do qual traz uma propriedade física detectável. Rótulos exemplificativos incluem grupos de massa, metais, grupos fluorescentes, grupos luminescentes, grupos quimio- luminescentes, grupos ópticos, grupos carregados, grupos polares, cores, haptenos, ligantes de ligação à pressão reduzida, seqüências de nucleotí- deo, grupos radioativos, enzimas, partículas e combinações dos mesmos.

Conforme usado aqui, "amostra" se refere a qualquer coisa que pode conter um ácido nucléico a ser analisado. A amostra pode ser uma amostra biológica, tal como um fluido biológico ou um tecido biológico. E- xemplos de fluidos biológicos incluem urina, sangue, plasma, soro, saliva, sêmen, fezes, escarro, fluido cérebro espinhal, lágrimas, muco, fluido amnió- tico ou semelhante. Tecidos biológicos são agregados de células, usualmen- te de um tipo particular, junto com sua substância intercelular que forma um dos materiais estruturais de um ser humano, animal, planta, estrutura bacte- riana, fúngica ou viral, incluindo tecido conectivo, epitelial, pele, músculo e nervo. Exemplos de tecidos biológicos também incluem órgãos, tumores, nódulos linfáticos, artérias e coleções de célula(s) individual(is), por exemplo, isoladas de plasma, sangue ou urina ou através de tratamento com colage- nase de tecidos sólidos.

Conforme usado aqui, "amplificação" se refere a um método pa- ra duplicação linear de um ácido nucléico analito alvo em uma amostra para melhorar a sensibilidade do ensaio. Conforme descrito aqui, muitos métodos diferentes para amplificação de ácidos nucléicos são conhecidos na técnica.

Conforme usado aqui, "conjunto" se refere a uma coleção de microesferas trazendo um endereço espectral diferente conjugadas com uma única sonda Ic ou uma coleção de sondas Ic.

Conforme usado aqui, "baixo número de cópias" ou "Ic" se refere a uma seqüência a qual se hibridizará a dez ou menos intervalos de seqüên- cia no ácido nucléico alvo ou locais em um genoma. É preferido que o núme- ro de cópias seja de 10 ou menos, mais preferivelmente 7 ou menos, ainda mais preferivelmente 5 ou menos e, ainda mais preferivelmente, 3 ou menos.

Conforme usado aqui, "única cópia" ou "sc" se refere a uma se- qüência de ácido nucléico a qual se hibridizará a três ou menos intervalos de seqüência no ácido nucléico alvo ou locais em um genoma. Assim, o termo abrangerá seqüências que são estritamente únicas (isto é, seqüências com- plementares a uma e apenas uma seqüência no genoma correspondente) bem como duplicons e triplicons. Os termos "elemento com uma única cópia" e "seqüência com uma única cópia" também podem ser usados para se refe- rir a tais seqüências de ácido nucléico.

Conforme usado aqui, "altamente reiterado" significa presente em mais de 1000 cópias.

Conforme usado aqui, "identidade de seqüência" se refere a uma relação entre duas ou mais seqüência de polinucleotídeo, isto é, uma seqüência de referência e uma dada seqüência a serem comparadas com a seqüência de referência. A identidade de seqüência é determinada através de comparação da determinada seqüência com a seqüência de referência após as seqüências terem sido otimamente alinhadas para produzir o maior grau de similaridade de seqüência, conforme determinado pela combinação entre trechos de tais seqüências. Quando de tal alinhamento, a identidade de seqüência é determinada em uma base posição- por- posição, por exem- pio, as seqüências são "idênticas" em uma posição em particular se, nessa posição, os nucleotídeos são idênticos. O número total de tais identidades de posição é, então, dividido pelo número total de nucleotídeos ou resíduos na seqüência de referência para proporcionar a identidade % de seqüência.

A identidade de seqüência pode ser prontamente calculada através de mé- todos conhecidos incluindo, mas não limitado a, aqueles descritos em Com- putational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Da- ta, Parte I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Iniciador, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stoekton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Métodos preferidos para determinar a identidade de seqüência são projetados para proporcionar a maior combi- nação entre as seqüências testadas. Métodos para determinar a identidade de seqüência são codificados em programas de computador publicamente disponíveis os quais determinam a identidade de seqüência entre determi- nadas seqüências. Exemplos de tais programas incluem, mas não estão Iimi- tados a, o pacote de programa GCG (Devereux, J., e outros, Nucleie Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. e outros, J. Molec. Biol., 215: 403410 (1990). O programa BLASTX está publi- camente disponível da NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. e outros, NCBI, NLM, NIH, Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. F. e outros, J. Molec. Biol., 215: 403410 (1990)). Esses programas alinham otimamente seqüências usando pesos de gap de default de forma a produzir o maior ní- vel de identidade de seqüência entre a determinada seqüência e aquela de referência. Como uma ilustração, por um polinucleotídeo tendo uma seqüên- cia de nucleotídeo tendo pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade de seqüência" a uma seqüência de nucleotídeo de referência, entenda-se que a seqüência de nucleotídeo do determinado polinucleotídeo é idêntica à se- qüência de referência, exceto que a determinada seqüência de polinucleotí- deo pode incluir até 5 diferenças por eada 100 nucleotídeos da seqüência de nucleotídeo de referência. Em outras palavras, em um polinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 95% de identidade com relação à seqüência de nucleotídeo de referência, até 5% dos nucleotídeos na seqüência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos até 5% dos nucleotídeos totais na seqüência de referência pode ser inserido na seqüência de referência. Inversões em qualquer seqüência são detectadas através desses programas de computador baseado na similaridade da seqüência de referência a fila- mento anti-sentido da seqüência de teste homóloga. Essas variantes da se- qüência de referência podem ocorrer nas posições 5' ou 3' terminais da se- qüência de nucleotídeo de referência ou em qualquer parte entre essas po- sições terminais interespaçadas individualmente entre nucleotídeos na se- qüência de referência ou em um ou mais grupos contínuos dentro da se- qüência de referência.

Conforme usado aqui, uma "seqüência repetida" é uma seqüên- cia a qual aparece repetidamente no genoma do qual o DNA alvo é uma par- te, com uma identidade de seqüência entre repetições de pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 80%, e a qual é de um comprimento suficiente ou tem outras qualidades as quais fariam com que a mesma interfira com a hibridização específica desejada da sonda ao DNA alvo, isto é, a sonda aparece pelo menos 10 vezes o genoma, tem um tama- nho repetido oscilando de 1 nucleotídeo a centenas de nucleotídeos, as uni- dades repetidas tendo comprimentos de pelo menos 10 nucleotídeos a mi- Ihares de nucleotídeos. Seqüências repetidas podem ser de qualquer varie- dade, por exemplo, seqüências repetitivas aleatórias, interespaçadas, palin- drômicas ou compartilhadas (com algumas cópias na região alvo e algumas em qualquer parte no genoma) e podem aparecer próximo dos centrômeros de cromossomas, próximo dos centrômeros de cromossomas, distribuídas sobre um único cromossoma ou por todos ou alguns cromossomas. Nor- malmente, com poucas exceções, seqüências repetidas não expressam pro- teínas fisiologicamente úteis. Uma "seqüência repetida" também pode ser referida como uma "seqüência repetitiva" ou "um elemento repetitivo".

Conforme usado aqui, "elemento interespaçado curto", também se refere aqui a um SINE, significa um elemento reversível interespaçado derivado de transcritos de RNA polimerase III com unidades repetidas osci- lando, quanto ao comprimento de 75 bp a 500 bp de comprimento. A classe mais abundante de elementos SINE é a família Alu. Seqüências Alu têm cer- ca de 300 bp de comprimento e estão presentes no genoma humano em aproximadamente 500,000 cópias.

Conforme usado aqui, um "elemento interespaçado longo", tam- bém referido aqui como um LINE, significa um elemento reversível interes- paçado altamente repetitivo derivado de transcritos dé RNA polimerase I e com unidades repetidas de até 7000 bp.

Conforme usado aqui, uma "repetição terminal longa", também referida aqui como uma LTR, significa uma grande classe de elementos re- versíveis a qual possui repetições terminais diretas, tipicamente de 200-500 bp de comprimento.

Conforme usado aqui, uma repetição "MIR" significa um elemen- to repetitivo interespaçado de mamífero o qual tem um comprimento da uni- dade repetida de pelo menos 260 bp e é encontrada em aproximadamente 105 cópias do genoma humano.

Conforme usado aqui, uma repetição "MER" significa elementos repetitivos humanos moderadamente interespaçados de origem desconheci- da com números de cópia no genoma humano oscilando de 100's a 1000's.

Conforme usado aqui, DNA moderadamente repetitivo significa seqüências repetitivas distribuídas uniformemente no genoma humano, pre- sente em 10 a 1000 cópias e tem 150 a 300 bp de comprimento. Um exem- plo é a família Alu.

Conforme usado aqui, DNA altamente repetitivo significa se- qüências repetitivas curtas de 5 a 300 bp de comprimento que estão presen- tes em até 105 cópias no genoma humano. Um exemplo é DNA satélite.

Conforme usado aqui, os termos "transposons de DNA" ou "transposons" se refere à seqüências de DNA que podem se mover de um local para o outro dentro do genoma. Essas seqüências também podem ser referidas como "elementos genéticos móveis". O movimento de transposons é, tipicamente, referido como transposição.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Fig. 1 é um diagrama ilustrando a hibridização de sondas a elementos com uma única cópia em DNA C0M.

A Fig. 2 é um diagrama ilustrando a hibridização de DNA de su- pressão a uma seqüência repetitiva em ácido nucléico alvo.

A Fig. 3 é um diagrama ilustrando estruturas potenciais produzi- das em hibridização QMH na presença de DNA C0M.

A Fig. 4 é um diagrama ilustrando produtos repetitivos sintéticos e sondas usadas em supressão de hibridização cruzada em padrões genômicos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES PREFERIDAS

O exemplo a seguir apresenta modalidades preferidas da pre- sente invenção. Essas modalidades demonstram a hibridização de sondas com uma única (ou baixo número) cópia a um alvo genômico previamente hibridizado a DNA sintético contendo elementos repetidos, mas não elemen- tos com uma única ou com baixo número de cópias. Contudo, essas modali- dades são para fins ilustrativos apenas e a divulgação aqui não deverá ser construída como uma limitação sobre o escopo da presente invenção.

Exemplo

Materiais e Métodos

Hibridização em microesfera quantitativa (QMH)

Seleção de sonda, síntese e conjugação de microesfera

As sondas estão na forma de fragmentos de ácido nucléico rotu- lados ou uma coleção de fragmentos de ácido nucléico rotulados cuja hibri- dização a uma seqüência alvo pode ser detectada. As sondas rotuladas po- dem ser usadas com qualquer alvo de ácido nucléico que contém seqüên- cias homólogas às seqüências na sonda. Essas seqüências alvo podem in- cluir, mas não estão limitadas a, DNA cromossômico ou nuclear purificado, RNA heteronuclear ou espécies de mRNA que contêm seqüências com uma única cópia como componentes integrais do transcrito. Na explicação deta- lhada a seguir, o caso usual de uma seqüência alvo de DNA e uma sonda de DNA é discutido; contudo aqueles versados na técnica compreenderão que a discussão é igualmente aplicável (com diferenças reconhecidas na técnica levando em conta a natureza das seqüências alvo e das sondas) a outras espécies de ácido nucléico.

Uma característica importante das sondas preferidas da inven- ção é que elas são compostas de seqüências de DNA "com baixo número de cópias", "com uma única cópia" ou "únicas" as quais são complementares a pelo menos uma porção da região de DNA alvo de interesse e são essen- cialmente isentas de seqüências complementares à seqüências repetidas dentro do genoma do qual a região alvo é uma parte. Conseqüentemente, uma sonda composta de uma seqüência com uma única cópia ou única é, de preferência, complementar à três ou menos seqüências e, de preferência, apenas uma seqüência, no genoma correspondente.

Sondas com uma seqüência com baixo número de cópias ou com baixo número de cópias e repetitivas misturadas foram projetadas con- forme anteriormente descrito14' 15' 16' 20. Em formas preferidas, a presente invenção utiliza sondas de hibridização com baixo número de cópias ou com uma única cópia especialmente projetadas para se hibridizar a um único Io- cus na seqüência do genoma haplóide com alta especificidade. O método para seleção e síntese de sonda é descrito nas Patentes U.S. Nos. 6.828.097 e 7.014.997, os ensinamentos e conteúdos das quais são aqui incorporados por referência. Essas etapas iniciais requerem conhecimento das seqüências das repetições alvo e genômica, informação que está cres- centemente disponível levando-se em conta Human Genome Project e estu- dos de bioinformática relacionados. Software de computador prontamente disponível foi usado para derivar seqüências com baixo número de cópias ou com uma única cópia preferidas.

De forma a desenvolver sondas de acordo com a invenção, a seqüência da região do DNA alvo deve ser conhecida. A região alvo pode ser um cromossoma inteiro ou apenas porções do mesmo, onde reestrutura- ções tenham sido identificadas. Com esse conhecimento de seqüência, o objetivo é determinar os limites de seqüências com uma única cópia ou úni- cas dentro da região alvo. Isso é, de preferência, realizado através de infe- rência a partir dos locais de seqüências repetitivas dentro da região alvo.

Normalmente, a seqüência da região alvo é comparada com seqüências re- petidas conhecidas do genorria correspondente usando um software de computador disponível. Uma vez que as seqüências repetidas dentro da re- gião alvo são identificadas, as seqüências intervenientes são deduzidas co- mo sendo com uma única ou com baixo número de cópias (isto é, as se- qüências entre seqüências repetidas adjacentes). Alinhamento ótimo das seqüências alvo e repetitivas para comparação pode ser conduzido através do algoritmo de homologia local de Smith e outros, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981) ou através do algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e outros, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970).

De preferência, pelo menos duas seqüências de sonda diferen- tes são selecionadas e sintetizadas. Pelo menos um conjunto de sondas de- verá ser selecionado e sintetizado para reconhecimento de uma seqüência de ácido nucléico em particular em que a anormalidade, se presente, residirá (sonda de teste) e outro conjunto de sondas deverá ser selecionado e sinte- tizado para reconhecimento de uma seqüência de referência (sonda de refe- rência). As sondas com baixo número de cópias deverão ter pelo menos cerca de 60 pares de base e geralmente não mais do que 2500 pares de base de tamanho. De preferência, as sondas têm entre 60 e 1000 pares de base, mais preferivelmente entre cerca de 80-500 pares de base e, ainda mais preferivelmente, entre cerca de 90-110 pares de base. Descobriu-se que microesferas conjugadas a sondas com baixo número de cópias de cer- ca de 100 pares de base produziram distribuições de fluorescência média bem definidas e valores de intensidade de fluorescência média de fIuoro- croma secundário consistentemente maiores e, assim, refletiam mais preci- samente os números de cópia reais. Os conjugados de sonda mais curtos também são mais estáveis e podem ser usados em reações de hibridização durante mais de dois meses após conjugação quando apropriadamente ar- mazenados, de preferência no escuro e em torno de 4 9C. Isso resulta em menos variação lote a lote nos estoques de microesferas rotuladas, desse modo, reduzindo o esforço requerido para conjugar, quantificar e qualificar microesferas sonda- conjugadas. Sondas conjugadas mais longas mostra- ram eficiência de hibridização degradada dentro de duas semanas após con- jugação.

As sondas usadas nesse exemplo incluem sondas com interva- los sc (i) ABLIa (Maio de 2004, chr9: 130623551-130625854) com repeti- ções AluJo/Sx/L2 e (ii) ABLIb (chr9: 130627353-130628735) com repetições AIuJo divergentes de dentro de ABL1, projetadas e validades anteriormente 13,14, (iii) uma sonda de cromossoma 9 com 1823 bp com seqüências repeti- tivas AIÜ/MER1, ABL1 AIuMERI (chr9: 130621702-130623525), (iv) um seg- mento sc de 98 bp de um íntron TEKT3 (Chr17: 15149108-15149206) e (v) um segmento sc de 101 bp de um íntron PMP22 (Chr17: 15073475- 15073576), (vi) um segmento sc de 93 bp de um íntron HOXB1 (Chr17: 43964237-43964330). Sondas para experimentos de reconstrução genômica incluíam: (vii) HOXBIb (chrl7: 43963396-43965681) e (viii) C1QTNF7 (chr4: 15141452-15141500). Seqüências repetitivas encontradas dentro de sondas foram definidas como divergentes, baseado nas diferenças percentuais de seqüência (>12 %) deleção percentual (>4 %) e/ou inserção percentual (>4 %) com relação a membros de famílias de consenso (na Internet em gi- rinst.org).

Acoplamento de sondas à microesferas

Sondas foram sintetizadas e acopladas a microesferas conforme previamente descrito13, 20. Durante síntese, as sondas podem ser amina- marcado, dependendo da reação de conjugação em particular, para conju- gação a microesferas espectralmente distintas. De preferência, as sondas são conjugadas a microesfera via uma reação com carbodiimida modificada.

Microesferas fluorescentes, cada uma com endereços espectrais distintos (L1-L9 designados; Duke Scientific, Palo Alto, CA) e revestidas com aproximadamente 200.000 carbóxi-sítios, foram conjugadas individualmente à diferentes sondas Ic. Sondas Ic amino-modificadas purificadas foram aco- piadas a microesferãs carboxiladas via um procedimento de acoplamento com carbodiimida modificado (Dunbar e outros, 2003; Fulton e outros, 1997). Cada sonda foi inicialmente desnaturada termicamente e, então, esfriada aos pedaços sobre gelo. Aproximadamente 3.125 χ 105 microesferãs com características espectrais idênticas foram pipetadas em um tubo para micro- centrífuga de 1,5 mL (USA Scientific1 Ocala, Florida), centrifugada durante dois minutos a 10.000 g e drenadas do sobrenadante. 150 μΙ_ de tampão de MES a 0,1 M (ácido (2-(A/-morfolino) etano-sulfônico), pH de 4,5, foram adi- cionados a cada tubo e as microesferãs foram, então, submetidas rapida- mente a turbilhonamento, seguido por centrifugação durante dois minutos a 10.000 g. O sobrenadante foi removido e as microesferãs foram ressuspen- sas, através de turbilhonamento, em 80 μΙ_ de MES a 0,1 m. Uma única son- da Ic (0,5 nmol) foi adicionada a cada tubo e misturada através de turbilho- namento. Um volume de 1,25 μΙ_ de solução fresca a 10 mg/ml de cloridrato de 1-etil-3-3-dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) foi adicionado e reação foi rapidamente submetida a turbilhonamento e incubada no escuro durante 30 minutos com mistura ocasional. Mistura e incubação de EDC foram repe- tidas duas vezes, usando 1,25 μΙ_ de solução de EDC recentemente prepa- rada a cada vez. A reação foi cessada através da adição de 500 μΙ_ de Twe- en 20 a 0,02%, seguido por turbilhonamento e centrifugação durante 2 minu- tos a 10.000 g. Após remoção do sobrenadante, 250 μΐ_ de CDS a 0,1% fo- ram adicionados a cada tubo, submetidos a turbilhonamento e, então, centri- fugados a 10.000 g durante 2 minutos. O sobrenadante foi cuidadosamente removido, 25 μΙ_ de MES a 0,1 M, pH de 4,5, foram adicionados e o tubo foi submetido a turbilhonamento e armazenado no escuro a 4 2C. As concentra- ções de microesferãs acopladas foram quantificadas através da adição de 1 μΐ_ de cada microesfera a 100 uL de 1X PBS e análise sobre o citômetro de fluxo FACSCaIibur (Becton Dickinson, San Jose, Califórnia) usando as con- dições fornecidas abaixo.

Outros métodos para acoplamento de ácidos nucléicos a microes- ferãs foram desenvolvidos que são equivalentes no escopo do presente méto- do. Outro método comum para conjugação de DNA a microesferãs liga glóbu- los revestidos com estreptavidina a sondas contendo um nucleotídeo modifica- do com uma porção de biotina no 5' término. Nanopartículas de outro foram conjugadas a ácidos nucléicos tiol-modificados na Patente U.S. No. 6.361.944. Ácidos nucléicos - proteínas foram conjugados a glóbulos Patentes U.S. Nos. 6.468.546; 6.838.243; 6.833.246; 6.828.146; e 6.828.142. Conjugação de oli- gonucleotídeos a microesferas também foi realizada via um tether eletrofílico, isto é, um reagente de N-cloroacetamidohexil fosforamidita (Guzaev, e outros Bioorg Med Chem Lett. 1998 Dec 15;8(24): 3671-6). DNA também foi conjuga- do a partículas nanocristalinas semicondutoras (Taylor, J.R., Fang1M.M., & Nie, S.M. Probing specific sequences on single DNA molecules with bioconju- gated fluorescent nanoparticles. Anal. Chem. 72,1979-1986, 2000; W. Z. Guo1 J. J. Li1 Ύ. A. Wang, X. G. Peng, Conjugation chemistry and bioapplications of semiconductor box nanocrystals prepared via dendrimer bridgihg. Chem. Ma- ter. 15, 3125-3133 (2003) e Patente U.S. No. 6.630.307).Em uma modalidade preferida, as microesferas são glóbulos de poliestireno fluorescentes interna- mente corados com vários endereços espectrais e são conjugadas a sondas com baixo número de cópias, de modo que várias combinações de glóbulos conjugados à sondas com baixo número de cópias resultam, em que as son- das de referência são designadas com um endereço espectral distinto. Os dife- rentes endereços espectrais são reconhecidos pelo citômetro de fluxo e permi- tem reações multiplex com várias sondas com baixo número de cópias presas a diferentes conjuntos de microesferas. Preparo de alvo qenômico

Padrão genômico (a seqüência de ácido nucléico alvo) foi prepa- rado usando péletes de células fixadas em metanol-ácido acético derivadas de preparados citogenéticos de amostras de medula óssea conforme previ- amente descrito13,20. Diferentes de outros métodos, a seqüência alvo não é pré-selecionada ou amplificada. Portanto, na presente invenção, uma cópia inteira de um genoma (ou transcriptoma) pode ser hibridizada para análise. Dependendo da fonte e da condição da amostra, o DNA (ou RNA) é extraído das células e, se necessário, pode ser replicado in vitro usando qualquer método convencional. De preferência, o ácido nucléico é replicado in vitro usando um kit GenomiPhi (Qiagen, Valencia CA), o qual utiliza menos de um ng de amostra de ácido nucléico e requer um tempo de trabalho efetivo de menos de 20 minutos. O DNA é, então, rotulado através de qualquer meio convencional, de preferência, através de uma etapa de rotulação direta du- rante replicação in vitro ou através de qualquer sistema de rotulação indireta consistindo em um rótulo e uma molécula repórter que tem afinidade por es- se rótulo. O alvo de ácido nucléico é rotulado com um rótulo de identificação, ta| como um fluoroforo, um conjugado enzimático ou um selecionado do gru- po consistindo em biotina ou as porções reconhecidas por avidina, estrepta- vidina ou anticorpos específicos. Existem vários tipos de rótulos de identifi- cação não-isotópicos. Um tipo é um rótulo o qual é quimicamente ligado ao alvo de ácido nucléico e serve como um meio para identificação direta. Um exemplo disso seria uma porção de fIuorocroma a qual, quando de aplicação de radiação com comprimentos de onda apropriados, se tornará excitada em um estado de alta energia e emitirá luz fluorescentes. Nucleotídeos fluores- centes diretamente rotulados, tal como Cy3-dUTP são conhecidos na técnica e seriam formas adequadas de rotulação de DNA alvo para uso com a pre- sente invenção. Outros métodos de rotulação direta de DNA também seriam adequados (um exemplo seria a rotulação com amino- alila comercializada com o método Ulysses (Kreatech, Países Baixos), contudo, em tais casos, o DNA genômico teria de ser fragmentado (através de ultra som, DNAse I, ci- salhamento ou outra digestão enzimática) para um tamanho adequado para hibridização antes de adição do alvo rotulado às microesferas conjugadas à sonda. Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico é diretamente rotula- do durante replicação in vitro usando biotina-dUTP ou digoxigenina-dUTP e a amostra rotulada resultante é submetida ao ultra-som para proporcionar fragmentos de -300 bp de comprimento. O alvo de ácido nucléico também pode ser rotulado através de "nick translation" usando um nucleotídeo modi- ficado ou diretamente rotulado (Rigby e outros, J. Mol. Biol., 113:237-251, 1977) de uma maneira convencional usando um reagente compreendendo o rótulo de identificação de escolha (mas não limitado a) conjugado a um nu- cleotídeo, tal como dUTP ou dATP. Os fragmentos são diretamente rotula- dos com nucleotídeo fluoroforo-marcado ou indiretamente rotulados através de ligação dá dupla rotulada a um anticorpo fluorescentemente rotulado que reconhece um nucleotídeo modificado que é incorporado no fragmento con- forme descrito abaixo. Traduções de nick (100 μΐ_) utilizam DNA polimerase I isenta de endonuclease (Roche Molecular Biochemicals and DNase I (Wor- thington Chemical). Cada fragmento é combinado com DNA polimerase I (4 unidades/ micrograrria de DNA), DNase (0,01- 3 microgramas/ 100 μΙ_ de reação), nucleotídeo rotulado (final de 0,05 mm) e tampão de tradução de nick. A reação é realizada a 15 eC durante 60 minutos e proporciona uma variedade de fragmentos de sonda rotulada de diferentes tamanhos de nu- cleotídeo em uma faixa de tamanho de -300 a 1000 bp. Alternativamente, biotina -dUTP ou digoxigenina-dUTP pode ser incorporada durante o proce- dimento de replicação in vitroe a amostra rotulada resultante pode ser trata- da com DNase I ou cisalhada através de algum outro método para propor- cionar fragmentos com um comprimento de -300 bp a 1 kb. Outros métodos para rotulação e detecção de ácido nucléicos em uso comum podem ser a- plicados à detecção de microesferas conjugadas a DNA com baixo número de cópias do presente método. Esses incluem rótulos de fluorocroma e com- posições fluorescentes, tais como grupos de transferência de energia, prote- ínas conjugadas, anticorpos ou antígenos.

Mais especificamente, um μg de DNA genômico e pUC19 foi n/c/c-traduzido com biotina-16 dUTP para obter produtos de 100 bp - 350 bp e 50 bp - 300 bp de comprimento, respectivamente17. Um μg de cada DNA C0t-1 (dos fabricantes I e R) foi n/c/c-traduzido com digoxigenina-11 dUTP para obter produtos de 50 bp - 300 bp.

Reações de hibridizacão e citometria de fluxo

DNA rotulado (50 ng) foi diluído em 40 pL de 1,5 X tampão de hibridização TMAC (3 mols/L de cloreto de tetrametilamônio, 50 mmols/L de Tris-HCl, pH de 8,0, 1 g/L de Sarkosyl) contendo 10.000 microesferas sonda- acopladas. As reações foram montadas com os componentes listados na tabela 1. <table>table see original document page 28</column></row><table> R produtos recuperados de ensaio de hibridização anterior * Nick-traduzido usando biotina-16 dUTP e detectado usando SPE sobre FL2, 50 ng por reação

Hibridização e detecção de reações foram realizadas conforme previamente descrito^13,20. As condições para a reação de hibridização são dependentes da composição de nucleotídeo em particular e do comprimento de cada sonda com baixo número de cópias e são facilmente determinadas por aqueles versados na técnica. Para hibridização, a seqüência de amostra é diluída em uma solução de tampão de hibridização contendo as microesfe- ras sonda com baixo número de cópias-conjugadas. A quantidade de micro- esferas sonda-conjugadas a ser utilizada dependerá da quantidade de a- mostra testada. De preferência, cerca de 5 pg a 1 μg de amostra, mais pre- ferivelmente cerca de 25-100 ng de amostra, ainda mais preferivelmente cerca de 30-70 ng, ainda mais preferivelmente cerca de 40-60 ng de amostra e, ainda mais preferivelmente, cerca de 50 ng de amostra, são analisados por reação de hibridização. Conseqüentemente, a solução tampão contém, de preferência, cerca de 2.000-10.000 microesferas sonda-conjugadas, mais preferivelmente 2.000-6.000 microesferas sonda-conjugadas, ainda mais preferivelmente cerca de 4.500-5.500 microesferas sonda-conjugadas e, a- inda mais preferivelmente, cerca de 5.000 microesferas sonda-conjugadas para cada conjunto a ser hibridizado. Uma vez diluída, a reação de hibridiza- ção é desnaturada termicamente, de preferência em torno de 95 9C e, então, hibridizada durante a noite em uma temperatura de hibridização adequada, de preferência em torno de 45 a 51 9C, dependendo da composição de nu- cleotídeo e comprimento da sonda. As microesferas hibridizadas são, então, lavadas e centrifugadas para remover a seqüência alvo não hibridizada.

O sobrenadante é removido e a amostra hibridizada é corada ou rotulada com uma quantidade de uma molécula repórter modificada ou outro rótulo adequado, de preferência um o qual atua como um fluorocroma se- cundário, para detectar a amostra rotulada hibridizada às microesferas son- da com baixo número de cópias-conjugadas. As moléculas repórteres prefe- ridas são estreptavidina ficoeritrina-rotulada ou fluoresceína antidigoxigeni- na, as quais detectam e se ligam aos rótulos da seqüência alvo preferidos, biotina e digoxigenina, respectivamente. A amostra hibridizada e rotula- da/corada é incubada na mesma temperatura usada para a reação de hibri- dização, durante um período de tempo suficiente para que a molécula repór- ter detecte e se ligue à seqüência alvo rotulada. Após o que, a amostra é lavada para remover manchas residuais. As amostras são centrifugadas, o sobrenadante removido e as microesferas hibridizadas coradas são resus- pensas em uma quantidade de tampão de hibridização.

Antes de análise através de citometria de fluxo, as amostras hi- bridizadas podem ser diluídas, dependendo das instruções do fabricante do citômetro de fluxo. De preferência, cerca de 2.000-6.000 microesferas de cada conjunto são analisadas por reação, mais preferivelmente cerca de 4.500-5.500 microesferas e, ainda mais preferivelmente, cerca de 5.000 mi- croesferas por conjunto são analisadas por reação. Contudo, a quantidade de amostra a ser analisada pode depender do citômetro de fluxo em particu- lar utilizado para análise. Ajustes de calibração e operação para o citômetro de fluxo podem ser modificados através de uma série de formas sem expe- rimentação indevida, por aqueles versados na técnica, para determinar as faixas ótimas para medição de um ensaio de hibridização em particular. Es- ses parâmetros também dependerão do software empregado para análise. Padrões de glóbulo fluorescente estão amplamente disponíveis e podem ser usados para calibrar a intensidade de diferentes canais de detecção de fluo- rocroma do citômetro de fluxo. O instrumento também pode ser calibrado com padrões de referência fluorescentes baseado em glóbulos superfície- rotulados calibrados em moléculas de unidades de fluorocroma (MESF) so- lúveis equivalentes. Ajustes da voltagem de tubo fotomultiplier (PMT) e limia- res para dispersão dianteira, dispersão lateral, taxa de fluxo e vários canais de detecção deverão ser, de preferência, otimizados para minimizar diferen- ças entre as intensidades de fluorescência de duas sondas diferentes hibri- dizadas a uma única amostra do paciente com um genotipo normal. Parâme- tros de voltagem não-ótimos são prontamente evidentes e resultam em am- plos picos de fluorescência ou dados não-lineares, enquanto que parâmetros ótimos resultam, de preferência, em microesferas hermeticamente agrupa- das com diferentes endereços espectrais quando visualizadas usando uma plotagem de dispersão lateral. De preferência, esses ajustes são determina- dos a partir de medições de fluorescência derivadas de média aritmética, média geométrica, mediana e canal de pico.

As reações foram desnaturadas durante 3 minutos e hibridizadas durante a noite a 50 °C. Microesferas hibridizadas foram lavadas e coradas com molécula repórter, estreptavidina/ficoeritrina (SPE; sondas moleculares) e/ou isotiocianato de fluoresceína anti-digoxigenina (FITC; sondas molecula- res). As amostras hibridizadas foram, então, analisadas através de citrome- tria de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, Califórnia) usando detecção a laser dupla, pelo que o citômetro co-detecta os endereços espec- trais das microesferas e o fluorocroma secundário ligado às seqüências de amostra de forma a identificar e quantificar as sondas hibridizadas. O sinal de cada seqüência de amostra, hibridizado à sua microesfera sonda com- plementar-conjugada, é determinado através de quantificação da intensidade de fluorescência do fluorocroma secundário preso à seqüência de amostra. Endereços espectrais de microesfera compatíveis são selecionados para minimizar sobreposição com os comprimentos de onda de emissão de qual- quer fluorocroma secundário não ligado (molécula repórter). Isso pode ser confirmado através de comparação com os resultados obtidos de microesfe- ras não conjugadas e não hibridizadas de outro modo idênticas. Um controle negativo pode ser também mantido usando um tubo de reação contendo todos os componentes, exceto quanto ao ácido nucléico de amostra, de for- ma a determinar a fluorescência de interferência no canal de detecção de fluorocroma secundário. De preferência, o sistema é submetido a fluxo de água destilada entre as operações para remover quaisquer microesferas residuais.

Aproximadamente 5.000 microesferas foram analisadas por rea- ção. hibridização pode ser quantificada a partir da intensidade média de fluo- rescência por SPE e/ou FITC (medida em canais FL2 e/ou FL1, respectiva- mente), a qual corresponde às quantidades de alvo genômico (FL2) ou de DNA C0t-1 (FL1) ligadas por sonda. Estudos de calibração com sondas con- jugadas e alvos rotulados contendo seqüências idênticas demonstraram que alterações na intensidade média de fluorescência eram linearmente relacio- nadas à quantidade de alvo hibridizado. A fluorescência de interferência dos canais FL1 e FL2 foi separadamente determinada em cada experimento de hibridização usando um controle negativo contendo todos os componentes de reação, exceto DNA alvo.

Voltagens PMT ótimas foram ajustadas conforme descrito ante- riormente; coleta e análise de dados foram realizadas com o software Cell- Quest fornecido pelo fabricante13,20. Ajustes de voltagem ótima do tubo foto- multiplier foram determinados através de seleção de ajustes de voltagem do tubo fotomultiplier que minimizavam diferenças entre as intensidades de fluo- rescência de duas sondas diferentes hibridizadas a uma única amostra de DNA do paciente com um genotipo normal. Esses ajustes foram determina- dos a partir de medições de fluorescência instrumento-derivadas (CellQuest; Becton Dickinson) da média aritmética, média geométrica, mediana e canal de pico. Ajustes típicos de voltagem do tubo fotomultiplier para o instrumento FACSCaIibur foram FSC (dispersão dianteira) = EOO (sem amplificação de sinal), SSC (dispersão lateral) = 344 V, FL1= 727 V, FL2 = 640 V, FL3 = 300 Ve FL4 = 500 V. Limiares para FSC, FL1, FL2 e FL3 foram ajustados no default de 52 V. O limiar de FSC foi selecionado como o parâmetro primário e tinha um valor de 52 V e o parâmetro secundário foi ajustado em SSC com um valor de 125 V. A taxa de fluxo foi ajustada em baixo e o fluido de prote- ção usado era FACsFlow (Becton Dickinson). O sistema foi submetido a flu- xo, entre as operações, com 2-5 mL de água destilada para remover quais- quer microesferas residuais. CelIQuest foi usado para coleta e análise de dados. Análise de dados também foi realizada usando o pacote de citometria de fluxo WinMDI2.8 (WinMDI; J. Trotter, Salk lnstitute, La Jollal Califórnia).

Recuperação de fragmentos de DNA sonda-hibridizados

Alíquotas (35 pL) de hibridizações genômicas com ABLIa (Tabe- la 1: reações 19 e 20) foram lavadas com 250 pL de 0,1 X SSC, SDS a 1 % e peletizadas através de centrifugação (13.000 χ g) e repetido duas vezes. As seqüências genômicas hibridizadas foram desnaturadas termicamente a 95 °C durante 5 minutos e esfriadas aos pedaços, seguido por centrifugação (13.000 χ g) a 4°C durante 3 minutos. Seqüências recuperadas foram usa- das como alvo para QPCR e para hibridização a ABL1AluMER1 microesfera- acoplado (Tabela 1: Reações 21 e 22).

DNA repetitivo sintético

DNA repetitivo sintético foi preparado a partir de regiões genô- micas selecionadas baseado nas famílias de seqüências repetitivas contidas dentro das mesmas, uma vez que cada uma é enriquecida no processo de fabricação de C0M. Contudo, qualquer região genômica representativa con- tendo regiões sc adjacentes a elementos repetitivos com um número mode- rado a alto de cópias poderia ser empregada. Para demonstrar que elemen- tos repetidos em sondas genômicas poderiam ser suprimidos em locais além do intervalo alvo desejado, uma sonda foi preparada contendo um elemento LTR de 1,1 kb centralizado entre duas regiões sc de 400 bp sobre o cromos- soma 4p (chr4:15139704-15141581) localizado a montante do gene C1QTNF7 (Fig. 4, A). Subseqüentemente, seqüências repetitivas situadas dentro da região da sonda ABLa para bloqueio desse elemento repetido fo- ram sintetizadas; ABL1 a do cromossoma 9 contém uma repetição AluJo de 280 bp, uma repetição AIuSx de 300 bp e um segmento de elemento L2 de 830 bp (Fig. 4, C). Um segmento de 2286 bp sobre o cromossoma 17q loca- lizado 5' de HOXB1 contendo uma repetição AIuSx de 306 bp e a seqüência truncada L1 de 154 bp (chrl 7:43963396-43965681) também foi usada como uma sonda (Fig. 4, B). Iniciadores que amplificavam seqüências únicas flan- queando imediatamente esses elementos repetitivos (Tabela 2: ΉΟΧΒ1 AluL1 e C1QTNF7LTR) foram desenvolvidos para amplificação por PCR de cada seqüência repetida e do produto alvo (Tabela 2: HOXBIb e C1QTNF7). Sondas de DNA genômico (Promega) foram amplificadas usan- do Pfx (Invitrogen). Os produtos da amplificação foram submetidos à eletro- forese e extraídos através de centrifugação em uma coluna Micro-spin. As sondas foram conjugadas às microesferas via uma reação com carbodiimida modificada, conforme previamente descrito13·20. Reações de hibridização (Tabela 1: Reações 23-33) avaliaram o efeito dos produtos de PCR repetiti- vos sintéticos hibridizados ao produto de PCR homólogo e/ou DNA genômi- co, na presença e ausência de DNA C"ot-1. As reações foram hibridizadas, lavadas, coradas com SPE e, então, analisadas através de citrometria de fluxo.

PCR Quantitativa

QPCR e análise de dados foram realizadas usando o sistema de PCR quantitativa Chromo4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califórnia). Ini- ciadores e intervalos amplificados foram verificados quanto à representação genômica única usando BLAT18 (encontrado na Internet em geno- me.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat) e BLAST (Tabela 2). O BLAT é uma ferramenta de software de computador que inclui um algoritmo de alinhamento de se- qüência e um índice de seqüências de vertebrado para identificar regiões no genoma humano de provável homologia à seqüência query. O BLAT é uma ferramenta de alinhamento similar ao BLAST, apenas diferentemente estru- turado, uma vez que o BLAT funciona mantendo um índice de um genoma inteiro na memória, enquanto que o banco de dados alvo para o BLAST in- clui coleções de seqüência no GenBank. Cada 50 μL de reação continha 0,5 μΜ de cada iniciador, 50 ng de padrão C"ot-1 ou DNA genômico humano de controle positivo (Promega) e 25 μί de 2X mistura mestre QTSybrG (Qia- gen). DNA genômico foi cortado usando DNAse para gerar fragmentos de 50 bp-300 bp e um controle negativo continha todos os componentes de rea- ção, exceto quanto ao DNA. Condições de ciclização térmica eram 95 °C durante 15 minutos, 45 ciclos de amplificação (94 °C durante 15 segundos, 61 °C durante 30 segundos (aquisição de dados), 72 °C durante 30 segun- dos), seguido por 72 °C durante 5 segundos com uma diminuição na tempe- ratura em 20 °C a cada segundo para a geração de uma curva de fusão. Uma curva de calibração usada para determinar a quantidade de seqüência alvo de entrada no padrão genômico recuperado foi gerada variando as quantidades de padrão genômico normal (1 ng, 2 ng, 4 ng, 10 ng e 20 ng) e através de determinação dos valores de C"T para cada reação.

A composição das seqüências recuperadas de hibridização do produto ABL1a (1 μL; Tabela 1: Reações 21 e 22) foi determinada através de QPCR. Conjuntos de iniciadores utilizaram várias seqüências amplifica- das de dentro da região ABL1, as quais não eram necessariamente homólo- gos a essa sonda, incluindo: ABLta e ABLIc (chr9:130709665-130711469), ABL1d (chr9:130699324-130700596)), bem como iniciadores específicos para outras regiões genômicas não ligadas, tal como DNJA3Alu (c- hr16:4421138-4421200), contendo uma repetição Alu localizada 5' dos ge- nes DNAJ3, TEKT3e HOXB1 (Tabela 2). As reações foram realizadas con- forme descrito acima. Um controle positivo (DNA genômico humano) foi rea- lizado para cada conjunto de iniciador para representar a quantidade inicial de DNA genômico originalmente adicionada às reações QMH (50 ng). Pro- porções molares de seqüências alvo recuperadas de QMH foram determina- das a partir da quantidade de padrão inicial em amostras de teste (interpola- das com seu valor de CT cruzado contra a curva de calibração padrão) na presença e ausência de DNA C0t-1.

<table>table see original document page 35</column></row><table> Tabela 2. Sondas e iniciadores usados nesse estudo <table>table see original document page 36</column></row><table> Tabela 2. Sondas e iniciadores usados nesse estudo Sonda Cromos soma Nome do Ini- ciador Seqüência (5'->3')

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Hibridizacão por fluorescência in situ (FISH)

O método da presente invenção também pode ser utilizado em experimentos de hibridização por fluorescência in situ (FISH). A região alvo para uma sonda FISH pode ser um cromossoma inteiro ou apenas porções do mesmos. Após síntese e rotulação da sonda1516, sondas de hibridização por FISH podem ser incubadas com DNA repetitivo sintético para supressão repetida ao invés de DNA C0t-1 antes de hibridização a cromossomas fixa- dos sobre lâminas. Experimentos comparativos freqüentes preparados com e sem pré-hibridização de sonda usando DNA C0t-1 mostram diferentes si- nais de hibridização da sonda14. FISH sem pré-hibridização da sonda de DNA C0t-1 revela um sinal de sonda mais fraco sobre o cromossoma quando comparado com o experimento FISH sem pré-hibridização de DNA C0t-114. O sinal mais fraco é proveniente de hibridização de seqüências com uma única cópia na sonda para seqüências com uma única cópia presentes no DNA C0t-1. Isso reduz a quantidade de sonda disponível para hibridização à seqüência alvo sobre os cromossomas e, assim, um sinal mais fraco. Contu- do, como uma conseqüência, o experimento sem pré-hibridização de DNA C0t-1 embora com uma intensidade de sinal da sonda mais brilhante, mostra tipicamente hibridizações de prova mais falso positivas, o que resulta em um nível de interferência maior, tornando a análise mais trabalhosa, através de pré-hibridização de sondas com uma fração de DNA repetitivo sintético puro não compreendida de nenhuma seqüência com uma única cópia, quaisquer seqüências repetitivas encontradas na sonda são eficazmente suprimidas, deixando as seqüências com uma única cópia disponíveis para hibridização aos cromossomas. Assim, a intensidade de sinal da sonda sobre o cromos- soma não é comprometida e interferência (sinais falso positivos de hibridiza- ção) é eficazmente minimizada.

Resultados

Hibridização em microesfera quantitativa com DNACnM

Uma sonda de seqüência repetitiva e sc misturada, FISH- validada, ABL1a, da extremidade 5' de IVSIb do gene ABL1 contendo repe- tições AluJo/Sx/L2 divergentes (chr9:130623551-130625854) foi hibridizada com DNA genômico biotina-rotulado13, 20. Embora fosse esperado que DNA C0M comercialmente preparado suprimisse a hibridização de seqüência re- petitiva, em hibridizações repetidas de ABLIa com DNA genômico biotina- rotulado, a intensidade média de fluorescência (ou hibridização) de alvo ge- nômico rotulado foi consistente e significativamente aumentada em 2,2 ve- zes quando C0t-1 foi incluído em hibridizações repetidas de ABLIa com DNA genômico n/c/c-traduzido (Tabela 1: Reações 1 e 2). Sondas sc derivadas de genes do cromossoma 17, PMP22 (Chr17:15073475-15073576) e TEKT3 (Chr17:15149108-15149206), mostraram aumentos menores, mas reprodu- zíveis de 1,08 e 1,14 vezes na intensidade de hibridização na presença de DNA C0t-1 (Tabela 1: Reações 3-6). Esses experimentos sugeriram que os efeitos em virtude de C0t-1 são relacionados à composição de seqüências repetitivas que envolvem esses intervalos sc. Uma sonda sc de HOXB1 (C- hr17:43964237-43964330) exibiu consistentemente uma pequena diminui- ção na intensidade de hibridização com a adição de DNA C0t-1 (Tabela 1, Reações 7-12) com uma diminuição de 0,84-0,92 vezes na intensidade de hibridização para as amostras genômicas testadas. O intervalo HOXB1 é praticamente desprovido de seqüências repetitivas (UCSC Genome Brow- ser, Maio de 2004). A região que circunscreve ABLIa contém elementos Sl- NE interespaçados conservados e abundantes, altamente densos (AluJo, AIuSx) e LINE (L2). Os intervalos TEKT3 e PMP22 contêm classes mais cur- tas, menos abundantes e mais divergentes de elementos repetidos (MIR, MER e L2). O grau até o qual a adição de DNa C0t-1 alterou a hibridização do alvo à sonda ABLIa foi determinado através de comparação de hibridiza- ções de DNA alvo biotina-rotulado (detectado com estreptavidina-ficoeritrina [SPE] no canal FL2), um alvo de controle negativo biotina-rotulado (plasmí- deo pUC19) e cada um desses com DNA C0t-1 digoxigenina-rotulado (detec- tado através de anti-digoxigenina FITC-conjugada no canal FL1). A presença de C0t-1 resultou em um aumento de 2 vezes na intensidade média de fluo- rescência para ABLIa hibridizada à seqüência alvo genômica homóloga bio- tina-rotulada. Contudo, a quantidade de seqüência C0t-1 rotulada ligada ex- cedeu substancialmente aquela necessária para supressão de seqüências repetitivas em ABL1a, baseado em um aumento de 50 vezes na intensidade com relação a reações nas quais seqüências C0t-1 foram omitidas (Tabela 1: Reações 13 e 14). A ligação de C0t-1 parece ser seqüência-específica, uma vez que a hibridização de ABLIa ao pUC19 exibiu sinais de nível de interfe- rência (<101), a despeito de se C0t-1 estava presente (Tabela 1, Reação 15). Essas descobertas sugerem que seqüências homólogas em C0t-1 se ligam diretamente à sonda ABL1a. Em virtude do fato de a seqüência ABLIa pre- sumivelmente representar apenas uma pequena proporção do alvo C0t-1, ela sozinha não pode ser levada em conta para o aumento na hibridização ob- servado.

Para determinar se o sinal aumentado estava relacionado à quantidade de DNA C0t-1, quantidades variadas de DNA C0t-1 digoxigenina- rotulado adicionadas a uma quantidade fixa (50 ng) de alvo genômico bioti- na-rotulado foram hibridizadas à ABL1b, a qual é uma sonda repetitiva e sc misturada. A ABLIb contém duas seqüências repetitivas AIuJo divergentes (chr9:130627353-130628735). Duplicando a quantidade de C0t-1 de 50 para 100 ng na reação, a hibridização de sonda ao C0t-1 aumentou em 1,8 vezes e, ao alvo homólogo, em 1,3 vezes (Tabela 1: Reações 16 e 17). Similar- mente, 150 ng de DNA C0t-1 rotulado aumentaram a hibridização à ABLIa em 3 vezes com relação a 50 ng de C0t-1 e em 1,5 vezes ao DNA alvo (Ta- bela 1: Reações 17 e 18). Mesmo embora a adição estequiométrica de DNA C0t-1 dilua o alvo biotinilado homólogo entre 2 e 4 vezes, a intensidade de hibridização correspondente é inesperadamente aumentada em 1,5 vezes.

A correlação da concentração de Cot-1 com a intensidade de hibridização sugeriu que esse componente de reação promoveu a formação de estruturas duplas contendo outras seqüências além da sonda e do alvo genômico desejado. Para determinar a composição de seqüências derivadas de C0M ligadas às sondas, produtos foram desnaturados e recuperados a- pós hibridização à microesferas ABL1 a-acopladas (Tabela 1, Reações 19 e 20). Esses produtos foram usados como seqüências alvo em subseqüentes hibridizações a uma sonda microesfera-conjugada repetitiva e sc não sobre- posta, ABL1 AluMERI, contendo elementos Alu (AluJb, AIuSq, Charliel e AIuSx) e seqüências MER1 localizadas 2,3 kb centromérica à ABL1a. Dada a localização genômica de ABL1AluMER1, não se esperava que ela estives- se presente nos produtos genômicos n/'c/c-translated recuperados. Contudo, descobriu-se que a fração de Cot-1 rotulado era a fonte da seqüência A- BL1AluMER1 recuperada, baseado em um aumento de 11 vezes na intensi- dade média de fluorescência no canal FL1 (Tabela 1: Reações 21 e 22). Se- qüências repetitivas adjacentes à ABLIa hibridizada em DNA Cot-1 parecem nuclear a hibridização à seqüências genômicas através de formação de re- des de elementos de seqüência repetitiva e com uma única cópia (Fig. 3: Painéis 1 e 2). Essa possibilidade foi avaliada através de análise por PCR quantitativa (QPCR) de seqüências presentes em produtos de hibridização recuperados.

Análise de seqüências hibridizadas através de PCR quantitativa

O teor de seqüências sc em Cot-1 que eram homólogas às nos- sas sondas foi determinado através de QPCR. Sondas e iniciadores usados no estudo são identificados na Tabela 2. Os resultados da análise são mos- trados na Tabela 3. Tabela 3. Quantificação de alvos de hibridização recuperados

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Um segmento sc de 100 bp de ABLIa foi amplificado a partir de 500 ng de amostras de DNA C0t-1 e DNA genômico de controle (Tabela 2). Baseado em seus respectivos valores de CT, as frações de C0t-1 dos Fabri- cantes I e R exibiram um aumento de 14 e 2 vezes, respectivamente, na quantidade de ABLIa hibridizado (ou um aumento de 2,5 e 1,7 molares) com relação à sua composição genômica normal (Tabela 3: Reações 1-3). Se- qüências ABLIa foram recuperadas após hibridização para determinar a composição de seqüências genômicas e derivadas de C0M hibridizadas a essa sonda (Tabela 1: Reações 21 e 22). Seqüências ABLIa foram aumen- tadas em 128 vezes em uma amostra hibridizada contendo DNA alvo e C0t-1 (Tabela 3: Reações 13 e 14). Seqüências recuperadas idênticas à A- BL1AluMER1 de hibridizações contendo C0t-1 eram 139 vezes mais abun- dantes do que aquelas encontradas em reações duplicadas carecendo de C0t-1 (Tabela 3: Reações 15 e 16). Seqüências repetitivas que eram intima- mente relacionadas à ABL1AluMER1 também foram detectadas nos produ- tos de hibridização recuperados. Um elemento Alu com 92% de similaridade, DNJA3AIU (5' ao gene DNJA3] chrl 6:4421138-4421200), foi encontrado na reação de hibridização contendo C0t-1, mas não na reação carecendo de C0t-1, indicando que C0M era a fonte dessa seqüência contaminante (Tabe- la 3: Reações 17 e 18). Outros segmentos genômicos sc (isto é, de CMTtA, HOXB1 e outras regiões ABL 1 (ABL1c e ABLId)) não foram detectados nos produtos recuperados de hibridização à sonda ABL1 a.

Seqüências derivadas de C0t-1 se hibridizaram a RRP4-1.6a, uma seqüência ligada ao ABL 1 (Tabela 2), contendo seqüências sc e repeti- tivas homólogas, a despeito do fato de que essa sonda com uma única cópia tinha sido validada através de FISH4. Elementos repetidos MlR, L2 e L1 mo- derada e altamente abundantes circundavam essa seqüência no genoma. QPCR demonstrou maiores concentrações de seqüências repetitivas recu- peradas de amplicons a montante (51) e jusante (31) com relação a um produ- to RRP4-1.6a curto derivado de dentro do intervalo sc (Tabela 3: Reações 4- 12). Comparação dos valores de Ct indica que seqüências sc delimitadas com repetições genômicas (RRP4-1.6a5' e RRP4-1.6a3') são apenas 6,8 vezes mais abundantes em DNA genômico do que na fração de C0t-1 para o Fabricante R (e, similarmente, para o Fabricante I). Conforme esperado, a seqüência sc RRP4-1.6a interna é consideravelmente mais abundante em DNA genômico do que em C0t-1 (24 vezes) mas, todavia, ela ainda pode ser detectada em C0M (Tabela 3: Reações 7-9). Enriquecimento por SINEs e LINEs durante preparo de C0t-1 resulta em acréscimo de seqüências Ic ou sc ligadas as quais, durante hibridização, podem se anelar potencialmente à sonda conjugada ou à seqüências sc reais no DNA genômico rotulado.

Supressão de hibridização cruzada com DNA repetitivo sintético

O efeito de hibridização de DNA C0t-1 foi revertido em três Ioci genômicos diferentes substituindo um excesso de DNA(s) sintético(s), purifi- cado(s) preparado(s) especificamente a partir dos elementos repetitivos ad- jacentes a seqüências sc (Fig. 4). Um produto da amplificação de 1,9 kb foi sintetizado, contendo um elemento repetitivo semelhante a LTR e uma se- qüência com uma única cópia a montante de C1QTNF7 sobre o cromosso- ma 4. A adição do elemento semelhante a LTR sintético purificado, C1QTNF7LTR, não teve efeito sobre a auto-hibridização desse produto às microesferas acopladas, enquanto que a adição de DNA C0t-1 aumentou a fluorescência média em 1,2 vezes (Tabela 1: Reações 23-25). C1QTNF7LTR foi usado para bloquear a hibridização de DNA genômico n/c/c-translated de seqüências repetitivas na presença e ausência de DNA C0t-1 e obteve resultados similares (Tabela 1: Reações 26-28). A hibridiza- ção de AIuSx e seqüências repetitivas L1 foi suprimida dentro de uma região de -2,3 kb sobre o cromossoma 17 a montante do Iocus HOXB1 (HOXBIb) usando um produto de PCR sintético, HOXB1 AIuLI, contendo essas se- qüências. A hibridização do produto de PCR HOXBIb e a sonda microesfe- ra-acoplada correspondente na presença de H0XB1 AIuLI bloqueou eficaz- mente a seqüência repetitiva dentro do alvo amplificado e, na verdade, redu- ziu a intensidade de hibridização em 0,3 vezes, presumivelmente em virtude da redução no comprimento do alvo (Tabela 1: Reações 32 e 33). A hibridi- zação de seqüências repetitivas também foi eficazmente suprimida em hibri- dizações genômicas comparáveis a ABLIa acoplado à microesferas através da adição de elementos Alu e L2 sintéticos de dentro dessa região alvo (Ta- bela 1: Reações 29-31).

Impacto de Cnt-1 em hibridização de microarranio

A inclusão quase que universal de C0t-1 para supressão de se- qüência repetida em estudos de hibridização publicados levanta a questão de como esse reagerite afeta medidas quantitativas de expressão e/ou nú- mero de cópias genômicas. A variabilidade nas intensidades de hibridização com rótulo duplo foi avaliada através de um conjunto de amostras alvo repe- tidas hibridizadas a arranjos de sondas clonadas em estudos de expressão que utilizavam C0M (dados de fontes do bando de dados GEO: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo). Os resultados foram analisados a partir de sondas de cDNA de genes usados no ensaio de hibridização em microesfera (incluindo ABL1a, H0XB1 e TEKT3), então, subseqüentemente, os perfis de hibridização para várias seqüências genéticas localizadas em ambientes genômicos distinguidos por sua composição de seqüência repeti- tiva, isto é, que eram densamente (Tabela 4, inferior) ou esparsamente (Ta- bela 4, acima) povoadas com seqüências repetitivas. Tabela 4. Variacao entre estudos demicroarranjo reperidos para differentes genes

<table>table see original document page 45</column></row><table> As proporções de intensidade Cy3/Cy5 repetidas são significati- vamente mais variáveis para seqüências que ocorrem dentro de intervalos genômicos repetidos-densos com relação a sondas derivadas de regiões genômicas contendo menos seqüências repetitivas divergentes. Por exem- pio, descobriu-se que ABL1 exibe expressão aumentada e diminuída usando a mesma amostra de teste em diferentes réplicas (por exemplo, registro em banco de dados GDS751/20213, o qual mostra uma variância de amostra de 0,30 e p=0,18; Tabela 4), análogo à distorção em hibridização qüe foi obser- vada com ABLIa microesfera-conjugado. Em contraste, HOXB1 mostrou pouca variabilidade nas intensidades de proporção Iog entre estudos de ar- ranjo de expressão repetidos usando a mesma amostra de teste (GDS223/31555; variância da amostra = 0,001 e p<0,0001), consistente com esses resultados para esse locus. Isso sugere que seqüências com uma ú- nica cópia em C0t-1 se hibridizam às sondas, nucleando a formação de re- des misturadas de seqüências Ic e repetitivas que capturam seqüências re- petitivas rotuladas do cDNA alvo. Em estudos de microarranjo, C0t-1, assim, distorce a hibridização de sondas clonadas enriquecidas por seqüências re- petitivas interespaçadas através de formação de redes de hibridização com- plexas de uma maneira análoga àquela observada em QMH. Discussão

As análises acima descritas demonstraram que seqüências não repetitivas presentes em DNA C0t-1 podem alterar significativamente a quan- tidade de alvo genômico rotulado detectado em reações de hibridização com sondas homólogas. Ao invés de supressão de hibridização cruzada, o C0t-1 intensificou a hibridização a sondas contendo seqüências repetitivas em tan- to quanto 3 vezes. Os resultados sugerem que seqüências de DNA C0t-1 não rotuladas ligam em ponte seqüências Ic e repetitivas em sondas se- qüência-específicas e seqüências alvo complementares. Seqüências repeti- tivas ligadas a seqüências Ic homólogas na fração de C0t-1 podem nuclear a subseqüente hibridização de seqüências repetitivas rotuladas em alvos ge- nômicos. A adição de DNA C0t-1 às hibridizações de sonda com padrãos genômicos rotulados catalisa a formação de uma rede de heteroduplas ho- mólogas à sonda e em qualquer lugar no genoma (Fig. 3, exemplo 2). Du- plas "parciais" contendo seqüências repetitivas e Ic (Fig. 3, exemplo 3) são facilitadas pela adição de DNA Cot-1 através de alvos genômicos Ic rotulados a elementos repetitivos ligados (Fig. 3, exemplo 4). Seqüências repetitivas rotuladas ligadas à seqüências de DNA alvo genômico Ic podem também alterar as intensidades de hibridização, mas não até o mesmo ponto em que o Cot-1, em virtude de seu enriquecimento por seqüências repetitivas inte- respaçadas e Ic.

Desde o advento de tecnologias de CGH de microarranjo e arra- nho, muitos pesquisadores têm observado preocupações a respeito da re- produtibilidade experimental4,5. Talvez, a maior fonte de variação com rela- ção à hibridização cruzada provenha de seqüências repetitivas7. Contudo, muitos pesquisadores acreditam que esse problema é dirigido por elementos de bloqueio repetitivos com DNA C0t-1 antes de hibridização de cDNA a um arranjo6,7. Dong e outros19 descobriram que "algumas regiões de seqüências não repetitivas eram suficientemente homólogas à seqüências repetitivas para se hibridizarem à fração de DNA C0t-1 humano" e propuseram que isso era responsável pelas intensidades de hibridização desviadas em seus re- sultados de microarranjo. O C0t-1 afeta a reprodutibilidade de ensaios de hibridização promovendo a formação de ligações em ponte de seqüências repetitivas entre sondas e alvos genômicos rotulados não relacionados. Ele também contém seqüências Ic e se que competem com os alvos rotulados por sítios na sonda. Uma análise ampla mais extensiva do genoma identifica outras regiões genômicas que são mais prováveis de serem suscetíveis a essa fonte de erro sistemático.

O componente repetitivo em DNA C0t-1 é fracionado baseado na cinética de re-associação ao invés de ser explicitamente definido baseado na composição de seqüência. Em virtude do fato de que ele não é contami- nado com seqüências Ic1 DNA repetitivo sintético seqüência-definido é mais eficaz no bloqueio de hibridização cruzada por seqüências repetitivas em sondas a alvos genômicos repetitivos parálogos. Outra vantagem de um re- agente sintético locus-específico é que famílias repetidas que estão sub- representadas na fração de DNA Cot-1 ou não representadas em virtude de divergência de seqüências repetitivas, podem ser sintetizadas, proporcio- nando um repertório mais preciso e compreensivo de seqüências repetidas genômicas isentas de seqüências sc.

Todavia, substituição de Cot-1 por um reagente de DNA repetiti- vo sintético que representa compreénsivamente todos os elementos repetiti- vos conhecidos por todo o genoma é provavelmente excluído baseado no custo e desafios logísticos inerentes a seu preparo. Pode ser possível pro- cessar Cot-1 adicionalmente de forma a limitar a quantidade de seqüências sc contaminantes que estão presentes. Seqüências repetitivas re-aneladas as quais compreendem a maioria do DNA de filamento duplo em Cot-1 são ligadas à seqüências de filamento simples as quais são, em si, compreendi- das de componentes repetitivos com uma única cópia e não sobrepostos. Tratamento dessas estruturas de filamento duplo e simples misturadas com uma exonuclease obrigatoriamente processadora, tal como Mung Bean Nu- clease ou Lambda Exonuclease, apararia seqüências de filamento simples que se projetam do DNA duplo. Essas enzimas não clivariam em nucleotí- deos erroneamente combinados, os quais são comuns dentre membros re- lacionados da mesma família de seqüência repetitiva, dentro de intervalos com gaps filamento simples separados por seqüências de base emparelha- das ou em nicks na dupla. Esse procedimento irá digerir seqüências repetiti- vas de filamento simples e intervalos com uma única cópia. Isso terá um im- pacto particular na representação de elementos repetitivos os quais mos- tram, comumente, truncamento genômico 5' (ou 3'), tal como observado nos retrotransposons L111. Perda dessas seqüências poderia ser atenuada atra- vés da adição dos reagentes de DNA sintético correspondentes. Deverá ser notado que esse tratamento de DNA Cot-1 não eliminará completamente to- das as seqüências sc em virtude da possibilidade de que as seqüências sc tenham se reanelado, contudo, a formação de tais duplas não seria favoreci- da pela cinética da reação.

À luz do acima, substituição de um reagente de bloqueio parcial ou completamente sintético composto de seqüências repetitivas definidas em lugar de DNA C^ot-1 melhoraria a reprodutibilidade de hibridização genô- mica comparativa em microarranjo e arranjo para expressão. Isso, por fim, levaria à padronização de condições experimentais nesses procedimentos amplamente usados.

Referências

Os materiais de referência a seguir são aqui incorporados por referência.

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<120> MITIGATION OF Cot-I DNA DISTORTION IN NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION

<i30> 36663-PCT

<150> 60/737,986

<151> 2005-11-18

<160> 26

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gtggcttatg cctgtaattt caca 24

<210> 2 <211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

agagacaggg tcttcttatg ttgc 24

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atttggaaag attatatcca tctacttaat gc 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 4

acaaacctac ctacgtttca acactctctt 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

gctttatgaa ctagctgatt tagtttgctc 30

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ctcaatctct cttttatctg ttttgtccat tg 32

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

tagttaattt agaaggttta aatcacgaga a 31

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

ctaattttta aatgtgtgaa tgcaatttt 29

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 9 cagaggaagg aagacgtagt gaac

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gctgaaccaa gcagacacag

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

atgggagctt ggataagaga tg

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

ctataccctg aggcgataat gttc

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13 agcagatcag acataçaggt ccaa

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 14 ggccaccgta agttacaaga cc <210> 15 <211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 12 carbonos e uma amina são conjugados na extremidade 5

<400> 15

cctcttcggg gtagagtttc gctct 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16 ctcaggccct tgtcacactc ttgaa 25

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

ctcctgtccg tgttctctgc 25

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

aggctggtag tgacctgtgg 25

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19 tcacccccat tgcatctatt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> biotina conjugada na extremidade 3

<400> 20

taggaagggg gtagggagtg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<40Ò> 21

tcacccccat tgcatctatt 2 0

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

tcccaaagtg ctaggattgc 20

<210> 23

<211> 24

<2l2> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

tgcaattcaa aacagattga aaat 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> bioton conjugated to the 3 prime end

<400> 24 ccaccatgtg agaagtttga ctac

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25 aagtgtgaaa ggcatatttt agcc

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

tacattttgg ggtcatttgt tatg

Claims (30)

1. Método de supressão de hibridizãção cruzada não-específica entre seqüências repetitivas presentes em sondas de ácido nucléico e se- qüências repetitivas homólogas em ácido nucléico genômico alvo, o referido método compreendendo as etapas de: identificação de seqüências repetitivas em uma região genômica representativa; síntese de ácido nucléico supressivo derivado das referidas se- qüências repetitivas identificadas, o referido ácido nucléico supressivo sendo substancialmente desprovido de seqüências de baixa cópia; e reação do referido ácido nucléico supressivo com um ácido nu- cléico alvo, desse modo, fazendo com que as seqüências repetitivas no refe- rido ácido nucléico supressivo se hibridizem a seqüências repetitivas homó- logas no referido ácido nucléico alvo, pelo que as referidas seqüências repetitivas no referido ácido nucléico alvo são substancialmente bloqueados de hibridizãção com se- qüências repetitivas homólogas em uma sonda de ácido nucléico subse- qüentemente reagida, desse modo, suprimindo a hibridizãção cruzada não- específica entre as referidas seqüências repetitivas na referida sonda e se- qüências repetitivas homólogas no referido ácido nucléico alvo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ácido nucléico alvo compreende seqüências de baixa cópia.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ácido nucléico supressivo é sintetizado para conter uma pluralidade de se- qüências repetitivas selecionadas para corresponder à seqüências repetiti- vas encontradas adjacentes à seqüências de baixa cópia em uma ou mais regiões genômicas representativas.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ácido nucléico supressivo é sintetizado de modo a ser completamente des- provido de seqüências de baixa cópia.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a etapa adicional de hibridizãção do referido ácido nucléico alvo com uma ou mais sondas contendo seqüências de baixa cópia homólogas à seqüências de baixa cópia no referido alvo.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida sonda é substancialmente desprovida de seqüências repetitivas.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida sonda é completamente desprovida de seqüências repetitivas.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, ainda compreen- dendo a etapa de conjugação da referida sonda a uma microesfera de poli- estireno espectralmente codificada.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a etapa de rotulação da referida sonda com uma porção detectável.

10. Método de acordo com a reivindicação 9 em que a referida porção é selecionada do grupo consistindo em fluoroforos, conjugados en- zimáticos, nucleotídeos fluoroforo-rotulados, anticorpos fluorescentemente rotulados ligados a nucleotídeos trazendo antígeno, biotina-dUTP, digoxige- nina-dUTP e combinações dos mesmos.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ácido nucléico supressivo é usado para bloquear seqüências repetitivas em um ensaio selecionado do grupo consistindo em ensaios de hibridização em microarranjo, ensaios de hibridização por fluorescência in situ e ensaios de hibridização em microesfera.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ácido nucléico supressivo compreende um ou mais produtos de PCR se- qüência-definidos selecionados do grupo consistindo em elementos curtos interespaçados, elementos longos interespaçados, repetições terminais lon- gas, elementos Alu, elementos L1 e transposons de DNA.

13. Método de síntese de ácido nucléico de supressão compre- endendo as etapas de: identificação de seqüências repetitivas em uma região genômica representativa; e síntese do referido ácido nucléico de supressão através de sín- tese de seqüências de ácido nucléico passíveis de hibridização com as refe- ridas seqüências repetitivas, mas não passíveis de hibridização com se- qüências de baixa cópia próximas ou dentro da referida região genômica representativa.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido ácido nucléico de supressão sintetizado é substancialmente isento de se- qüências de baixa cópia.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, ainda compreen- dendo a etapa de seleção de determinadas seqüências repetitivas identifica- das para síntese como o referido ácido nucléico de supressão baseado em sua proximidade a uma seqüência de baixa cópia de interesse.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que determi- nadas seqüências repetitivas identificadas estão mais próximas à referida seqüência de baixa cópia de interesse.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o referido ácido nucléico de supressão sintetizado é isento de seqüências que são passíveis de hibridização com a referida seqüência de baixa cópia de inte- resse.

18. Método de acordo com a reivindicação 13, ainda compreen- dendo a etapa de uso do referido ácido nucléico supressivo sintetizado em um ensaio de hibridização.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido ensaio é hibridização é selecionado do grupo consistindo em fluorescência em ensaios de hibridização in situ, ensaios em microarranjo e ensaios de hibridização em microesfera.

20. Método de aumento de especificidade de hibridização entre sondas de ácido nucléico com baixo número de cópia e regiões homólogas em um ácido nucléico alvo, o referido método compreendendo as etapas de: hibridização de elementos repetitivos no referido ácido nucléico alvo com elementos repetitivos homólogos em um ácido nucléico supressivo, o referido ácido nucléico supressivo compreendendo uma pluralidade de e- lementos repetitivos e sendo substancialmente desprovido de elementos com baixo número de cópia; e hibridização de elementos com baixo número de cópia no referi- do ácido nucléico alvo com elementos homólogos com baixo número de có- pia em uma ou mais das referidas sondas de ácido nucléico.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que os referi- dos elementos repetitivos no referido ácido nucléico supressivo são selecio- nados por terem homologia substancial a elementos repetitivos que flan- queiam elementos de baixa cópia em uma ou mais regiões genômicas re- presentativas.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que os referi- dos elementos repetitivos de fIanqueamento são de um número de cópia baixo a moderado.

23. Método de acordo com a reivindicação 20, em que os referi- dos elementos de baixa cópia compreendem elementos com uma única có- pia.

24. Método de acordo com a reivindicação 20, em que as referi- das sondas são substancialmente desprovidas de elementos repetitivos.

25. Método de quantificação precisa de números de cópias de seqüência de ácido nucléico, o referido método compreendendo as etapas de: preparo de uma primeiro microesfera fluorescente especialmen- te codificada tendo um primeiro endereço espectral e uma segunda microes- fera fluorescente espectralmente codificada tendo um segundo endereço espectral; identificação de uma seqüência de sonda de ácido nucléico ge- nômico alvo através de determinação da seqüência de nucleotídeo por nu- cleotídeo de uma seqüência de ácido nucléico alvo em que se suspeita que a seqüência de interesse reside; síntese de uma sonda-alvo com baixo número de cópia derivada da referida seqüência de sonda de ácido nucléico genômica alvo identifica- da, a referida sonda-alvo compreendendo pelo menos um elemento com baixa cópia e sendo substancialmente desprovida de elementos repetitivos; conjugação da referida sonda alvo à referida primeira microesfe- ra; síntese de uma sonda de referência selecionada para se hibridi- zar a uma seqüência de ácido nucléico de referência da referida seqüência de ácido nucléico alvo; conjugação da referida sonda de referência a uma microesfera tendo um segundo endereço espectral; identificação de seqüências repetitivas em uma região genômica representativa; síntese de ácido nucléico supressivo, o referido ácido nucléico supressivo compreendendo seqüências de homologia suficiente para se hi- bridizar às referidas seqüências repetitivas identificadas, o referido ácido nucléico supressivo compreendendo substancialmente elementos repetitivos e sendo substancialmente desprovido de elementos de baixa cópia; reação do referido ácido nucléico supressivo com uma seqüên- cia alvo cromossômica, desse modo, fazendo com que os elementos repeti- tivos no referido ácido nucléico supressivo se hibridizem com elementos re- petitivos homólogos na referida seqüência alvo cromossômica; reação da referida sonda alvo à referida seqüência alvo cromos- sômica, desse modo, fazendo com que elementos de baixa cópia na referida sonda alvo se hibridizem a elementos homólogos de baixa cópia na referida seqüência alvo cromossômica; reação do referido ácido nucléico supressivo com uma seqüên- cia de referência cromossômica contendo a referida seqüência alvo cromos- sômica, desse modo, fazendo com que elementos repetitivos no referido á- cido nucléico supressivo se hibridize a elementos repetitivos homólogos na referida seqüência de referência cromossômica; reação da referida sonda de referência com a referida seqüência de referência cromossômica, desse modo, fazendo com que a referida son- da de referência se hibridize à referida seqüência de referência cromossômi- ca; detecção da sonda alvo hibridizada via o referido primeiro ende- reço espectral; detecção da sonda de referência hibridizada via o referido se- gundo endereço espectral; e quantificação da sonda alvo detectada através de comparação da resposta da sonda alvo hibridizada detectada com a resposta da sonda de referência hibridizada detectada.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido DNA supressivo compreende elementos repetitivos, os referidos elementos repetitivos correspondendo a elementos repetitivos genômicos adjacentes a elementos de baixa cópia no referido alvo.

27. Método de supressão de hibridização cruzada não-específica entre elementos repetitivos presentes em sondas de ácido nucléico e ele- mentos repetitivos homólogos em ácido nucléico alvo, o referido método compreendendo a etapa de: hibridização de ácido nucléico supressivo, o referido ácido nu- cléico supressivo sintetizado para conter uma pluralidade de elementos re- petitivos selecionados para corresponder a uma ou mais regiões genômicas representativas contendo regiões com uma única cópia adjacentes ao ele- mento repetitivo com número moderado a alto de cópias e sintetizado para ser substancialmente desprovido de elementos de baixa cópia, com elemen- tos repetitivos homólogos em um ácido nucléico alvo contendo um ou mais elementos de baixa cópia; hibridização adicional do referido ácido nucléico com uma ou mais sondas contendo elementos de baixa cópia homólogos a elementos de baixa cópia no referido alvo, as referidas sondas sendo substancialmente desprovidas de seqüências repetitivas.

28. Método de supressão de hibridização cruzada não-específica entre elementos de baixa cópia presentes em ácido nucléico supressivo e elementos de baixa cópia homólogos em sondas de ácido nucléico ou ácido nucléico alvo, o referido método compreendendo as etapas de: identificação de elementos repetitivos e de baixa cópia dentro e próximo do referido ácido nucléico alvo; síntese de seqüências de ácido nucléico supressivo através de seleção de seqüências repetitivas do referido ácido nucléico alvo para inclu- são no referido ácido nucléico supressivo, enquanto se evita substancial- mente a inclusão de seqüências de baixa cópia no referido processo de sín- tese; e reação do referido ácido nucléico supressivo sintetizado com o referido ácido nucléico alvo, de modo que o respectivo ácido nucléico su- pressivo homólogo e elementos de ácido nucléico alvo se hibridizem uns com os outros.

29. Método de aumento da precisão e reprodutibilidade de en- saios usando DNA de Cot-1 compreendendo as etapas de: seleção ou síntese de ácido nucléico de supressão que inclui uma pluralidade de elementos repetitivos, mas é substancialmente isento de seqüências de baixa cópia; e uso do referido ácido nucléico de supressão selecionado ou sin- tetizado em lugar de DNA de Cot-1.

30. Método de supressão de hibridização adventícia de ácido nucléico alvo genômico com uma sonda de ácido nucléico compreendendo as etapas de: preparo de ácido nucléico alvo genômico para hibridização atra- vés de seleção de uma seqüência ou seqüências no genoma corresponden- do a uma seqüência de interesse; identificação de seqüências de baixa cópia dentro das referidas seqüências alvo de interesse; síntese de sondas de baixa cópia homólogas às referidas se- qüências alvo de baixa cópia identificadas, as referidas sondas de baixa có- pia substancialmente desprovidas de seqüências repetitivas; identificação de seqüências repetitivas adjacentes às referidas seqüências alvo de baixa cópia; síntese de DNA de supressão homólogo às referidas seqüências alvo repetitivas, o referido DNA de supressão compreendendo substancial- mente elementos repetitivos; reação do referido ácido nucléico alvo com o referido DNA de supressão de modo que os referidos elementos repetitivos no DNA de su- pressão se hibridizam a elementos repetitivos homólogos no ácido nucléico alvo; reação do ácido nucléico alvo com sondas de baixa cópia para se hibridizar a elementos de baixa cópia dentro das referidas sondas a ele- mentos homólogos de baixa cópia no referido ácido nucléico alvo; e detecção das referidas sondas de baixa cópia para quantificar a hibridização da referida sonda ao referido alvo, pelo que casos de elementos de baixa cópia dentro do referido ácido nucléico alvo podem ser determina- dos.