JP6206181B2 - 核酸の検出方法 - Google Patents

核酸の検出方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6206181B2
JP6206181B2 JP2013510382A JP2013510382A JP6206181B2 JP 6206181 B2 JP6206181 B2 JP 6206181B2 JP 2013510382 A JP2013510382 A JP 2013510382A JP 2013510382 A JP2013510382 A JP 2013510382A JP 6206181 B2 JP6206181 B2 JP 6206181B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
target nucleic
detection
capture probe
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2013510382A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2013129457A1 (ja
Inventor
洋二 上田
洋二 上田
中村　史夫
史夫 中村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries Inc filed Critical Toray Industries Inc
Publication of JPWO2013129457A1 publication Critical patent/JPWO2013129457A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6206181B2 publication Critical patent/JP6206181B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、核酸の検出方法に関する。
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティングに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
核酸検出方法の一つとしてサンドイッチハイブリダイゼーション法が知られている。サンドイッチハイブリダイゼーション法は、フィルター上に固定された捕捉プローブを用いる。捕捉プローブは、標的核酸の第１の部分に相補的である。一つの段階において、フィルターに結合した捕捉プローブを、標的核酸配列について調べるべき試料に曝露し、さらに、標的核酸の第２の部分に相補的な標識付けされた検出プローブに曝露するが、前述の第２の部分は、第１のプローブが相補的な標的の部分とは別（すなわち、それらと重複していない）である（特許文献１、２、非特許文献１）。この手法は、フィルター上に試料を固定化するのに要する手間を解消し、また第１のプローブを支持体に適合するように選択することができる。
米国特許第4,486,539号 特開平7-75600号公報 特表平9-507121号公報 WO 99/47705
Sinikka Parkkinen et al., Journal of Medical Virology 20:279-288(1986)
サンドイッチハイブリダイゼーション法には、事前に検体をPCR法などの核酸増幅技術を用いて増幅のちに検出することが一般に行われている。標的核酸を増幅することで検出感度は増強されるが、一方で、混入した異物DNAをも増幅してしまうため擬陽性の懸念が生じるうえ、また、複数の遺伝子を同時に検出する場合には、遺伝子の数に応じたプライマーセットが必要となり、その品質管理に多くの労力を必要であった。
一方、PCR法で標的核酸を増幅せずに、検出する方法も多数の検討がなされている。標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイゼーションした後に、標識体あるいはタグ配列を土台にして、多数の発光体、あるいは蛍光体を取りこむ等の増感技術が工夫されているが、特殊な酵素や複雑な反応、又は特殊な支持体（光平面導波路等）や特殊な発光体（エバネッセント性励起発光により検出可能であるシグナルを提供するラベルが必要であった（特許文献４）。
本発明の目的は、核酸増幅や増感技術を用いずに、サンドイッチハイブリダイゼーションで標的核酸を検出する場合であっても高感度に標的核酸を検出することができる、核酸の検出方法を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、サンドイッチハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸の異なる領域とそれぞれハイブリダイズする複数の検出プローブを同時にハイブリダイズさせることにより、核酸増幅や増感技術を用いなくても高感度に標的核酸を検出できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1) 標的核酸の断片化処理物と、複数の検出プローブと、支持体に固定した捕捉プローブとを逐次的又は同時に接触させて、前記捕捉プローブと前記標的核酸の断片化処理物をハイブリダイズさせ、かつ、前記標的核酸の断片化処理物と前記複数の検出プローブをハイブリダイズさせ、それによって、前記複数の検出プローブを、前記捕捉プローブと前記標的核酸の断片化処理物を介して前記支持体に結合させる工程と、
支持体に結合された前記複数の検出プローブを検出する工程とを含む、標的核酸の検出方法であって、前記捕捉プローブとハイブリダイズさせる前記標的核酸の断片化処理物における捕捉プローブ結合位置からの距離が、該標的核酸の断片化処理物の核酸長の最頻値以下の範囲に、複数の検出プローブをハイブリダイズさせ、かつ、前記捕捉プローブとハイブリダイズさせる前記標的核酸の断片化処理物の、核酸長の最頻値が100塩基から1500塩基の範囲である、方法。
(2) 前記標的核酸の断片化処理物と、複数の検出プローブと、支持体に固定した捕捉プローブとを逐次的又は同時に接触させる工程は、前記標的核酸の断片化処理物を、複数の検出プローブとハイブリダイズさせ、次いで前記複数の検出プローブとハイブリダイズした前記標的核酸の断片化処理物と、前記捕捉プローブとをハイブリダイズさせることにより逐次的に行われる(1)記載の方法。
(3) 前記捕捉プローブとハイブリダイズさせる前記標的核酸の断片化処理物が、核酸増幅法による増幅を経ていないものである(1)又は(2)記載の方法。
(4) 前記標的核酸を含む、動物由来の検体を前記検出方法に供し、該検出方法は、動物ゲノム中に存在する少なくとも１種の反復配列を内部標準として検出する工程をさらに含み、該反復配列は、動物ゲノム断片中に含まれる、(1)〜(3)のいずれか１項に記載の方法。
(5) 前記動物ゲノムを断片化する工程をさらに含み、前記反復配列は、断片化された動物ゲノム中に含まれる(4)記載の方法。
(6) 前記動物がヒトである(4)又は(5)記載の方法。
(7) 前記反復配列が、短分散型核内反復配列である(4)〜(6)のいずれか１項に記載の方法。
(8) 前記短分散型核内反復配列がAlu配列である(7)記載の方法。
本発明によれば、ＰＣＲ法のような核酸増幅、または増感技術を用いるなくでも高感度に核酸検出を行うことができる。
本発明の方法の原理を説明するための概念図である。 核酸長分析の例を示す図である。 実施例１における捕捉プローブおよび検出プローブの位置を概念的に示す図である。 実施例２における捕捉プローブおよび検出プローブの位置を概念的に示す図である。 変異解析におけるサンドイッチハイブリの概念図である。 実施例３および実施例４における、k-ras変異捕捉プローブおよび検出プローブの位置を概念的に示す図である。 実施例３および実施例４における、ＥＧＦＲ変異捕捉プローブおよび検出プローブの位置を概念的に示す図である。 内部標準として、ヒト由来の検体中に含まれるヒトゲノム中のAlu配列を用いて本発明の方法を行う実施形態を模式的に示す図である。
本発明の検出方法に供せられる標的核酸としては、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの標的核酸を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液や、各種組織、パラフィン包埋検体（ＦＦＰＥ）およびその切片、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる標的核酸は、血液や細胞から常法により抽出した検体核酸であってもよく、検体から抽出したＤＮＡやＲＮＡなどを用いることができる。ＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ，ウイルスＤＮＡ，細菌、カビ等のＤＮＡ、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡ，それらの一部である断片などを用いることができるがこれらに限定されるものではない。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，ｓｍａｌｌ ＲＮＡやそれらの一部である断片などを用いることができるがこれらに限定されるものではない。また、化学的に合成したＤＮＡ、あるいはＲＮＡ等も標的核酸として用いることができる。
検体核酸には、測定の対象とする標的核酸以外の核酸成分（非標的核酸）も含まれていることがある。これら非標的核酸は、標的核酸との性状の差を考慮して除去してもかまわないし、除去せずに被検物質として用いてもよい。
標的核酸は、該標的核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよく、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を標的核酸とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。もっとも、本発明の方法によれば、核酸増幅法を用いなくても十分な感度で標的核酸の検出を行うことができ、また、核酸増幅法を用いると擬陽性の問題や操作に手間がかかる等の問題が生じるので、本発明は、核酸増幅法による増幅を経ていない標的核酸又はその断片化処理物に適用される場合に特に威力を発揮するものである。
本発明の方法は、標的核酸の有無、ウイルスの遺伝子型、細菌の種および株、カビの種および株等を区別した検出、ＳＮＰ（一塩基多型）の検出、メッセンジャーＲＮＡの検出、ｍｉＲＮＡの検出、ＣＧＨ、コピー数変動、ゲノムＤＮＡ配列の欠落・重複・融合、あるいは転写産物の欠落・重複・融合の検出に用いることができる。また、検出プローブからの信号強度を測定することにより標的核酸の定量にも適用することができる。なお、標的核酸の定量を行えば、必然的に標的核酸の検出が行われることになるので、本発明の「検出方法」は定量を伴う場合も包含する。
本発明の方法には、標的核酸をそのまま適用することも可能であるし、標的核酸の断片化処理物を適用することも可能である。もっとも、標的核酸が長い場合（１５００塩基以上、特に４０００塩基以上の場合）には、断片化処理により、後述するように適切な長さに断片化した断片化処理物を適用することが好ましい。断片化処理物は、生じた核酸断片から特定の核酸断片を選択する必要はなく、断片化処理物をそのまま本発明の方法に供することができ、それによって検出感度を高めることが可能である。
断片化のために標的核酸を切断する方法としては、超音波を照射して切断する方法、酵素で切断する方法、制限酵素で切断する方法、ネブライザーを用いる方法、酸やアルカリで切断する方法などを用いることができる。超音波で切断する方法の場合、標的核酸に照射する超音波の出力強度と照射時間を制御することにより、所望の長さに切断することが可能である。
処理した標的核酸は、以下に述べる電気泳動法などの分析手段を用いて断片化の度合いを分析することができる。分析した結果、超音波処理が不十分であれば、さらに超音波処理を施し、所望の条件の標的核酸が得られるまで処理を行うことができる。超音波処理装置の例として、アコースティックソルビライザー（コバリス社）、バイオラプター（東湘電気）、超音波式ホモジュナイザー（タイテック社、VP-050）などが例示できる。コバリス社アコースティックソルビライザーS220は、Duty Factor、Peak incident power, Cycles per burst, timeの4つのパラメータを設定することで、所望の長さまで切断することができる。核酸長の最頻値を400塩基にしたい場合は、Duty Factorを１０％、Peak incident powerを１４０, Cycles per burstを２００, timeを５５に設定すると良い。その他の長さに切断したいときには、コバリス社の推奨設定に従えば良い。
酵素で切断する方法として、ｄＳＤＮＡｓｈｅａｒａｓｅ（ザイモリサーチ社）や制限酵素等を用い、加温時間の加減により所望の長さの核酸断片を得ることができる。一例として、ｄＳＤＮＡｓｈｅａｒａｓｅを用いる場合は、メーカー推奨の加温時間に従えば良い。例えば、核酸長の最頻値を300塩基にしたい場合は、37℃で40分間インキュベーションすると良いとされている。その他のＤＮＡ切断方法についても同様に、処理の条件を加減することで切断断片の長さを制御することができる。
断片化処理した標的核酸は、核酸長の最頻値を指標に評価することができる。核酸長の最頻値とは、断片化した核酸をアガロースゲル電気泳動やバイオアナライザー（アジレント社、ＤＮＡ７５００キット、 ＲＮＡ６０００ｎａｎｏキット）といった電気泳動法を用いて得られるピークトップ値を指す。電気泳動した結果をエレクトロフェログラムで表示し、波形の最も高い位置をピークトップとし、ピークトップから下ろした垂線とｘ軸との交点の値を核酸長の最頻値と定義する。核酸長の分析方法は特許４６１９２０２などを参照できる。アガロースゲル電気泳動で分析する場合には、ＤＮＡラダー（タカラバイオ社 型番：3415Aなど）を同時に泳動し、その移動度を指標に、切断断片のピークトップを測定することができる。図２Ａは、ラダーマーカーと切断した核酸のアガロースゲル電気泳動像である。この画像をＮＩＨ Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ）のような画像処理ソフトを使い、輝度を波形で表示させる。このとき、ラダーマーカーごとに電気泳動の原点からの距離を求める。切断した核酸の場合は、ピークトップ、すなわち最も輝度が高い部分までの距離を求める。ラダーマーカーから得られた距離を元に、図２Ｃに示したような、検量線と回帰式が得られる。回帰式に距離Ｙを代入することで、切断した標的核酸の最頻値を求めることができる。以上のようにして分析すると、図２で使用した切断した標的核酸の核酸長の最頻値は１５８塩基となる。
波形の形状は、どのようであっても構わないが、ブロードであるよりシャープである方がより好ましい結果を生じさせる。
上記の種々の方法によって、所望の核酸長の最頻値を有する切断断片を得ることができる。核酸長の最頻値は、１００塩基から１５００塩基の間である。好ましい範囲は２５０塩基から５００塩基である。
非標的核酸が混入した被検物質を用いる場合においても、上記と同様に断片化処理を施し、核酸長の最頻値を評価することができる。
支持体はスライドガラスやメンブレン、ビーズなどを用いることができる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。このように、本発明によれば、従来からこの分野において常用されている支持体を用いることが可能であり、光平面導波路のような特殊な支持体を用いる必要はない。コスト面や煩雑性を回避する観点から、支持体は光平面導波路ではないことが好ましい。
捕捉プローブとは、被験試料に含まれる標的核酸と直接的に、選択的に結合し得る物質を意味する。本発明の標的核酸を検出する方法においては、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう捕捉プローブに該当する。本発明に用いる捕捉プローブは、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。捕捉プローブとして、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが２００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。
捕捉プローブは、標的核酸配列と相補的な配列を含んでいれば良く、どの領域を選択しても良い。以下で述べる検出プローブの配列と重複しないことが好ましい。また、標的核酸の異なる領域とハイブリダイズする複数種類の捕捉プローブを用いることもできる。もっとも、本発明の方法によれば、捕捉プローブは１種類であっても満足できる検出感度が得られるので、捕捉プローブは各標的核酸に対して１種類であるのが単純で好ましい。
標的核酸が、二本鎖ＤＮＡである場合、ワトソン鎖（センス鎖）、クリック鎖（アンチセンス鎖）のいずれかの鎖に対して相補的な配列を捕捉プローブとして選択することができる。以下で述べる検出プローブと捕捉プローブは、同じ鎖の配列を選択することが好ましい。
検体核酸に含まれる、異なる標的核酸を区別して検出する場合は、例えば、患者に感染しているウイルスの型を区別して検出するなど、検体核酸に含まれうる核酸配列の中から、特異性が高い配列領域を選択することが好ましい。すなわち、捕捉プローブとして選択した配列が、検体核酸に含まれる全ての配列において、当該領域以外に相同性の高い配列がないことを意味する。
一塩基多型の検出に用いることのできる捕捉プローブの設計について、特許文献３で提案されている方法を用いることができる。具体的には、変異が疑われる塩基を、捕捉プローブの中央に配し、その前後の１０塩基を付加し、全長２１塩基の捕捉プローブとする。変異が疑われる塩基部分にＡを配した捕捉プローブと、変異が疑われる塩基部分にＴを配した捕捉プローブと、変異が疑われる塩基部分にＧを配した捕捉プローブと、変異が疑われる塩基部分にＣを配した捕捉プローブとを捕捉プローブセットとして用いることができる（図５）。さらに、複数のSNPを検出する場合においては、捕捉プローブセット間でＴｍ値が近くなるような配列を選択することが、より好ましい。捕捉プローブ配列の長さを調整する、ＬＮＡなどの人工核酸を用いるといった方法を用いることができる。
相同性（％）は、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、相同性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、相同性（％）は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ ６２ ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０ ｍａｔｒｉｘ、並びにｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４、及びｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５若しくは６のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。
検出プローブとは、被験試料に含まれる標的核酸と直接的に、結合し得る物質を意味する。本発明の標的核酸を検出する方法においては、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう検出プローブに該当する。本発明に用いる検出プローブは、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。検出プローブとして、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが２００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。
標的核酸が、二本鎖ＤＮＡである場合、ワトソン鎖、クリック鎖のいずれかの鎖に対して相補的な配列を検出プローブとして選択することができる。上述した捕捉プローブと検出プローブは、同じ鎖の配列を選択することが好ましい。
検出プローブは、標的核酸配列と相補的な配列を含んでいれば良く、どの領域を選択しても良い。ただし、上述した捕捉プローブの配列と重複しないことが好ましい。さらに、捕捉プローブ設計位置から１５００塩基以内の範囲の配列を選択することが好ましい。
検出プローブの配列は、捕捉プローブと相同性が低いことが望ましく、相同性が８０％以下になることが好ましいが、ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーを勘案して決定することができる。
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望する標的核酸の検出のために用意した捕捉プローブ、および検出プローブとしての機能を得るための条件を適宜決定することができる。
検体核酸に含まれる、複数種類の標的核酸を検出する場合、検出対象の標的核酸の間で相同性が１００％である配列を、共通検出プローブとして用いることができる。共通検出プローブは、検出対象の標的核酸の間で相同性が１００％でない場合、縮重配列を用いても良い。縮重配列については、「バイオ実験イラストレイテッド 本当にふえるＰＣＲ」、（1999年）、中山広樹編、（株）秀潤社発行、121頁〜125頁を参考にすることができる。
検出プローブには標識体を結合させることができる。検出プローブが核酸である場合、5'末端または3'末端のいずれか、または両方に標識体を結合させることができる。また、検出プローブ内部にも標識体を導入することが可能である。標識体の結合には化学反応、酵素反応などを用いることができる。好ましくは、化学反応を用いて反応させる。さらに好ましくは、検出プローブを化学合成する際に、末端に標識体を結合させる。検出プローブの内部にも標識体を結合させることができる。標識体の結合には化学反応を用いることができ、合成機でビオチン標識を挿入することができる。Biotin-TEG、Biotin-ON, Biotin-dTなどを挿入することができる（https://www.operon.jp/index.php）。
本発明において、使用できる標識体としては、タンパク質結合性物質、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、タンパク質結合性物質である。タンパク質結合性物質の例としてビオチンがあげられる。ビオチンはアビジンあるいはストレプトアビジンと結合することができる。アビジンあるいはストレプトアビジンに蛍光色素が結合したもの、アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素が結合したものを用いることができる。アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼを用いる場合には、それぞれの基質を添加し、基質と酵素が反応した結果、発光反応が生じる。発光反応は、プレートリーダーやＣＣＤカメラなどを用いて検出する。
なお、このように、本発明によれば、従来からこの分野において常用されている標識を用いることが可能であり、エバネッセント性励起発光により検出可能であるシグナルを提供するラベルのような特殊な標識を用いる必要はない。コスト面や煩雑性を回避する観点から、標識はエバネッセント性励起発光により検出可能であるシグナルを提供するラベルではないことが好ましい。
標識体として、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素を用いても良い。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスター、BODIPY系色素、フィコエリスリンなどの公知の蛍光色素が挙げられる。
また、標識体として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、カルコパイライト系微粒子、、シリコン（Si）、などが挙げられる。蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナなどにより行うことができる。
検出されたシグナルは、周辺ノイズと比較される。具体的には、捕捉プローブが固定されている位置から得られたシグナル値と、それ以外の位置から得られたシグナル値を比較し、前者の数値が上回っている場合を検出されたとする。
支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体上面部でオリゴＤＮＡを合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴＤＮＡを支持体上面部へ滴下し固定する方法が知られている。前者の方法にはRonaldらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Michelらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Francescoらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）がある。これらの方法ではＤＮＡ合成反応時に有機溶媒を用いるため、担体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。例えば、特表平１０−５０３８４１号公報に記載の方法を用いて作製した凹凸構造を有したガラス担体を用いることができる。特にFrancescoらの方法においては担体の裏面から光を照射し、ＤＮＡ合成を制御するため、担体は透光性を有する材質であることが好ましい。後者の方法には、廣田ら（特許第３９２２４５４号）の方法やガラスキャピラリーを用いることができる。ガラスキャピラリーの一例としては、自作したガラスキャピラリーやマイクロピペット（（株）マイクロサポート社製；ＭＰ−００５）などの市販製品を用いることができるが、これらの方法に限定されるものではない。
生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（ Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３： ２３０３ （１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（ Favaloro et.al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
本発明の方法は、サンドイッチハイブリダイゼーションであるので、基本的な操作自体は公知のサンドイッチハイブリダイゼーションと同じである。すなわち、標的核酸又はその断片化処理物と、複数の検出プローブと、支持体に固定した捕捉プローブとを逐次的又は同時に接触させて、前記捕捉プローブと前記標的核酸又はその断片化処理物をハイブリダイズさせ、かつ、前記標的核酸又はその断片化処理物と前記複数の検出プローブをハイブリダイズさせ、それによって、前記複数の検出プローブを、前記捕捉プローブと前記標的核酸又はその断片化処理物を介して前記支持体に結合させ、次いで、支持体に結合された前記複数の検出プローブを検出する。標的核酸又はその断片化処理物と、複数の検出プローブと、支持体に固定した捕捉プローブとを逐次的又は同時に接触させる工程は、(1)先ず標的核酸又はその断片化処理物と、複数の検出プローブとを接触させてハイブリダイズさせ、次に、複数の検出プローブとハイブリダイズした標的核酸又はその断片化処理物を支持体上に固定化された捕捉プローブと接触させてハイブリダイズさせてもよいし、(2)逆に、先ず標的核酸又はその断片化処理物と、支持体上に固定化された捕捉プローブと接触させてハイブリダイズさせ、次に捕捉プローブとハイブリダイズした標的核酸又はその断片化処理物と複数の検出プローブとを接触させてハイブリダイズさせてもよいし、(3) 標的核酸又はその断片化処理物と、複数の検出プローブと、支持体に固定した捕捉プローブとを同時に接触させて前記捕捉プローブと前記標的核酸又はその断片化処理物をハイブリダイズさせ、かつ、前記標的核酸又はその断片化処理物と前記複数の検出プローブをハイブリダイズさせてもよい。これらのうち、上記(1)の方法により逐次的に接触させる方法が検出感度が高くなる場合が多いので好ましい。
各ハイブリダイゼーション工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、３０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。
図１を用いて本発明の概念を説明する。例として、全長で３０００塩基ある標的核酸を用いて検出するものとする。
捕捉プローブは、標的核酸のどの部分に設計しても良いが、この例では標的核酸の先頭から２２００塩基〜２２３０塩基目までを捕捉プローブが結合する配列として用いた。検出プローブは、捕捉プローブが結合する領域から１５００塩基の範囲含まれる領域に４本を設計した。各検出プローブと配列領域は次の通りである。検出プローブ１：２０００塩基目〜２０１９塩基目、検出プローブ２：２１００塩基目〜２１１９塩基目、検出プローブ３：２３１９塩基目〜２３３０塩基目、検出プローブ４：２４１９塩基目〜２４３０塩基目。
捕捉プローブからの距離は、標的核酸配列上に捕捉プローブ結合位置および検出プローブ結合位置を配し、最も遠い塩基を端部としてその間の塩基数を数える。図１Ｂの例を用いて説明する。検出プローブ２：２１００塩基目〜２１１９塩基目と、捕捉プローブ：２２００塩基〜２２３０塩基目の距離は、最も遠い塩基の位置を端部として数えるため、距離は１３１塩基となる。検出プローブ３：２３１９塩基目〜２３３０塩基目と、捕捉プローブ：２２００塩基〜２２３０塩基目の距離は、最も遠い塩基の位置を端部として数えるため、距離は１３１塩基となる。このように計算すると、検出プローブ１，４と捕捉プローブの距離はともに２３１塩基となる。
次に標的核酸を、核酸の最頻値が２５０塩基になるように切断する。この標的核酸と、検出プローブ１，２，３，４と、捕捉プローブをハイブリダイゼーションさせた模式図が図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃである。
標的核酸は、任意の位置で切断されているため、図１のように種々の結合形態が生じうる。
図１Ａは、標的核酸が、２２３１塩基目以降で切断された断片のハイブリダイゼーションの形態を示している。標的核酸に、検出プローブ１と検出プローブ２が結合することができる。
図１Ｂは、標的核酸が、２１００塩基目の前と、２３３０塩基目の後ろで切断された断片のハイブリダイゼーションの形態を示している。標的核酸に、検出プローブ２、検出プローブ３が結合することができる。
図１Ｃは、標的核酸が、２２００塩基目の前と、２４３０塩基目の後ろで切断された断片のハイブリダイゼーションの形態を示している。標的核酸に、検出プローブ３，検出プローブ４が結合することができる。
検出プローブを複数本用意し、さらに標的核酸を、核酸長の最頻値を２５０塩基になるよう切断することで、図１のいずれかの形態で検出することができる。
一方、検出プローブを１つだけ用意した場合には、いずれかの場合において、検出することができない。例えば、検出プローブ１だけであれば、図１Ｂ、図１Ｃの場合は検出することができないため、検出感度は低下する。
また、核酸長の最頻値を１５０塩基とした場合には、捕捉プローブに結合した標的核酸に結合できる検出プローブは、検出プローブ２と検出プローブ３である。そのため、検出感度は低下する。
なお、図１においては、捕捉プローブの両側に検出プローブを設計した例示をしたが、検出プローブは、捕捉プローブの3'末端側のみ、あるいは5'末端側のみであってもよい。
一般に、本発明のような核酸の検出方法においては、検出方法自体が正しく行われたか否かを確認するために、内部標準も同時に検出している。すなわち、検出方法によって、標的核酸が検出されなかった場合、被検試料中に標的核酸が存在していなかったのか、検出方法が正しく行われなかったのかの判別ができない。このため、被検試料中に普遍的に存在する核酸領域を内部標準として用い、この内部標準が検出されれば検出方法は正しく行われたと判断し、内部標準が検出されなければ検出方法が正しく行われなかったと判断することが行われている。被検試料がヒト由来の場合、内部標準としては、アクチンやグロビンが一般的に用いられている。本発明の方法においても、従来の方法と同様、アクチン遺伝子やグロビン遺伝子を内部標準として用いることができ、特に、標的核酸又はその断片化処理物をＰＣＲ等により増幅する場合は、従来の方法と同様な内部標準を問題なく用いることができる。
しかしながら、本発明の検出方法は、上記の通り、核酸増幅法を行わなくても十分な感度で標的核酸を検出できるという優れた効果を発揮する方法である。核酸増幅法を行わない場合、アクチン遺伝子やグロビン遺伝子は、ゲノム中に１コピーしかないので、感度が不十分となり、検出方法が正しく行われたにもかかわらず、内部標準が検出されない恐れが生じる。
この問題を克服するために、本発明の好ましい実施形態では、前記標的核酸を含む、ヒト等の動物由来の検体を前記検出方法に供し、動物ゲノム中に存在する少なくとも１種の反復配列を内部標準として検出する。この反復配列は、動物ゲノム断片中に含まれる。動物ゲノム断片は、動物ゲノムの断片化処理により生じたものでもよいし、自然に生じた断片でもよい。ゲノム断片の好ましい長さは、上記した標的核酸又はその断片化処理物の好ましい長さと同様である。動物としては、ヒト；イヌやネコ等のペット；ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜；サル、マウス、ラット等の実験動物等の哺乳動物が好ましく、特にヒトが好ましいがこれらに反復配列が存在する他の動物でもよい。反復配列としては、レトロトランスポゾン、特に短分散型核内反復配列(short interspersed nuclear sequence, SINE)が好ましく、とりわけ、ヒトゲノム中に１００万コピー存在するAlu配列が好ましい。Alu配列自体は周知の配列であり、その塩基配列も周知である（配列番号４７）。
標的核酸がウイルスＤＮＡであり、ヒトゲノムを含むヒト由来検体を検出方法に供する場合の本発明の方法の原理を説明するための概念図を図８に示す。図８に示す方法では、内部標準としてヒトAlu配列を用いている。Alu配列を補足するヒトAlu配列捕捉プローブを支持体に固定化し、捕捉されたヒトＤＮＡを検出する複数種類のヒトAlu配列検出用プローブを捕捉されたヒトAlu配列とハイブリダイズさせて、捕捉されたヒトAlu配列を検出する。ここで、ヒトAlu配列等の動物ＤＮＡの検出は、上記した標的核酸又はその断片化処理物の検出方法と同様に行うことができ、好ましい条件も上記と同様である。
実施例１
本発明を、患者に感染しているウイルスの型を区別して検出する例として、ヒトパピローマウイルス検出の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
ヒトパピローマウイルスは子宮頸がんの原因ウイルスとして知られている。ヒトパピローマウイルスには、１００種以上の型が存在し、その中でも子宮頸がんの原因となる悪性度の高い型として１３種が存在している。子宮頸がんの予防医学において、被験者がどの型のウイルスに感染しているか知ることは、治療方針を考える上で重要な情報となる。ヒトパピローマウイルスの型判別は、子宮頸部のぬぐい液から行われる。ハイブリッドキャプチャー法、PCR法などが知られている。本発明をヒトパピローマウイルスの検出に適用することにより、被験者が感染しているウイルスの型を高感度に特定することができる。
（捕捉プローブ、検出プローブの設計）
ヒトパピローマウイルスの型判別の研究は、古くから行われており、捕捉プローブはその研究成果を活用することができる。ここでは、一例として文献（j.clin.microbiol, 1995. p.901-905）で報告された捕捉プローブ配列を用いた（表１）。この文献では、ヒトパピローマウイルスのL1遺伝子領域の配列を用いて型を判別することができるよう捕捉プローブを設計しており、型に共通のPCRプライマーＭＹ１１，ＭＹ０９を用いて対象配列を増幅したのち、各型に特異的に結合する捕捉プローブを固定したフィルターにハイブリダイゼーションさせ、検出するという仕組みである。そのため、捕捉プローブの設計位置は、どの型であってもL1遺伝子のほぼ同じ領域に位置している。本発明では、捕捉プローブの位置と共通プライマーの配列に着目し、共通プライマーを、共通の検出プローブとして用いることで、捕捉プローブからの距離は、型間でほぼ同一となるようにした（図３、表２）。上記配列を有した捕捉プローブは、５’末端にアミノ基修飾をいれた合成DNAをオペロン社にて合成した。検出プローブは、3’末端、および5’末端にビオチン標識をしたものをオペロン社にて合成した。
（DNAチップの作製）
DNAチップ“3D-Gene”（登録商標）（http://www.3d-gene.com/en/products/pro_009.html）の基板に、表１の捕捉プローブの全てを固定したDNAチップを作製した。詳細は以下に記す。
（ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製の担体を得た。ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学社、＃３０５０Ｂ）を含有させており、担体は黒色である。担体の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、担体の中央部分を除き表面は平坦であった。担体の中央には、直径１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部を６４（８×８）箇所設けた。凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．６ｍｍであった。
（プローブＤＮＡの固定化）
表１の捕捉プローブＤＮＡは、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ(ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ＬにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５)でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。そして、これらの混合溶液をガラスキャピラリーで担体凸部上面に点着した。次いで、担体を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。捕捉プローブＤＮＡを固定化後、ＤＮＡチップの中央部分にカバーを貼り付け、ＤＮＡチップとカバーとの間に、ハイブリダイゼーション反応時の溶液撹拌用にジルコニア製ビーズを封入した。
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、ヒトパピローマウイルスのゲノムDNAがクローニングされた組み替えプラスミドpHPV16をヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入し用いた。pHPV16は全長１６，６００塩基対であった。１塩基対の分子量を６８０とすると、１μgは８９ｎｍｏｌとなる。
検体ＤＮＡの調製方法を以下に示す。１μgのpHPV１６は、超音波処理（コバリス、ｓ２２０）によって断片化した。断片化の処理条件は、メーカー推奨の方法に従い、１００塩基、１５０塩基、２５０塩基、４００塩基、１５００塩基、４０００塩基となるよう設定した。断片の長さは、バイオアナライザー（アジレント社）を用いて評価し、各処理条件で得られた断片化核酸のピークトップは、１００塩基、１５０塩基、２５０塩基、４００塩基、１５００塩基、４０００塩基であった。切断した検体ＤＮＡの濃度は、ナノドロップ（サーモフィッシャー社、ND-1000）を用いて測定し、核酸の濃度を求めた。核酸濃度から、各切断した溶液に含まれる切断したDNAを、1 amol/μLまで１Ｘハイブリダイゼーション溶液で希釈し、検体DNAとした。
（検出プローブ溶液の調製）
検出プローブは、濃度が100 fmol/μLになるよう滅菌水で希釈した。複数の検出プローブを混和して用いる場合でも、同様に各検出プローブの濃度は100 fmol/μLとなるよう滅菌水で希釈した。
（ハイブリダイゼーション）
検体DNA 5μLに、希釈した検出プローブ液1μLを混和し、サーマルサイクラーを用いて、９５℃で５分間加熱した。加熱後、室温に戻るまで、机上に２分間静置した。この溶液に、１Ｘハイブリダイゼーション溶液（１重量％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５０ｎｇ/ｍｌ サケ精子ＤＮＡの溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％フォルムアミド）を35μL加え、ハイブリ溶液とした。全量をDNAチップに注入し、３２℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、“3D-Gene”の標準プロトコールに従い、250rpmで旋回撹拌をしながら、32℃で２時間行った。ハイブリダイゼーション後、DNAチップを30℃に加温した洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。さらに、ストレプトアビジンフィコエリスリン（プロザイム社）を染色溶液（５０ｎｇ／μｌストレプトアビジンフィコエリスリン、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ＮａＣｌ，０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意し、DNAチップ上に滴下した。３５℃で５分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液（６ＸＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。染色済みのDNAチップは、DNAチップスキャナ（東レ）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。
検出結果を表３に示す。４種類の検出プローブを混和して検出した結果から、切断しない場合、４０００塩基に切断した場合に比べ、１５００塩基以下に切断した検体では優位に検出シグナルが向上していることがわかる。特に、２５０塩基、５００塩基で最も感度が高くなり、さらに短く切断すると感度が低下し始めることがわかる。
次に、検出プローブを個別に用いて検出した結果では、GP5およびGP6については、上記４種混合で検出したときと同様の挙動を示している。MY11についても同様の挙動であるが、検出プローブの結合度が低いためか、GP5、GP6にくらべシグナル強度は劣っている。MY09は、捕捉プローブから３４０塩基離れた場所に設計された検出プローブで、DNA長が250塩基以下に切断した場合には、標的核酸に結合する領域がなく、検出プローブとして機能しないことが予想された。実施例でも、５００塩基および１５００塩基ではシグナルが得られているが、２５０塩基以下ではシグナルが得られていない。
個別の検出プローブで得られるシグナル強度の和が、４種を混合して用いた時のシグナル強度と同等であることは容易に推測される。表３の最下段に個別の検出プローブで得られたシグナル強度の和を示した。これに対し、標的核酸を１５００塩基以下に切断した場合において、４種混合で用いた場合のシグナル強度は非常に大きな値を示している。これは、複数の検出プローブが結合することにより、捕捉プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションが強められたものと推測された。
実施例２
本発明を、ヒトパピローマウイルス検出の別の実施形態によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（捕捉プローブ、検出プローブの設計）
捕捉プローブは実施例１と同様、文献で報告のある配列を用いた（j.clin.microbiol, 1995. p.901-905、表１）。一般的に、核酸のハイブリ結合強度は、長い方が強くなる。そこで、検出プローブを、図４および表４に示したように捕捉プローブの前後の配列に８０〜８６塩基の長さをもつ配列を５領域分用意した。
上記配列を有した捕捉プローブは、５’末端にアミノ基修飾をいれた合成DNAをオペロン社にて合成した。検出プローブは、内部にビオチン標識を導入したものをオペロン社にて合成した（表４）。
（DNAチップの作製）
表１の全ての捕捉プローブを固定したDNAチップを作製した。ＤＮＡチップの作製方法は、実施例１と同様である。
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、ヒトパピローマウイルスのゲノムDNAがクローニングされた組み替えプラスミドpHPV16をヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入し用いた。pHPV16は全長１６，６００塩基対であった。１塩基対の分子量を６８０とすると、１μgは８９ｎｍｏｌとなる。
検体ＤＮＡの調製方法を以下に示す。5μgのpHPV16は、超音波処理（コバリス、ｓ２２０）によって断片化した。断片化の処理条件は、メーカー推奨の方法に従い、１５０塩基、２５０塩基となるよう設定した。断片の長さは、バイオアナライザー（アジレント社）を用いて評価し、各処理条件で得られた断片化核酸のピークトップは、１５０塩基、２５０塩基であった。切断した検体ＤＮＡの濃度は、ナノドロップ（サーモフィッシャー社、ND-1000）を用いて測定し、核酸の濃度を求めた。核酸濃度から、各切断した溶液に含まれる切断したDNAを、1 amol/μLまで１Ｘハイブリダイゼーション溶液で希釈し、検体DNAとした。
（検出プローブ溶液の調製）
検出プローブは、濃度が100fmol/μLになるよう滅菌水で希釈した。複数の検出プローブを混和して用いる場合でも、同様に各検出プローブの濃度は100fmol/μLとなるよう滅菌水で希釈した。
（ハイブリダイゼーション）
検体DNA 5μLに、希釈した検出プローブ液1μLを混和し、サーマルサイクラーを用いて、95℃で5分間加熱した。加熱後、室温に戻るまで、机上に２分間静置した。この溶液に、ハイブリダイゼーション溶液１Ｘハイブリダイゼーション溶液（１重量％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５０ｎｇ/ｍｌ サケ精子ＤＮＡの溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％フォルムアミド）を３５μL加え、ハイブリ溶液とした。全量をDNAチップに注入し、３２℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、“3D-Gene”の標準プロトコールに従い、250rpmで旋回撹拌をしながら、32℃で２時間行った。ハイブリダイゼーション後、DNAチップを30℃に加温した洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。さらに、ストレプトアビジンフィコエリスリン（プロザイム社）を染色溶液（５０ｎｇ／μｌストレプトアビジンフィコエリスリン、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ＮａＣｌ，０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意し、DNAチップ上に滴下した。35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液（６ＸＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。染色済みのDNAチップは、DNAチップスキャナ（東レ）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。
検出結果を表５に示す。５種類の検出プローブを混和（５種混合）して検出した結果から、１５０塩基に比べ２５０塩基のシグナル強度が高い。１５０塩基に切断した場合に有効な検出プローブは２本であるのに対して、２５０塩基に切断した場合に有効な検出プローブは３本である。結合できた検出プローブの本数の差により、シグナル強度の差が生じたといえる。一方、２５０塩基に切断した標的核酸を、４種混合と５種混合で検出した結果を比較すると、５種混合の方がシグナル強度が高い。これは、４種混合を用いた場合の有効な検出プローブが２本であるのに対し、５種混合では３本である。結合できた検出プローブの本数の差により、シグナル強度の差が生じたといえる。
以上のように、複数の検出プローブを用意し、かつ、検出プローブの結合領域を考慮した標的核酸の切断を行うことにより、特に十分なシグナル強度を得ることができる。なお、５種混合の検出プローブを用いた場合、標的核酸は４００塩基前後（±５０塩基程度）、さらには４００塩基に切断することが好ましい。
実施例３
本発明を、ＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphisms）検出によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。がん患者において、EGFR遺伝子やk-ras遺伝子の変異の有無によって、抗がん剤の奏功率が異なることが知られており、抗がん剤投与の判断材料になっている。既存の技術では、ＰＣＲで増幅したのちに種々の方法を用いて検出している。
（捕捉プローブ、検出プローブの設計）
ＳＮＰ検出の捕捉プローブは、SNPサイトをプローブの中央に位置させる。具体的には、SNPサイトの前後１０塩基を捕捉プローブ配列として用いる。ＳＮＰ検出の場合、捕捉プローブはＳＮＰサイトを全ての塩基の組み合わせを用意し、捕捉プローブセットとして用いる。具体的には、野生型：Ｇ，変異型：ＡのＳＮＰサイトの場合、ＧまたはＡの前後１０塩基を含む２１塩基を捕捉プローブとして用いる。また、比較対象とするため、プローブの中央部分をＴまたはＣにし、前後１０塩基を含む２１塩基を捕捉プローブとする。以上の４配列を捕捉プローブセットとして用いる。このようにして、k-ras変異であるGly１２Ser、 Gly１２Arg、Gly１２CysおよびEGFR変異であるT７９０Mに対する捕捉プローブセットを用意した（表６）。
検出プローブは、捕捉プローブ設計からの距離を考慮した上で、図６および図７の位置に設計した。検出プローブの配列および捕捉プローブからの距離を表７，表８に示した。
上記配列を有した捕捉プローブは、５'末端にアミノ基修飾をいれた合成DNAをオペロン社にて合成した。検出プローブは、3'末端、および5'末端にビオチン標識をしたものをオペロン社にて合成した。
（DNAチップの作製）
表６の全ての捕捉プローブを固定したＤＮＡチップを作製した。ＤＮＡチップの作製方法は、実施例１と同様である。
（検体ＤＮAの調製）
検体ＤＮＡとしてA549細胞から抽出したDNAを用いた。A549細胞は、肺がん組織由来の培養細胞であり、Gly12Serの変異が入っていることが知られている。Ａ５４９細胞から抽出した５μｇのＤＮＡを超音波処理（コバリス、ｓ２２０）によって断片化した。断片化の処理条件は、メーカー推奨の方法に従った。断片の長さは、バイオアナライザー（アジレント社）を用いて評価した。核酸長の最頻値は７５０塩基であった。切断したDNAの全量を検体DNAとして用いた。
（検出プローブ溶液の調製）
検出プローブは、混和し、それぞれの濃度が100fmol/μLになるよう滅菌水で希釈した。
（ハイブリダイゼーション）
検体DNA 5μLに、希釈した検出プローブ液1μLを混和し、サーマルサイクラーを用いて、95℃で5分間加熱した。加熱後、室温に戻るまで、机上に２分間静置した。この溶液に、ハイブリダイゼーション溶液（組成確認。１重量％ＢＳA（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮAの溶液）を35μL加え、ハイブリ溶液とした。全量をDNAチップに注入し、32℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、“3D-Gene”の標準プロトコールに従い、250rpmで旋回撹拌をしながら、32℃で２時間行った。ハイブリダイゼーション後、DNAチップを30℃に加温した洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。さらに、ストレプトアビジンフィコエリスリン（プロザイム社）を染色溶液（５０ｎｇ／μｌストレプトアビジンフィコエリスリン、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ＮａＣｌ，０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意し、DNAチップ上に滴下した。35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液（６ＸＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。染色済みのDNAチップは、DNAチップスキャナ（東レ）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。
検出結果を表９に示す。ＥＧＦＲ捕捉プローブセットでは、野生型のプローブが最もシグナル強度が高いため、Ａ５４９細胞においてＴ７９０Ｍ変異は生じていないと考えられる。Ｋ−ＲＡＳ捕捉プローブでは、Gly12Serのプローブのシグナル強度が最も高い。Ａ５４９細胞は、Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ変異が入っていることが知られており、本検出結果と一致した。
以上のように、サンドイッチハイブリを用いることで、ＰＣＲ増幅することなくＳＮＰを正しく検出することができた。
実施例４
実施例３で示したＫ−ｒａｓ遺伝子変異やＥＧＦＲ遺伝子変異は、抗がん剤投与の重要な指標であるが、それらの遺伝子発現の有無を別の手法で確認することも重要である。本発明は、ＲＮＡを直接検出することもでき、さらにそのＲＮＡ中の変異を検出することができる。これまでのＲＮＡ技術は、逆転写酵素でｃＤＮＡにしたのち、ＰＣＲ法で増幅する必要があった。逆転写する場合に用いられる逆転写酵素は、一般に変異が入りやすいため、誤検出の原因となる可能性がある。以下に、詳細について記すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（捕捉プローブ、検出プローブの設計）
実施例３と同様の捕捉プローブセット、および検出プローブを用いた。
（DNAチップの作製）
表６の全ての捕捉プローブを固定したＤＮＡチップを作製した。ＤＮＡチップの作製方法は、実施例１と同様である。
（検体ＤＮAの調製）
検体ＤＮＡとしてA549細胞から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた。A549細胞は、肺がん組織由来の培養細胞であり、Gly12Serの変異が入っていることが知られている。Ａ５４９細胞から抽出した５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを超音波処理（コバリス社、ｓ２２０）によって断片化した。断片化の処理条件は、メーカー推奨の方法に従った。断片の長さは、バイオアナライザー（アジレント社）を用いて評価した。核酸長の最頻値は２５０塩基であった。切断したＲＮＡの全量を検体ＲＮＡとして用いた。
（検出プローブ溶液の調製）
検出プローブは、混和し、それぞれの濃度が100fmol/μLになるよう滅菌水で希釈した。
（ハイブリダイゼーション）
検体ＲＮＡ 5μLに、希釈した検出プローブ液1μLを混和し、サーマルサイクラーを用いて、95℃で5分間加熱した。加熱後、室温に戻るまで、机上に２分間静置した。この溶液に、ハイブリダイゼーション溶液（組成確認。１重量％ＢＳA（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮAの溶液）を35μL加え、ハイブリ溶液とした。全量をDNAチップに注入し、32℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、“3D-Gene”の標準プロトコールに従い、250rpmで旋回撹拌をしながら、32℃で２時間行った。ハイブリダイゼーション後、DNAチップを30℃に加温した洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。さらに、ストレプトアビジンフィコエリスリン（プロザイム社）を染色溶液（５０ｎｇ／μｌストレプトアビジンフィコエリスリン、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ＮａＣｌ，０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意し、DNAチップ上に滴下した。35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液（６ＸＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。染色済みのDNAチップは、DNAチップスキャナ（東レ）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。
検出結果を表１０に示す。ＥＧＦＲ捕捉プローブセットでは、野生型のプローブが最もシグナル強度が高いため、Ａ５４９細胞においてＴ７９０Ｍ変異は生じていないと考えられる。Ｋ−ＲＡＳ捕捉プローブでは、Gly12Serのプローブのシグナル強度が最も高い。Ａ５４９細胞は、Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ変異が入っていることが知られており、本検出結果と一致した。
以上のように、サンドイッチハイブリを用いることで、ＲＮＡを逆転写することなく直接検出することができ、さらにＳＮＰを正しく検出することができた。
実施例５
本発明を、ヒトパピローマウイルス検出の別の実施形態によってさらに詳細に説明する。上述の実施例１及び実施例２では、ヒトパピローマウイルスＤＮＡを検出した。ヒト検体から核酸を抽出し、解析する場合において、検出シグナルが得られなかった時には、ヒト検体にパピローマウイルスが存在しなかったとうい解釈と、核酸の抽出作業や検出作業を失敗したという解釈の両方が考えられる。どちらであるか区別することは困難である。このような問題は、内部標準を用いることで、解消できる。
ヒト検体からヒトパピローマウイルスＤＮＡを抽出する時には、微量なヒトＤＮＡが検体溶液に含まれることが知られている。ヒトパピローマウイルスに感染していないヒト検体からは、ヒトパピローマウイルスＤＮＡは取得できないが、ヒトＤＮＡを得ることができる。この性質を利用し、ヒト検体から抽出した検体溶液に含まれるヒトＤＮＡを検出することで、ヒトパピローマウイルスＤＮＡ検出の内部標準として用いることができる。ここでは、パピローマウイルスの塩基配列が組み込まれたプラスミドＤＮＡとヒトゲノムＤＮＡを、混和した検体を、擬似的に用いる。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（捕捉プローブ、検出プローブの設計）
捕捉プローブは実施例１と同様、文献で報告のある配列を用いた（j.clin.microbiol, 1995. p.901-905、表１）。一般的に、核酸のハイブリ結合強度は、長い方が強くなる。そこで、検出プローブを、図４および表４に示したように捕捉プローブの前後の配列に８０〜８６塩基の長さをもつ配列を５領域分用意した。
上記配列を有した捕捉プローブは、５’末端にアミノ基修飾をいれた合成DNAをオペロン社にて合成した。検出プローブは、内部にビオチン標識を導入したものをオペロン社にて合成した（表４）。
ヒトゲノム中に繰り返し存在するAlu配列に対する捕捉プローブ及び検出プローブを、表１１に示した。上記配列を有した捕捉プローブは、５’末端にアミノ基修飾をいれた合成DNAをオペロン社にて合成した。検出プローブは、5’末端と３‘末端にビオチン標識を導入したものをオペロン社にて合成した。
（DNAチップの作製）
表１の全ての捕捉プローブ及び表１１配列番号４６の捕捉プローブを固定したＤＮＡチップを作製した。ＤＮＡチップの作製方法は、実施例１と同様である。
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、ヒトパピローマウイルスのゲノムDNAがクローニングされた組み替えプラスミドpHPV16をヒューマンサイエンス研究資源バンク（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）より購入し用いた。pHPV16は全長１６，６００塩基対であった。１塩基対の分子量を６８０とすると、１μgは８９ｎｍｏｌとなる。ヒトゲノムＤＮＡは、クロンテック社から購入したものを用いた。
検体ＤＮＡの調製方法を以下に示す。5μgのpHPV16およびヒトゲノムＤＮＡは、超音波処理（コバリス社、型番：ｓ２２０）によって断片化した。断片化の処理条件は、メーカー推奨の方法に従い、２５０塩基となるよう設定した。断片の長さは、バイオアナライザー（アジレント社）を用いて評価し、各処理条件で得られた断片化核酸のピークトップは、２５０塩基であった。切断した検体ＤＮＡの濃度は、ナノドロップ（サーモフィッシャー社、型番：ND-1000）を用いて測定し、核酸の濃度を求めた。核酸濃度から、各切断した溶液に含まれる切断したDNAを、pHPV16は1amol/uL、ヒトゲノムＤＮＡは5ng/uLとなるように１Ｘハイブリダイゼーション溶液で希釈した。
（検出プローブ溶液の調製）
表４及び表１１の検出プローブは、滅菌水で溶解させた後、それぞれの濃度が100fmol/μLになるよう混和し、検出プローブ液とした。
（ハイブリダイゼーション）
切断したpHPV16とヒトゲノムＤＮＡを表１２の組成になるように混和した検体DNA 5μLに、希釈した検出プローブ液1μLを混和し、サーマルサイクラーを用いて、95℃で5分間加熱した。加熱後、室温に戻るまで、机上に２分間静置した。この溶液に、１Ｘハイブリダイゼーション溶液（１重量％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５０ｎｇ/ｍｌ サケ精子ＤＮＡの溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％フォルムアミド）を３５μL加え、ハイブリ溶液とした。全量をDNAチップに注入し、３２℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、“3D-Gene”の標準プロトコールに従い、250rpmで旋回撹拌をしながら、32℃で２時間行った。ハイブリダイゼーション後、DNAチップを30℃に加温した洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬社）を用いて乾燥した。さらに、ストレプトアビジンフィコエリスリン（プロザイム社）を染色溶液（５０ｎｇ／μｌストレプトアビジンフィコエリスリン、１００ｍＭ ＭＥＳ，１Ｍ ＮａＣｌ，０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意し、DNAチップ上に滴下した。35℃で5分間インキュベーションした。30℃に加温した洗浄液（６ＸＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で5分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬社）を用いて乾燥した。染色済みのDNAチップは、DNAチップスキャナ（東レ社）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。
検出結果を表１２に示す。
検体１（ヒトゲノムＤＮＡ 5ng）は、捕捉プローブ Ｐｒｏｂｅ Ａｌｕでのみシグナルが検出された。この検体にはpHPV16のＤＮＡが含まれていないため、捕捉プローブ Ｐｒｏｂｅ １６ではシグナルが得られていない。
検体３（ｐＨＰＶ１６ 1amol）は、捕捉プローブ Ｐｒｏｂｅ １６でのみシグナルが検出された。この検体にはヒトゲノムＤＮＡが含まれていないため、捕捉プローブ Ｐｒｏｂｅ Ａｌｕではシグナルが得られていない。以上の結果から、ｐＨＰＶ１６用の捕捉プローブ及び検出プローブと、Ａｌｕ配列用の検出プローブ及び捕捉プローブは、相互に誤ったハイブリダイズをしないことが分かる。
検体２（ｐＨＰＶ１６ １ａｍｏｌ、ヒトゲノムＤＮＡ 5ng）は、捕捉プローブ Ｐｒｏｂｅ １６及びＰｒｏｂｅ Ａｌｕでシグナルが得られた。このことから、pHPV１６とヒトゲノムＤＮＡを同時に検出できることがわかった。
以上のように、ヒトパピローマウイルスＤＮＡの有無にかかわらず、検体溶液に含まれるヒトＤＮＡのAlu配列を検出することができたことから、ヒトＤＮＡを内部標準として用いることができることが分かった。ヒト検体から核酸を抽出し、解析する場合においても本技法は有効であると考えられる。

Claims (8)

  1. 標的核酸の断片化処理物と、複数の検出プローブと、支持体に固定した捕捉プローブとを逐次的又は同時に接触させて、前記捕捉プローブと前記標的核酸の断片化処理物をハイブリダイズさせ、かつ、前記標的核酸の断片化処理物と前記複数の検出プローブをハイブリダイズさせ、それによって、前記複数の検出プローブを、前記捕捉プローブと前記標的核酸の断片化処理物を介して前記支持体に結合させる工程と、
    支持体に結合された前記複数の検出プローブを検出する工程とを含む、標的核酸の検出方法であって、前記捕捉プローブとハイブリダイズさせる前記標的核酸の断片化処理物における捕捉プローブ結合位置からの距離が、該標的核酸の断片化処理物の核酸長の最頻値以下の範囲に、複数の検出プローブをハイブリダイズさせ、かつ、前記捕捉プローブとハイブリダイズさせる前記標的核酸の断片化処理物の、核酸長の最頻値が100塩基から1500塩基の範囲である、方法。
  2. 前記標的核酸の断片化処理物と、複数の検出プローブと、支持体に固定した捕捉プローブとを逐次的又は同時に接触させる工程は、前記標的核酸の断片化処理物を、複数の検出プローブとハイブリダイズさせ、次いで前記複数の検出プローブとハイブリダイズした前記標的核酸の断片化処理物と、前記捕捉プローブとをハイブリダイズさせることにより逐次的に行われる請求項１記載の方法。
  3. 前記捕捉プローブとハイブリダイズさせる前記標的核酸の断片化処理物が、核酸増幅法による増幅を経ていないものである請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記標的核酸を含む、動物由来の検体を前記検出方法に供し、該検出方法は、動物ゲノム中に存在する少なくとも１種の反復配列を内部標準として検出する工程をさらに含み、該反復配列は、動物ゲノム断片中に含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記動物ゲノムを断片化する工程をさらに含み、前記反復配列は、断片化された動物ゲノム中に含まれる請求項４記載の方法。
  6. 前記動物がヒトである請求項４又は５記載の方法。
  7. 前記反復配列が、短分散型核内反復配列である請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記短分散型核内反復配列がAlu配列である請求項７記載の方法。
JP2013510382A 2012-02-27 2013-02-27 核酸の検出方法 Expired - Fee Related JP6206181B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012040051 2012-02-27
JP2012040051 2012-02-27
PCT/JP2013/055085 WO2013129457A1 (ja) 2012-02-27 2013-02-27 核酸の検出方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2013129457A1 JPWO2013129457A1 (ja) 2015-07-30
JP6206181B2 true JP6206181B2 (ja) 2017-10-04

Family

ID=49082652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013510382A Expired - Fee Related JP6206181B2 (ja) 2012-02-27 2013-02-27 核酸の検出方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20150045249A1 (ja)
EP (1) EP2843047B1 (ja)
JP (1) JP6206181B2 (ja)
KR (1) KR102018934B1 (ja)
CN (1) CN104136611B (ja)
CA (1) CA2865541C (ja)
WO (1) WO2013129457A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10266828B2 (en) 2013-12-16 2019-04-23 Syddansk Universitet RAS exon 2 skipping for cancer treatment
WO2018008435A1 (ja) * 2016-07-04 2018-01-11 株式会社ダナフォーム 核酸分析方法

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI63596C (fi) 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
EP0238332A2 (en) * 1986-03-19 1987-09-23 Cetus Corporation Liquid hybridization method and kit for detecting the presence of nucleic acid sequences in samples
US5030557A (en) * 1987-11-24 1991-07-09 Ml Technology Venture Means and method for enhancing nucleic acid hybridization
DE69018961T2 (de) * 1989-08-11 1995-11-23 Amoco Corp Detektion von pneumocystis carinii durch die verwendung von nukleinsäuresonden.
US5595900A (en) * 1990-02-14 1997-01-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
US5252296A (en) 1990-05-15 1993-10-12 Chiron Corporation Method and apparatus for biopolymer synthesis
US5695926A (en) * 1990-06-11 1997-12-09 Bio Merieux Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
FR2663040B1 (fr) * 1990-06-11 1995-09-15 Bio Merieux Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich.
US5494794A (en) * 1992-10-20 1996-02-27 Emory University Detection of mitochondrial DNA mutations associated with Alzheimer's disease and Parkinson's disease
JPH0775600A (ja) 1993-09-08 1995-03-20 Toyobo Co Ltd 標的核酸の検出法
WO1995009248A1 (en) * 1993-09-27 1995-04-06 Arch Development Corp. Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
EP0730663B1 (en) 1993-10-26 2003-09-24 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
JPH0889300A (ja) * 1994-09-28 1996-04-09 Mitsui Toatsu Chem Inc 核酸検出法
GB9507238D0 (en) * 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
CA2255774C (en) * 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
DE19741232C5 (de) 1997-09-18 2008-07-10 Still Gmbh Speicherbremse für ein Fahrzeug
WO1999028494A1 (en) * 1997-12-04 1999-06-10 Packard Bioscience Company Methods of using probes for analyzing polynucleotide sequence
GB9805935D0 (en) 1998-03-19 1998-05-13 Ciba Geigy Ag Organic compounds
US6214187B1 (en) * 1998-06-18 2001-04-10 Mosaic Technologies Denaturing gradient affinity electrophoresis and methods of use thereof
AU4833899A (en) * 1998-06-24 2000-01-10 Therasense, Inc. Multi-sensor array for electrochemical recognition of nucleotide sequences and methods
US6268147B1 (en) * 1998-11-02 2001-07-31 Kenneth Loren Beattie Nucleic acid analysis using sequence-targeted tandem hybridization
DK2206791T3 (en) * 2000-04-10 2016-10-24 Taxon Biosciences Inc Methods of study and genetic analysis of populations
GB0016814D0 (en) * 2000-07-07 2000-08-30 Lee Helen Improved dipstick assays (3)
WO2002048310A2 (en) * 2000-12-15 2002-06-20 Genetics Institute, Llc Methods and compositions for diagnosing and treating rheumatoid arthritis
US7407746B2 (en) 2001-02-08 2008-08-05 Ngk Insulators, Ltd. Biochip and method for producing the same
WO2003046208A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Mj Bioworks Incorporated Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction
US7037659B2 (en) 2002-01-31 2006-05-02 Nimblegen Systems Inc. Apparatus for constructing DNA probes having a prismatic and kaleidoscopic light homogenizer
US7214492B1 (en) * 2002-04-24 2007-05-08 The University Of North Carolina At Greensboro Nucleic acid arrays to monitor water and other ecosystems
DE10228785B4 (de) * 2002-06-23 2007-10-04 Stiftung Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung Stiftung des öffentlichen Rechts Detektion von toxischen Algen
DE60229890D1 (de) * 2002-09-30 2008-12-24 Hoffmann La Roche Oligonukleotide zur genotypisierung des thymidylat-synthase gens
EP1431398A1 (en) * 2002-12-20 2004-06-23 Evotec OAI AG A method for detecting in a mixture an amount of analytes
US20040180369A1 (en) * 2003-01-16 2004-09-16 North Carolina State University Photothermal detection of nucleic acid hybridization
US7354706B2 (en) * 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
US20050186590A1 (en) * 2003-11-10 2005-08-25 Crothers Donald M. Nucleic acid detection method having increased sensitivity
JP2007535944A (ja) * 2004-05-04 2007-12-13 ヴェンタナ メディカル システムズ インコーポレイテッド ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための内部対照
JP4619202B2 (ja) 2005-06-01 2011-01-26 パナソニック株式会社 電気泳動システム
FR2886735B1 (fr) * 2005-06-01 2015-09-11 Biomerieux Sa Procede de marquage ou de traitement d'un echantillon biologique contenant des molecules biologiques d'interet, notamment des acides nucleiques
US8407013B2 (en) * 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
JP5514401B2 (ja) * 2005-09-21 2014-06-04 国立大学法人広島大学 Ｇテイル配列の長さ測定方法及びそれに用いるキット
WO2007073523A2 (en) * 2005-11-18 2007-06-28 The Children's Mercy Hospital MITIGATION OF Cot-1 DNA DISTORTION IN NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION
US8188255B2 (en) * 2006-10-20 2012-05-29 Exiqon A/S Human microRNAs associated with cancer
US20110008775A1 (en) * 2007-12-10 2011-01-13 Xiaolian Gao Sequencing of nucleic acids
BRPI1006411A8 (pt) * 2009-02-27 2017-09-19 Koninklijke Philips Electronics Nv Seleção genômica e sequenciamento utilizando microcarreadores codificados, processo para determinar a sequência de uma molécula de ácido nucleico alvo, e, dispositivo para determinar a sequência de uma amostra de ácido nucleico
EP2230312A1 (en) * 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
WO2010126913A1 (en) * 2009-04-27 2010-11-04 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences
KR20120089476A (ko) * 2009-09-01 2012-08-10 코닌클리케 필립스 일렉트로닉스 엔.브이. 마이크로어레이 선택을 위한 장치 및 방법
JP5901046B2 (ja) * 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
CN102329876B (zh) * 2011-10-14 2014-04-02 深圳华大基因科技有限公司 一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2865541C (en) 2019-11-05
KR20140131960A (ko) 2014-11-14
CA2865541A1 (en) 2013-09-06
EP2843047A1 (en) 2015-03-04
JPWO2013129457A1 (ja) 2015-07-30
EP2843047B1 (en) 2019-10-30
CN104136611B (zh) 2018-03-27
EP2843047A4 (en) 2015-11-18
US20150045249A1 (en) 2015-02-12
WO2013129457A1 (ja) 2013-09-06
CN104136611A (zh) 2014-11-05
KR102018934B1 (ko) 2019-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6219816B2 (ja) 核酸の増幅方法、および、増幅核酸の検出方法
EP1818416B1 (en) Methods and kits for the detection of HPV
WO2010021396A1 (ja) Ｄｎａを定量又は検出する方法
JP6182300B2 (ja) 標的核酸の検出方法
EP4355909A2 (en) Devices, systems, and methods for analysis of nucleic acids
JP2010017179A (ja) Ｄｎａを定量又は検出する方法
KR20150139582A (ko) 나노파티클-지원 신호 증폭을 이용한 rna 마이크로칩 검출
Yan et al. Integration of CRISPR/Cas12a and multiplexed RPA for fast detection of gene doping
JP6206181B2 (ja) 核酸の検出方法
CN104059907A (zh) 含有树状分子染料的寡核苷酸探针及其制备方法和应用
JP7410023B2 (ja) 定量ｐｃｒプローブ
JP6248633B2 (ja) 標的核酸の検出方法
JP5613160B2 (ja) ゲノムｄｎａ中の標的配列の検出又は解析方法
JP2014180278A (ja) 核酸の解析方法、そこにおいて使用されるアッセイキット
JP2014187934A (ja) 標的核酸の検出方法
WO2016129609A1 (ja) 標的核酸の検出方法
KR101854760B1 (ko) Pna 프로브를 이용하여 흰반점 바이러스를 검출하는 방법
JP2007521014A (ja) 診断および毒物学用のシンテニーゲノムアレイの調製および使用のためのアレイ、方法およびキット
JP2021040555A (ja) 核酸試料の品質評価方法
JPWO2015182601A1 (ja) 標的核酸の検出方法
WO2016121907A1 (ja) 一本鎖ｄｎａ産物の調製方法
Gül Development of an oligonucleotide based sandwich array platform for the detection of transgenic elements from plant sources using labal-free PCR products
GREIL et al. Interactions Using Tethered DNA Adenine Methyltransferase

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160225

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20160225

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160620

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170131

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170331

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170808

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170821

R151 Written notification of patent or utility model registration

Ref document number: 6206181

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees