CN104136611B - 核酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
公开了在不使用核酸扩增和/或增感技术、通过夹心杂交来检测目标核酸的情况下,也可以高灵敏度地检测目标核酸的核酸的检测方法。目标核酸的检测方法包括:使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触,使捕捉探针与目标核酸或其片段化处理物杂交,并且使目标核酸或其片段化处理物与多种检测探针杂交,由此介由捕捉探针和目标核酸或其片段化处理物而使多种检测探针结合于支持体的工序;接着检测结合于支持体的多种检测探针的工序。
Description
技术领域
本发明涉及核酸的检测方法。
背景技术
各种生物的遗传信息分析的研究已经开始,关于以人类基因为首的大量基因及其碱基序列、还有由基因序列所编码的蛋白质和由这些蛋白质二次加工成的糖链的信息正在迅速被阐明。对于序列被阐明的基因、蛋白质、糖链等高分子体的功能,可以通过各种方法来调查。作为主要的方法,对于核酸,可以利用RNA印迹(northern bloting)、或者DNA印迹(southern bloting)这样的各种核酸/核酸间的互补性来调查各种基因与其生物体功能表达的关系。对于蛋白质,可以利用以蛋白质印迹(western bloting)为代表的蛋白质/蛋白质间的反应来调查蛋白质的功能和表达。
作为核酸检测方法之一,已知夹心杂交法。夹心杂交法使用被固定于过滤器上的捕捉探针。捕捉探针与目标核酸的第1部分互补。在一个阶段中,使结合于过滤器的捕捉探针暴露于应对于目标核酸序列进行调查的样品,进一步暴露于与目标核酸的第2部分互补的带有标记的检测探针,但前述的第2部分与第1探针所互补的目标部分不同(即,与它们不重复)(专利文献1、2、非专利文献1)。该方法解除了在过滤器上固定化样品所需的工夫,另外可以选择第1探针使其适合支持体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利第4,486,539号
专利文献2:日本特开平7-75600号公报
专利文献3:日本特表平9-507121号公报
专利文献4:WO 99/47705
非专利文献
非专利文献1:Sinikka Parkkinen et al.,Journal of Medical Virology20:279-288(1986)
发明内容
发明要解决的课题
夹心杂交法一般在事先使用PCR法等核酸扩增技术将样本扩增之后进行检测。通过扩增目标核酸而检测灵敏度被增强,但另一方面,由于混入的杂质DNA也被扩增,因而不仅产生假阳性的担心,而且在同时检测多种基因时,需要相应于基因数的引物组,其品质管理需要大量的劳力。
另一方面,也研究了多种不通过PCR法扩增目标核酸而进行检测的方法。下工夫研究了使目标核酸与捕捉探针杂交后,以标记体或者标签序列为基础,收入大量的发光体、或者荧光体等的增感技术,但是需要特殊的酶和/或复杂的反应、或特殊的支持体(平面光波导等)和/或特殊的发光体(提供能够通过瞬时性激发发光来检测的信号的标识(专利文献4)。
本发明的目的是,提供即使在不使用核酸扩增和/或增感技术而通过夹心杂交来检测目标核酸的情况下,也能够高灵敏度地检测目标核酸的核酸的检测方法。
用于解决课题的方法
本申请发明者们进行了深入研究,结果发现,在夹心杂交中,通过使与目标核酸的不同区域分别杂交的多种检测探针同时杂交,即使不使用核酸扩增和/或增感技术也可以高灵敏度地检测目标核酸,从而完成了本发明。
即,本发明提供以下(1)~(11)。
(1)目标核酸的检测方法,包括:
使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触,使所述捕捉探针与所述目标核酸或其片段化处理物杂交,并且使所述目标核酸或其片段化处理物与所述多种检测探针杂交,由此介由所述捕捉探针和所述目标核酸或其片段化处理物而使所述多种检测探针结合于所述支持体的工序;和
检测结合于支持体的所述多种检测探针的工序。
(2)根据(1)所述的方法,所述使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触的工序如下依次进行:使所述目标核酸或其片段化处理物与多种检测探针杂交,接着使与所述多种检测探针杂交了的所述目标核酸或其片段化处理物与所述捕捉探针杂交。
(3)根据(1)或(2)所述的方法,与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物的核酸长度的众数在100个碱基~1500个碱基的范围。
(4)根据(1)~(3)的任一项所述的方法,在与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为1500个碱基的范围内,使多种检测探针杂交。
(5)根据(1)~(3)的任一项所述的所述的方法,在与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为该目标核酸或其片段化处理物的核酸长度的众数以下的范围内,使多种检测探针杂交。
(6)根据(1)~(5)的任一项所述的方法,使目标核酸的片段化处理物与所述捕捉探针杂交,所述目标核酸的片段化处理物是以核酸长度的众数包含在100个碱基~1500个碱基的范围内的方式将目标核酸进行片段化处理而得到。
(7)根据(1)~(6)的任一项所述的方法,与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸或其片段化处理物,是没有经过利用核酸扩增法的扩增的目标核酸或其片段化处理物。
(8)根据(1)~(7)的任一项所述的方法,将包含所述目标核酸的来源于动物的样本供于所述检测方法,该检测方法还包含以存在于动物基因组中的至少1种重复序列作为内标进行检测的工序,该重复序列包含于动物基因组片段中。
(9)根据(8)所述的方法,还包含将所述动物基因组进行片段化的工序,所述重复序列包含于被片段化后的动物基因组中。
(10)根据(8)或(9)所述的方法,所述重复序列是短分散型核内重复序列。
(11)根据权利要求(10)所述的方法,所述短分散型核内重复序列是Alu序列。
发明的效果
根据本发明,即使不使用PCR法这样的核酸扩增、或增感技术,也可以高灵敏度地进行核酸检测。
附图说明
图1是用于说明本发明的方法的原理的概念图。
图2是显示核酸长度分析的例子的图。
图3是显示实施例1中的捕捉探针和检测探针的位置的概念图。
图4是显示实施例2中的捕捉探针和检测探针的位置的概念图。
图5是突变分析中的夹心杂交的概念图。
图6是显示实施例3和实施例4中的、k-ras突变捕捉探针和检测探针的位置的概念图。
图7是显示实施例3和实施例4中的、EGFR突变捕捉探针和检测探针的位置的概念图。
图8是显示作为内标使用来源于人的样本中所含的人基因组中的Alu序列来进行本发明的方法的实施方式的模式图。
具体实施方式
作为供于本发明的检测方法的目标核酸,可列举例如,病原菌和/或病毒等的基因、遗传病的病原基因等及其一部分等,但不限于这些。另外,作为包含这些目标核酸的样本,可列举血液、血清、血浆、尿、便、脑脊液、唾液、粘液、各种组织液等体液、和/或各种组织、石蜡包埋样本(FFPE)及其切片、各种饮食物以及它们的稀释物等,但不限于这些。另外,成为被检物质的目标核酸可以是从血液和/或细胞通过常规方法提取的样本核酸,也可以使用从样本提取的DNA和/或RNA等。作为DNA,可以使用染色体DNA,病毒DNA,细菌、霉等的DNA,将RNA进行逆转录而得的cDNA,作为它们的一部分的片段等,但不限于这些。作为RNA,可以使用信使RNA,核糖体RNA,小RNA(small RNA)和/或作为它们的一部分的片段等,但不限于这些。另外,化学合成的DNA、或者RNA等也可以作为目标核酸使用。
样本核酸有时还包含除了作为测定对象的目标核酸以外的核酸成分(非目标核酸)。这些非目标核酸既可以考虑与目标核酸的性状的差而除去,也可以不除去地作为被检物质使用。
目标核酸也可以是以该目标核酸作为模板通过PCR等核酸扩增法进行扩增而得的,可以大幅提高测定灵敏度。在以核酸扩增产物作为目标核酸的情况下,通过在用荧光物质等进行了标记的核苷三磷酸的存在下进行扩增,可以将扩增核酸进行标记。本来,通过本发明的方法,即使不使用核酸扩增法也可以以充分的灵敏度进行目标核酸的检测,而且如果使用核酸扩增法则产生假阳性的问题和/或操作花费工夫等问题,因此,本发明在应用于未经过利用核酸扩增法的扩增的目标核酸或其片段化处理物的情况下特别发挥威力。
本发明的方法可以在区别目标核酸的有无、病毒的基因型、细菌的种和株、霉的种和株等的检测、SNP(单碱基多态性)的检测、信使RNA的检测、miRNA的检测、CGH、拷贝数变化、基因组DNA序列的缺失·重复·融合、或者转录产物的缺失·重复·融合的检测中使用。另外,通过测定来自检测探针的信号强度,还可以应用于目标核酸的定量。此外,如果进行目标核酸的定量,则必然要进行目标核酸的检测,因此本发明的“检测方法”也包含伴随定量的情况。
本发明的方法中可以直接应用目标核酸,也可以应用目标核酸的片段化处理物。本来,在目标核酸较长的情况(1500个碱基以上、特别是4000个碱基以上的情况)下,优选应用通过片段化处理而片段化成如后述那样适当的长度而得的片段化处理物。片段化处理物不需要从产生的核酸片段中选择特定的核酸片段,可以将片段化处理物直接供于本发明的方法,从而可以提高检测灵敏度。
作为为了片段化而将目标核酸切断的方法,可以使用照射超声波而切断的方法、用酶切断的方法、用限制性酶切断的方法、使用雾化器的方法、用酸和/或碱切断的方法等。在用超声波切断的方法的情况下,可以通过控制照射于目标核酸的超声波的输出强度和照射时间来切断成所期望的长度。
处理后的目标核酸可以使用以下所述的电泳法等分析方法来分析片段化的程度。如果分析的结果是超声波处理不充分,则可以进一步实施超声波处理,进行处理直至得到所期望的条件的目标核酸。作为超声波处理装置的例子,可以例示アコースティックソルビライザー(コバリス社)、バイオラプター(东湘电气)、超声波式匀浆器(タイテック社、VP-050)等。コバリス社アコースティックソルビライザーS220通过设定Duty Factor、Peakincident power,Cycles per burst,time的4个参数,可以切断至所期望的长度。在想要使核酸长度的众数为400个碱基时,可以将Duty Factor设定为10%、Peak incident power设定为140,Cycles per burst设定为200,time设定为55。想要切断成其他长度时,按照コバリス社的推荐设定即可。
作为用酶切断的方法,可以使用dSDNAshearase(双链DNA剪切酶,ザイモリサーチ社)和/或限制性酶等,通过加温时间的加减来获得所期望的长度的核酸片段。作为一例,在使用dSDNAshearase时,按照制造商推荐的加温时间即可。例如,想要使核酸长度的众数为300个碱基时,在37℃孵育40分钟即可。对于其他的DNA切断方法,也同样可以通过加 减处理的条件来控制切断片段的长度。
片段化处理后的目标核酸可以以核酸长度的众数为指标进行评价。核酸长度的众数是指对片段化后的核酸使用琼脂糖凝胶电泳和/或生物分析仪(アジレント社、DNA7500Kit、RNA6000nanoKit)这样的电泳法得到的峰顶值。将电泳的结果用电泳图谱表示,以波形最高的位置为峰顶,将从峰顶落下的垂线与x轴的交点的值定义为核酸长度的众数。核酸长度的分析方法可以参照日本特许4619202等。在通过琼脂糖凝胶电泳进行分析的情况下,可以使DNA Ladder(梯状条带)(タカラバイオ社型号:3415A等)同时泳动,以其迁移率为指标,测定切断片段的峰顶。图2A是Ladder标志物与切断的核酸的琼脂糖凝胶电泳图像。将该图像使用像NIH Image(NIH)这样的图像处理软件,用波形表示亮度。此时,对于每个Ladder标志物求出距离电泳的原点的距离。在切断的核酸的情况下,求出至峰顶、即亮度最高的部分的距离。以从Ladder标志物得到的距离为基础,得到如图2C所述那样的标准曲线和回归方程。通过在回归方程中代入距离Y,可以求出切断的目标核酸的众数。如以上进行分析,则图2中使用的切断的目标核酸的核酸长度的众数为158个碱基。
波形的形状可以是怎样都可以,与宽阔的相比,锋利的产生更好的结果。
通过上述的各种方法,可以获得具有所期望的核酸长度的众数的切断片段。核酸长度的众数的优选范围为100个碱基~1500个碱基之间。更优选的范围为250个碱基~500个碱基。
即使在使用混入了非目标核酸的被检物质的情况下,也可以与上述同样地实施片段化处理,评价核酸长度的众数。
支持体可以使用载玻片和/或膜、珠等。对支持体的材质不特别限定,可列举玻璃、陶瓷、硅等无机材料、聚对苯二甲酸乙二醇酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅胶等聚合物等。这样,通过本发明,可以使用一直以来在本领域常用的支持体,不需要使用像平面光波导那样的特殊支持体。从成本方面和/或避免复杂性的观点出发,支持体 优选不是平面光波导。
捕捉探针是指能够直接与受试样品所含的目标核酸地选择性地结合的物质。在本发明的目标核酸的检测方法中,具体可以使用DNA、RNA、PNA、LNA(锁核酸,Locked NucleicAcid)等的核酸衍生物。这里衍生物在核酸的情况下,是指被荧光基团等标识化的衍生物、包含修饰核苷酸(例如受到包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸和碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的替换等的核苷酸等)的衍生物等化学修饰衍生物。
具有特定碱基序列的单链核酸与具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性地杂交而结合,因此相当于本发明中所说的捕捉探针。本发明中使用捕捉探针可以是市售的,另外,也可以是从活细胞等得到的。作为捕捉探针,特别优选的是核酸。该核酸中,被称为寡核酸的长度为200个碱基以下的核酸可以用合成仪容易地人工合成。
捕捉探针可以含有与目标核酸序列互补的序列,也可以选择任何区域。优选与以下所述的检测探针的序列不重复。另外,还可以使用与目标核酸的不同区域杂交的多种捕捉探针。本来,通过本发明的方法,即使捕捉探针为1种也会得到能够满意的检测灵敏度,因此捕捉探针对各目标核酸为1种因为单纯而优选。
在目标核酸是双链DNA的情况下,可以选择与沃森链(正义链)、克里克链(反义链)的任一链互补的序列作为捕捉探针。以下所述的检测探针与捕捉探针优选选择相同链的序列。
在区别检测样本核酸所含的不同目标核酸时,例如,区别检测感染患者的病毒的型等时,优选从可以在样本核酸中含有核酸序列的中,选择特异性高的序列区域。即,是指作为捕捉探针选择的序列在样本核酸所含的全部序列中除了该区域以外没有同源性高的序列。
关于能够在单碱基多态性的检测中使用的捕捉探针的设计,可以使用专利文献3所提出的方法。具体地,将怀疑突变的碱基配置于捕捉探针的中央,在其前后附加10个碱基,制成全长21个碱基的捕捉探针。将在怀 疑突变的碱基部分配置了A的捕捉探针、在怀疑突变的碱基部分配置了T的捕捉探针、在怀疑突变的碱基部分配置了G的捕捉探针、和在怀疑突变的碱基部分配置了C的捕捉探针作为捕捉探针组使用(图5)。进而,在检测多种SNP的情况下,更优选选择在捕捉探针组间Tm值接近那样的序列。可以使用如下方法:利用用于调整捕捉探针序列的长度的LNA等人工核酸。
同源性(%)可以通过以初始设定使用该领域常用的同源性检索程序(例如,BLAST、FASTA等)来确定。另外,在其他情况下,同源性(%)可以使用该领域公知的任意算法、例如,Needleman等(1970)(J.Mol.Biol.48:444-453)、Myers和Miller(CABIOS,1988,4:11-17)的算法等来确定。Needleman等的算法被编入GCG软件包(可以在www.gcg.com获得)的GAP程序中,同源性(%)可以通过使用例如BLOSUM 62 matrix或PAM250 matrix、以及gapweight:16、14、12、10、8、6或4、和length weight:1、2、3、4、5或6的任一者来确定。另外,Myers和Miller的算法被编入作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序中。
检测探针是指能够直接与受试样品所含的目标核酸结合的物质。在本发明的目标核酸的检测方法中,具体可以使用DNA、RNA、PNA、LNA(锁核酸,Locked Nucleic Acid)等的核酸衍生物。这里衍生物在核酸的情况下,是指通过荧光基团等标识化的衍生物、包含修饰核苷酸(例如受到包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸和碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的替换等的核苷酸等)的衍生物等的化学修饰衍生物。
具有特定碱基序列的单链核酸可以与具有与该碱基序列或其一部分互补的碱基序列的单链核酸选择性地杂交而结合,因此相当于本发明中所说的检测探针。本发明中使用的检测探针可以是市售的,另外,也可以是从活细胞等中获得的。作为检测探针,特别优选的是核酸。该核酸中,被称为寡核酸的长度为200个碱基以下的核酸可以用合成仪容易地人工合成。
在目标核酸是双链DNA的情况下,可以选择与沃森链、克里克链的 任一链互补的的序列作为检测探针。上述的捕捉探针与检测探针优选选择相同链的序列。
检测探针包含与目标核酸序列互补的序列即可,可以选择任意区域。但是,优选与上述的捕捉探针的序列不重复。进一步优选选择距离捕捉探针设计位置1500个碱基以内的范围的序列。
检测探针的序列期望与捕捉探针同源性低,优选同源性为80%以下,但可以考虑杂交时的严格度来确定。
已知杂交时的严格度是温度、盐浓度、探针的链长、探针的核苷酸序列的GC含量和杂交缓冲液中的离液剂的浓度的函数。作为严格条件,可以使用例如,Sambrook,J.et al.(1998)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.),Cold Spring HarborLaboratory Press,New York所记载的条件等。严格的温度条件为约30℃以上。作为其他的条件,是杂交时间、洗涤剂(例如,SDS)的浓度、和载体DNA的存在与否等,通过组合这些条件,可以设定各种严格度。本领域技术人员可以适宜确定为了检测所期望的目标核酸而准备的捕捉探针、和用于获得作为检测探针的功能的条件。
在检测样本核酸所含的多种目标核酸的情况下,可以使用在检测对象的目标核酸的间同源性为100%的序列作为共同检测探针。在共同检测探针在检测对象的目标核酸的间同源性不是100%的情况下,也可以使用简并序列。关于简并序列可以参考“バイオ实验イラストレイテッド本当にふえるPCR”、(1999年)、中山广树编、(株)秀润社发行、121页~125页。
检测探针可以结合标记体。在检测探针是核酸的情况下,可以在5’末端或3’末端的任一端、或两端结合标记体。另外,也可以在检测探针内部导入标记体。标记体的结合可以使用化学反应、酶反应等。优选使用化学反应使其反应。进一步优选在化学合成检测探针时,在末端结合标记体。也可以在检测探针的内部结合标记体。标记体的结合可以使用化学反应,可以用合成仪插入生物素标记。可以插入生物素-TEG、生物素-ON、生物 素-dT等(https://www.operon.jp/index.php)。
在本发明中,作为可以使用的标记体,可以使用蛋白质结合性物质、荧光色素、磷光色素、放射线同位素等在标记中使用的公知物质。优选的是蛋白质结合性物质。作为蛋白质结合性物质的例子可列举生物素。生物素可以与亲和素或者链霉亲和素结合。可以使用在亲和素或者链霉亲和素上结合了荧光色素的物质、结合了碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶等酶的物质。在使用碱性磷酸酶和/或辣根过氧化物酶的情况下,添加各自的底物,底物与酶反应的结果产生发光反应。发光反应使用酶标仪和/或CCD相机等来检测。
此外,这样通过本发明,可以使用一直以来在本领域常用的标记,不需要使用像提供能够通过瞬时性激发发光来检测的信号的标识那样的特殊标记。从成本方面和/或避免复杂性的观点出发,标记优选不是提供能够通过瞬时性激发发光来检测的信号的标识。
作为标记体可以使用测定简便、信号容易检测的荧光色素。具体可列举菁(菁2)、氨基甲基香豆素、萤光素、吲哚碳菁(菁3)、菁3.5、四甲基罗丹明、罗丹明红、德克萨斯红、吲哚碳菁(菁5)、菁5.5、菁7、オイスター(牡蛎)、BODIPY系色素、藻红蛋白等公知的荧光色素。
另外,作为标记体可以使用具有发光性的半导体微粒。作为这样的半导体微粒,可列举例如硒化镉(CdSe)、碲化镉(CdTe)、铟镓磷(InGaP)、黄铜矿系微粒、硅(Si)等。荧光色素的检测可以用荧光显微镜和/或荧光扫描仪等来进行。
检测到的信号与周围噪声进行比较。具体地,将从固定有捕捉探针的位置得到的信号值、与从除此以外的位置得到的信号值进行比较,将前者的数值高的情况作为检测到。
作为在支持体固定化捕捉探针的方法,已知在支持体上面部合成寡DNA的方法、将预先合成好的寡DNA向支持体上面部滴加并进行固定的方法。前者的方法有Ronald等的方法(美国专利第5705610号说明书)、Michel等的方法(美国专利第6142266号说明书)、Francesco等的方法(美 国专利第7037659号说明书)。这些方法中在DNA合成反应时使用有机溶剂,因此担载体期望是对有机溶剂有耐性的材质。例如,可以使用利用日本特表平10-503841号公报所记载的方法制作的有凹凸结构的玻璃担载体。特别是在Francesco等的方法中从担载体的背面照射光,控制DNA合成,因此担载体优选是具有透光性的材质。后者的方法可使用广田等(日本特许第3922454号)的方法和/或玻璃毛细管。作为玻璃毛细管的一例,可以使用自制的玻璃毛细管和/或微量移液器((株)マイクロサポート社制;MP-005)等市售制品,但不限于这些方法。
关于从活细胞制备DNA或RNA可以通过公知的方法来进行,例如DNA的提取可以通过Blin等的方法(Blin等,Nucleic Acids Res.3:2303(1976))等来进行,另外,RNA的提取可以通过Favaloro等的方法(Favaloro等,Methods Enzymol.65:718(1980))等来进行。作为固定化的核酸,进一步可以使用链状或环状的质粒DNA和/或染色体DNA、将它们通过限制性酶切断或化学地切断而得的DNA片段、在试管内通过酶等合成的DNA、或化学合成的寡核苷酸等。
因为本发明的方法是夹心杂交,所以基本的操作本身与公知的夹心杂交相同。即,使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触,使所述捕捉探针与所述目标核酸或其片段化处理物杂交,并且使所述目标核酸或其片段化处理物与所述多种检测探针,由此介由所述捕捉探针和所述目标核酸或其片段化处理物而使所述多种检测探针结合于所述支持体,接着,检测结合于支持体的所述多种检测探针。使目标核酸或其片段化处理物、多种检测探针及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触的工序,(1)既可以首先使目标核酸或其片段化处理物、与多种检测探针接触而杂交,接着使与多种检测探针杂交了的目标核酸或其片段化处理物与固定化于支持体上的捕捉探针接触而杂交;(2)也可以相反地,首先使目标核酸或其片段化处理物、与固定化于支持体上的捕捉探针接触而杂交,接着使与捕捉探针杂交了的目标核酸或其片段化处理物与多种检测探针接触而杂交;(3)还可以使目标核酸或其片段化处理物、 多种检测探针及固定于支持体的捕捉探针同时接触而使所述捕捉探针与所述目标核酸或其片段化处理物杂交,并且使所述目标核酸或其片段化处理物与所述多种检测探针杂交。其中,多数情况下下通过上述(1)的方法使其依次接触的方法检测灵敏度较高,因此优选。
各杂交工序可以与现有完全同样地进行。反应温度和时间可根据杂交的核酸的链长来适宜选择,在核酸的杂交的情况下,通常为30℃~70℃左右、1分钟~十几小时,在免疫反应的情况下,通常为室温~40℃左右、1分钟~几小时左右。
使用图1来说明本发明的概念。作为例子,使用全长有3000个碱基的目标核酸进行检测。
捕捉探针可以在目标核酸的任何部分设计,在该例子中,使用从目标核酸的起始到第2200个碱基~2230个碱基作为捕捉探针的结合序列。检测探针在距离捕捉探针结合的区域为1500个碱基的范围所包含的区域中设计4条。各检测探针和序列区域如下。检测探针1:第2000个碱基~第2019个碱基、检测探针2:第2100个碱基~第2119个碱基、检测探针3:第2319个碱基~第2330个碱基、检测探针4:第2419个碱基~第2430个碱基。
离捕捉探针的距离,在目标核酸序列上配置捕捉探针结合位置和检测探针结合位置,以最远的碱基作为端部数出其间的碱基数。使用图1B的例子来说明。检测探针2:第2100个碱基~第2119个碱基、与捕捉探针:第2200个碱基~2230个碱基的距离,由于以最远的碱基的位置作为端部来数,因而距离为131个碱基。检测探针3:第2319个碱基~第2330个碱基、与捕捉探针:第2200个碱基~2230个碱基的距离,由于以最远的碱基的位置作为端部来数,因而距离为131个碱基。这样计算,检测探针1,4与捕捉探针的距离均为231个碱基。
接着将目标核酸以核酸的众数为250个碱基的方式切断。使该目标核酸、检测探针1,2,3,4及捕捉探针杂交的模式图是图1A、图1B、图1C。
目标核酸在任意位置被切断,因而像图1那样产生各种结合方式。
图1A显示目标核酸在第2231个碱基以后被切断而得的片段的杂交方式。目标核酸可以结合检测探针1和检测探针2。
图1B显示目标核酸在第2100个碱基之前、和第2330个碱基之后被切断而得的片段的杂交方式。目标核酸可以结合检测探针2、检测探针3。
图1C显示目标核酸在第2200个碱基之前、和第2430个碱基之后被切断而得的片段的杂交方式。目标核酸可以结合检测探针3、检测探针4。
准备多条检测探针,进而将目标核酸以核酸长度的众数为250个碱基的方式切断,从而可以以图1的任一方式进行检测。
另一方面,在仅准备1条检测探针的情况下,在任一情况下都不能检测。例如,如果仅有1条检测探针,则图1B、图1C的情况下不能检测,因而检测灵敏度降低。
另外,在核酸长度的众数为150个碱基的情况下,能够与结合于捕捉探针的目标核酸结合的检测探针是检测探针2和检测探针3。因此,检测灵敏度降低。
此外,在图1中,显示了在捕捉探针的两侧设计检测探针的例示,但检测探针也可以仅在捕捉探针的3’末端侧、或者仅在5’末端侧。
一般地,在本发明这样的核酸的检测方法中,为了确认检测方法本身是否正确地进行,还同时检测内标。即,在通过检测方法检测不到目标核酸的情况下,不能判别是被检样品中不存在目标核酸,还是检测方法没有正确地进行。因此,使用在被检样品中普遍存在的核酸区域作为内标,如果该内标被检测到,则判断检测方法正确地进行,如果内标未被检测到,则判定检测方法没有正确地进行。在被检样品来源于人的情况下,作为内标一般使用肌动蛋白和/或球蛋白。在本发明的方法中,可以与现有的方法同样地,使用肌动蛋白基因和/或球蛋白基因作为内标,特别是在通过PCR等扩增目标核酸或其片段化处理物的情况下,可以没问题地使用与现有的方法同样的内标。
然而,本发明的检测方如上所述,是发挥即使不进行核酸扩增法也能 以充分的灵敏度检测目标核酸这样的优异效果的方法。在不进行核酸扩增法的情况下,肌动蛋白基因和/或球蛋白基因在基因组中仅有1拷贝,因此灵敏度不充,可能虽然检测方法正确地进行,也检测不到内标。
为了克服该问题,在本发明的优选实施方式中,将包含所述目标核酸的来源于人等动物的样本供于所述检测方法,以存在于动物基因组中的至少1种重复序列作为内标进行检测。该重复序列包含在动物基因组片段中。动物基因组片段可以是通过动物基因组的片段化处理而产生的,也可以是自然产生的片段。基因组片段的优选长度与上述的目标核酸或其片段化处理物的优选长度是同样的。作为动物,优选人;狗、猫等宠物;猪、牛、马、绵羊、山羊等家畜;猴、小鼠、大鼠等实验动物等哺乳动物,特别优选人,但也可以是其中存在重复序列的其他动物。作为重复序列,优选反转录转座子、特别是短分散型核内重复序列(short interspersed nuclear sequence,SINE),尤其优选在人基因组中存在100万拷贝的Alu序列。Alu序列本身是周知的序列,其碱基序列也是周知的(序列号47)。
将用于说明当目标核酸是病毒DNA、将包含人基因组的来源于人的样本供于检测方法时的本发明的方法的原理的概念图示于图8。在图8所示的方法中,作为内标使用人Alu序列。将捕捉Alu序列的人Alu序列捕捉探针固定化于支持体,使检测被捕捉到的人DNA的多种人Alu序列检测用探针与被捕捉到的人Alu序列杂交,从而检测被捕捉到的人Alu序列。这里,人Alu序列等动物DNA的检测可以与上述的目标核酸或其片段化处理物的检测方法同样地进行,优选的条件也与上述同样。
实施例1
作为区别检测感染患者的病毒的型的例子,通过人乳头瘤病毒检测的实施例更详细地说明本发明。当然,本发明不限于下述实施例。
人乳头瘤病毒作为宫颈癌的原因病毒已知。人乳头瘤病毒存在100种以上的型,其中作为造成宫颈癌的恶性度的高的型存在13种。在宫颈癌的预防医学中,知晓受试者感染了哪种型的病毒在考虑治疗方针上成为重要信息。人乳头瘤病毒的型判别通过宫颈部的粘液进行。已知杂交捕捉法、 PCR法等。通过将本发明应用于人乳头瘤病毒的检测,可以高灵敏度地特定受试者所感染的病毒的型。
(捕捉探针、检测探针的设计)
人乳头瘤病毒的型判别的研究早就在进行,捕捉探针可以灵活运用其研究成果。这里,作为一例使用文献(j.clin.microbiol,1995.p.901-905)所报告的捕捉探针序列(表1)。该文献中,是如下构造:以能够使用人乳头瘤病毒的L1基因区域的序列来判别型的方式设计了捕捉探针,使用型中共同的PCR引物MY11、MY09来扩增对象序列,然后使其与固定了与各型特异性地结合的捕捉探针的过滤器杂交,进行检测。因此,捕捉探针的设计位置在任一型中都位于与L1基因几乎相同的区域。在本发明中,着眼于捕捉探针的位置和共同引物的序列,通过使用共同引物作为共同的检测探针,从而使离捕捉探针的距离在型间几乎相同(图3、表2)。具有上述序列的捕捉探针由オペロン社合成在5’末端加入了氨基修饰的合成DNA。检测探针由オペロン社合成在3’末端和5’末端进行了生物素标记的合成DNA。
表1
名 | 序列号 | 探针序列5’->3’ |
Probe6 | 序列号1 | ATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAA |
Probe11 | 序列号2 | ATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAA |
Probe16 | 序列号3 | GTCATTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGA |
Probe18 | 序列号4 | TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA |
Probe31 | 序列号5 | TGTTTGTGCTGCAATTGCAAACAGTGATAC |
Probe33 | 序列号6 | TTTATGCACACAAGTAACTAGTGACAGTAC |
Probe34 | 序列号7 | TACACAATCCACAAGTACAAATGCACCATA |
Probe35 | 序列号8 | GTCTGTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGTGA |
Probe39 | 序列号9 | TCTACCTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCT |
Probe40 | 序列号10 | GCTGCCACACAGTCCCCCACACCAACCCCA |
Probe42 | 序列号11 | CTGCAACATCTGGTGATACATATACAGCTG |
Probe43 | 序列号12 | TCTACTGACCCTACTGTGCCCAGTACATAT |
Probe44 | 序列号13 | GCCACTACACAGTCCCCTCCGTCTACATAT |
Probe45 | 序列号14 | ACACAAAATCCTGTGCCAAGTACATATGAC |
Probe51 | 序列号15 | AGCACTGCCACTGCTGCGGTTTCCCCAACA |
Probe52 | 序列号16 | TGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACATATAA |
Probe54 | 序列号17 | TACAGCATCCACGCAGGATAGCTTTAATAA |
Probe56 | 序列号18 | GTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG |
Probe58 | 序列号19 | ATTATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC |
表2
(DNA芯片的制作)
在DNA芯片“3D-Gene”(注册商标)(http://www.3d-gene.com/en/products/pro_009.html)的基板上固定表1的全部捕捉探针,从而制作DNA芯片。详细在以下记述。
(DNA固定化担载体的制作)
使用公知的方法LIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung,光刻电铸注塑)工艺,制作注射成型用的模具,通过注射成型法获得具有如后述那样的形状的PMMA制的担载体。PMMA中以1重量%的比例含有炭黑(三菱化学社、#3050B),因而担载体为黑色。担载体的形状是,大小为长76mm、宽26mm、厚1mm,除了担载体的中央部分以外表面是平坦的。担载体的中央设有直径10mm、深0.2mm的凹陷部分,该凹陷中设有直径0.2mm、高0.2mm的凸部64(8×8)处。从凹凸部的凸部的间距(从凸部中央部到相邻的凸部中央部的距离)为0.6mm。
(探针DNA的固定化)
将表1的捕捉探针DNA在纯水中以0.3nmol/μL的浓度溶解,作为贮备液。点样于担载体时,用PBS(将NaCl 8g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCl 0.2g、KH2PO4溶于0.2g纯水中,定容至1L,加入pH调整用的盐酸而得的缓冲液,pH5.5)将探针DNA的终浓度调整为0.03nmol/μL,并且为了使担载体表面的羧酸与探针DNA的末端的氨基缩合,加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC),使其终浓度为50mg/mL。然后,将它们的混合溶液用玻璃毛细管点样于担载体凸部上面。接着,将担载体装入密闭的塑料容器中,在37℃、湿度100%的条件下孵育20小时左右,用纯水洗涤。将捕捉探针DNA固定化后,在DNA芯片的中央部分贴合覆盖物,在DNA芯片与覆盖物之间封入用于杂交反应时的溶液搅拌的氧化锆制珠。
(样本DNA的制备)
作为样本DNA,从ヒューマンサイエンス研究資源バンク购买并使用克隆化有人乳头瘤病毒的基因组DNA的重组质粒pHPV16。pHPV16全长16,600个碱基对。1个碱基对的分子量为680,则1μg为89nmol。
以下显示样本DNA的制备方法。1μg的pHPV16通过超声波处理(コバリス、s220)而片段化。片段化的处理条件按照制造商推荐的方法,设定为100个碱基、150个碱基、250个碱基、400个碱基、1500个碱基、4000个碱基。片段的长度使用生物分析仪(アジレント社)进行评价,各处理条件下得到的片段化核酸的峰顶为100个碱基、150个碱基、250个碱基、400个碱基、1500个碱基、4000个碱基。切断的样本DNA的浓度使用NanoDrop(サーモフィッシャー社、ND-1000)来测定,求出核酸的浓度。根据核酸浓度,用1×杂交溶液将各切断的溶液所含的切断的DNA稀释至1amol/μL,作为样本DNA。
(检测探针溶液的制备)
将检测探针用灭菌水稀释至浓度为100fmol/μL。在将多种检测探针混和使用的情况下,也同样地将各检测探针的浓度用灭菌水稀释至100fmol/μL。
(杂交)
在样本DNA 5μL中混合稀释后的检测探针液1μL,使用热循环仪在95℃加热5分钟。加热后,在桌子上静置2分钟至回到室温。在该溶液中加入1×杂交溶液(1重量%BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC、1重量%SDS(十二烷基硫酸钠)、50ng/ml鲑鱼精DNA的溶液、5重量%葡聚糖硫酸钠、30%甲酰胺)35μL,作为杂交用溶液。将总量注入DNA芯片,放入在32℃加温的孵化器中。杂交按照“3D-Gene”的标准方案,一边以250转/分钟旋转搅拌,一边以32℃进行2小时。杂交后,将DNA芯片用加温至30℃的洗涤液(0.5×SSC、0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠))洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。再准备将链霉亲和素藻红蛋白(プロザイム社)添加到染色溶液(50ng/μl链霉亲和素藻红蛋白、100mM MES,1M NaCl,0.05重量%Tween20、2mg/mlBSA(牛血清白蛋白))中而得的溶液,滴加到DNA芯片上。在35℃孵育5分钟。用加温至30℃的洗涤液(6×SSPE、0.01重量%Tween20)洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。染色后的DNA芯片使用DNA芯片扫描仪(東レ)检测荧光信号。扫描仪的设 定为激光器输出100%、光电倍增管的电压设定为70%。
检测结果示于表3。由将4种检测探针混和进行检测的结果可知,与不切断的情况、切断成4000个碱基的情况相比,在切断成1500个碱基以下的样本中检测信号明显增强。特别是250个碱基、500个碱基灵敏度最高,如果切断得更短,则灵敏度开始降低。
表3
接着,在单个地使用检测探针进行检测而得的结果中,GP5和GP6与用上述4种混合进行检测时显示同样的行为。MY11也是同样的行为,但可能由于检测探针的结合度低,与GP5、GP6相比信号强度差。预想MY09是在距离捕捉探针340个碱基的位置设计的检测探针,预计在切断成DNA长为250个碱基以下的情况下,没有与目标核酸结合的区域,不能作为检测探针发挥功能。在实施例中,虽然在500个碱基和1500个碱基得到信号,但在250个碱基以下得不到信号。
容易推测用单个检测探针得到的信号强度的和与4种混合使用时的信号强度同等。表3的最下段显示用单个检测探针得到的信号强度的和。与此相对,在将目标核酸切断成1500个碱基以下的情况下,4种混合使用时的信号强度显示非常大的值。推测这是因为,通过多种检测探针结合,捕捉探针与目标核酸的杂交增强。
实施例2
通过人乳头瘤病毒检测的其他实施方式来更详细地说明本发明。当然,本发明不限于下述实施例。
(捕捉探针、检测探针的设计)
捕捉探针与实施例1同样地,使用文献中有报告的序列(j.clin.microbiol,1995.p.901-905、表1)。一般地,核酸越长,核酸的杂交结合强度越强。于是,作为检测探针,如图4和表4所示那样,在捕捉探针的前后的序列,分成5个区域准备具有80~86个碱基的长度的序列。
表4
具有上述序列的捕捉探针由オペロン社合成在5’末端加入了氨基修饰的合成DNA。检测探针由オペロン社合成在内部导入了生物素标记的合成DNA(表4)。
(DNA芯片的制作)
制作固定了表1的全部捕捉探针的DNA芯片。DNA芯片的制作方法与实施例1同样。
(样本DNA的制备)
作为样本DNA,从ヒューマンサイエンス研究資源バンク购买并使用克隆化有人乳头瘤病毒的基因组DNA的重组质粒pHPV16。pHPV16全长为16,600个碱基对。1个碱基对的分子量为680,则1μg为89nmol。
以下显示样本DNA的制备方法。将5μg的pHPV16通过超声波处理(コバリス、s220)而片段化。片段化的处理条件按照制造商推荐的方法,设定成150个碱基、250个碱基。片段的长度使用生物分析仪(アジレント社)进行评价,各处理条件下得到的片段化核酸的峰顶为150个碱基、250个碱基。切断的样本DNA的浓度使用NanoDrop(サーモフィッシャー社、ND-1000)进行测定,求出核酸的浓度。根据核酸浓度,将各切断的溶液所含的切断的DNA,用1×杂交溶液稀释至1amol/μL,作为样本DNA。
(检测探针溶液的制备)
将检测探针用灭菌水稀释至浓度为100fmol/μL。在混合使用多种检测探针的情况下,也同样地将各检测探针的浓度用灭菌水稀释至100fmol/μL。
(杂交)
在样本DNA 5μL中,混合稀释了的检测探针液1μL,使用热循环仪在95℃加热5分钟。加热后,在桌子上静置2分钟至回到室温。在该溶液中加入杂交溶液1×杂交溶液(1重量%BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC、1重量%SDS(十二烷基硫酸钠)、50ng/ml鲑鱼精DNA的溶液、5重量%葡聚糖硫酸钠、30%甲酰胺)35μL,作为杂交用溶液。将总量注入DNA芯片中,放置在以32℃加温的孵化器上。杂交按照“3D-Gene”的标准方案,以250转/分钟一边旋转搅拌一边在32℃进行2小时。杂交后,将DNA芯片用加 温至30℃的洗涤液(0.5×SSC、0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠))洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。进一步准备将链霉亲和素藻红蛋白(プロザイム社)添加在染色溶液(50ng/μl链霉亲和素藻红蛋白、100mM MES,1M NaCl,0.05重量%Tween20、2mg/ml BSA(牛血清白蛋白))中而得的溶液,滴加于DNA芯片上。在35℃孵育5分钟。用加温至30℃的洗涤液(6×SSPE、0.01重量%Tween20)洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。染色后的DNA芯片使用DNA芯片扫描仪(東レ)检测荧光信号。扫描仪的设定为激光器输出100%、光电倍增管的电压设定为70%。
检测结果示于表5。根据混合5种检测探针(5种混合)进行检测而得的结果,与150个碱基相比,250个碱基的信号强度高。切断为150个碱基时有效的检测探针为2条,与此相对,切断为250个碱基时有效的检测探针为3条。可以说由于能够结合的检测探针的条数差,而产生了信号强度的差。另一方面,对于切断为250个碱基的目标核酸,将4种混合与5种混合进行检测而得的结果进行比较,则5种混合时信号强度高。这是因为,使用4种混合时的有效的检测探针为2条,与此相对,5种混合时为3条。可以说由于能够结合的检测探针的条数差,而产生信号强度的差。
表5
核酸长 | 添加的检测探针 | 有效的检测探针 | 检测信号 |
150碱基 | 5种混合(检测探针1,2,3,4,5) | 检测探针1,2 | 17,500 |
250个碱基 | 4种混合(检测探针2,3,4,5) | 检测探针2,3 | 15,000 |
250个碱基 | 5种混合(检测探针1,2,3,4,5) | 检测探针1,2,3 | 30,000 |
如以上那样,通过准备多种检测探针,并且进行考虑了检测探针的结合区域的目标核酸的切断,可以得到特别充分的信号强度。此外,在使用5种混合的检测探针的情况下,目标核酸优选切断成400个碱基左右(±50个碱基的程度)、进而优选切断为400个碱基。
实施例3
通过SNPs (single nucleotide polymorphisms,单核苷酸多态性)检测更详细地说明本发明。当然,本发明不限于下述实施例。已知在癌患者中,由于EGFR基因和/或k-ras基因的突变的有无而抗癌剂的有效率不同,成 为抗癌剂施与的判断材料。在现有的技术中,在PCR扩增之后,使用各种方法进行检测。
(捕捉探针、检测探针的设计)
SNP检测的捕捉探针,使SNP位点位于探针的中央。具体地,使用SNP位点前后10个碱基作为捕捉探针序列。SNP检测的情况下,关于捕捉探针,对于SNP位点准备全部碱基的组合,作为捕捉探针组使用。具体地,在野生型:G,突变型:A的SNP位点的情况下,使用包含G或A的前后10个碱基的21个碱基作为捕捉探针。另外,为了作为比较对象,使探针的中央部分为T或C,以包含前后10个碱基的21个碱基作为捕捉探针。使用以上的4个序列作为捕捉探针组。这样,准备针对作为k-ras突变的Gly12Ser、Gly12Arg、Gly12Cys的捕捉探针组,和针对作为EGFR突变的T790M的捕捉探针组(表6)。
表6
检测探针在考虑了离捕捉探针设计的距离之后,在图6和图7的位置设计。检测探针的序列和离捕捉探针的距离示于表7、表8。
表7
表8
具有上述序列的捕捉探针由オペロン社合成在5’末端加入了氨基修饰的合成DNA。检测探针由オペロン社合成在3’末端和5’末端进行了生物素标记的合成DNA。
(DNA芯片的制作)
制作固定了表6的全部捕捉探针的DNA芯片。DNA芯片的制作方法与实施例1同样。
(样本DNA的制备)
作为样本DNA使用从A549细胞提取的DNA。已知A549细胞是来源于肺癌组织的培养细胞,引入了Gly12Ser的突变。将从A549细胞提取的5μg的DNA通过超声波处理(コバリス、s220)而片段化。片段化的处理条件按照制造商推荐的方法。片段的长度使用生物分析仪(アジレント社)进行评价。核酸长度的众数为750个碱基。使用切断的DNA的总量作为样本DNA。
(检测探针溶液的制备)
将检测探针混和,用灭菌水稀释至各自的浓度为100fmol/μL。
(杂交)
在样本DNA5μL中混合稀释后的检测探针液1μL,使用热循环仪在95℃加热5分钟。加热后,在桌子上静置2分钟至回到室温。在该溶液中加入杂交溶液(组成确认。1重量%BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC、0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠)、0.01重量%鲑鱼精DNA的溶液)35μL,作为杂交用溶液。将总量注入DNA芯片,放置在以32℃加温的孵化器中。杂交按照“3D-Gene”的标准方案,一边以250转/分钟旋转搅拌一边在32℃进行2小时。杂交后,将DNA芯片用加温至30℃的洗涤液(0.5×SSC、0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠))洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。进而,准备将链霉亲和素藻红蛋白(プロザイム社)添加在染色溶液(50ng/μl链霉亲和素藻红蛋白、100mM MES,1M NaCl,0.05重量%Tween20、2mg/mlBSA(牛血清白蛋白))中而得的溶液,滴加于DNA芯片上。在35℃孵育5分钟。用加温至30℃的洗涤液(6×SSPE、0.01重量% Tween20)洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。染色后的DNA芯片使用DNA芯片扫描仪(東レ)检测荧光信号。扫描仪的设定为激光器输出100%、光电倍增管的电压设定为70%。
表9
检测结果示于表9。在EGFR捕捉探针组中,由于野生型的探针信号强度最高,因而考虑在A549细胞中未发生T790M突变。在K-RAS捕捉探针中,Gly12Ser的探针的信号强度最高。A549细胞已知引入了Gly12Ser突变,与本检测结果一致。
如以上那样,通过使用夹心杂交,可以不进行PCR扩增而正确地检测SNP。
实施例4
实施例3所示的K-ras基因突变和/或EGFR基因突变是抗癌剂施与的重要指标,但用其他方法确认这些基因表达的有无也是重要的。本发明也可以直接检测RNA,进而可以检测该RNA中的突变。到目前为止的RNA技术需要用逆转录酶制成cDNA,然后用PCR法扩增。逆转录时使用的逆转录酶一般容易引入突变,因而可能成为误检测的原因。以下,关于详细进行记述,但本发明不限于下述实施例。
(捕捉探针、检测探针的设计)
使用与实施例3同样的捕捉探针组、和检测探针。
(DNA芯片的制作)
制作固定了表6的全部捕捉探针的DNA芯片。DNA芯片的制作方法与实施例1同样。
(样本DNA的制备)
作为样本DNA,使用从A549细胞提取的总RNA。已知A549细胞是来源于肺癌组织的培养细胞,引入了Gly12Ser的突变。将从A549细胞提取的5μg的总RNA通过超声波处理(コバリス社、s220)而片段化。片段化的处理条件按照制造商推荐的方法。片段的长度使用生物分析仪(アジレント社)进行评价。核酸长度的众数为250个碱基。将切断的RNA的总量作为样本RNA。
(检测探针溶液的制备)
将检测探针混和,用灭菌水稀释至各自的浓度为100fmol/μL。
(杂交)
在样本RNA 5μL中混合稀释后的检测探针液1μL,使用热循环仪,在95℃加热5分钟。加热后,在桌子上静置2分钟至回到室温。在该溶液中加入杂交溶液(组成确认。1重量%BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC、0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠)、0.01重量%鲑鱼精DNA的溶液)35μL,作为杂交用溶液。将总量注入DNA芯片中,放置在以32℃加温的孵化器中。杂交按照“3D-Gene”的标准方案,一边以250转/分钟旋转搅拌一边在32℃进行2小时。杂交后,将DNA芯片用加温至30℃的洗涤液(0.5×SSC、0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠))洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。进而,准备将链霉亲和素藻红蛋白(プロザイム社)添加在染色溶液(50ng/μl链霉亲和素藻红蛋白、100mM MES,1M NaCl,0.05重量%Tween20、2mg/mlBSA(牛血清白蛋白))中而得的溶液,滴加于DNA芯片上。在35℃孵育5分钟。用加温至30℃的洗涤液(6×SSPE、0.01重量%Tween20)洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药)进行干燥。染色后的DNA芯片使用DNA芯片扫描仪(東レ)检测荧光信号。扫描仪的设定为激光器输出100%、光电倍增管的电压设定为70%。
检测结果示于表10。在EGFR捕捉探针组中,由于野生型的探针信号强度最高,因而考虑在A549细胞未发生T790M突变。在K-RAS捕捉探针中,Gly12Ser的探针的信号强度最高。A549细胞已知引入了Gly12Ser突变,与本检测结果一致。
表10
如以上那样,通过使用夹心杂交,可以不将RNA逆转录地直接进行检测,进一步可以正确地检测SNP。
实施例5
通过人乳头瘤病毒检测的其他实施方式更详细地说明本发明。在上述的实施例1和实施例2中,检测了人乳头瘤病毒DNA。在从人样本提取核酸进行分析的情况下,在得不到检测信号时,可考虑人样本中不存在乳头瘤病毒这样的解释、和核酸的提取工作和/或检测工作失败这样的解释两种解释。区别是哪一种是困难的。这样的问题可以通过使用内标来解决。
已知从人样本提取人乳头瘤病毒DNA时,样本溶液中含有微量的人DNA。从未感染人乳头瘤病毒的人样本不能提取人乳头瘤病毒DNA,但可以获得人DNA。利用该性质,可以通过检测从人样本提取的样本溶液所含的人DNA,作为人乳头瘤病毒DNA检测的内标使用。这里,模拟地使用插入了乳头瘤病毒的碱基序列的质粒DNA与人基因组DNA混和而成的样本。当然,本发明不限于下述实施例。
(捕捉探针、检测探针的设计)
捕捉探针与实施例1同样地,使用在文献中有报告的序列(j.clin.microbiol,1995.p.901-905、表1)。一般地,核酸越长,核酸的杂交结合强度越强。于是,作为检测探针,如图4和表4所示那样,在捕捉探针的前后的序列,分成5个区域准备具有80~86个碱基的长度的序列。
具有上述序列的捕捉探针由オペロン社合成在5’末端加入了氨基修饰的合成DNA。检测探针由オペロン社合成在内部导入了生物素标记的合成DNA(表4)。
将针对人基因组中重复存在的Alu序列的捕捉探针和检测探针示于表11。具有上述序列的捕捉探针由オペロン社合成在5’末端加入了氨基修饰的合成DNA。检测探针由オペロン社合成在5’末端和3’末端导入了生物素标记的合成DNA。
(DNA芯片的制作)
制作固定了表1的全部捕捉探针和表11序列号46的捕捉探针的DNA芯片。DNA芯片的制作方法与实施例1同样。
表11
(样本DNA的制备)
作为样本DNA,从ヒューマンサイエンス研究資源バンク(财团法人ヒューマンサイエンス振兴财团)购买并使用克隆化有人乳头瘤病毒的基因组DNA的重组质粒pHPV16。pHPV16全长为16,600个碱基对。1个碱基对的分子量为680,则1μg为89nmol。人基因组DNA使用从クロンテック社购买的。
以下显示样本DNA的制备方法。将5μg的pHPV16和人基因组DNA通过超声波处理(コバリス社、型号:s220)进行片段化。片段化的处理条件按照制造商推荐的方法,设定为250个碱基。片段的长度使用生物分析仪(アジレント社)进行评价,各处理条件下得到的片段化核酸的峰顶为250个碱基。切断的样本DNA的浓度使用NanoDrop(サーモフィッシャー社、型号:ND-1000)来测定,求出核酸的浓度。根据核酸浓度,将各切断的溶液所含的切断的DNA用1×杂交溶液进行稀释,使得pHPV16为1amol/uL,人基因组DNA为5ng/uL。
(检测探针溶液的制备)
将表4和表11的检测探针用灭菌水溶解后进行混合,使得各自的浓度为100fmol/μL,作为检测探针液。
(杂交)
在将切断的pHPV16与人基因组DNA以表12的组成混和而得的样本DNA 5μL中,混合稀释后的检测探针液1μL,使用热循环仪,在95℃加热5分钟。加热后,在桌子上静置2分钟至回到室温。在该溶液中加入1×杂交溶液(1重量%BSA(牛血清白蛋白)、5×SSC、1重量%SDS(十二烷基硫酸钠)、50ng/ml鲑鱼精DNA的溶液、5重量%葡聚糖硫酸钠、30%甲酰胺)35μL,作为杂交用溶液。将总量注入DNA芯片中,放置在以32℃加温的孵化器中。杂交按照“3D-Gene”的标准方案,一边以250转/分钟旋转搅拌一边在32℃进行2小时。杂交后,将DNA芯片用加温至30℃的洗涤液(0.5×SSC、0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠))洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药社)进行干燥。进而,准备将链霉亲和素藻红蛋白(プロザ イム社)添加在染色溶液(50ng/μl链霉亲和素藻红蛋白、100mM MES,1M NaCl,0.05重量%Tween20、2mg/mlBSA(牛血清白蛋白))中而得的溶液,滴加于DNA芯片上。在35℃孵育5分钟。用加温至30℃的洗涤液(6×SSPE、0.01重量%Tween20)洗涤5分钟,然后使用自旋干燥机(和研药社)进行干燥。染色后的DNA芯片使用DNA芯片扫描仪(東レ社)测定荧光信号。扫描仪的设定为激光器输出100%、光电倍增管的电压设定为70%。
检测结果示于表12。
表12
样本1(人基因组DNA 5ng)仅用捕捉探针Probe Alu才能检测到信号。由于该样本中不包含pHPV16的DNA,因而用捕捉探针Probe 16得不到信号。
样本3(pHPV161amol)仅用捕捉探针Probe 16才能检测到信号。由于该样本中不包含人基因组DNA,因而用捕捉探针Probe Alu得不到信号。由以上的结果可知,pHPV16用的捕捉探针和检测探针、与Alu序列用的检测探针和捕捉探针相互不进行误杂交。
样本2(pHPV16 1amol、人基因组DNA 5ng)用捕捉探针Probe 16和Probe Alu得到信号。由此可知,可以同时检测pHPV16和人基因组DNA。
如以上可知,由于无论有无人乳头瘤病毒DNA,都可以检测样本溶液所含的人DNA的Alu序列,因而可以使用人DNA作为内标。考虑在从人样本提取、分析核酸的情况下,本方法是有效的。
Claims (9)
1.非诊断目的的目标核酸的检测方法,包括:
使目标核酸的片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触,使所述捕捉探针与所述目标核酸的片段化处理物杂交,并且使所述目标核酸的片段化处理物与所述多种检测探针杂交,由此介由所述捕捉探针和所述目标核酸的片段化处理物而使所述多种检测探针结合于所述支持体的工序,其中,在与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸的片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为该目标核酸的片段化处理物的核酸长度的众数以下的范围内,使多种检测探针杂交,所述离捕捉探针结合位置的距离是指在目标核酸序列上配置捕捉探针结合位置和检测探针结合位置,以最远的碱基作为端部数出的其间的碱基数,其中,与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸的片段化处理物的核酸长度的众数在100个碱基~1500个碱基的范围;和
检测结合于支持体的所述多种检测探针的工序。
2.根据权利要求1所述的方法,所述使目标核酸的片段化处理物、多种检测探针以及固定于支持体的捕捉探针依次或同时接触的工序如下依次进行:使所述目标核酸的片段化处理物与多种检测探针杂交,接着使与所述多种检测探针杂交了的所述目标核酸的片段化处理物与所述捕捉探针杂交。
3.根据权利要求1所述的方法,在与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸的片段化处理物中离捕捉探针结合位置的距离为1500个碱基的范围内,使多种检测探针杂交。
4.根据权利要求1所述的方法,与所述捕捉探针杂交的所述目标核酸的片段化处理物,是没有经过利用核酸扩增法的扩增的目标核酸的片段化处理物。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的方法,将包含所述目标核酸的来源于动物的样本供于所述检测方法,该检测方法还包含以存在于动物基因组中的至少1种重复序列作为内标进行检测的工序,该重复序列包含于动物基因组片段中。
6.根据权利要求5所述的方法,还包含将所述动物基因组进行片段化的工序,所述重复序列包含于被片段化后的动物基因组中。
7.根据权利要求5所述的方法,所述动物是人。
8.根据权利要求5所述的方法,所述重复序列是短分散型核内重复序列。
9.根据权利要求8所述的方法,所述短分散型核内重复序列是Alu序列。
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