CN116157533A - 使用杂交方法捕获遗传靶标 - Google Patents

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CN116157533A CN202180031221.3A CN202180031221A CN116157533A CN 116157533 A CN116157533 A CN 116157533A CN 202180031221 A CN202180031221 A CN 202180031221A CN 116157533 A CN116157533 A CN 116157533A
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F·梅斯基
J·陈
J·G·阿瑟
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Z·本特
K·普法伊弗
A·J·希尔
L·J·阿尔瓦拉杜马丁内斯
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Abstract

本文提供了使用杂交作为增强分析物检测的方法来确定分析物位置的方法。具体地，使用包含空间条形码和捕获域的捕获探针来捕获与基材接触的生物样品中的分析物。分析物可以是核酸或蛋白质。在测序之前，使用诱饵寡核苷酸来富集感兴趣的核酸。

Description

使用杂交方法捕获遗传靶标
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月21日提交的美国临时专利申请号62/979,652；2020年2月21日提交的美国临时专利申请号62/980,124；以及2020年9月11日提交的美国临时专利申请号63/077,019的优先权。上述申请的内容通过引用其全部内容纳入本文。
背景技术
对象组织内的细胞由于不同细胞内的不同分析物丰度(例如，基因和/或蛋白质表达)而在细胞形态和/或功能上存在差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响，例如，细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为以及与组织中其它细胞的信号转导和串扰。
空间异质性先前被研究过，所述研究使用的技术仅提供完整组织或部分组织中的少量分析物的数据，或提供单细胞的大量分析物数据，但无法提供有关单细胞在亲本生物样品(例如，组织样品)中位置的信息。
全外显子组测序提供了对于样品中各转录物的覆盖。本领域需要转录组特异性方法，用于高保真富集用于靶向测序的核酸分子，同时降低成本、最大化效率和最小化冗余。
序列表
本申请包含通过光盘提交并通过引用全部内容纳入本文的序列表。创建于2021年2月19日的所述光盘命名为47706-0198WO1_sequence_listing_CORRECTED.txt，大小为316,281,109字节。提交3份光盘拷贝。
发明概述
本文公开了用于识别生物样品中分析物丰度和位置的方法，该方法包括：(a)将多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，在一些实施方式中，多个核酸包括延伸的核酸，其包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列；多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含：(i)捕获域，其与分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列杂交，和(ii)分子标签；(b)使用基材捕获与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸，所述基材包含与分子标签结合的试剂；和(c)确定(i)空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)延伸的核酸的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)所确定的序列识别生物样品中分析物的丰度和位置。
在一些实施方式中，分析物是核酸。
在一些实施方式中，该方法还包括生成多个核酸，该方法包括：(a)将生物样品与基材接触，所述基材包含多个附接的捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域，其结合核酸中存在的序列；(b)使捕获探针与核酸杂交；(c)使用与捕获域结合的核酸作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(d)扩增延伸的捕获探针以产生延伸的核酸。
在一些实施方式中，延伸的核酸释放自延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，分析物衍生物是寡核苷酸，其包含分析物结合部分条形码，和分析物捕获序列。
一些实施方式中，该方法还包括生成多个核酸，该方法包括：(a)将多个分析物捕获剂与生物样品接触，在一些实施方式中，多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含(i)结合蛋白质的分析物结合部分和(ii)包含分析物结合部分条形码和分析物捕获序列的寡核苷酸；(b)使多个分析物捕获剂与基材接触，所述基材包含多个捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，在一些实施方式中，捕获域结合分析物捕获序列；(c)使用分析物结合部分条形码作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(d)扩增延伸的捕获探针以产生延伸的核酸。
在一些实施方式中，延伸的核酸释放自延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，基本上同时进行步骤(a)和步骤(b)。在一些实施方式中，步骤(a)在步骤(b)之前进行。在一些实施方式中，步骤(b)在步骤(a)之前进行。
本文还提供了用于富集生物样品中分析物或分析物衍生物的方法，该方法包括：(a)将多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，在一些实施方式中，多个核酸包括延伸的核酸，其包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列；多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含：(i)捕获域，其与分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列杂交，和(ii)分子标签；(b)使用基材捕获与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸的复合物，所述基材包含与分子标签结合的试剂；和(c)分离与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸的复合物，从而富集生物样品中的分析物或分析物衍生物。
在一些实施方式中，分析物是核酸。
在一些实施方式中，该方法还包括生成多个核酸，该方法包括：(a)将生物样品与基材接触，所述基材包含多个附接的捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域，其结合核酸中存在的序列；(b)使捕获探针与核酸杂交；(c)使用与捕获域结合的核酸作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(d)扩增延伸的捕获探针以产生延伸的核酸。
在一些实施方式中，延伸的核酸释放自延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，分析物衍生物是寡核苷酸，其包含分析物结合部分条形码，和分析物捕获序列。
一些实施方式中，该方法还包括生成多个核酸，该方法包括：(a)将多个分析物捕获剂与生物样品接触，在一些实施方式中，多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含(i)结合蛋白质的分析物结合部分和(ii)包含分析物结合部分条形码和分析物捕获序列的寡核苷酸；(b)使多个分析物捕获剂与基材接触，所述基材包含多个捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，在一些实施方式中，捕获域结合分析物捕获序列；(c)使用分析物结合部分条形码作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(d)扩增延伸的捕获探针以产生延伸的核酸。
在一些实施方式中，延伸的核酸释放自延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，基本上同时进行步骤(a)和步骤(b)。在一些实施方式中，步骤(a)在步骤(b)之前进行。在一些实施方式中，步骤(b)在步骤(a)之前进行。
在一些实施方式中，来自生物样品的分析物与疾病或病症相关。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域结合分析物、分析物衍生物或其互补物的序列的3′部分、5′部分、内含子、外显子、3′非翻译区或5′非翻译区。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域包括总共约10个核苷酸至约300个核苷酸。
在一些实施方式中，分子标签包括蛋白质、小分子、核酸或碳水化合物。
在一些实施方式中，分子标签是链霉亲和素、亲和素、生物素或荧光团。
在一些实施方式中，与分子标签结合的试剂包括蛋白质(例如，抗体)、核酸或小分子。
在一些实施方式中，分子标签是生物素并且与分子标签结合的试剂是亲和素或链霉亲和素。
在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂附接到基材。在一些实施方式中，基材是珠、孔或载玻片。
在一些实施方式中，延伸的核酸是DNA分子(例如，cDNA分子)。
在一些实施方式中，延伸的核酸还包含引物序列或其互补物；独特分子序列或其互补物；或其他引物结合序列或其互补物。
在一些实施方式中，生物样品是组织样品，选自福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品或冷冻的组织样品。
在一些实施方式中，生物样品预先使用可检测标记物、苏木精和伊红(H&E)染料、免疫荧光或免疫组织化学染色。
在一些实施方式中，生物样品是透化的生物样品。
在一些实施方式中，本文所述确定步骤包括对(i)空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)来自生物样品的核酸的全部或部分序列进行测序。
在一些实施方式中，测序是高通量测序。
在一些实施方式中，分析物在癌细胞、免疫细胞、细胞信号转导通路或神经细胞中失调或差异表达。
本文还公开了用于识别生物样品中核酸丰度和位置的方法，该方法包括：(a)将生物样品与基材接触，所述基材包含多个附接的捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)与核酸中存在的序列结合的捕获域；(b)使捕获探针与核酸杂交；(c)使用与捕获域结合的核酸作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(d)扩增延伸的捕获探针以产生延伸的核酸；在一些实施方式中，延伸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)核酸或其互补物的全部或部分序列；(e)由延伸的捕获探针释放延伸的核酸；(f)将多个释放的核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，所述释放的核酸包含来自步骤(e)的延伸的核酸，在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含：(i)捕获域，其与核酸或其互补物的全部或部分序列杂交和(ii)分子标签；(g)使用基材捕获与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸，所述基材包含与分子标签结合的试剂；和(h)确定(i)空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)延伸的核酸的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)确定的序列识别生物样品中核酸的丰度和位置。
本文还公开了用于识别生物样品中蛋白质丰度和位置的方法，该方法包括：(a)将多个分析物捕获剂与生物样品接触，在一些实施方式中，多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含(i)与蛋白质结合的分析物结合部分和(ii)包含分析物结合部分条形码和分析物捕获序列的寡核苷酸；(b)将多个分析物捕获剂与基材接触，所述基材包含多个捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，在一些实施方式中，捕获域结合分析物捕获序列；(c)使用分析物结合部分条形码作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；(d)扩增延伸的捕获探针以产生延伸的核酸；在一些实施方式中，延伸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)寡核苷酸或其互补物的全部或部分序列；(e)由延伸的捕获探针释放延伸的核酸；(f)将多个释放的核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，所述释放的核酸包含来自步骤(e)的延伸的核酸，在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含(i)与寡核苷酸或其互补物的全部或部分序列杂交的捕获域和(ii)分子标签；(g)使用基材捕获与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸，所述基材包含与分子标签结合的试剂；和(h)确定(i)空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)延伸的核酸的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)确定的序列来识别生物样品中蛋白质的丰度和位置。
本文还公开了包含诱饵寡核苷酸和延伸的核酸的组合物，在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与延伸的核酸结合，在一些实施方式中，延伸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列；在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸包含分子标签，在一些实施方式中，分子标签选自链霉亲和素、亲和素、生物素或荧光团。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸通过捕获域与延伸的核酸结合，所述捕获域与分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列杂交。
在一些实施方式中，如本文所述的组合物还包含与分子标签结合的试剂。
在一些实施方式中，与分子标签结合的试剂包括蛋白质(例如，抗体)、核酸或小分子。
在一些实施方式中，分子标签是生物素并且与分子标签结合的试剂是亲和素或链霉亲和素。
在一些实施方式中，如本文所述的组合物还包含基材，在一些实施方式中，与分子标签结合的试剂附接于基材。在一些实施方式中，基材是珠、孔或载玻片。
本文还提供了试剂盒，其包括：包含多个捕获探针的阵列，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域；多个诱饵寡核苷酸；和用于进行本文所述方法的说明书。
本文还提供了试剂盒，其包括：多个分析物捕获剂，在一些实施方式中，多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含分析物结合部分、分析物结合部分条形码和分析物捕获序列；包含多个捕获探针的阵列，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域；多个诱饵寡核苷酸；和用于进行本文所述方法的说明书。
在一些实施方式中，本文所述试剂盒还包含用于进行所述方法的试剂和/或酶。
本文还公开了用于识别生物样品中核酸位置的方法，该方法包括：(a)将来自生物样品的多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，在一些实施方式中，多个核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)来自生物样品的核酸或其互补物的部分序列；多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含捕获域和分子标签，所述捕获域特异性结合来自生物样品的核酸或其互补物的全部或部分序列；(b)使用基材捕获特异性结合核酸的诱饵寡核苷酸，所述基材包含特异性结合分子标签的试剂；和(c)确定(i)空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)来自生物样品的核酸的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)所确定的序列识别生物样品中核酸的位置。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸的全部或部分序列特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸或其互补物的序列的3′部分特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸或其互补物的序列的5′部分特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸或其互补物的序列中的内含子特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸或其互补物的序列中的外显子特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸或其互补物的3′非翻译区特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸或其互补物的5′非翻译区特异性地结合。
在一些实施方式中，来自生物样品的核酸与疾病或病症相关联。在一些实施方式中，来自生物样品的核酸包含突变。在一些实施方式中，来自生物样品的核酸包含单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方式中，来自生物样品的核酸包含三核苷酸重复。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域包括总共约10个核苷酸至约300个核苷酸。
在一些实施方式中，分子标签包括部分(moiety)。在一些实施方式中，部分是链霉亲和素、亲和素、生物素或荧光团。在一些实施方式中，分子标签包括小分子。在一些实施方式中，分子标签包括核酸。在一些实施方式中，分子标签包括碳水化合物。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中捕获域的5′位置。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中捕获域的3′位置。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是抗体。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括核酸。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括小分子。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂附接到基材。在一些实施方式中，基材是珠。在一些实施方式中，基材是孔。在一些实施方式中，基材是载玻片。
在一些实施方式中，核酸是DNA。在一些实施方式中，核酸还包含功能序列。在一些实施方式中，功能序列是引物序列或其互补物。在一些实施方式中，核酸还包括独特分子序列或其互补物。在一些实施方式中，核酸还包括其他引物结合序列或其互补物。
在一些实施方式中，生物样品是组织样品。在一些实施方式中，组织样品是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品或冷冻的组织样品。在一些实施方式中，生物样品预先使用可检测标记物染色。在一些实施方式中，生物样品经预先染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用苏木精和伊红(H&E)染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用免疫荧光或免疫组织化学染色。在一些实施方式中，生物样品是已经透化剂透化的透化的生物样品，所述透化剂选自有机溶剂、交联剂、去污剂和酶或其组合。在一些实施方式中，透化剂是交联剂。在一些实施方式中，分析物是RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子是mRNA分子。
在一些实施方式中，步骤(c)中的确定包括对(i)空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)来自生物样品的核酸的全部或部分序列进行测序。在一些实施方式中，测序是高通量测序。在一些实施方式中，测序包括将衔接子与核酸连接。
在一些实施方式中，该方法还包括生成多个核酸，其包括：(a)将生物样品与基材接触，所述基材包含多个附接的捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域，其特异性地结合分析物中存在的序列；(b)使用与捕获域特异性结合的分析物作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(c)扩增延伸的捕获探针以产生核酸。在一些实施方式中，扩增是等温的。
在一些实施方式中，产生的核酸释放自延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，核酸在癌细胞中失调或差异表达。在一些实施方式中，核酸在免疫细胞中失调或差异表达。在一些实施方式中，核酸在细胞信号转导通路中失调。在一些实施方式中，核酸在神经细胞中失调或差异表达。
本文还公开了用于识别生物样品中核酸位置的方法，该方法包括：(a)将多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，在一些实施方式中，多个核酸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)结合部分条形码或其互补物的部分；多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含捕获域和分子标签，所述捕获域特异性结合(i)核酸或其互补物的全部或部分和/或(ii)结合部分条形码或其互补物全部或部分；(b)使用基材捕获与核酸或其互补物特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物或与分析物结合部分条形码或其互补物特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物，所述基材包含与分子标签特异性结合的试剂；和(c)确定(i)核酸或其互补物的全部或部分序列和/或(ii)分析物结合部分条形码或其互补物的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)所确定的序列识别生物样品中核酸的位置。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸序列的全部或部分特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与分析物结合部分条形码的全部或部分特异性地结合。
在一些实施方式中，来自生物样品的核酸与疾病或病症相关联。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域包括总共约10个核苷酸至约300个核苷酸。
在一些实施方式中，分子标签包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是链霉亲和素、亲和素或生物素。在一些实施方式中，分子标签包括小分子。在一些实施方式中，分子标签包括核酸。在一些实施方式中，分子标签包括碳水化合物。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的5′位置。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的3′位置。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是抗体。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括核酸。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括小分子。
在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂附接到基材。在一些实施方式中，基材是珠。在一些实施方式中，基材是孔。在一些实施方式中，基材是载玻片。
在一些实施方式中，核酸是DNA。在一些实施方式中，核酸还包括引物结合序列或其互补物。在一些实施方式中，核酸还包括独特分子序列或其互补物。在一些实施方式中，核酸还包括其他引物结合序列或其互补物。
在一些实施方式中，生物样品是组织样品。在一些实施方式中，组织样品是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品或冷冻的组织样品。在一些实施方式中，生物样品预先使用可检测标记物染色。在一些实施方式中，生物样品经预先染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用苏木精和伊红(H&E)染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用免疫荧光或免疫组织化学染色。在一些实施方式中，生物样品是已经透化剂透化的透化的生物样品，所述透化剂选自有机溶剂、交联剂、去污剂和酶或其组合。在一些实施方式中，透化剂选自有机溶剂、交联剂、去污剂和酶或其组合。在一些实施方式中，分析物是RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子是mRNA分子。
在一些实施方式中，步骤(c)中的确定包括对(i)核酸或其互补物的全部或部分序列和(ii)分析物结合部分条形码的全部或部分序列进行测序。在一些实施方式中，测序是高通量测序。在一些实施方式中，测序包括将衔接子与核酸连接。
在一些实施方式中，该方法还包括生成多个核酸，其包括：(a)将多个捕获剂与置于基材的生物样品接触，在一些实施方式中，多个捕获剂的捕获剂包含(i)与生物样品中核酸特异性结合的结合部分，(ii)结合部分条形码，和(iii)捕获序列；基材包含多个捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，在一些实施方式中，捕获域与分析物捕获序列特异性地结合；和(b)使用分析物结合部分条形码作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(c)扩增延伸的捕获探针以产生核酸。在一些实施方式中，扩增是等温的。
在一些实施方式中，产生的核酸释放自延伸的捕获探针。在一些实施方式中，核酸是在癌细胞中失调或差异表达的核酸。在一些实施方式中，核酸是在免疫细胞中失调或差异表达的核酸。在一些实施方式中，核酸是在细胞信号转导通路中失调的核酸。在一些实施方式中，核酸是在神经细胞中失调或差异表达的核酸。
本文还公开了用于富集生物样品中核酸的方法，该方法包括：(a)将多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，在一些实施方式中，多个核酸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)结合部分条形码或其互补物的部分；多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含捕获域和分子标签，所述捕获域特异性结合(i)核酸或其互补物的全部或部分和/或(ii)结合部分条形码或其互补物的全部或部分；(b)使用基材捕获与核酸或其互补物特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物或与分析物结合部分条形码或其互补物特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物，所述基材包含与分子标签特异性结合的试剂；和(c)分离与核酸或其互补物特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物或与分析物结合部分条形码或其互补物特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物，从而富集生物样品中的核酸。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与来自生物样品的核酸序列的全部或部分特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域与分析物结合部分条形码的全部或部分特异性地结合。在一些实施方式中，来自生物样品的核酸与疾病或病症相关联。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的捕获域包括总共约10个核苷酸至约300个核苷酸。
在一些实施方式中，分子标签包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是链霉亲和素、亲和素或生物素。在一些实施方式中，分子标签包括小分子。在一些实施方式中，分子标签包括核酸。在一些实施方式中，分子标签包括碳水化合物。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的5′位置。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的3′位置。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是抗体。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括核酸。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括小分子。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂附接到基材。在一些实施方式中，基材是珠。在一些实施方式中，基材是孔。在一些实施方式中，基材是载玻片。
在一些实施方式中，核酸是DNA。在一些实施方式中，核酸还包括引物结合序列或其互补物。在一些实施方式中，核酸还包括独特分子序列或其互补物。在一些实施方式中，核酸还包括其他引物结合序列或其互补物。
在一些实施方式中，生物样品是组织样品。在一些实施方式中，组织样品是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品或冷冻的组织样品。在一些实施方式中，生物样品预先使用可检测标记物染色。在一些实施方式中，生物样品经预先染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用苏木精和伊红(H&E)染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用免疫荧光或免疫组织化学染色。
在一些实施方式中，生物样品是已经透化剂透化的透化的生物样品，所述透化剂选自有机溶剂、交联剂、去污剂和酶或其组合。在一些实施方式中，透化剂选自有机溶剂、交联剂、去污剂和酶或其组合。
在一些实施方式中，分析物是RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子是mRNA分子。
在一些实施方式中，该方法还包括生成多个核酸，其包括：(a)将多个捕获剂与置于基材的生物样品接触，在一些实施方式中，多个捕获剂的捕获剂包含(i)与生物样品中核酸特异性结合的结合部分，(ii)结合部分条形码，和(iii)捕获序列；基材包含多个捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，在一些实施方式中，捕获域与分析物捕获序列特异性地结合；和(b)使用分析物结合部分条形码作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(c)扩增延伸的捕获探针以产生核酸。在一些实施方式中，扩增是等温的。
在一些实施方式中，产生的核酸释放自延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，核酸是在癌细胞中失调或差异表达的核酸。在一些实施方式中，核酸是在免疫细胞中失调或差异表达的核酸。在一些实施方式中，核酸是在细胞信号转导通路中失调的核酸。在一些实施方式中，核酸是在神经细胞中失调或差异表达的核酸。
本文还公开了用于识别生物样品中核酸位置的方法，该方法包括：(a)将多个捕获剂与置于基材的生物样品接触，在一些实施方式中，多个捕获剂的捕获剂包含(i)与生物样品中核酸特异性结合的结合部分，(ii)结合部分条形码和(iii)捕获序列；基材包含多个捕获探针，在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，在一些实施方式中，捕获域与分析物捕获序列特异性地结合；和(b)使用分析物结合部分条形码作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(c)扩增延伸的捕获探针以产生核酸；在一些实施方式中，核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)部分分析物结合部分条形码或其互补物；(d)由延伸的捕获探针释放产生的核酸；(e)将来自步骤(d)的多个释放的核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含捕获域和分子标签，所述捕获域特异性结合(i)核酸或其互补物的全部或部分和/或(ii)分析物结合部分条形码或其互补物全部或部分；(f)使用基材捕获与核酸或其互补物特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物或与分析物结合部分条形码或其互补物特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物，所述基材包含与分子标签特异性结合的试剂；和(g)确定(i)核酸或其互补物的全部或部分序列和/或(ii)分析物结合部分条形码或其互补物的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)所确定序列识别生物样品中核酸的位置。
本文还公开了包含与核酸结合的诱饵寡核苷酸的组合物，在一些实施方式中，核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)部分分析物结合部分条形码或其互补物。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸通过捕获域与核酸结合，捕获域特异性结合(i)全部或部分核酸和/或(ii)全部或部分分析物结合部分条形码或其互补物。
在一些实施方式中，组合物还包含分子标签。在一些实施方式中，组合物还包含特异性结合分子标签的试剂。在一些实施方式中，分子标签包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是链霉亲和素、亲和素或生物素。在一些实施方式中，分子标签包括小分子。在一些实施方式中，分子标签包括核酸。在一些实施方式中，分子标签包括碳水化合物。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的5′位置。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的3′位置。
在一些实施方式中，试剂包括链霉亲和素、亲和素或生物素。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是抗体。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括核酸。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括小分子。
一些实施方式中，组合物还包括基材。在一些实施方式中，基材是珠。在一些实施方式中，基材是孔。在一些实施方式中，基材是载玻片。
本说明书中提到的可在因特网上获得的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就如同将各篇单独的发表物、专利、专利申请和信息项目专门和单独地通过引用纳入本文那样。对于通过引用纳入的出版物、专利、专利申请和信息项目与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。
在以范围来描述值的情况下，应当理解的是，该描述包括在该范围内的所有可能的子范围的公开，以及在该范围内的特定数值的公开，而不管是否明确地说明了特定数值或特定子范围。
术语“每个”提及一组物品时，意在鉴别该集合中的一个单独物品，但不一定指该集合中的每一项物品，除非另有明确说明，或除非用法的上下文另有明确说明。
如本文所用，术语“分析物衍生物”是指衍生自分析物(例如核酸)或传递对应分析物(例如蛋白质)信息(例如同源性信息)的分子(例如核酸或蛋白质分子)。在一些实施方式中，分析物衍生物包括本文所述分析物(例如，核酸)的全部或部分。在一些实施方式中，分析物衍生物包括本文所述的分析物捕获剂的全部或部分(例如，分析物捕获部分、分析物结合部分条形码和/或分析物捕获序列的全部或部分)。
本文描述了本发明的特征的各种实施方式。然而，应当理解，这些实施方式仅作为示例提供，并且在不脱离本公开的范围的情况下，本领域技术人员可以作出许多变化、改变和替换。还应理解，本文所描述的特定实施方式的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图说明了本发明的特征和优点的某些实施方式。这些实施方式无意以任何方式限制所附权利要求的范围。附图中的相同附图标记表示相同的元素。
图1是示出如本文所述的条码化捕获探针的示例的示意图。
图2是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的目标分析物。
图3是示例性多重空间条码化特征的示意图。
图4是示例性分析物捕获剂的示意图。
图5是描绘特征固定的(feature-immobilized)捕获探针524和分析物捕获剂526之间的示例性相互作用的示意图。
图6A-6C是图示如何在基于阵列的系统中利用链霉亲和素细胞标签来产生空间条码化细胞或细胞内容物的示意图。
图7是显示靶向空间基因表达的工作流程示意图。
图8A-8B显示了中靶、富集和复杂性值，其中使用了不同的空间文库。该空间文库包括来自心脏、乳腺、乳腺癌或淋巴的样品。使用hL1k_200.1组或Immune组。
图9是显示靶向空间基因表达的示例性工作流程。
图10是使用空间基因表达文库对靶向的核酸序列进行杂交和基于捕获的富集的示例性工作流程。
图11是显示使用65基因靶向的富集神经组(Y轴)的小鼠脑组织空间UMI计数相比Visium对照全转录组分析(X轴)之间相关性的示意图。
图12A-12B是显示A)来自Visium全转录组空间阵列的OLIG2基因表达(对照)和B)来自65基因靶向的富集神经组的OLIG2基因表达的示例性图片。图片与图11的数据相关联。
图13A-13B是显示A)全转录组Visium相对4个Visium靶向的基因组的映射读数和B)Visium全转录组对照(X轴)相较Visium靶向的泛癌基因组(Y轴)之间的UMI计数相关性的示例性图表。
图14A-14B是显示使用4个靶向的基因富集组的12个人组织类型空间阵列相较A)针对匹配的Visium全转录组恢复的基因部分和B)针对匹配的Visium全转录组的UMI R平方(R-squared)一致性的Visium全转录组空间阵列的靶向度量的示例性图表。
图15A-15C显示了A)Visium全转录组和B)神经科学靶向的基因富集组的6个基因簇的人大脑皮层聚类。图15C显示了图15A和图15B之间的UMI相关性。
图16A-16D显示了来自泛癌基因组的人乳腺癌组织切片中的空间基因表达；A)病理学家的注释(对照)、B)全转录组Visium数据、C)来自泛癌富集组的196个乳腺癌基因和D)来自泛癌富集组的ERBB2基因表达。
图17A-17D提供了关于根据本公开实施方式的癌症组中包含的遗传靶标的细节。
图18A-18C提供了关于根据本公开实施方式的免疫学探针组中包含的遗传靶标的细节。
图19A-19D提供了关于根据本公开实施方式的通路组中包含的遗传靶标的细节。
图20A-20D提供了关于根据本公开实施方式的神经组中包含的遗传靶标的细节。
具体实施方式
I.引言
本文所述的空间分析方法和组合物能以高空间分辨率提供生物样品内大量分析物和/或各种各样分析物的表达数据，同时保留天然空间背景信息。空间分析方法和组合物可以包括，例如，使用包括空间条形码(例如，提供关于分析物在细胞或组织样品(例如哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的位置或方位的信息的核酸序列)的捕获探针，和能够与细胞产生和/或其中存在的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)结合的捕获域。空间分析方法和组合物还可包括使用具有捕获域的捕获探针，其捕获用于间接检测分析物的中间物(intermediate agent)。例如，中间物可以包括与中间物相关联的核酸序列(例如，条形码)。因此，中间物的检测指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析的方法和组合物的非限制性方面描述于美国专利号10,774,374，10,724,078，10,480,022，10,059,990，10,041,949，10,002,316，9,879,313，9,783,841，9,727,810，9,593,365，8,951,726，8,604,182，7,709,198，美国专利申请公开号2020/239946，2020/080136，2020/0277663，2020/024641，2019/330617，2019/264268，2020/256867，2020/224244，2019/194709，2019/161796，2019/085383，2019/055594，2018/216161，2018/051322，2018/0245142，2017/241911，2017/089811，2017/067096，2017/029875，2017/0016053，2016/108458，2015/000854，2013/171621，WO 2018/091676，WO2020/176788，Rodriques等，Science 363(6434)：1463-1467，2019；Lee等，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；Trejo等，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；Chen等，Science 348(6233)：aaa6090，2015；Gao等，BMC Biol.15：50，2017；和Gupta等，Nature Biotechnol.36：1197-1202，2018；Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial GeneExpression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial Tissue Optimization Reagent Kits UserGuide)(例如，Rev C，日期2020年7月)，两者均可得于10x基因组学有限公司(10xGenomics)支持文档网站，可以任意组合使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其它非限制性方面。
可以在本公开中使用的一些通用术语可以见于WO2020/176788的第(I)(b)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。通常，“条形码”是一种标签或标识符，它传递或能够传递信息(例如，关于样品中分析物、珠和/或捕获探针的信息)。条形码可以是分析物的部分，也可以独立于分析物。条形码可以附接于分析物。特定条形码相对于其它条形码可能是独特的。就本发明而言，“分析物”可包括任何待分析的生物物质、结构、部分或组分。术语“靶标”可以类似地指感兴趣的分析物。
分析物可大致分为两类：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的示例包括但不限于脂质、碳水合合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体，蛋白质泛素化变体、蛋白质硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒附件、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白质、抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，分析物可定位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、内吞囊泡、排出囊泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方式中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的其它示例可见于WO2020/176788第(I)(c)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。在一些实施方式中，分析物可被间接检测，例如通过检测中间物，例如连接的探针(例如连接产物)或分析物捕获剂(例如，寡核苷酸偶联的抗体)，如本文所述的那些。
通常从对象处获取“生物样品”，以使用各种技术中的任一种进行分析，包括但不限于活检、手术和激光捕获显微镜(LCM)，并且通常包括来自对象的细胞和/或其他生物材料。在一些实施方式中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方式中，生物样品可以是固定和/或染色的生物样品(例如，固定和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性示例包括组织染色剂(例如，苏木精和/或伊红)和免疫染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方式中，可以对生物样品(例如，固定和/或染色的生物样品)成像。生物样品也描述于WO2020/176788第(I)(d)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些实施方式中，生物样品用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可以促进分析物的捕获。示例性透化剂和条件描述于WO2020/176788的第(I)(d)(ii)(13)部分或示例性实施方式部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列，其中各特征与阵列上的独特空间位置相关联。转移分析物的后续分析包括确定分析物的相同性以及生物样品中分析物的空间位置。分析物在生物样品中的空间位置是基于阵列中分析物所结合(例如，直接或间接)的特征以及特征在阵列上的相对空间位置来确定的。
“捕获探针”是指能够捕获(直接或间接)和/或标记生物样品中的分析物(例如，感兴趣的分析物)的任何分子。在一些实施方式中，捕获探针是核酸或多肽。在一些实施方式中，捕获探针包括条形码(例如，空间条形码和/或独特分子标识符(UMI))和捕获域。在一些实施方式中，捕获探针可包括裂解域和/或功能域(例如，引物结合位点，例如用于下一代测序(NGS))。
图1是示出如本文所述的示例性捕获探针的示意图。如图所示，捕获探针102任选地通过例如二硫键接头的裂解域101耦合到特征103。捕获探针可以包括对后续处理有用的功能序列104。功能序列104可以包括全部或部分测序仪特异性流动池附连序列(例如P5或P7序列)、全部或部分测序引物序列(例如R1引物结合位点、R2引物结合位点)或其组合。获探针还可以包括空间条形码10。捕获探针还可以包括独特分子标识符(UMI)序列106。虽然图1显示空间条形码105位于UMI序列106上游(5′)，但应理解的是，其中UMI序列106位于空间条形码105上游(5′)的捕获探针也适合使用在本文所述的任何方法中。捕获探针还可以包括捕获域107以促进目标分析物的捕获。在一些实施方式中，捕获探针包含一个或多个额外的功能序列，其可以位于例如空间条形码105和UMI序列106之间、UMI序列106和捕获域107之间或在捕获域107之后。捕获域可以具有与核酸分析物序列互补的序列。捕获域可以具有与本文所述连接的探针互补的序列。捕获域可以具有与分析物捕获剂中存在的捕获柄(handle)序列互补的序列。捕获域可以具有与夹板(splint)寡核苷酸互补的序列。这种夹板寡核苷酸除了具有与捕获探针捕获域互补的序列外，还可具有核酸分析物的序列、与本文所述连接的探针的部分互补的序列和/或本文所述的捕获柄序列。
通常可选择功能性序列以与各种不同测序系统中的任何一种兼容，例如离子激流质子(Ion Torrent Proton)或PGM、Illumina测序仪、PacBio、牛津纳米孔(OxfordNanopore)等及其要求。在一些实施方式中，可选择功能性序列以与非商业化测序系统兼容。可使用适当功能性序列的此类测序系统和技术的示例包括(但不限于)离子激流质子或PGM测序、Illumina测序、PacBio SMRT测序和牛津纳米孔测序。此外，在一些实施方式中，可以选择功能性序列以与其他测序系统(包括非商业化测序系统)兼容。
在一些实施方式中，空间条形码105和功能序列104对于所有与给定特征附接的探针都是共同的。在一些实施方式中，附接给定特征的捕获探针的UMI序列106与附接给定特征的不同捕获探针的UMI序列是不同的。
图2是说明可裂解捕获探针的示意图，其中裂解的捕获探针可进入非透化细胞并结合到样品内的分析物。捕获探针201包含裂解域202、细胞穿透肽203、报告分子204和二硫键(-S-S-)。205表示捕获探针的所有其他部分，例如，空间条形码和捕获域。
图3是示例性多重空间条码化特征的示意图。在图3中，特征301可耦合到空间条码化捕获探针，其中特定特征的空间条码化探针可具有相同的空间条形码，但具有设计成将特征的空间条形码与多个目标分析物相关联的不同捕获域。例如，特征可以耦合到四种不同类型的空间条码化捕获探针，每种类型的空间条码化捕获探针具有空间条形码302。与该特征相关联的一种类型捕获探针包括空间条形码303与聚(T)捕获域403的组合，其设计用于捕获mRNA目标分析物。与该特征相关联的第二类型捕获探针包括空间条形码304与用于gDNA分析的随机N-聚体捕获域804的组合。与该特征相关联的第三类型捕获探针包括空间条形码302联合与感兴趣的分析物捕获剂305的捕获柄序列互补的捕获域。与该特征相关联的第四类型捕获探针包括空间条形码306与捕获探针组合，该捕获探针可特异性结合可在CRISPR分析(例如CRISPR/Cas9)中起作用的核酸分子806。虽然图3中仅示出了四种不同的捕获探针条码化构建体，但是捕获探针条码化构建体可被定制用于与核酸相关联的任何给定分析物的分析，并且能够与这种构建体结合。例如，图3中所示的方案也可用于本文中所公开的其它分析物的同时分析，包括但不限于：(a)mRNA，谱系追踪构建体，细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及gDNA；(b)mRNA，可获得的染色质(例如，ATAC-seq，DNA酶-seq，和/或MNA酶-seq)细胞表面或细胞内蛋白质和代谢物，以及扰动剂(例如，CRISPR-crRNA/sgRNA、TALEN、锌指核酸酶和/或如本文所述的反义寡核苷酸)；(c)mRNA、细胞表面或细胞内蛋白质和/或代谢物，条码化标记剂(例如，本文所述的MHC多聚体)和免疫细胞受体(例如，T细胞受体)的V(D)J序列。在一些实施方式中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适配体、miRNA、物理环境(例如，温度变化)，或任何其它已知扰动剂。参见例如WO2020/176788的第(II)(b)部分(例如，第(i)-(vi)小节)和/或美国专利申请公开号2020/0277663。捕获探针的产生可以通过任何合适的方法来实现，包括在WO2020/176788的第(II)(d)(ii)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的那些。
在一些实施方式中，可采用任何合适的多重化技术(例如，描述于WO 2020/176788的第(IV)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663)来检测(例如同时或依次检测)来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)。
在一些实施方式中，可以使用一种或多种分析物捕获剂进行一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指某一物质，其与分析物(例如，生物样品中的分析物)以及与捕获探针(例如，连接至基材或特征的捕获探针)相互作用以鉴别分析物。在一些实施方式中，分析物捕获剂包括：(i)分析物结合部分(例如，其结合分析物)，例如抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)捕获柄序列(例如，分析物捕获序列)。如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分相关联或以其他方式鉴别分析物结合部分的条形码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”或“捕获柄序列”是指被配置为杂交到捕获探针的捕获域、结合到捕获探针的捕获域、耦合到捕获探针的捕获域或以其他方式与捕获探针的捕获域相互作用的区域或部分。在一些实施方式中，捕获柄序列与捕获探针的捕获域互补。在一些情况中，分析物结合部分条形码(或其部分)可能能够从分析物捕获剂去除(例如，裂解)。
图4是由分析物结合部分404和分析物结合部分条形码408构成的示例性分析物捕获剂402的示意图。示例性分析物结合部分404是能够与到分析物406结合的分子，反应性物质捕获剂能够与空间条码化捕获探针相互作用。分析物结合部分可以高亲和力和/或高特异性结合到分析物406。分析物捕获剂可以包括分析物结合部分条形码结构域408、核苷酸序列(例如，寡核苷酸)，其可与捕获探针的捕获域的至少部分或全部杂交。反应性物质结合部分条形码加工和使用408可以包含本文所述的分析物结合部分条形码和捕获柄序列。分析物结合部分404可以包括多肽和/或适配体。分析物结合部分404可包括抗体或抗体片段(例如，抗原结合片段)。
图5是描绘特征固定的(feature-immobilized)捕获探针524和分析物捕获剂526之间的示例性相互作用的示意图。特征固定的捕获探针524可以包括空间条形码508以及功能序列506和UMI 510，如本文他处所述。捕获探针还可以包括能够结合到分析物捕获剂526的捕获域512。分析物捕获剂526可以包括功能序列518、分析物结合部分条形码516和能够与捕获探针524的捕获域512结合的捕获柄序列514。分析物捕获剂还可以包括接头520，其使捕获剂条形码结构域516耦合到分析物结合部分522。
图6A、6B和6C是图示如何在基于阵列的系统中利用链霉亲和素细胞标签来产生空间条码化细胞或细胞内容物的示意图。例如，如图6A所示，肽结合的主要组织相容性复合物(MHC)可单独与生物素(β2m)关联并与链霉亲和素部分结合，使得链霉亲和素部分包含多个pMHC部分。这些部分中的每一个可结合到TCR，使得链霉亲和素通过多个MCH/TCR结合相互作用结合到靶T细胞。多个相互作用协同作用，可以大大提高结合亲和力。这种改进的亲和力可以改善T细胞的标记，也可以降低标记从T细胞表面解离的可能性。如图6B所示，捕获剂条形码结构域601可由链霉亲和素602修饰并与生物素化MHC603的多个分子接触，使得生物素化MHC 603分子与链霉亲和素偶联的捕获剂条形码结构域601耦合。结果是条码化的MHC多聚体复合物605。如图6B所示，捕获剂条形码结构域序列601可以将MHC识别为其相关联的标签，并且还包括可选的功能序列，例如用于与其他寡核苷酸杂交的序列。如图6C所示，一个示例寡核苷酸是捕获探针606，其包括互补序列(例如，与C C C相对应的rGrGrG)、条形码序列和其他功能序列，例如，UMI、衔接子序列(例如，包括测序引物序列(例如，R1或部分R1(“pR1”))、流动池附接序列(例如，P5或P7或其部分序列)等。在某些情况下，捕获探针606可首先与特征(例如，凝胶珠)相关联并从特征中释放。在其它实施方式中，捕获探针606可与MHC-寡核苷酸复合物601的捕获剂条形码结构域605杂交。杂交的寡核苷酸(间隔子C C C和间隔子rGrGrG)随后可在引物延伸反应中延伸，使得生成包含对应于两个空间条形码序列(与捕获探针相关联的空间条形码，与MHC-寡核苷酸复合物相关联的条形码)中的每一个的序列的构建物。在一些情况中，这些对应序列中的一个或两个可以是捕获探针606或捕获剂条形码结构域601中的原始序列的互补物。在其他实施方式中，捕获探针和捕获剂条形码结构域连接在一起。所得到的构建体可以任选地进一步加工(例如，以添加任何其它序列和/或用于清理)并进行测序。如本文别处所述，源自捕获探针606空间条形码序列的序列可用于识别特征，并且源自捕获剂条形码结构域601上的空间条形码序列的序列可用于识别结合在细胞表面上的特定肽MHC复合物604(例如，当使用用于筛选免疫细胞或免疫细胞群的MHC肽库时)。
分析物捕获剂的其它描述可见于WO2020/176788的第(II)(b)(ix)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(viii)部分。
存在将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联的至少两种方法，从而使得空间条形码将一个或多个细胞和/或一个或多个细胞的内容标识为与特定空间位置相关联。一种方法是促进分析物或分析物代用物(proxy)(例如，中间物)移出细胞并朝向空间条码化阵列(例如，包括空间条码化捕获探针)。另一种方法是从阵列裂解空间条码化捕获探针，并促进空间条码化捕获探针朝向生物样品和/或至生物样品中或至生物样品上。
在一些情况中，捕获探针可以用于由模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物(例如，结合的探针(例如，连接产物)或分析物捕获剂)或其部分)或其衍生物引发、复制并任选地由此产生条码化的延伸产物(参见，例如，WO2020/176788的第(II)(b)(vii)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663关于延伸的捕获探针)。在一些情况中，捕获探针可以用于与模板(例如，DNA或RNA模板，例如分析物或中间物或其部分)形成结合的探针(例如，连接产物)，由此产生用作模板代用物的连接产物。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指具有添加到捕获探针末端(例如，3′或5′端)的附加核苷酸从而延伸捕获探针总长度的捕获探针。例如，“延伸的3′端”表示附加的核苷酸被添加到捕获探针的最3′核苷酸以延伸的捕获探针的长度，例如，通过用于延伸的核酸分子的聚合反应，包括通过聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方式中，延伸的捕获探针包括向捕获探针的3′末端添加与特异性结合捕获探针的捕获域的分析物或中间物的核酸序列互补的核酸序列。在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种DNA聚合酶延伸。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码序列。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以用于下游分析(例如通过DNA测序)的量。在一些实施方式中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
在WO2020/176788的第(II)(a)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述了空间分析方法的其它变化形式，在一些实施方式中包括成像步骤。捕获的分析物(和/或中间物或其部分)的分析，例如，包括样品移出、捕获探针的延伸、测序(例如，裂解的延伸捕获探针和/或与延伸的捕获探针互补的cDNA分子的测序)、阵列上测序(例如，使用例如原位杂交或原位连接方法)、时域分析和/或邻近捕获，描述于WO2020/176788的第(II)(g)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663。一些质量控制措施也描述于WO2020/176788的第(II)(h)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
空间信息可以提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断、预后和/或用于确定治疗功效)；确定用于治疗疾病或病症的候选药物靶标；将对象鉴定(例如，诊断)为患有疾病或病症；鉴定对象的疾病或病症的阶段和/或预后；将对象鉴定为具有增加的发展疾病或病症的可能性；监测对象的疾病或病症的进展；确定治疗对象的疾病或病症的功效；确定治疗对疾病或病症有效的患者亚群；对患有疾病或病症的对象的治疗的修改；选择参加临床试验的对象；和/或为患有疾病或病症的对象选择治疗。
空间信息可以提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可以允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达谱(例如，在健康和/或患病组织中)；近距离鉴别多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中上调和/或下调的基因和/或蛋白质；肿瘤微环境的表征；肿瘤免疫反应的表征；细胞类型的表征及其在组织中的共定位；组织内遗传变异的鉴定(例如，基于与特定疾病或障碍生物标志物相关联的基因和/或蛋白质表达谱)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基材起到支持捕获探针直接或间接附接到阵列特征的作用。“特征”是一个实体，作为空间分析中使用的各种分子实体的支持或存储库。在一些实施方式中，阵列中的一些或全部特征被功能化以用于分析物捕获。示例性基材描述于WO2020/176788的第(II)(c)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。阵列的示例性特征和几何属性可以在WO2020/176788的第(II)(d)(i)、(II)(d)(iii)和(II)(d)(iv)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中找到。
通常，当将生物样品与包括捕获探针的基材(例如，具有嵌入、点样、印刷、制造在基材上的捕获探针的基材，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基材)接触时，分析物和/或中间物(或其部分)可被捕获。如本文所用，使生物样品“接触”基材指任何接触(例如，直接或间接)，使得捕获探针可以与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价或非共价结合(例如，杂交))。捕获可以主动(例如，使用电泳)或被动(例如，使用扩散)实现。分析物捕获进一步描述于WO2020/176788的第(II)(e)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况中，可以通过将具有条形码(例如空间条形码)的分子(例如肽、脂质或核酸分子)附连和/或引至生物样品(例如，引至生物样品中的细胞)来进行空间分析。在一些实施方式中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入生物样品(例如，生物样品中的多个细胞))用于空间分析。在一些实施方式中，在将具有条形码的分子附连和/或引至生物样品之后，可以将生物样品物理分离(例如，解离)成单细胞或细胞群以进行分析。一些这样的空间分析方法描述于WO2020/176788的第(III)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。
在一些情况中，空间分析可以通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来进行。在一些情况中，例如，可以使用RNA模板连接(RTL)进行空间分析。RTL的方法之前已经描述过。参见例如Credle等，Nucleic Acids Res.2017年8月21日；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，例如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在一些情况中，寡核苷酸是DNA分子。在一些情况中，寡核苷酸之一在3′末端包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一寡核苷酸在5′末端包括磷酸化核苷酸。在一些情况中，两个寡核苷酸之一包括捕获域(例如，聚(A)序列、非均聚序列)。在与分析物杂交后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生结合的探针(例如，连接产物)。在一些情况中，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在一些情况中，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在连接之前延伸寡核苷酸之一。连接后，结合的探针(例如，连接产物)释放自分析物。在一些情况中，利用核酸内切酶(例如，RNA酶H)释放结合的探针(例如，连接产物)。然后可以通过阵列上的捕获探针(例如，代替分析物的直接捕获)捕获释放的结合的探针(例如，连接产物)，任选地经扩增和测序，从而确定生物样品中分析物的位置和任选地丰度。
在空间信息分析期间，获得与分析物相关联的空间条形码的序列信息，并且该序列信息可用于提供关于分析物在生物样品中的空间分布的信息。可以使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方式中，特定捕获探针和它们捕获的分析物与基材上特征阵列中的特定位置相关联。例如，特定空间条形码可以在阵列制造之前与特定阵列位置相关联，并且空间条形码的序列可以与特定阵列位置信息一起存储(例如，在数据库中)，从而使得每个空间条形码唯一地映射到特定的阵列位置。
或者，特定空间条形码可以在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置，从而使得在每个位置，仅存在一种类型的空间条形码，由此空间条形码与阵列的单个特征独特地相关联。必要时，可以使用本文所述的任何方法对阵列进行解码，以便空间条形码与阵列特征位置独特地相关联，并且可以如上所述存储该映射。
当在空间信息分析期间获得捕获探针和/或分析物的序列信息时，可以通过参考存储的将每个空间条形码与阵列特征位置独特关联的信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。以此方式，特定捕获探针和捕获分析物与特征阵列中的特定位置相关联。各阵列特征位置表示相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标志物)的位置。因此，各特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
一些示例性空间分析工作流程描述于WO2020/176788的示例性实施方式部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中。参见例如WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的以“在本文描述的工作流程的一些非限制性示例中，可以将样品浸入……”开头的示例性实施方式。还参见，例如，Visium空间基因表达试剂盒用户指南(Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年6月)，靶向基因表达空间用户指南(the Targeted Gene Expression-Spatial UserGuide)(，例如，Rev A，日期2020年10月)，和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(Visium Spatial Tissue Optimization Reagent Kits User Guide)(例如，Rev C，日期2020年7月)。
在一些实施方式中，可以使用专用硬件和/或软件来进行空间分析，例如WO2020/176788的第(II)(e)(ii)和/或(V)部分和/或美国专利申请公开号2020/0277663中描述的任何系统，或在WO2020/123320的用于成像的控制载玻片、使用控制载玻片和基材的方法、使用用于成像的控制载玻片和基材的系统和/或样品和阵列对齐装置和方法、信息标签中描述的任何一种或多种装置或方法。
用于进行空间分析的合适系统可以包括部件，例如用于容纳生物样品的室(例如，流动池或可密封的流体密封室)。生物样品可以被固定在例如生物样品容器中。一个或多个流体室可以通过流体导管连接到室和/或样品容器，并且可以通过流体泵、真空源或连接到流体导管的其它装置(产生压强梯度以驱动流体流)将流体递送到室和/或样品容器中。一个或多个阀也可以连接到流体导管以调节试剂从储器到室和/或样品容器的流动。
系统可以任选地包括控制单元，该控制单元包括一个或多个电子处理器、输入接口、输出接口(例如显示器)和存储单元(例如固态存储介质，例如但不限于，磁性、光学或其它固态、持久性、可写和/或可重写存储介质)。控制单元可以任选地通过网络连接到一个或多个远程设备。控制单元(及其组件)通常可以进行本文描述的任何步骤和功能。在系统连接到远程设备的情况下，远程设备(或多个设备)可以进行本文描述的任何步骤或特征。该系统可以任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。系统还可以任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED、基于二极管、激光器)、具有特征的基材、来自捕获在基材上的生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
系统可以可选地包括在一种或多种有形存储介质和硬件组件(例如专用集成电路)中编码和/或实现的软件指令。软件指令在由控制单元(尤其是电子处理器)或集成电路执行时，可以使控制单元、集成电路或其它执行软件指令的组件执行本文所述的任何方法步骤或功能。
在一些情况中，本文描述的系统可以检测(例如配准图像)阵列上的生物样品。检测阵列上的生物样品的示例性方法描述于PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请序列号16/951,854。
在将分析物从生物样品转移到基材上的特征阵列之前，可以将生物样品与阵列对齐。生物样品和包括捕获探针的特征阵列的对齐可以促进空间分析，这可以用于检测生物样品中不同位置内分析物存在和/或水平的差异，例如，生成分析物的存在和/或水平的三维图。用于生成分析物存在和/或水平的二维和/或三维图的示例性方法描述于PCT申请号2020/053655中，空间分析方法一般描述于WO2020/061108和/或美国专利申请序列号16/951,864中。
在一些情况中，可以使用一个或多个基准标志物将分析物存在和/或水平的图与生物样品的图像对齐，例如，放置在成像系统视野中的物体出现在产生的图像中，如WO2020/123320的基材属性部分、用于成像的控制载玻片部分、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请序列号16/951,843中所述。基准标志物可被用作对准的参考点或测量标度(例如，以对准样品和阵列、以对准两个基材、以确定基材上样品或阵列相对于基准标志物的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
PCT专利申请公开好WO 2020/123320中描述了夹层工艺，该专利申请通过以引用引用其全部内容纳入本文。
II.通过空间cDNA的杂交和捕获进行靶向空间基因表达谱分析
(a)引言
使用捕获探针和/或分析物捕获剂的空间分析方法提供了关于分析物(例如，核酸或蛋白质)丰度和位置的信息。传统上，测序结果包含不需要的基因、核糖体或线粒体转录物，以及其他不感兴趣的读数。感兴趣的分析物的检测很大程度上取决于(至少部分)阵列上所有捕获的分析物的测序能力。本文公开了使用对感兴趣的目标分析物具有特异性的诱饵寡核苷酸来捕获感兴趣的目标分析物的方法和组合物。通过这种方式，测序结果包含来自感兴趣的目标分析物更高百分比的读数，这增加了感兴趣的目标分析物的空间分辨率和测序成本
本文公开了使用对感兴趣的目标分析物具有特异性的诱饵寡核苷酸来捕获感兴趣的目标分析物的方法。如本文所公开，诱饵寡核苷酸是与转录的(例如，mRNA)序列杂交的短(40bp至160bp)寡核苷酸，从而检测mRNA及其表达。已鉴定诱饵寡核苷酸可与转录物的5′端、转录物的3′端或转录物的任何插入序列杂交。特别地，设计探针以与转录物的插入序列(即并非5′端和3′端)杂交具有某些优势。例如，人基因组中许多转录物在5′和3′端具有不同的序列。因此，设计将靶向间插转录物序列的诱饵，特别是靶向保守序列的诱饵，可以使得单个诱饵与同一基因的多个同种型杂交。因此，本文公开了包含诱饵寡核苷酸的组合物和方法，所述诱饵寡核苷酸与同一基因的多个同种型杂交。
因此，本文提供这样的方法，其包括设计和使用探针(例如，诱饵寡核苷酸、核酸诱饵等)来捕获全长(例如，未片段化的)cDNA用于测序分析，而不是诱饵寡核苷酸用于捕获包含3′UTR的最终文库片段。通过靶向全长cDNA，有可能针对各个基因的个转录物(例如，同种型)利用靶基因更可靠注释的区域，例如编码序列。因此，使用该方法识别样品中感兴趣的靶标的步骤包括但不限于制备核酸文库以使核酸诱饵可以与一个或多个目标分析物杂交；使核酸诱饵与一个或多个目标分析物杂交；和确定生物样品中目标分析物的位置和丰度。
本文的特征还在于检测已经通过基材(即空间阵列)上捕获探针捕获的感兴趣的分析物的方法。在一些情况中，在感兴趣的分析物被捕获在空间阵列上后，使用探针(例如，核酸诱饵)来鉴定感兴趣的目标分析物。因此，使用该方法识别样品中感兴趣的靶标的步骤包括但不限于使用捕获探针捕获样品中的分析物；扩增杂交捕获探针/分析物产物以创建cDNA文库；制备cDNA文库以使核酸诱饵可以与一个或多个目标分析物杂交；使核酸诱饵与一个或多个目标分析物杂交；和确定生物样品中目标分析物的位置和丰度。
使用上述任何一种方法以及本文进一步阐明的方法对生物样品的表型进行概况分析有助于避免混淆生物学因素，例如检测与研究无关的强表达基因或可能掩盖生物学差异的细胞周期表型。此外，增强对一个或多个目标分析物的检测有助于显著降低获得感兴趣的基因组的信息的测序成本，通过将消耗在非组内基因(例如核糖体蛋白转录物、线粒体转录物等)的读数数量最小化。如此，文所述的方法还具有成本效益。
(b)生物样品、分析物及其制备
(i)生物样品和分析物
在一些实施方式中，本文公开的方法中使用的生物样品是细胞培养样品。在一些情况中，生物样品是组织样品。在一些实施方式中，生物样品是组织样品切片。在一些实施方式中，生物样品是新鲜组织样品。在一些实施方式中，生物样品是新鲜冷冻组织样品。在一些实施方式中，生物样品是已经福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的组织样品(即FFPE样品)。在一些实施方式中，生物样品是包埋于最佳切割温度(OCT)化合物中的组织样品。在一些实施方式中，生物样品已经预先染色(例如，免疫组织化学(IHC)或组织学染色)和成像，并且任选地，脱色。
在一些实施方式中，生物样品获自对象，以使用各种技术中的任一种进行分析，包括但不限于活检、手术和激光捕获显微镜(LCM)，并且通常包括来自对象的细胞和/或其他生物材料。生物样品还可获自原核生物，例如细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌(Staphylococci)或肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)；古细菌；病毒，例如丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒；或类病毒。生物样品还可以获自真核生物，例如患者来源的类器官(PDO)或患者来源的异种移植物(PDX)。生物样品可以来自哺乳动物，例如人，非人哺乳动物(例如，小鼠)等。可从中获得生物样品的对象可以是健康或无症状的个体、患有或怀疑患有疾病(例如，患有疾病如癌症的患者)的个体或对疾病有预处置的个体，和/或需要治疗或怀疑需要治疗的个体。
生物样品可以包括任何数量的大分子，例如细胞大分子和细胞器(例如线粒体和细胞核)。生物样品可以是核酸样品和/或蛋白质样品。生物样品可以是碳水合合物样品或脂质样品。生物样品可以作为组织样品获得，例如组织切片、活检、核心活检、针吸或细针吸。样品可以是液体样品，例如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品、结肠样品、颊拭子、组织学样品、组织病理学样品、血浆或血清样品、肿瘤样品、活细胞、培养细胞、临床样品，例如全血或血液衍生产品、血细胞或培养组织或细胞，包括细胞悬浮液。
生物样品可来自本文所述的对象或生物体的同质培养物或群体，或可替代地来自例如群落或生态系统中的若干不同生物体的集合。在一些实施方式中，生物样品是人样品。
生物样品可以包括一个或多个病变细胞。病变细胞可以具有改变的代谢特性、基因表达、蛋白质表达和/或形态特征。疾病的例子包括炎症紊乱、代谢紊乱、神经系统紊乱和癌症。癌细胞可以来源于实体瘤、血液系统恶性肿瘤、细胞系，也可以以循环肿瘤细胞形式获得。
生物样品也可以包括胎儿细胞。例如，可以进行例如羊膜穿刺术之类的操作以从母体循环获得胎儿细胞样品。胎儿细胞测序可用于鉴定许多遗传疾病中的任何一种，包括例如非整倍体，例如唐氏综合征、爱德华兹综合征和帕陶综合征。此外，胎儿细胞的细胞表面特征可用于识别多种疾病或病症中的任一种。
生物样品也可以包括免疫细胞。对这类细胞的免疫功能进行序列分析，包括基因组学、蛋白质组学和细胞表面特征，可以提供丰富的信息，有助于了解免疫系统的状态和功能。举例来说，在自体干细胞移植后确定多发性骨髓瘤(MM)患者中最小残留病(MRD)的状态(例如阴性或阳性)被认为是MM患者中MRD的预测因素(参见，例如，美国专利申请公开号2018/0156784，其通过引用全文纳入本文)。
生物样品中的免疫细胞的示例包括但不限于B细胞、T细胞(例如，细胞毒性T细胞、自然杀伤性T细胞、调节性T细胞和辅助性T细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、髓样细胞，例如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞/多节核中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、血小板/巨核细胞和树突状细胞。
在一些实施方式中，生物样品固定于载玻片。在一些实施方式中，在创建核酸文库(例如，多个核酸)之前对样品进行染色。在一些实施方式中，生物样品在载玻片上时染色。在一些实施方式中，在创建核酸文库(例如，多个核酸)之前对染色的生物样品进行成像。
在一些实施方式中，染色包括生物染色技术，例如H&E染色。在一些实施方式中，染色包括使用荧光偶联抗体(例如，免疫荧光)鉴定分析物。在一些实施方式中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或两种或更多种不同的染色技术(例如，IF、IHC和/或H&E染色)对生物样品进行染色。例如，生物样品可以这样来制备：通过使用一种技术(例如，H&E染色和明场成像)进行染色和成像，脱色(例如，淬灭或光漂白)，然后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微镜)对同一生物样品进行染色和成像。
在一些实施方式中，可以在创建核酸空间文库之前对生物样品进行脱色。生物样品的去污或脱色方法在本领域是已知的，并且通常取决于应用于样品的染色剂的性质。
在一些实施方式中，生物样品中的分析物是核酸。在一些实施方式中，分析物(例如，核酸)获自生物样品。在一些实施方式中，核酸是DNA(例如，基因组DNA、线粒体DNA或外泌体DNA)。在一些实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方式中，RNA是mRNA。RNA的其他示例，例如各种类型的编码和非编码RNA。不同类型的RNA分析物包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、小RNA(miRNA)和病毒RNA。RNA可以是转录物(例如，存在于组织切片中)。RNA可以是小的(例如，长度小于200个核酸碱基)或大的(例如，长度大于200个核酸碱基的RNA)。小RNA主要包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。RNA可以是细菌rRNA(例如，16s rRNA或23s rRNA)。
在一些实施方式中，核酸包含DNA。DNA的示例包括基因组DNA、甲基化DNA、特定甲基化DNA序列、片段化DNA、线粒体DNA、原位合成的PCR产物和RNA/DNA杂合体。
(ii)成像和染色
在一些情况中，可以使用多种染色剂和染色技术对生物样品进行染色。在一些情况中，生物样品是组织的切片(例如，10μm切片)。在一些情况中，生物样品在放置到载玻片上之后被干燥。在一些情况中，生物样品在42℃干燥。在一些情况中，干燥发生约1小时、约2小时、约3小时，或直到切片变得透明。在一些情况中，可以将生物样品干燥过夜(例如，在室温的干燥器中)。
在一些实施方式中，可使用任意数量的生物染色剂对样品进行染色，包括但不限于吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、伊红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、霍氏染色剂、碘、甲基绿、亚甲基蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或藏红。在一些情况中，本文公开的方法包括对生物样品进行成像。在一些情况中，样品成像发生在生物样品脱氨基之前。在一些情况中，样品可以使用已知的染色技术染色，包括坎格伦瓦染色(Can-Grunwald)、姬姆萨染色(Giemsa)、苏木精和伊红(H&E)、哲纳尔氏染色(Jenner′s)、利什曼染色(Leishman)、马松(Masson′s)三色、巴氏(Papanicolaou)、罗曼落司基染色(Romanowsky)、银染(silver)、苏丹(Sudan)、瑞氏染色(Wright′s)和/或PAS染色法染色技术。PAS染色通常在甲醛或丙酮固定后进行。在一些情况中，染剂是H&E染剂。
在一些实施方式中，可以使用如本文他处所述的可检测标记物(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)对生物样品进行染色。在一些实施方式中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术对生物样品进行染色。在一些实施方式中，染色包括生物染色技术，例如H&E染色。在一些实施方式中，染色包括使用荧光偶联抗体鉴定分析物。在一些实施方式中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或两种或更多种不同的染色技术对生物样品进行染色。例如，可以通过使用一种技术(例如，H&E染色和明场成像)进行染色和成像，然后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微镜)对同一生物样品进行染色和成像，来制备生物样品。
在一些实施方式中，生物样品可以脱色。生物样品的去污或脱色方法在本领域是已知的，并且通常取决于应用于样品的染色剂的性质。例如，H&E染色可通过在HCl或任何其它酸中洗涤样品来脱色(例如，硒酸、硫酸、氢碘酸、苯甲酸、碳酸、苹果酸、磷酸、草酸、琥珀酸、水杨酸、酒石酸、亚硫酸、三氯乙酸、氢溴酸、盐酸、硝酸、正磷酸、砷酸、亚硒酸、铬酸、柠檬酸、氢氟酸、亚硝酸、异氰酸、甲酸、硒化氢、钼酸、乳酸、乙酸、碳酸、硫化氢或其组合)。在一些实施方式中，脱色可以包括在酸(例如HCl)中的1、2、3、4、5或更多次洗涤。在一些实施方式中，脱色可包括将HCl添加到下游溶液(例如透化溶液)中。在一些实施方式中，脱色可包括在酸(例如HCl)溶液中溶解所公开方法中使用的酶(例如胃蛋白酶)。在一些实施方式中，在用酸对苏木精脱色后，可向脱色溶液中添加其他试剂以升高pH用于其他应用。例如，可以向酸脱色溶液中添加SDS以与单独酸脱色溶液相比升高pH。作为另一个示例，在一些实施方式中，通过抗体偶联将一种或多种免疫荧光染色剂施用于样品。这些染色剂可以使用例如通过还原剂和洗涤剂洗涤处理的二硫键的裂解、潮变性盐处理、抗原回收溶液处理和酸性甘氨酸缓冲液处理等技术移除。例如，Bolognesi等，J.Histochem.Cytochem.2017；65(8)：431-444，Lin等，Nat Commun.2015；6：8390，Pirici等，J.Histochem.Cytochem.2009；57：567-75，和Glass等，J.Histochem.Cytochem.2009；57：899-905中描述了多重染色和脱色的方法，其全部内容通过引用纳入本文。
在一些实施方式中，免疫荧光或免疫组织化学方案(直接和间接染色技术)可以作为本文呈现的示例性空间工作流程的部分或附加部分来执行。例如，可以根据本文所述的方法固定组织切片。可以将生物样品转移至阵列(例如，捕获探针阵列)，其中使用免疫荧光方案探测分析物(例如，蛋白质)。例如，可以对样品进行再水合、封闭和透化(3XSSC、2％BSA、0.1％Triton X、1U/μl RNA酶抑制剂，4℃持续10分钟)，然后用荧光一抗染色(1∶100于3XSSC，2％BSA、0.1％Triton X、1U/μl RNA酶抑制剂，4℃持续30分钟)。可对生物样品进行洗涤、加盖玻片(在甘油+1U/μl RNA酶抑制剂中)、成像(例如，使用共聚焦显微镜或其他能够进行荧光检测的装置)、洗涤和处理(根据本文所述的分析物捕获或空间工作流程)。
在一些情况中，可以将甘油溶液和盖玻片添加到样品中。在一些情况中，甘油溶液可以包括复染剂(例如，DAPI)。
如本文所用，抗原修复缓冲液可改善IF/IHC方案中的抗体捕获。抗原修复的示例性方案可以是预热抗原修复缓冲液(例如，至95℃)，将生物样品浸入加热的抗原修复缓冲液中持续预定时间，然后从抗原修复缓冲液中取出生物样品并洗涤生物样品。
在一些实施方式中，优化透化对于鉴定细胞内分析物可能是有用的。透化优化可以包括选择透化剂、透化剂的浓度和透化持续时间。组织透化在本文别处讨论。
在一些实施方式中，在标记(labeling)生物样品的准备过程中封闭阵列和/或生物样品能降低抗体与阵列和/或生物样品的非特异性结合(减低背景)。一些实施方式提供了可以在施用标记物之前和/或期间施加的封闭缓冲液/封闭溶液，其中封闭缓冲液可以包括封闭剂和任选的表面活性剂和/或盐溶液。在一些实施方式中，封闭剂可以是牛血清白蛋白(BSA)、血清、明胶(例如鱼明胶)、牛奶(例如脱脂奶粉)、酪蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、生物素封闭剂、过氧化物酶封闭剂、左旋咪唑、卡诺伊溶液(Carnoy′s solution)、甘氨酸、赖氨酸、硼氢化钠、泮胺天蓝(pontamine sky blue)、苏丹黑、台盼蓝、FITC封闭剂和/或醋酸。封闭缓冲液/封闭溶液可以在对生物样品进行标记(例如，应用偶联了荧光团的抗体)之前和/或期间施用于阵列和/或生物样品。
(iii)样品制备供探针应用
在一些情况中，生物样品被脱蜡。脱蜡可以使用本领域已知的任何方法实现。例如，在一些情况中，用包括二甲苯和各种浓度的乙醇的一系列洗涤液处理生物样品。在一些情况中，脱蜡方法包括用二甲苯处理(例如，每次5分钟洗涤3次)。在一些情况中，所述方法还包括用乙醇处理(例如，100％乙醇，每次洗涤两次，每次10分钟；95％乙醇，每次洗涤两次，每次10分钟；70％乙醇，每次洗涤两次，每次10分钟；50％乙醇，每次洗涤两次每次10分钟)。在一些情况中，在乙醇洗涤之后，可以用去离子水洗涤生物样品(例如，每次洗涤两次，每次5分钟)。可以理解，本领域技术人员可以调整这些方法以优化脱蜡。
在一些情况中，生物样品是去交联的。在一些情况中，生物样品在含有TE缓冲液(包括Tris和EDTA)的溶液中去交联。在一些情况中，TE缓冲液是碱性的(例如，在约9的pH下)。在一些情况中，去交联发生在约50℃至约80℃。在一些情况中，去交联发生在约70℃。在一些情况中，去交联在70℃发生约1小时。就在去交联之前，可以用酸(例如，0.1M HCl，约1分钟)处理生物样品。在去交联步骤之后，可以洗涤生物样品(例如，用1 x PBST)。
在一些情况中，制备用于探针应用的生物样品的方法包括对样品进行透化。在一些情况中，使用磷酸盐缓冲液对生物样品进行透化。在一些情况中，磷酸盐缓冲液是PBS(例如，1 x PBS)。在一些情况中，磷酸盐缓冲液是PBST(例如，1 x PBST)。在一些情况中，透化步骤进行多次(例如，每次5分钟3次)。
在一些情况中，制备用于探针应用的生物样品的方法包括平衡和封闭生物样品的步骤。在一些情况中，使用杂交前(pre-Hyb)缓冲液进行平衡。在一些情况中，pre-Hyb缓冲液不含RNA酶。在一些情况中，pre-Hyb缓冲液不含牛血清白蛋白(BSA)、Denhardt氏溶液或其它可能被核酸酶污染的生物材料。
在一些情况中，平衡步骤进行多次(例如，2次，每次5分钟；3次，每次5分钟)。在一些情况中，生物样品用封闭缓冲液封闭。在一些情况中，封闭缓冲液包括运载体(例如tRNA)，例如来自啤酒酵母的酵母tRNA(例如，终浓度为10-20μg/mL)。在一些情况中，封闭可以进行5、10、15、20、25或30分钟。
任何前述步骤都可以针对性能进行优化。例如，可以改变温度。在一些情况中，预杂交方法在室温下进行。在一些情况中，预杂交方法在4℃进行(在一些情况中，改变本文提供的时间范围)。
(c)核酸文库制备
(i)单细胞文库制备
本文公开了由细胞或细胞群制备核酸文库(例如，多个核酸)的方法。在一些实施方式中，生物样品可从体外生长的细胞培养物中获得。来自细胞培养物的样品可包括一个或多个悬浮细胞，其在细胞培养物内是锚定独立的。此类细胞的示例包括但不限于衍生自造血细胞及衍生自以下细胞系的细胞系：Colo205、CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR、HOP-92、NCI-H322M及MALME-3M。
来自细胞培养物的样品可以包括生长在含有培养基的容器表面上的一个或多个贴壁细胞。贴壁细胞的非限制性示例包括DU145(前列腺癌)细胞、H295R(肾上腺皮质癌)细胞、HeLa(宫颈癌)细胞、KBM-7(慢性粒细胞白血病)细胞、LNCaP(前列腺癌)细胞、MCF-7(乳腺癌)细胞、MDA-MB-468(乳腺癌)细胞、PC3(前列腺癌)细胞、SaOS-2(骨癌)细胞、SH-SY5Y(神经母细胞瘤，克隆自骨髓瘤)细胞、T-47D(乳腺癌)细胞、THP-1(急性髓系白血病)细胞、U87(胶质母细胞瘤)细胞、国家癌症研究所60癌细胞系小组(NCI60)、vero(非洲绿猴肾上皮细胞系)细胞、MC3T3(胚胎颅骨)细胞、GH3(垂体瘤)细胞，PC12(嗜铬细胞瘤)细胞、狗MDCK肾上皮细胞、爪蟾A6肾上皮细胞、斑马鱼AB9细胞和Sf9昆虫上皮细胞。
被视为细胞或细胞群的样品的其他示例包括但不限于优先权文件美国临时专利申请No.62/979,652、62/980,124和63/077,019中表1中列的那些，其各自通过引用其全部内容纳入本文。应当理解的是，单细胞文库制备中所细胞群可以来自本文公开的任何细胞或细胞培养物群。
在一些实施方式中，核酸文库(例如，多个核酸)包括一个或多个感兴趣核酸，可以使用杂交方法增强对其的检测。可以分离、扩增和/或以其他方式处理分析物，用于后续分析，例如片段化和测序文库制备。
在一些实施方式中，使用本文所述的任何方法对生物样品进行透化。生物样品经透化，使得分析物从生物样品中的一个或多个细胞中释放。在一些实施方式中，从生物样品中获得分析物集(例如，mRNA)包括本领域已知和/或本文所述的任何核酸提取和/或分离方法。在一些实施方式中，可以扩增释放并获自一个或多个的分析物。在一些实施方式中，聚腺苷酸化mRNA集获自为测序方法准备物中的生物样品(例如，通过测序文库制备工作流程中包含的任何方法)。
在分析样品之前，可以向生物样品中添加其它试剂以进行各种功能。在一些实施方式中，可以将DNA酶和RNA酶失活剂或抑制剂和/或螯合剂如EDTA添加到样品中。在一些实施方式中，样品可以用一种或多种酶处理。例如，可以添加一种或多种用于片段化DNA或RNA的核酸内切酶，以及聚合酶，用于扩增核酸。可以添加到样品中的酶包括但不限于聚合酶、转座酶、连接酶、DNA酶和RNA酶。
在一些实施方式中，可将逆转录酶添加到样品中，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和转换寡核苷酸。模板转换可用于增加cDNA的长度，例如通过将预定义的核酸序列附加到cDNA，由此可以进行核酸延伸。
在一些实施方式中，获得多个cDNA序列包括通过逆转录相应的分析物集(例如，聚腺苷酸化mRNA)来进行第一链cDNA合成。在一些这类实施方式中，使用含有引物多聚(T)生成cDNA。在一些实施方式中，使用捕获探针对生成的cDNA进行条码化，该捕获探针的特征在于具有与所生成的cDNA的至少部分杂交的条形码序列(和可选的UMI序列)。在一些实施方式中，使用捕获探针为生成的cDNA附加独特的分子标识符(UMI)，该捕获探针的特征在于具有与所生成的cDNA的至少部分杂交的UMI。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸与通过逆转录酶添加到cDNA 3′端的多聚(C)尾杂交。在一些这类实施方式中，原始mRNA模板和模板转换寡核苷酸从cDNA中变性，并且条码化的捕获探针与cDNA杂交以生成cDNA的互补物，该条码化的捕获探针具有任选的UMI。
在一些实施方式中，获得多个cDNA序列还包括扩增(例如，PCR扩增)和/或衔接子延伸多个cDNA序列中的各cDNA序列。在一些实施方式中，衔接子延伸发生在cDNA扩增前。在一些实施方式中，衔接子延伸发生在第一链cDNA合成期间。在一些这类实施方式中，衔接子延伸通过RNA分子与捕获探针的杂交发生。在一些这类实施方式中，衔接子延伸通过cDNA分子与捕获探针的杂交发生。
在一些实施方式中，多个cDNA序列未被片段化，使得多个cDNA序列中的各cDNA序列都是全长cDNA序列。在一些这类实施方式中，多个cDNA序列包含基因表达文库制备工作流程的中间产物(例如，使用3′基因表达文库制备方法生成的未片段化的cDNA序列)。
在一些实施方式中，多个cDNA序列包含第一cDNA序列子集，其中第一cDNA序列子集中的各相应cDNA序列映射至多个基因中的各相应基因。多个基因可以是靶向的基因组(例如，感兴趣的基因组)。在一些实施方式中，多个基因介于5个基因和20000个基因之间。在一些实施方式中，多个基因介于100个基因和10000个基因之间。在一些实施方式中，多个基因介于500个基因和2000个基因之间。在一些实施方式中，多个基因是超过10个、超过50个、超过100个、超过500个、超过1000个、超过2000个、超过5000个、超过10000个、超过15000个或超过20000个基因。
在一些实施方式中，多个cDNA序列包含第二cDNA序列子集，其中第二cDNA序列子集中的各相应cDNA序列映射至未通过第一cDNA序列集合映射至的多个基因代表的参考基因组部分。第二cDNA序列子集可以包括映射到参考基因组脱靶区域和/或未包括在靶向的基因组中的其他基因的cDNA序列。
在一些实施方式中，多个cDNA序列由第一cDNA序列子集和第二cDNA序列子集组成。在一些这类实施方式中，多个cDNA序列中的各cDNA序列映射到感兴趣的基因或参考基因组的脱靶区域。
多个基因中的各相应基因可以通过任何数量的转录物来表征。例如，在一些实施方式中，3个或更多个转录物对应于各相应基因。例如，在一些实施方式中，4个或更多个转录物对应于各相应基因。在一些实施方式中，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个转录物对应于各相应基因。在一些实施方式中，多个基因中各相应基因对应的多个转录物包含各相应基因的多个同种型。
基因的同种型是指源自同一基因组基因座但包含不同核酸序列的mRNA分子(和对应的cDNA分子)，包括但不限于转录起始位点(TSS)、蛋白质编码DNA序列(CDS)和/或非翻译区(UTR)。这些差异是由可变剪接、可变启动子使用、基因融合或缺失、单核苷酸多态性(SNP)和/或其他突变或转录后遗传修饰所引起的。由于编码序列的mRNA序列和/或启动子序列中的顺式调节元件的差异，基因的同种型可能具有不同的功能能力。
鉴定基因的不同同种型是准确富集相应基因的cDNA序列的重要步骤。例如，当靶基因的两个或更个同种型的不同核酸序列包括不同的转录起始位点和/或非翻译区时，与基因3′或5′注释端互补的诱饵探针可能无法捕获所有可能的同种型。如果将核酸诱饵设计成与延伸超过第二同种型任一末端的第一同种型区域杂交，则可能发生这种情况虽然最小诱饵探针组对于成本效益和线性靶向测序分析是理想的，但在某些情况下，当两个或多个同种型具有如此显著不同的长度以至于它们不重叠，则可能有必要设计多个核酸诱饵，以便可以结合和富集各同种型。在一些此类情况下，各个非重叠的同种型与不同的独特诱饵探针杂交。
因此，对各同种型跨越的基因组区域(例如，编码和/或非编码序列)进行适当注释是必要的，以确保诱饵探针设计生成代表靶基因的各转录物的多个诱饵探针(例如，可杂交的)。
在一些实施方式中，多个转录物中的各转录物是蛋白质编码的。或者，多个转录物中的一个或多个转录物可以包含非编码序列(例如，3′或5′非翻译区)。例如，多个转录物中的一个或多个转录物可以包含终止密码子下游的3′UTR序列或起始密码子上游的5′UTR。在一些实施方式中，多个转录物中的一个或多个转录物是蛋白质编码的，但包含不完整的编码序列。例如，在一些这类实施方式中，多个转录物中对应于相应基因的转录物是编码序列(CDS)3′不完整的、CDS 5′不完整的或3′和CDS 5′不完整的。如本文所用，CDS 3′不完整是指由于不完整验证(evidence)而不包括终止密码子的蛋白质编码转录物。如本文所用，CDS5′不完整是指由于不完整验证而不包括起始密码子的蛋白质编码转录物。
在一些实施方式中，参考数据库能够用于比对对应于相应基因的转录物，例如参考基因组GENCODE版本33(GRCh38.p13)。例如，相应基因的注释能够作为GENCODE联盟(Consortium)内的参考数据库。在其他情况下，可通过Ensembl项目获得相应基因的注释，参见Harrow等，2012，“GENCODE：ENCODE项目的参考人基因组注释(GENCODE：The referencehuman genome annotation for The ENCODE Project)，”Genome Res.22(9)：1760-1774：doi：10.1101/gr.135350.111；和Flicek等，2014，“Ensembl 2014，”Nucleic Acids Res.42(数据库发行)：D749-D755：doi：10.1093/nar/gkt1196，它们的全部内容通过引用纳入本文。
(ii)空间文库制备
本文公开了生成多个延伸的核酸(例如，本文所述的任何延伸的核酸)用于检测包括蛋白质和核酸的分析物的方法。在一些情况中，该方法包括检测核酸。在一些实施方式中，该方法包括检测蛋白质。
如本文所用，“延伸的核酸”是指具有添加到核酸末端(例如，3′或5′端)的附加核苷酸从而延伸核酸总长度的核酸。
本文公开了使用诱饵寡核苷酸制备靶核酸文库的方法，其中靶核酸文库最初由与捕获空间阵列(即，基材)上的探针杂交的核酸制备。例如，基材上捕获的核酸序列可以通过空间工作流程，提供可以被分离、扩增和/或以其他方式处理用于后续分析(例如片段化和测序文库制备)的所得核酸。捕获探针、基材和阵列已在本申请的前述部分描述并纳入本部分中。
在一些情况中，本文所述的任何方法的实施方式可以包括将生物样品与基材接触，所述基材包含多个附接的捕获探针，其中多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获域，其特异性地结合分析物中存在的序列(例如，核酸)；使用与捕获域特异性结合的分析物作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和扩增延伸的捕获探针。在一些情况中，本文所述的任何方法的实施方式可以包括将多个分析物捕获剂与生物样品接触，其中多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含(i)结合分析物(例如，蛋白质)的分析物结合部分和(ii)包含分析物结合部分条形码和分析物捕获序列的寡核苷酸；使多个分析物捕获剂与基材接触，所述基材包含多个捕获探针，其中多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，其中捕获域结合分析物捕获序列；使用分析物结合部分条形码作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和扩增延伸的捕获探针。单独的方法步骤和系统特征可以组合存在于许多不同的实施方式中；本文中描述的特定组合不以任何方式限制步骤或特征的其它组合。
当将生物样品与例如包含捕获探针的基材(例如阵列)接触时，分析物可以被捕获在阵列上。捕获探针通过本申请通篇所述的捕获域与释放自生物样品的分析物相互作用以捕获分析物。例如，捕获域通过与来自生物样品的靶核酸分子中的核酸序列杂交来捕获分析物。在一些情况中，与捕获域互补的序列是聚腺苷酸化(多聚(A))序列。在一些情况中，将与捕获域互补的序列设计成对感兴趣的序列(即，在目标分析物中的)具有特异性。
在核酸检测设置中，核酸分析物与阵列(例如基材)上的捕获探针直接杂交。在蛋白质检测设置中，参考图4，分析物结合部分402包含蛋白质结合部分404和寡核苷酸408。在一些情况中，将分析物结合部分添加到生物样品中。在蛋白质与蛋白质结合部分404结合后，通过阵列(例如基材)的捕获域捕获寡核苷酸。因此，可以将本文所用的分析物结合部分认为是分析物衍生物，并且可以与分析核酸分析物类似的方式捕获和分析其寡核苷酸。先前已描述了分析物结合部分的实施方式，例如于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中，其各自通过引用其全文方式纳入本文。
或者，可以通过阵列上捕获探针的捕获域捕获分析物的替代物(proxy)。例如，两个探针可以与靶核酸杂交，由此它们可以连接在一起以产生可以作为靶序列替代物的连接产物。连接产物可以包含与阵列上捕获探针的捕获域基本上互补的序列。连接产物可以被捕获在阵列上并作为靶核酸存在的替代物。
在一些实施方式中，在创建核酸文库之前对样品进行染色。在一些实施方式中，生物样品在载玻片上时染色。在一些实施方式中，在创建核酸文库之前对染色的生物样品进行成像。在一些实施方式中，染色包括生物染色技术，例如H&E染色。在一些实施方式中，染色包括使用荧光偶联抗体(例如，免疫荧光)鉴定分析物。在一些实施方式中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或两种或更多种不同的染色技术(例如，IF、IHC和/或H&E染色)对生物样品进行染色。例如，生物样品可以这样来制备：通过使用一种技术(例如，H&E染色和明场成像)进行染色和成像，脱色(例如，淬灭或光漂白)，然后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微镜)对同一生物样品进行染色和成像。
在一些实施方式中，在与阵列上的捕获探针相互作用之前，在生物样品中进行靶特异性反应以增强一个或多个感兴趣的靶标的检测。靶特异性反应的示例包括但不限于靶向特异性衔接子、探针和/或其他寡核苷酸的连接、使用对一种或多种分析物特异性引物的靶特异性扩增、以及使用原位杂交、DNA显微镜和/或抗体检测的靶特异性检测。在一些实施方式中，捕获探针包括被靶向到靶特异性产物的捕获域(例如，扩增或连接)。然后可以通过捕获探针(例如，如本文通篇所述)捕获目标分析物。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括透化步骤，从而从生物样品释放分析物。在一些实施方式中，使用蛋白酶发生透化。在一些实施方式中，蛋白酶是内肽酶。可以使用的内肽酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、谷氨酰内肽酶(GluC)、ArgC、肽酰-天冬氨酸内肽酶(ApsN)、内肽酶LysC和内肽酶LysN。在一些实施方式中，内肽酶是胃蛋白酶。
在一些实施方式中，本文提供的方法包括生物样品的透化，从而使得捕获探针可以更容易地结合分析物或分析物衍生物(即，与无透化相比)。在一些实施方式中，可以将逆转录(RT)试剂添加到透化生物样品中。与RT试剂一起孵育可以从捕获的分析物(例如，聚腺苷酸化的mRNA)产生空间条码化的全长cDNA。第二链试剂(例如，第二链引物、酶)可被添加到载玻片上的生物样品中以起始第二链合成。
在一些情况中，透化步骤包括将透化缓冲液施加于生物样品。在一些情况中，透化缓冲液包括缓冲液(例如，Tris pH 7.5)、MgCl2、肌氨酰去污剂(例如，月桂酰肌氨酸钠)或其他去污剂、酶(例如，蛋白酶K、胃蛋白酶、胶原酶等)和无核酸酶的水。在一些情况中，透化步骤在37℃进行。在一些情况中，透化步骤进行约20分钟至2小时(例如，约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时或约2小时)。在一些情况中，释放步骤进行约40分钟。
在透化后，在一些情况中，通过捕获探针和/或分析物捕获剂捕获分析物。在一些实施方式中，本文所述增加空间阵列捕获效率的此类方法包括将空间阵列与生物样品接触并允许分析物与捕获探针和/或分析物捕获剂相互作用。
在一些实施方式中，利用杂交的分析物作为模板，可以用聚合酶(例如逆转录酶)延伸与分析物杂交的捕获探针，以生成延伸的捕获探针。在一些实施方式中，利用杂交的分析物作为模板，可以使用聚合酶(例如逆转录酶)延伸与分析物杂交的捕获探针的3′端，以生成延伸的捕获探针。在一些实施方式中，利用杂交的分析物作为模板，可以使用聚合酶(例如逆转录酶)延伸与分析物杂交的捕获探针的5′端，以生成延伸的捕获探针。可以扩增延伸的捕获探针(例如，通过第二链合成)，以生成包含与延伸的捕获探针互补的序列的单链核酸。包含与延伸的捕获探针互补的序列的单链核酸可用于生成核酸文库或者可以是核酸文库的一部分。
分析物与捕获探针杂交后，扩增杂交的产物。例如，获得cDNA序列文库还包括扩增(例如，PCR扩增)和/或衔接子延伸cDNA序列。在一些实施方式中，衔接子延伸发生在cDNA扩增前。在一些实施方式中，衔接子延伸发生在第一链cDNA合成期间。
在一些实施方式中，该方法包括使用等温扩增或非等温扩增来扩增全部或部分分析物。在一些实施方式中，扩增产生扩增产物，其包括(i)与捕获探针或其互补物结合的分析物或分析物衍生物的全部或部分序列，和(ii)空间条形码或其互补物的全部或部分序列。在一些实施方式中，确定步骤包括测序。可用于确定分析物、分析物衍生物和/或空间条形码的序列的非限制性测序示例是原位测序。在一些方面中，原位测序通过合成测序(SBS)、顺序荧光杂交、连接测序、核酸杂交或高通量数字测序技术进行。在一些实施方式中，分析物是DNA或RNA。在一些实施方式中，分析物是蛋白质。
在一些实施方式中，在将生物样品与包括捕获探针的基材接触之后，可任选地进行移出步骤以从基材移出全部或部分生物样品。在一些实施方式中，移出步骤包括生物样品细胞的酶促和/或化学降解。例如，移出步骤可包括用酶(例如，蛋白酶，例如，蛋白酶K)处理生物样品以从基材去除生物样品的至少部分。在一些实施方式中，移出步骤可包括组织的消融(例如，激光消融)。
在一些实施方式中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物(例如生物分析物)的位置)的方法，该方法包括：(a)任选地对基材上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基材上的生物样品(例如，提供包含透化试剂的溶液)；(c)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中捕获探针捕获生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测生物分析物；其中生物样品从基材全部或部分移出。
在一些实施方式中，不从基材移出生物样品。例如，在从基材释放捕获探针(例如，结合到分析物的捕获探针)之前，不从基材移出生物样品。在一些实施方式中，这种释放包括从基材上裂解捕获探针(例如，通过裂解域)。在一些实施方式中，这种释放不包括从基材释放捕获探针(例如，可以制备与分析物结合的捕获探针的拷贝，且该拷贝可从基材释放，例如，通过变性)。在一些实施方式中，生物样品从基材释放后，在分析结合到捕获探针的分析物之前，不从基材移出生物样品。在一些实施方式中，在从基材移出捕获探针期间和/或在从基材释放后分析结合到捕获探针的分析物期间，生物样品保持在基材上。在一些实施方式中，在捕获探针(例如，互补体)的拷贝的去除(例如，通过变性)期间，生物样品保留在基材上。在一些实施方式中，可以在不使生物样品经受细胞(例如透化的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如激光消融)的情况下进行对结合到来自基材的捕获探针的分析物的分析。
在一些实施方式中，至少部分生物样品不从基材被移出。例如，在从基材释放捕获探针(例如，与分析物结合的捕获探针)和/或分析从基材释放的与捕获探针结合的分析物之前，生物样品的部分可以保留在基材上。在一些实施方式中，在分析结合到来自基材的捕获探针的分析物之前，生物样品的至少部分不经受细胞(例如透化的细胞)的酶促和/或化学降解或组织的消融(例如激光消融)。
在一些实施方式中，本文提供了用于从生物样品(例如，存在于生物样品中)空间检测分析物(例如，检测分析物的位置，例如，生物分析物)的方法，其包括：(a)任选地对基材上的生物样品进行染色和/或成像；(b)透化基材上的生物样品(例如，提供包含透化试剂的溶液)；(c)将生物样品与包含多个捕获探针的阵列接触，其中多个捕获探针的捕获探针捕获生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测生物分析物；其中生物样品未从基材移出。
在一些实施方式中，本文提供用于从生物样品空间检测感兴趣的生物分析物的方法，其包括：(a)对基材上生物样品进行染色和成像；(b)向基材上的生物样品提供包含透化试剂的溶液；(c)将生物样品与基材上的阵列接触，其中阵列包括一个或多个捕获探针，从而使一个或多个捕获探针捕获感兴趣的生物分析物；和(d)分析捕获的生物分析物，从而在空间上检测感兴趣的生物分析物；其中生物样品未从基材移出。
在一些实施方式中，所述方法还包括对生物样品中的感兴趣区域进行空间转录组学分析。在一些实施方式中，一种或多种捕获探针包括捕获域。在一些实施方式中，一种或多种捕获探针包含独特的分子标识符(UMI)。在一些实施方式中，一种或多种捕获探针包含裂解域。在一些实施方式中，裂解域包含由尿嘧啶DNA糖基酶、无嘌呤/无嘧啶(AP)核酸内切酶(APE1)、U尿嘧啶特异性切除试剂(USER)和/或核酸内切酶VIII识别和裂解的序列。在一些实施方式中，一个或多个捕获探针不包含裂解域并且不从阵列裂解。
在一些实施方式中，捕获探针可以被延伸(“延伸的捕获探针”，例如，如本文所述)。例如，延伸的捕获探针可以包括从捕获的(杂交的)RNA生成cDNA。该过程涉及合成杂交核酸的互补链，例如，基于捕获的RNA模板(与捕获探针的捕获域杂交的RNA)生成cDNA。因此，在延伸的捕获探针的初始步骤(例如cDNA生成)中，捕获的(杂交的)核酸(例如RNA)充当延伸的模板(例如逆转录步骤)。
在一些实施方式中，捕获探针使用逆转录延伸。例如，逆转录包括使用逆转录酶从RNA(例如信使RNA)合成cDNA(互补或拷贝DNA)。在一些实施方式中，当组织仍在原位时进行逆转录，产生分析物文库，其中分析物文库包括来自邻近捕获探针的空间条形码。在一些实施方式中，捕获探针使用一种或多种DNA聚合酶延伸。
在一些实施方式中，捕获探针的捕获域包括用于产生与捕获探针杂交的核酸互补链的引物，例如，用于DNA聚合酶和/或逆转录的引物。由延伸反应产生的核酸(例如DNA和/或cDNA)分子纳入捕获探针的序列。捕获探针的延伸，例如DNA聚合酶和/或逆转录反应，可以使用各种合适的酶和方案来进行。
在一些实施方式中，产生全长DNA(例如cDNA)分子。在一些实施方式中，“全长”DNA分子是指整个捕获的核酸分子。然而，如果核酸(例如RNA)在组织样品中部分降解，则捕获的核酸分子将与组织样品中的初始RNA长度不同。在一些实施方式中，延伸的探针的3′端(例如第一链cDNA分子)被修饰。例如，接头或衔接子可以连接到延伸的探针的3′端。这可以通过使用单链连接酶如T4 RNA连接酶或CircleGaseTM(可从威斯康星州米德尔顿的鲁慈根公司(Lucigen)购得)来实现。在一些实施方式中，模板转换寡核苷酸用于延伸cDNA以产生全长cDNA(或尽可能接近全长cDNA)。在一些实施方式中，第二链合成辅助探针(能够与延伸的捕获探针的3′端杂交的部分双链DNA分子)可以使用双链连接酶(例如T4DNA连接酶)连接到延伸的探针的3′端，例如第一链cDNA分子。适用于连接步骤的其他酶的其他酶在本领域中是已知的，并且包括例如Tth DNA连接酶、Taq DNA连接酶、热球菌属(菌株9°N)DNA连接酶(9°NTM DNA连接酶，新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、AmpligaseTM(可从威斯康星州米德尔顿的鲁慈根公司(Lucigen)获得)和SplintR(可从马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室获得)。在一些实施方式中，多核苷酸尾(例如聚(A)尾)纳入延伸的探针分子的3′端。在一些实施方式中，使用末端转移酶活性酶纳入多核苷酸尾。
在一些实施方式中，处理双链延伸的捕获探针以在扩增和/或分析(例如序列分析)之前去除任何未延伸的捕获探针。这可以通过多种方法实现，例如，使用酶降解未延伸的探针，例如核酸外切酶或纯化柱。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针被扩增以产生足以进行分析的量，例如通过DNA测序。在一些实施方式中，延伸的捕获探针的第一链(例如，DNA和/或cDNA分子)用作扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
在一些实施方式中，扩增反应使用包括亲和力基团的引物将亲和力基团纳入延伸的捕获探针(例如，RNA-cDNA杂交)上。在一些实施方式中，所述引物包括亲和基团，所述延伸的捕获探针包括亲和基团。亲和基团可以对应于前面描述的任何亲和基团。
在一些实施方式中，包括亲和基团的延伸的捕获探针可以耦合到亲和基团特异性的基材。在一些实施方式中，基材可包括抗体或抗体片段。在一些实施方式中，基材包括亲和素或链霉亲和素，并且亲和基团包括生物素。在一些实施方式中，基材包括麦芽糖，亲和基团包括麦芽糖结合蛋白。在一些实施方式中，基材包括麦芽糖结合蛋白，亲和基团包括麦芽糖。在一些实施方式中，只要延伸的探针的拷贝未固定到基材，则扩增延伸的捕获探针可以起到从基材表面释放延伸的探针的作用。
在一些实施方式中，释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。从基材表面释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子的步骤可以通过多种方式实现。在一些实施方式中，通过核酸裂解和/或变性(例如通过加热使双链分子变性)从阵列释放延伸的捕获探针或其互补物。
在一些实施方式中，通过物理方式从基材的表面(例如阵列)释放延伸的捕获探针或其互补物或扩增子。例如，当延伸的捕获探针被间接固定在阵列基材上时，例如通过与表面探针杂交，能足以破坏延伸的捕获探针和表面探针之间的相互作用。破坏核酸分子之间相互作用的方法包括本领域已知的使双链核酸分子变性。释放DNA分子(即剥离延伸探针阵列)的直接方法是使用干扰双链分子氢键的溶液。在一些实施方式中，通过施加加热的溶液(例如至少85℃的水或缓冲液，例如至少90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的水)来释放延伸的捕获探针。在一些实施方式中，添加包括盐、表面活性剂等可以进一步使核酸分子之间的相互作用不稳定的溶液以从基材释放延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，延伸的捕获探针包括裂解域，延伸的捕获探针通过裂解从基材表面释放。例如，延伸的捕获探针的裂解域可以通过本文所述的任何方法裂解。在一些实施方式中，在扩增延伸的捕获探针的步骤之前，例如通过裂解延伸的捕获探针中的裂解域，从基材表面释放延伸的捕获探针。
在一些实施方式中，如上文所述，通过与与细胞表面杂交、结合或关联或引入细胞的捕获探针或分析物捕获剂杂交直接对样品进行条码化，可对完整样品进行测序。
许多种不同的测序方法可用于分析条码化的分析物或部分。一般来说，测序的多核苷酸可以是例如核酸分子，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA或DNA/RNA杂合体，以及具有核苷酸类似物的核酸分子)。
多核苷酸的测序可以通过各种系统进行。更一般地，可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如，数字PCR和液滴数字PCR(ddPCR)、定量PCR、实时PCR、多重PCR、基于PCR的单重方法、乳液PCR)和/或等温扩增来进行测序。对遗传物质进行测序的方法的非限制性示例包括但不限于DNA杂交方法(例如，Southern印迹法)、限制性酶消化方法、桑格测序法、下一代测序法(例如，单分子实时测序、合成测序、纳米孔测序和Polony测序)、连接法和微阵列法。
(iii)核酸文库的处理
在一些实施方式中，在创建核酸文库(例如，多个核酸)后，一个或多个诱饵寡核苷酸(例如，来自本文所述的一个或多个组)与多个核酸杂交。该核酸包括感兴趣的分析物或其互补物的全部或部分序列和/或包括感兴趣的空间条形码或其互补物的全部或部分。在一些实施方式中，一个或多个诱饵寡核苷酸与核酸杂交，所述核酸包含感兴趣的分析物或其互补物的全部或部分序列。
在一些实施方式中，将一个或多个核酸文库汇集。在一些情况中，将一个或多个文库与Cot DNA(例如，人Cot DNA)孵育。在一些情况中，将一个或多个文库与通用型阻断剂核酸一起孵育，该通用型阻断剂核酸与一个或多个良好表达的核酸杂交以防止不需要的核酸与诱饵寡核苷酸杂交。
在其他实施方式中，在诱饵寡核苷酸杂交之前，可以使用定量PCR(qPCR)对文库、核酸或富集的核酸进行定量。在一些实施方式中，可以对文库、核酸或富集的核酸进行片段化。在一些实施方式中，文库、核酸或富集的核酸可以通过基于酶的方法(例如，通过限制酶、切口酶和/或转座酶)进行片段化。在一些实施方式中，文库、核酸或富集的核酸可以通过核酸内切酶片段化。在一些实施方式中，文库、核酸或富集的核酸可以通过机械剪切(例如，声剪切、流体动力学剪切和/或雾化)片段化。在一些实施方式中，文库、核酸或富集的核酸可以通过基于合并酶的方法和机械剪切片段化。在一些实施方式中，文库、核酸或富集的核酸可以通过末端修复、多聚A加尾或其组合片段化。在一些实施方式中，衔接子连接到各核酸或富集的核酸序列。在一些实施方式中，衔接子连接到核酸或富集的核酸序列的3′端。在一些实施方式中，衔接子连接到核酸序列或富集的核酸序列的5′端。在一些实施方式中，衔接子可以是添加功能的核酸序列，例如，间隔子序列、引物序列/位点、条形码序列、独特分子标识符(UMI)序列、接头和/或测序衔接子。
在一些实施方式中，本文公开的方法包括样品索引(SI)PCR，其将核酸序列(例如，条形码)添加到核酸序列或富集的核酸序列的5′和/或3′端。在某些情况下，SI-PCR反应在67℃下进行。在一些实施方式中，SI-PCR是将样品索引序列(例如i5和i7)引入核酸序列或富集核酸序列的5′和/或3′端的PCR反应。在一些实施方式中，用于SI-PCR的方法添加i5样品索引序列。在一些实施方式中，用于SI-PCR的方法添加i7样品索引序列。在一些实施方式中，将P5衔接子添加至核酸序列或富集的核酸序列。在一些实施方式中，将P7衔接子添加至核酸序列或富集的核酸序列。在一些实施方式中，在诱饵寡核苷酸富集感兴趣的核酸之前进行SI-PCR。在一些实施方式中，在诱饵寡核苷酸富集感兴趣的核酸之后进行SI-PCR。
在一些实施方式中，可以干燥感兴趣的核酸(在使用诱饵寡核苷酸富集之前或之后)或由其产生的文库。在一些实施方式中，干燥包括脱水过程，例如加热、真空、冻干、干燥、过滤和风干。在一些实施方式中，使用真空离心机来干燥样品。在一些情况中，干燥在约50℃、约55℃、约60℃、约63℃、约65℃、约67℃、约70℃或约75℃下进行。在一些实施方式中，干燥可以进行至少1小时、至少2小时、至少3小时或至少4小时。如果不立即使用样品，可以储存样品(例如，在-20℃)。在一些实施方式中，对感兴趣的核酸(在使用诱饵寡核苷酸富集之前或之后)或由其产生的文库不进行干燥。
(d)使用诱饵寡核苷酸的杂交靶向捕获分析物
在从生物样品制备核酸文库后，可以将文库与多个诱饵寡核苷酸孵育，从而选择性地富集感兴趣的靶标的文库。可以从库中分离目标分析物，从而产生富集的目标分析物群。虽然全转录组空间分析提供非常有用的信息，但更靶向的基因富集能够空间定位特别感兴趣的靶标的子集，例如用于癌症或疾病检测相关癌症或疾病相关基因和基因表达。因此，研究可以专注于感兴趣的基因的子集并最大限度地了解这些基因的空间知识，同时最大限度地减少与空间全转录组工作流程相关的成本和试剂。
(i)锈铒寡核苷酸设计
在一些实施方式中，将诱饵寡核苷酸组设计为靶向并杂交多个核酸(例如，制备的空间文库，例如制备的cDNA文库)。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸组与来自更广泛的文库核酸组的靶核酸(例如，cDNA)杂交。在一些实施方式中，随后通过链霉亲和素珠捕获杂交的产物(例如，诱饵寡核苷酸和杂交的核酸)。在一些实施方式中，随后通过亲和素珠捕获杂交的产物(例如，诱饵寡核苷酸和杂交的核酸)。洗去未杂交的核酸。再次扩增和测序靶产物。在一些实施方式中，再次扩增的靶产物可以经片段化、与接头序列连接并通过SI-PCR扩增。
本文公开了设计和测试候选诱饵寡核苷酸序列的方法。设计候选诱饵寡核苷酸序列，以使各诱饵寡核苷酸序列在理论上与感兴趣的独特靶标杂交。因此，设计的诱饵寡核苷酸长度为至少40个核苷酸。为了识别感兴趣的诱饵寡核苷酸，使用为比对RNA-seq数据而设计的对齐器来识别人转录组独特的40个核苷酸部分并将其与基因组比对。在一些实施方式中，将诱饵寡核苷酸设计成与特定外显子杂交。在一些实施方式中，将诱饵寡核苷酸设计成跨过外显子-外显子连接(exon-exon junction)。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸可以与靶标杂交，从而能够识别转录组中的剪接和可变剪接转录物。使用比对识别并分类与基因组对齐一次或多次的序列。可以针对(即与其比较)基因组中识别的序列测试各设计的诱饵。如果诱饵寡核苷酸和基因组中的序列不匹配，则可以在如本文公开的一个或多个组中测试诱饵。
本公开提供了一种为全长cDNA设计核酸诱饵的方法，其包括获得靶向的基因组中各靶基因的各转录物(例如，同种型)的编码序列。当编码序列小于阈值长度(例如，120个碱基对)时，可以使用完整的mRNA序列代替。该方法还包括，对于各编码序列中的各120个碱基对子序列，获得其中出现该120个碱基对子序列的转录物数量的计数。通过获得的计数对各子序列进行排序，并从相应基因最大数量的转录物中出现的子序列选择第一子序列。对第一子序列进一步进行过滤标准(例如，独特性、可映射性、不存在重复子序列和/或总体GC含量)。在一些实施方式中，如果第一子序列未能满足一个或多个过滤标准，则拒绝该第一子序列，并从进一步满足过滤标准的相应基因最大数量的转录物中出现的子序列选择新的第一子序列。在一些实施方式中，如果第一子序列未能满足一个或多个过滤标准，则对第一子序列进行修饰(例如，通过截短第一子序列以使其满足一个或多个过滤标准和/或通过使第一个子序列沿参考基因组移位以使其满足一个或多个过滤标准)。
该方法还包括从相应基因最大数量的剩余转录物中出现的子序列选择第二子序列(例如，不是第一子序列出现的转录物)。对所有剩余转录物迭代该方法直到没有转录物剩余(例如，多个选定子序列中的至少一个子序列出现在靶基因多个转录物中的各转录物)。
本公开中提供的方法通过利用全长cDNA序列而非3′片段化测序文库改进了当前技术，允许访问更大区域的可靠注释序列用于核酸诱饵设计。例如，全长cDNA序列包含通常被良好注释的编码序列，确保更好的靶向杂交结果和中靶率。
全长cDNA序列包括转录物(例如，同种型)间共享的共同序列，能够设计可以靶向多个转录物并将所需的核酸诱饵数量减少10倍的核酸诱饵。因此，可以使所得的多个核酸诱饵缩小尺寸和线性化，从而为需要用于大型和/或定制靶向基因组的核酸诱饵的用户带来更高的效率和更低的成本。例如，虽然通常“平铺的”多个核酸诱饵对于1000个基因组的1倍覆盖将包括38,000到68,000个核酸诱饵，但使用本公开的方法设计的多个核酸诱饵对于相同的1000个基因组将包括2,500到4,000个核酸诱饵。此外，本公开的方法可以用于任何需要靶向分析的应用(例如，单细胞RNA测序和/或空间基因表达谱分析)。在一些情况中，多个核酸诱饵包括至少500个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个或至少5000个核酸诱饵。
在一些情况中，与映射到多个基因中相应基因的cDNA序列杂交的多个核酸诱饵中各相应的核酸诱饵(i)在对应于相应基因的多个转录物中对应的多个转录物子集中，与第一转录物子集选择性地杂交，或(ii)在对应于相应基因的多个转录物中对应的多个转录物子集中，与另一转录物子集而非第一转录物子集杂交。多个基因中各相应基因对应的多个转录物中的各相应转录物与多个核酸诱饵中的核酸诱饵可杂交。
例如，核酸诱饵可以与对应于靶基因的一个或多个核酸序列杂交(例如，可以包含与之互补的核酸序列)。在一些情况中，与核酸诱饵杂交的一个或多个核酸序列代表靶基因的相应一个或多个转录物或同种型。如本文所用，转录物子集(例如，同种型子集)定义为与相应核酸诱饵杂交的靶基因的转录物(例如，同种型)组。
在一些实施方式中，与靶基因的cDNA序列杂交的核酸诱饵与相应基因的多个转录物中的各转录物选择性地杂交。例如，单个核酸诱饵可以与靶基因的所有同种型杂交，使得第一同种型子集由靶基因的多个同种型组成。在一些这类情况下，没有定义其他同种型子集(例如，可以将多个同种型分组为单个或第一同种型子集)。
在一些情况中，靶基因的多个转录物可以细分为多个转录物子集。多个转录物子集可以包括第一和第二转录物子集。
在一些实施方式中，将多个转录物子集中的各转录物子集定义为与相应核酸诱饵杂交的转录物组。在这种情况下，将第一转录物子集定义为至少第一核酸诱饵与之杂交的转录物组，并将第二转录物子集定义为至少第二核酸诱饵与之杂交的转录物组。例如，将与第一核酸诱饵杂交的靶基因的第一组转录物(例如，同种型)定义为第一转录物子集(例如，第一同种型子集)。此外，将与第二核酸诱饵杂交的靶基因的第二组转录物(例如，同种型)定义为第二转录物子集(例如，第二同种型子集)
在一些实施方式中，第二转录物子集由第一转录物子集未包括的转录物组成(例如，第一同种型子集和第二同种型子集可以包括互斥的同种型组)。
在一些情况中，可以通过对候选诱饵序列具有给定长度的各可能的子序列(例如，靶基因编码序列或mRNA序列的子序列)的匹配进行计数来选择第一同种型子集。
对于相应基因的各同种型，反复进行各可能的诱饵子序列和各同种型中各位置之间的杂交匹配。计算与各诱饵子序列匹配的同种型(例如，包含互补序列)的数量，将具有最高匹配数的诱饵子序列选为第一核酸诱饵，并将与第一核酸诱饵匹配的同种型子集定义为第一同种型子集。在一些情况中，当对应的第一同种型子集未能考虑到靶基因的所有同种型时，对未能与第一核酸诱饵匹配的所有剩余同种型重复该过程。因此，将与剩余同种型(例如，第一同种型子集中不包括的同种型)具有最高匹配数的诱饵子序列选为第二核酸诱饵，并将与第二核酸诱饵匹配的第二同种型子集定义为第二同种型子集。
在一些情况中，可以根据需要重复该过程多次，直到鉴定出多个核酸诱饵，使得相应基因的多个转录物中的所有转录物与多个核酸诱饵中的至少一个核酸诱饵可杂交。
在一些实施方式中，多个转录物子集包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个转录物子集。在一些实施方式中，各转录物子集对应单个核酸诱饵。在一些替代性实施方式中，各转录物子集对应多个核酸诱饵。
在一些实施方式中，除第一转录物子集外的转录物子集由一个或多个、两个或更多、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多转录物组成。在一些实施方式中，多个核酸诱饵包括至少2 x 103、至少3 x 103、至少4 x 103、至少5 x 103、至少1 x 104、至少2 x 104、至少3 x104、至少4 x 104、至少5 x 104、至少6 x 104、至少7 x 104或至少1 x 105个核酸诱饵。
在一些实施方式中，多个核酸诱饵包括与多个基因中相应基因对应的多个转录物中各相应转录物选择性杂交所需的最小数量的诱饵。例如，多个基因中各相应基因对应的多个转录物中的各相应转录物能够与多个核酸诱饵中的至少一个核酸诱饵杂交。
在一些实施方式中，多个核酸诱饵中的各核酸诱饵能够与多个转录物中的单个转录物杂交，并且多个核酸诱饵中的核酸诱饵数量等于多个基因中的各相应基因的多个转录物中的转录物数量。在一些实施方式中，多个核酸诱饵中的各核酸诱饵能够与多个转录物杂交，并且多个核酸诱饵中的核酸诱饵数量小于多个基因中的各相应基因的多个转录物中的转录物数量。
在一些这类实施方式中，针对相应基因的多个转录物中各相应转录物的诱饵覆盖小于1X。在一些这类实施方式中，针对第一遗传靶标的多个同种型中各相应同种型的诱饵覆盖小于0.8X、小于0.6X、小于0.4X、小于0.2X或小于0.1X。
在一些实施方式中，多个核酸诱饵中的各相应核酸诱饵与多个核酸诱饵中的任何其他核酸诱饵的序列同一性小于阈值百分比。例如，在一些实施方式中，多个核酸诱饵中的各相应的核酸诱饵与多个核酸诱饵中的其他任何核酸诱饵的同一性小于100％、小于98％、小于96％、小于94％、小于92％、小于90％、小于88％、小于86％、小于84％、小于82％、小于80、小于70％、小于60％、小于50％或小于40％。在一些实施方式中，序列同一性阈值百分比是10％、20％、30％或5％-50％。在一些实施方式中，多个核酸诱饵中的相应核酸诱饵与多个核酸诱饵中的任何其他核酸诱饵之间共享的序列同一性的阈值决定了各相应核酸诱饵与脱靶序列读数交叉杂交的水平。在一些实施方式中，多个核酸诱饵中的各相应核酸诱饵包含与参考基因组具有至少90％最小同一性的核酸序列。在一些实施方式中，多个核酸诱饵中的各相应核酸诱饵包含与参考基因组具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％最小同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，与相应基因的多个转录物中的转录物杂交的多个核酸诱饵中的各相应核酸诱饵相对于转录物具有介于第一阈值温度和第二阈值温度之间的Tm。在一些这类实施方式中，第一阈值温度介于55℃和85℃之间，第二阈值温度介于90℃和110℃之间在某些情况下，杂交发生在65℃。在某些情况下，杂交发生在60℃。
在一些实施方式中，多个核酸诱饵中的各相应核酸诱饵与距相应基因的任何注释的起始和/或终止位点至少最小阈值距离的相应基因区域杂交。在一些实施方式中，映射到相应基因的多个序列读数中的相应序列读数的多个核酸诱饵中的相应核酸诱饵位于距相应序列读数3′端至少最小阈值距离的位置。在一些这类实施方式中，当基因组外显子和/或mRNA序列中存在导致寡聚dT错引的未注释的多聚A位点或多聚A序列时，可以发生相应核酸诱饵与相应cDNA序列的脱靶杂交。因此，在一些这类实施方式中，核酸诱饵与对应cDNA序列杂交的最佳位置位于距3′端至少最小阈值距离的位置。最小阈值距离的非限制性示例是100-200碱基对(bp)、200-300bp、300-400bp、400-500bp、500-600bp、600-700bp、700-800bp、800-900bp、900-1000bp或超过1000bp。在一些实施方式中，在距3′端至少最小阈值距离的位置与核酸诱饵优先杂交的cDNA序列的百分比介于0％和10％之间、介于10％和20％之间或介于20％和30％之间。此外，在一些实施方式中，从多个核酸诱饵中去除在mRNA序列中包含未注释的多聚A位点或多聚A序列的核酸诱饵。在一些情况中，如果诱饵寡核苷酸中的序列和基因组中的序列匹配，则设计修饰的诱饵。为了制备修饰的诱饵，可以将初始序列从原始位置滑动+/-40bp以识别潜在新的诱饵寡核苷酸。对于各设计，新的诱饵寡核苷酸针对基因组测试。在将所有这类候选物分类后，最终包含在本文所述的一个或多个组中的诱饵寡核苷酸根据诱饵寡核苷酸长度(即，优先考虑较长的诱饵)整理(即排序)，然后通过距原始预定位置的距离(距原始预定位置更近的序列优先)进行。然而，如果没有诱饵符合要求的标准，则将该诱饵舍弃并不在该位置设计诱饵。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸序列的长度为40个核苷酸。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸序列的长度为40-160个核苷酸。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸序列的长度为40-120个核苷酸。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸序列的长度为约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100、约101、约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约110、约111、约112、约113、约114、约115、约116、约117、约118、约119、约120、约121、约122、约123、约124、约125、约126、约127、约128、约129、约130、约131、约132、约133、约134、约135、约136、约137、约138、约139、约140、约141、约142、约143、约144、约145、约146、约147、约148、约149、约150、约151、约152、约153、约154、约155、约156、约157、约158、约159或约160个核苷酸。在某些情况下，诱饵寡核苷酸是具有5′生物素修饰的单链120个核苷酸长的DNA寡核苷酸。在一些情况中，各诱饵靶向独特的文库分子。诱饵寡核苷酸可以跨越所有成熟mRNA序列，包括UTR和所有注释的同种型。
在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包括特异性结合全部或部分空间条形码或其互补物的结构域。在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包括特异性结合来自生物样品的分析物或其互补物全部或部分序列的结构域。在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包括特异性结合全部或部分空间条形码或其互补物或来自生物样品的分析物或其互补物全部或部分序列的结构域。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与感兴趣的分析物杂交。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与感兴趣的分析物特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与全部或部分空间条形码或其互补物特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与来自生物样品的分析物的全部或部分序列特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与来自生物样品的分析物或其互补物的序列的3′部分特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与来自生物样品的分析物或其互补物的序列的5′部分特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与来自生物样品的分析物或其互补物的序列中的内含子特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与来自生物样品的分析物或其互补物的序列中的外显子特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与来自生物样品的分析物或其互补物的3′非翻译区特异性地结合。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与来自生物样品的分析物或其互补物的5′非翻译区特异性地结合。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸序列的结构域的长度为40个核苷酸。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸序列的结构域的长度为40-160个核苷酸。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸序列的结构域的长度为40-120个核苷酸。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸序列的结构域的长度为约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100、约101、约102、约103、约104、约105、约106、约107、约108、约109、约110、约111、约112、约113、约114、约115、约116、约117、约118、约119、约120、约121、约122、约123、约124、约125、约126、约127、约128、约129、约130、约131、约132、约133、约134、约135、约136、约137、约138、约139、约140、约141、约142、约143、约144、约145、约146、约147、约148、约149、约150、约151、约152、约153、约154、约155、约156、约157、约158、约159或约160个核苷酸。
在一些实施方式中，来自生物样品的分析物与疾病或病症相关。在一些实施方式中，来自生物样品的分析物包含突变。在一些实施方式中，来自生物样品的分析物包含单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方式中，来自生物样品的分析物包含三核苷酸重复。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域与转录物(即mRNA分子)的特定外显子杂交。例如，可以处理转录物，使得在正常设置中将被切除的外显子包含在不同环境(例如病理环境，诸如癌症)中的成熟mRNA产物中。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域识别(例如，杂交)一个或多个同种型或分析物，但不识别其他。在一些实施方式中，例如，诱饵寡核苷酸与病理环境(例如癌症)中检测到的特定外显子杂交。
在一些实施方式中，对于组中的特定感兴趣分析物，存在超过一个诱饵寡核苷酸。例如，分析物可以经历交替剪接(例如，如在mRNA分子中)。在一些实施方式中，不同的诱饵可以检测和增强特定转录物，从而检测特定外显子是否包含在分析物中。因此，在一些实施方式中，对于一个分析物，组将包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个诱饵寡核苷酸。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与目标分析物的部分完全互补(即100％互补)。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与目标分析物的部分部分互补(即小于100％互补)。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与目标分析物的部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与目标分析物的部分部分互补(即小于100％互补)。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与目标分析物的部分部分互补(即小于100％互补)。在一些实施方式中，部分诱饵寡核苷酸与目标分析物的部分杂交。在一些实施方式中，部分诱饵寡核苷酸与目标分析物的部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
诱饵寡核苷酸包含在一个或多个组(例如，群组)中。组包括靶向特定分析物群组的诱饵寡核苷酸组。例如，组可以包括特定于病理环境的诱饵寡核苷酸集合。在一些实施方式中，可以使用超过一个组(例如，诱饵寡核苷酸集合)来增强分析物的检测。例如，在一些实施方式中，可以使用至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个组(例如，诱饵寡核苷酸集合)来增强分析物的检测。公开的所有组的诱饵寡核苷酸和目标分析物在本文公开的附带测序列表中提供。
在一些实施方式中，组包括杂交并增强癌症中失调的分析物的检测(例如，癌症组)的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，癌症组能够定量分析癌症转录组中异常表达的分析物，同时避免与对整个外显子组进行测序相关的额外成本和时间。示例性癌症组的诱饵寡核苷酸和目标分析物在表1和本文公开的附带测序列表中提供。在一些实施方式中，癌症组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测与诸如细胞凋亡、代谢、细胞周期(例如，检查点分析物)、DNA损伤和修复、缺氧和应激毒性等生物过程相关的失调的分析物。更具体地，癌症组中的诱饵寡核苷酸靶向癌症特异性分析物，例如在包括但不限于Myc通路、Hippo通路、RTK/RAS通路、TP53和TP53相关通路、TFGβ通路和Wnt通路等通路中起作用的分析物。癌症组中的诱饵寡核苷酸还可以检测癌症热点、肿瘤抑制分析物和免疫失调分析物。示例性癌症组的诱饵寡核苷酸和目标分析物公开于美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/CaptureApproach)”)中，其各自通过引用其全部内容纳入本文。
在一些实施方式中，组包括杂交并增强与免疫失调相关的分析物的检测(例如，免疫学组)的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，免疫学组能够定量分析与免疫失调相关的分析物，同时避免与对整个外显子组进行测序相关的额外成本和时间。示例性免疫学组的诱饵寡核苷酸和目标分析物在表2和本文公开的附带测序列表中提供。在一些实施方式中，免疫学组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测与诸如B细胞功能、T细胞功能、细胞周期、细胞信号传导、白介素信号传导和代谢等生物过程相关的失调分析物。更具体地，诱饵寡核苷酸靶向分析物，包括但不限于转录因子、T细胞活化标志物、抗原呈递基因、代谢基因和SIRP家族成员。在一些实施方式中，免疫学组具有检测与免疫失调相关的应用，以检查先天免疫、适应性免疫、一种或多种炎症反应、检测一种或多种传染病(例如，细菌感染；病毒感染)，和移植受体的免疫反应。更具体地，免疫学组中的诱饵寡核苷酸靶向免疫特异性生物标志物，包括但不限于谱系标志物、组织标志物和癌症标志物。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸增强骨髓、肠、肺、唾液腺、肠、淋巴结、干细胞或其组合中表达的分析物的检测。示例性免疫学组的诱饵寡核苷酸和目标分析物公开于美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/CaptureApproach)”)中，其各自通过引用其全部内容纳入本文。
在一些实施方式中，组包括杂交并增强检测通路失调的分析物的检测(例如，通路组或基因特征组)的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，通路组能够定量分析与通路失调相关的分析物，同时避免与对整个外显子组进行测序相关的额外成本和时间。示例性通路组的诱饵寡核苷酸和目标分析物在表3和本文公开的附带测序列表中提供。在一些实施方式中，通路组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测与复杂信号转导通路相关的失调分析物。目标分析物包括对疾病或药物靶标具有特异性的分析物；G蛋白偶联受体(GPCR)，一种或多种激酶；一种或多种表观遗传标志物；或一种或多种检查点分析物。通路组中通过诱饵寡核苷酸检测的分析物包括但不限于癌症失调、中枢神经系统失调、炎症失调、代谢失调、心血管失调、呼吸失调和生殖失调的组织标志物。示例性通路组的诱饵寡核苷酸和目标分析物公开于美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(CapturingTargeted Genetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing TargetedGenetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)中，其各自通过引用其全部内容纳入本文。
在一些实施方式中，组包括杂交并增强检测神经发育和/或失调的分析物的检测的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，组包括杂交并增强检测神经发育的分析物的检测的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，组包括杂交并增强检测神经失调的分析物的检测的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，组包括杂交并增强检测神经发育和失调的分析物的检测的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，神经组能够定量分析与通路失调相关的分析物，同时避免与对整个转录组进行测序相关的额外成本和时间。示例性神经组的诱饵寡核苷酸和目标分析物在表4和本文公开的附带测序列表中提供。在一些实施方式中，神经组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测与轴突靶向、缺氧和胶质母细胞瘤相关的失调分析物。在一些实施方式中，神经组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测与轴突靶向相关的失调分析物。在一些实施方式中，神经组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测与缺氧相关的失调分析物。在一些实施方式中，神经组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测与胶质母细胞瘤相关的失调分析物。在一些实施方式中，神经组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测线粒体蛋白编码基因。在一些实施方式中，神经组中的诱饵寡核苷酸可以包括检测线粒体蛋白编码基因，从而评估能量代谢。
在一些情况中，可以向各组添加额外的(即定制的)诱饵。此外，在一些情况中，可以制备完全定制的组。
在一些实施方式中，本文公开的任何组包括这样的诱饵寡核苷酸，其可以增强对至少约100个分析物、约200个分析物、约300个分析物、约400个分析物、约500个分析物、约600个分析物、约700个分析物、约800个分析物、约900个分析物、约1000个分析物、约1100个分析物、约1200个分析物、约1300个分析物、约1400个分析物、约1500个分析物、约1600个分析物、约1700个分析物、约1800个分析物、约1900个分析物、约2000个分析物或者更多个分析物的检测。
在一些实施方式中，相较于使用诱饵寡核苷酸未检测到的分析物，诱饵寡核苷酸将感兴趣的分析物的检测提高约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、500倍、1000倍或更高。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸包括分子标签。如本文所公开的，诱饵寡核苷酸的分子标签附着于(例如，偶联至)诱饵寡核苷酸的核酸序列。在一些实施方式中，分子标签包括一个或多个部分。在一些实施方式中，部分包括如本文所述的标记物。标记物能够检测诱饵寡核苷酸与分析物的杂交。在一些实施方式中，标记物与诱饵寡核苷酸直接相关联(即偶联)。可检测标记物可由其自身而可直接检测(例如，放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者，在酶标记物的情况下，可以是可间接检测的，例如，通过催化化学底物化合物或组合物的化学改变，该化学底物化合物或组合物可直接检测。可检测标记物可适于小规模检测和/或适于高通量筛选。因此，合适的可检测标记物包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料。
在一些实施方式中，分子标签包括小分子。在一些实施方式中，分子标签包括核酸。在一些实施方式中，靶核酸是单链的。在一些实施方式中，靶核酸是双链的。在一些实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方式中，核酸是DNA。在一些实施方式中，分子标签包括碳水化合物。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的5′位置。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的3′位置。
在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是抗体。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括核酸。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括小分子。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂附接到基材。在一些实施方式中，基材是珠。在一些实施方式中，基材是孔。在一些实施方式中，基材是载玻片。
在一些实施方式中，部分是生物素。在一些实施方式中，生物素分子与诱饵寡核苷酸在3′端直接相关联(即偶联)。在一些实施方式中，生物素分子与诱饵寡核苷酸在5′端直接相关联(即偶联)。一些实施方式中，并如下文所公开的，生物素分子可以与亲和素分子相关联(例如偶联)，从而能够拉下(pulldown)分析物。一些实施方式中，并如下文所公开的，生物素分子可以与链霉亲和素分子相关联(例如偶联)，从而能够拉下分析物。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸不包括附着于序列的部分(即诱饵寡核苷酸是裸诱饵寡核苷酸)。
(ii)杂交方法
在一些情况中，来自单个核酸文库(即单个样品)的核酸与寡核苷酸诱饵杂交。在一些情况中，在杂交之前，可以由多个样品汇集。。在一些情况中，汇集至少2、3、4、5、6、7、8或更多个样品。在一些情况中，各文库与对特定核酸集具有特异性的条形码复合。在一些情况中，集文库来自相同的细胞或组织类型。在一些情况中，集文库来自不同的细胞或组织类型。
在汇集来自一个或多个阵列上不同点的多个样品的设置中，汇集计算考虑了阵列上组织覆盖的点的数量。在一些情况中，可以目测估计组织覆盖的基因表达点的数量，或者通过使用自动计算方法进行更准确的测量。在具有约5000个点的阵列的设置中，阵列上样品覆盖的点的数量可以通过将覆盖百分比乘以基因表达点总数(例如，约5000个)来计算。
在一些情况中，在预杂交汇集核酸的步骤中，将通用阻断剂添加到集中。在一些实施方式中，将人Cot DNA添加到集中。人Cot DNA富含基因组DNA中常见的重复性非编码元件。这些重复序列通常导致杂交反应期间的非特异性结合。向这些反应添加Cot DNA减少与这些重复序列相关的非特异性结合，提高准确性。
在一些情况中，本文公开的诱饵寡核苷酸杂交方法包括多种缓冲液和组分以帮助核酸捕获。在一些情况中，该方法包括杂交增强剂、洗涤缓冲液、平衡缓冲液、杂交缓冲液或其任何组合。任何缓冲液可以是浓缩形式，其可以由本领域技术人员使用例如无核酸酶的水稀释至适当浓度。在一些情况中，组分包括链霉亲和素珠。在一些情况中，组分包括亲和素珠。
在其中RNA是核酸分析物的一些实施方式中，可以选择性地富集一种或多种感兴趣的RNA分析物。例如，可以通过向样品中添加一个或多个寡核苷酸来选择一种或多种感兴趣的RNA。在一些实施方式中，其它寡核苷酸是用于通过聚合酶引发反应的序列。例如，与一种或多种感兴趣的RNA具有序列互补性的一种或多种引物序列可用于扩增一种或多种感兴趣的RNA，从而选择性地富集这些RNA。在一些实施方式中，与捕获的RNA(例如cDNA)的互补链具有序列互补性的寡核苷酸(例如探针)可结合cDNA。例如，具有与一种或多种感兴趣的cDNA互补的序列的生物素化寡核苷酸能够结合到cDNA并且可以利用生物素化-链霉亲和素亲和力，使用本领域已知的各种方法中的任何一种(例如，链霉亲和素珠)来选择。本领域已知他非核酸亲和部分，例如2-(4-羟基苯基偶氮)苯甲酸(HABA)或表5中列出的化合物。
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或者，可以使用多种方法中的任何一种来向下选择(例如，去除)一种或多种RNA。例如，可以将探针给予选择性地与核糖体RNA(rRNA)杂交的样品，从而减少样品中rRNA的集和浓度。随后将捕获探针应用于样品可导致由于样品中存在的非特异性RNA的减少所得到的对其他类型RNA的捕获的改善。
(1)诱饵寡核苷酸的直接杂交
在创建多个核酸或使用其生成的文库之后，可以使用一个或多个诱饵寡核苷酸来富集一个或多个感兴趣的核酸。
在一些实施方式中，将诱饵寡核苷酸添加到多个核酸(例如，核酸文库)。在一些实施方式中，多个核酸包括这样的核酸，其具有空间条形码或其互补物以及来自生物样品的分析物或其互补物的部分序列。在一些实施方式中，空间条形码包括对应于生物样品中感兴趣的区域的序列。在一些实施方式中，空间条形码能够检测生物样品中感兴趣的特定区域并与其相关联。在一些实施方式中，本文公开的方法包括识别感兴趣的区域。在一些实施方式中，空间条形码提供关于生物样品中分析物位置的信息。在一些实施方式中，本文公开的方法包括识别生物样品中分析物的位置和/或丰度。
在一些实施方式中，将诱饵寡核苷酸添加到多个核酸。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸包括特异性结合空间条形码或其互补物的全部或部分和/或分析物或其互补物的全部或部分序列的结构域。在一些实施方式中，可以富集与核酸特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物。例如，诱饵寡核苷酸可以包括分子标签，并且可以使用与分子标签特异性结合的试剂来富集与核酸特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物。在一些实施方式中，分子标签可以(直接或间接地)连接于基材(例如，载玻片、孔或珠)。在一些实施方式中，分子标签可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物、小分子或其任意组合。在一些实施方式中，特异性结合分子标签的试剂可以是蛋白质、核酸、碳水化合物、小分子或其任意组合。在一些实施方式中，分子标签可以是亲和素并且特异性结合分子标签的试剂可以是生物素。在一些实施方式中，分子标签可以是链霉亲和素并且特异性结合分子标签的试剂可以是生物素。
在一些实施方式中，分子标签可以是生物素并且与分子标签特异性结合的试剂可以是亲和素或链霉亲和素(例如，连接于珠的链霉亲和素)。在一些情况中，使用本领域已知的方法制备珠。在一些情况中，缓冲液(例如，平衡缓冲液)用于悬浮珠。在一些情况中，使用本领域已知的方法(例如，使用磁分离器；离心)分离珠与缓冲液。在一些情况中，将珠重悬于缓冲液中以用于捕获诱饵寡核苷酸。
在分子标签是生物素并且该方法包括使用亲和素或链霉亲和素珠来富集与诱饵寡核苷酸复合的核酸的一些实施方式中，可以使用本领域已知的任何方法洗涤链霉亲和素珠。在一些实施方式中，可以洗涤链霉亲和素珠1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次。在一些实施方式中，可以严格洗涤链霉亲和素珠1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次。在一些实施方式中，链霉亲和素珠洗涤可以在约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约48℃、约50℃、约55℃、约60℃、约62℃、约65℃、约67℃、约70℃、约75℃或更高。在一些实施方式中，可以在约67℃下洗涤链霉亲和素珠。在一些情况中，亲和素或链霉亲和素珠洗涤的温度与诱饵寡核苷酸杂交步骤的温度相同(例如，60℃或65℃)。在一些实施方式中，在一个或多个洗涤步骤之后，可以回收并富集与一个或多个诱饵寡核苷酸杂交的一个或多个核酸。
在一些实施方式中，回收的核酸可以从一个或多个诱饵寡核苷酸释放并经纯化以去除亲和素或链霉亲和素和生物素(或任何其他分子标签和特异性结合分子标签的试剂)。
在一些实施方式中，分子标签可以是生物素并且与分子标签特异性结合的试剂可以是亲和素(例如，连接于珠的亲和素)。在分子标签是生物素并且该方法包括使用亲和素珠来富集与诱饵寡核苷酸复合的核酸的一些实施方式中，可以使用本领域已知的任何方法洗涤亲和素珠。在一些实施方式中，可以洗涤亲和素珠1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次。在一些实施方式中，可以严格洗涤亲和素珠1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次。在一些实施方式中，亲和素珠洗涤可以在约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约48℃、约50℃或更高。在一些实施方式中，在一个或多个洗涤步骤之后，可以回收并富集与一个或多个诱饵寡核苷酸杂交的一个或多个核酸。在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸可用于本文所述的任何方法中以从多个核酸富集一个或多个感兴趣的核酸。在一些实施方式中，将多个诱饵寡核苷酸设计成富集包括感兴趣的分析物(例如，在特定细胞状态或通路中起作用或异常表达的一个或多个基因)或其互补物全部或部分序列的一个或多个核酸。例如，在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸可用于富集包括癌症相关转录物或其互补物全部或部分序列的核酸(例如，美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using AHybridization/Capture Approach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using AHybridization/Capture Approach)”)中所公开，其各自通过引用其全部内容纳入本文)。在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸可用于富集包括免疫相关转录物或其互补物全部或部分序列的核酸(例如，美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/CaptureApproach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/CaptureApproach)”)中所公开，其各自通过引用其全部内容纳入本文)。在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸可用于富集包括通路特异性转录物或其互补物全部或部分序列的核酸(例如，美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(CapturingTargeted Genetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing TargetedGenetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)中所公开，其各自通过引用其全部内容纳入本文)。在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸可用于富集包括神经学特异性转录物或其互补物全部或部分序列的核酸，如表4和附带序列表中所列。
在一些实施方式中，在一个或多个诱饵寡核苷酸与其靶核酸杂交之后，富集杂交的核酸，从而产生富集了感兴趣的特定核酸的核酸集。在一些情况中，在与链霉亲和素或亲和素珠杂交和结合之后，未杂交的核酸从样品中洗出，从而富集感兴趣的核酸。在一些实施方式中，在一个或多个诱饵寡核苷酸与其靶核酸杂交之后，降解未杂交的核酸(例如，通过核酸酶)，从而富集杂交的核酸。在一些实施方式中，在一个或多个诱饵寡核苷酸杂交之后，降解杂交的核酸(例如，通过核酸酶)，从而富集未杂交的核酸；例如，该技术可用于减少不感兴趣的高丰度核酸的量。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸可以不包括可检测部分。在一些实施方式中，纯化富集的核酸。在一些实施方式中，对富集的核酸进行样品索引(例如，在测序之前)。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与核酸杂交在约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃，约80℃或更高。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与核酸杂交至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少90分钟、至少2小时、至少3小时、至少至少4小时、至少5小时或更长。
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与核酸杂交约2小时。在一些情况中，诱饵寡核苷酸与核酸杂交过夜(例如，至少约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时或更长)。在一些情况中，诱饵寡核苷酸与核酸杂交约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时或更长。在一些情况中，在杂交之后，洗涤包含与感兴趣的核酸杂交的诱饵寡核苷酸的样品。在一些情况中，使用本文所述的任何洗涤溶液进行洗涤。在一些情况中，洗涤发生在65℃。在一些情况中，洗涤发生在60℃。在一些情况中，杂交在60℃下发生过夜，然后在60℃下进行后续洗涤步骤。在核酸分子的平均长度小于700个碱基对的情况下，杂交应延长至60℃过夜。在该设置中，后续洗涤在60℃下进行。在文库集包括不同长度(例如，如果集包含短(例如，＜700bp)和长(例如，＞700bp))的核酸分子的情况下，杂交可以延长至60℃过夜，随后在60℃下进行洗涤。例如，一定百分比(例如，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)的核酸分子集可以少于700个碱基对，因此该替代方法在60℃下过夜，随后在60℃下进行洗涤。
在一些实施方式中，一个或多个可检测部分可以与诱饵寡核苷酸结合(例如，直接或间接连接)。在一些实施方式中，一个或多个可检测部分可用于检测(或增强检测)诱饵寡核苷酸(例如，与核酸杂交的诱饵寡核苷酸)。
在一些实施方式中，可以扩增富集的核酸。扩增后，富集和扩增的核酸可用于生成核酸文库并使用本领域已知的任何方法测序，包括本文所述的示例性测序方法。在一些实施方式中，测序可包括确定核酸中空间条形码或其互补物的全部或部分序列。在一些实施方式中，测序包括确定核酸中来自生物样品的分析物或其互补物的全部或部分序列。在一些实施方式中，测序包括高通量测序。
在一些情况中，扩增方法包括这样的步骤，其包括含有缓冲液和文库引物集合的组合物。热循环仪可用于扩增富集的核酸文库(例如，98℃、67℃和72℃的循环步骤)。可以理解的是，本领域技术人员可以确定温度和运行时间参数，从而扩增核酸文库。在一些情况中，可以改变扩增的总循环数，从而优化一个或多个诱饵寡核苷酸的检测。在一些情况中，为扩增文库而运行的PCR循环数为至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个循环。可以理解的是，如果给定靶标的预期表达较低，则需要更多个循环来检测靶标。在一些情况中，可以在珠(例如，亲和索或链霉亲和素)在混合物中时进行扩增。在一些情况中，可以使用本领域已知的方法(例如，使用磁体)去除一个或多个珠。
在一些情况中，可以在扩增后确定文库中核酸的平均片段大小。在一些情况中，可以运行自动化电泳系统(例如，来自安捷伦公司(Agilent)的TapeStation)作为核酸文库样品的质量控制。在一些情况中，可以在下游分析(例如测序)之前分析样品的大小、数量和完整性。
在一些实施方式中，相较于无偏倚空间谱分析，使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析可富集约1倍，约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或更多的靶核酸。在一些实施方式中，相较于无偏倚空间谱分析，使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析可富集各基因约1倍，约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或更多的靶核酸。
在一些实施方式中，相较于无偏倚空间谱分析，使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析可使中靶读数百分比增加约1倍，约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或更多。在一些实施方式中，相较于使用无偏倚空间谱分析，使用如本文所述的一个或多个组的靶向空间基因表达谱分析的中靶读数数量为至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，相较于无偏倚空间谱分析，使用如本文所述的组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析可使脱靶读数百分比降低约1倍，约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或更多。
在一些实施方式中，使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析富集目标分析物的检测。在一些实施方式中，使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析富集一个或多个目标分析物的检测。在一些实施方式中，富集包括增加对多个核酸和/或探针进行测序时检测到的测序读数的数量。在一些实施方式中，富集包括增加本文所述亲和素-生物素拉下后对多个核酸进行测序时检测到的测序读数的数量。在一些实施方式中，富集包括增加本文所述链霉亲和素-生物素下拉后对多个核酸进行测序时检测到的测序读数的数量。在一些实施方式中，相较于进行全基因座测序时同一目标分析物中的序列读数的数量，增加约50％、约55％、约60％、约62％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或更多的富集目标分析物序列读数。
在一些实施方式中，从使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析获得的富集的目标分析物序列读数与同一生物样本中进行无偏倚(例如，非靶向)空间基因表达谱分析时的序列读数高度关联。在一些实施方式中，从富集的目标分析物序列读数中检测到的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％UMI与同一生物学样品中进行无偏倚(例如，非靶向)空间基因表达谱分析时的序列读数匹配。在一些实施方式中，匹配的UMI计数的R2为至少0.95、至少0.96、至少0.97、至少0.98或至少0.99。
在一些实施方式中，相较于获自无偏倚(例如，非靶向)空间基因表达谱分析的各点的读数数量(读数/点)，从使用本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析获得的各点的读数数量(读数/点)小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施方式中，相较于获自无偏倚(例如，非靶向)空间基因表达谱分析的总读数，从使用本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析获得的总读数小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于3％、小于2％或小于1％。在一些实施方式中，虽然通过使用如本文所述的一个或多个组的靶向空间基因表达谱分析减少了总读数和/或读数/点，但生物模式(例如，生物样品中特定基因表达的空间模式)相较于从无偏倚(例如，非靶向)空间基因表达谱分析获得的结果保持一致。
在一些实施方式中，相对于无偏空间基因表达谱分析，使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析可获得约50％、约55％、约60％、约62％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更多的组基因回收。
在一些实施方式中，相对于无偏(例如，非靶向)空间基因表达谱分析，使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析可获得约50％、约55％、约60％、约62％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更多的组UMI回收和/或UMI保留。在一些实施方式中，使用如本文所述的一个或多个组(例如，癌症组、免疫组、通路组或神经组)的靶向空间基因表达谱分析可使基因或UMI靶向复杂性(或复杂性)降低至无偏(例如，非靶向)空间基因表达谱分析的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或更少。
在一些实施方式中，双索引文库可用于靶向空间基因表达谱分析。在一些实施方式中，可以在富集步骤之前通过杂交/捕获来混合单独索引的文库，以生成用于下游高通量测序的靶向文库。在一些实施方式中，可以在富集步骤之后通过杂交/捕获来混合单独索引的文库，以生成用于下游高通量测序的靶向文库。在一些实施方式中，相较于获自病理学家的注释和/或无偏倚(例如，非靶向)空间基因表达谱分析，使用如本文所述的一个或多个组的靶向空间基因表达谱提供可比较的，甚至更详细的空间基因谱分析结果。
(2)诱饵寡核苷酸与目标分析物的直接杂交
在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸(例如，来自本文公开的一个或多个组的诱饵寡核苷酸集合)可以直接添加到分析物。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与可检测部分或分子标签在3′端直接相关联(即偶联)。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸与可检测部分或分子标签在5′端直接相关联(即偶联)。在一些实施方式中，可检测部分是荧光团或放射性同位素。
在一些实施方式中，在生物样品中进行靶特异性反应。在一些实施方式中，在与诱饵寡核苷酸接触之前核酸分析物可以变性以产生单链分析物。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸直接结合(例如杂交)分析物(例如单链分析物)，并且可使用一种或多种成像技术鉴定可检测部分(例如荧光团)。在一些实施方式中，靶特异性反应包括诱饵寡核苷酸与分析物(例如，单链分析物)的原位杂交。在一些实施方式中，原位杂交是荧光原位杂交(FISH)。在一些实施方式中，荧光团或分子标签可以用作识别(例如，富集)感兴趣分析物的标志物。在一些实施方式中，荧光显微术可用于定位生物样品中或其他地方中的荧光团标记的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，可以洗去与诱饵寡核苷酸未杂交的分析物。在一些实施方式中，洗涤方法包括仅分离发荧光的那些分析物。在一些实施方式中，洗涤步骤包括本文提供的任何洗涤步骤。
在一些实施方式中，荧光团(例如，本文公开的任何荧光团)可以与诱饵寡核苷酸直接结合(例如，偶联)。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸可以包括与诱饵寡核苷酸直接结合(例如，偶联)的非荧光部分。在一些实施方式中，荧光团可以结合非荧光部分，从而增强分析物的检测。
在一些实施方式中，本文公开的荧光原位杂交方法检测特定的转录物组。在一些实施方式中，本文公开的荧光原位杂交方法检测癌症相关转录物(例如，美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing TargetedGenetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted GeneticTargets Using A Hybridization/Capture Approach)”)中所公开，其各自通过引用其全部内容纳入本文)。在一些实施方式中，本文公开的荧光原位杂交方法检测免疫相关转录物(例如，美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(CapturingTargeted Genetic Targets Using A Hybridization/Capture Approach)”)中所公开，其各自通过引用其全部内容纳入本文)。在一些实施方式中，本文公开的荧光原位杂交方法检测通路特异性转录物(例如，美国专利申请号62/970,066(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/CaptureApproach)”)和美国专利申请号62/929,686(标题为“使用杂交/捕获方法捕获靶向遗传靶标(Capturing Targeted Genetic Targets Using A Hybridization/CaptureApproach)”)中所公开，其各自通过引用其全部内容纳入本文)。在一些实施方式中，本文公开的荧光原位杂交方法检测如本文所述的神经学特异性转录物。
在一些实施方式中，杂交的分析物/诱饵寡核苷酸复合物可由基材裂解。在一些实施方式中，聚集有多个捕获探针的空间条码化阵列可以与生物样品接触。可使空间条码化捕获探针裂解，然后与生物样品内的细胞相互作用。在一些实施方式中，多个捕获探针的捕获探针可以任选地包括至少一个裂解域裂解域表示用于将捕获探针可逆地附接到阵列特征的捕获探针部分。此外，捕获探针的一个或多个区段或区域可任选地通过裂解域的裂解从阵列特征中释放。例如，空间条形码可以通过裂解域的裂解来释放。在一些实施方式中，捕获探针还可包括裂解位点(例如，限制性核酸内切酶的裂解识别位点)、光不稳定键、热敏键或化学敏感键。在一些实施方式中，一旦空间条码化捕获探针与特定细胞或其分析物相关联，可以任选地移出生物样品。
在一些实施方式中，裂解或富集的分析物/诱饵寡核苷酸复合物可在下游步骤(例如，测序)之前进行纯化。可以使用本领域已知的任何方法进行测序，包括本文描述的示例性测序方法。在一些情况中，本文公开的方法包括单索引文库的测序。在一些情况中，本文公开的方法包括对双索引文库进行测序。在一些情况中，文库包含标准Illumina末端配对的构建体，其中包括P5和P7序列。对于单索引文库，将8bp样品索引序列纳入，作为i7样品索引序列。对于双索引文库，将10bp样品索引序列纳入，作为为i7和i5样品索引序列。
在一些实施方式中，核酸测序包括确定空间条形码或其互补物的全部或部分序列。在一些实施方式中，测序包括确定来自生物样品的分析物或其互补物的全部或部分序列。在一些实施方式中，测序包括高通量测序。在一些实施方式中，测序包括将一个或多个衔接子序列或其互补物、多聚(GI)序列或其互补物、模板转换寡核苷酸序列或其互补物、引物结合位点或其互补物与核酸连接或将其添加至核酸。
在一些实施方式中，多个诱饵寡核苷酸(例如，两个或更多个诱饵寡核苷酸)可用于通过RNA模板化连接探询生物样品中的空间基因表达。
(3)诱饵寡核苷酸杂交后的下游应用
在一些实施方式中，本文公开的方法包括捕获后扩增。在一些情况中，可以在下游测序事件之前扩增与链霉亲和素或亲和素珠结合的杂交文库分子。在一些情况中，将引物(例如，P5衔接子和/或P7衔接子)添加到核酸序列或富集的核酸序列。在一些实施方式中，在诱饵寡核苷酸富集感兴趣的核酸之前进行扩增。在一些实施方式中，在诱饵寡核苷酸富集感兴趣的核酸之后进行扩增。
在本文提供的方法的一些实施方式中，RNA模板化连接用于询问生物样品(例如FFPE组织切片)中的空间基因表达。在一些方面中，RNA模板化连接的步骤包括：(1)使诱饵寡核苷酸对与核酸(例如，单链cDNA或RNA分子)杂交；(2)原位连接相邻退火的探针对；(3)RNA酶H处理，其(i)从组织释放RNA模板化连接产物(例如，释放到溶液中)和(ii)破坏不需要的DNA模板化连接产物；和任选地，(4)扩增RNA模板化连接产物(例如，通过多重PCR)。
在一些方面中，RNA模板化连接用于检测目标分析物、确定序列同一性和/或表达监测和转录物分析。在一些方面中，RNA模板化连接允许检测核酸中的特定变化(例如，突变或单核苷酸多态性(SNP))、特定核酸的检测或表达、或特定核酸组的检测或表达(例如，在类似的细胞通路中或在特定病理中表达)。在一些实施方式中，包括RNA模板化连接的方法用于分析核酸，例如，通过基因分型、DNA拷贝数或RNA转录物的定量、样品内特定转录物的定位等。在一些方面中，本文提供的包括RNA模板化连接的系统和方法能鉴定单核苷酸多态性(SNP)。在一些方面中，此类系统和方法能识别突变。
在一些方面中，本文公开了检测RNA表达的方法，其包括使第一诱饵寡核苷酸、第二诱饵寡核苷酸和连接酶(例如，T4 RNA连接酶)接触。在一些实施方式中，将第一诱饵寡核苷酸和第二诱饵寡核苷酸设计成与靶序列杂交，使得第一诱饵寡核苷酸的5′端和第二诱饵寡核苷酸的3′端相邻并且可以连接。杂交后，如果目标样品中存在靶序列，则连接酶(例如，T4 RNA连接酶)连接第一诱饵寡核苷酸和第二诱饵寡核苷酸，但如果靶序列不存在于目标样品中，则连接酶(例如，T4 RNA连接酶)不连接第一诱饵寡核苷酸和第二诱饵寡核苷酸。生物样品中靶序列的存在与否可以通过确定第一诱饵寡核苷酸和第二诱饵寡核苷酸是否在连接酶存在的情况下连接来确定。
在一些方面中，使用包括RNA模板化连接的方法分析两种或更多种RNA分析物。在一些方面中，当分析两个或更多个分析物时，使用对各RNA分析物具有特异性(例如，特异性杂交)的第一诱饵寡核苷酸和第二诱饵寡核苷酸。
在一些方面，在本文提供的RNA模板化连接方法中使用三种或更多种诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，将三种或更多种诱饵寡核苷酸设计成与靶序列杂交，从而使三种或更多种诱饵寡核苷酸彼此相邻杂交，从而可以连接相邻探针的5′和3′端。在一些实施方式中，生物样品中靶序列的存在与否可以通过确定三种或更多种诱饵寡核苷酸是否在连接酶存在的情况下连接来确定。
(e)组合物和试剂盒
本文还提供了包括用于进行本文所述方法的部件和说明书的试剂盒。在一些情况中，试剂盒包括诱饵寡核苷酸集合。在一些情况中，诱饵寡核苷酸集合对特定转录物集合(例如，如本文公开的癌症组、免疫学组、细胞通路组或神经科学组)具有特异性。在一些实施方式中，试剂盒包括对本文所述癌症组具有特异性的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒包括对本文所述免疫组具有特异性的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒包括对本文所述细胞通路组具有特异性的诱饵寡核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒包括对本文所述神经组具有特异性的诱饵寡核苷酸。还应理解的是，可以使用如本文所述设计诱饵寡核苷酸的方法来设计定制组。在一些情况中，试剂盒包括针对同一组的多组诱饵，从而可以在同一载玻片上同时进行多个(例如，双重复、三重复)反应。在一些情况中，可以将其他诱饵寡核苷酸添加到本文所述的组之一(例如，如本文公开的癌症组、免疫组、通路组或神经组)。在一些情况中，试剂盒包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个反应，其中各反应是指测试一个样品。
在一些情况中，部分(例如，生物素)粘附到诱饵寡核苷酸集合中的各诱饵。在一些情况中，试剂盒还包括链霉亲和素珠。在一些情况中，试剂盒还包括亲和素珠。在一些情况中，试剂盒包括包含多个捕获探针的阵列(即入本文所述)。阵列上的捕获探针各自包括空间条形码和捕获域。
试剂盒还可以包括用于实施本文公开的方法的试剂。例如，在一些情况中，试剂盒包括试剂，用于进行逆转录反应(例如逆转录酶)、如本文所述的核酸定量、向核酸序列添加片段和核酸清理。在一些情况中，试剂盒包括对生物样品进行固定、染色和脱色所必需的试剂。
在一些情况中，试剂盒包括能够进行多个反应的组分。在一些情况中，试剂盒包括能够进行靶标杂交的组分。在一些情况中，用于靶标杂交的组分包括通用阻断剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、平衡缓冲液(浓缩或1x)、洗涤缓冲液(浓缩或1x)、引物、对照样品或其任何组合中的一种或多种。在一些情况中，试剂盒包括用于扩增核酸文库的组分。在一些情况中，用于扩增核酸文库的组分包括有助于扩增的混合物、引物或其任何组合。
在一些情况中，试剂盒还包括使用本文描述的方法进行文库制备和核酸检测的说明书。
本文还提供了用于分析生物样品中存在的一个或多个生物分析物的系统，其包括包含多个捕获探针的阵列。本文所述的任何捕获探针都可以包括在系统的部分中。在一些情况中，捕获探针各自包含空间条形码和捕获域。在一些情况中，系统包括可以将探针从阵列裂解的组合物(例如，酶)。在一些情况中，探针的裂解发生在探针与分析物杂交之后。
在一些情况中，系统包括对感兴趣的靶标具有特异性的诱饵寡核苷酸集合。在一些情况中，该系统包括对本文所述癌症组具有特异性的诱饵寡核苷酸。在一些情况中，系统包括对本文所述免疫组具有特异性的诱饵寡核苷酸。在一些情况中，该系统包括对本文所述通路组具有特异性的诱饵寡核苷酸。在一些情况中，系统包括对本文所述神经组具有特异性的诱饵寡核苷酸。
系统还可以包括用于实施本文公开的方法的试剂。例如，在一些情况中，系统包括试剂，用于进行逆转录反应(例如逆转录酶)、如本文所述的核酸定量、向核酸序列添加片段和核酸清理。在一些情况中，系统包括对生物样品进行固定、染色和脱色所必需的试剂。
在一些情况中，系统包括试剂递送系统。试剂递送系统包括能够将试剂递送到生物样品的离散部分的仪器，从而保持寻址方案的空间模式的完整性。在一些情况中，本测定系统的试剂递送系统包括可选的成像手段、试剂递送硬件和控制软件。试剂递送可以通过多种不同方式实现。。应该注意的是，可以将试剂一次递送到多种不同的生物样品中。本文举例说明了单个组织切片；但是，可以同时操作和分析多个生物样品。例如，可以并行分析组织样品的连续切片，并将数据合并以构建3D地图。在一个示例性方面中，试剂输送系统可以是基于流的系统。本发明中用于试剂递送的基于流的系统可以包括仪器，例如一个或多个泵、阀、流体容器、通道和/或试剂储存单元。
本文还提供了包含与核酸结合的诱饵寡核苷酸的组合物，其中，核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)部分分析物结合部分条形码或其互补物。在一些情况中，组合物是通过本文所公开的方法产生的中间组合物。
诱饵寡核苷酸可以是本文所述的任何诱饵寡核苷酸。在一些情况中，诱饵寡核苷酸通过捕获域与核酸结合，捕获域特异性结合(i)全部或部分核酸和/或(ii)全部或部分分析物结合部分条形码或其互补物。
在一些情况中，本文所述的组合物还包含分子标签。在一些情况中，组合物还包含特异性结合分子标签的试剂。分子标签可以是本文所述的任何合适的分子标签。在一些情况中，分子标签包括蛋白质。在一些情况中，蛋白质是链霉亲和素、亲和素或生物素。在一些情况中，分子标签包括小分子。在一些情况中，分子标签包括核酸。在一些情况中，分子标签包括碳水化合物。
在一些情况中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的5′位置。在一些情况中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的3′位置。
特异性结合分子标签的试剂可以是本文所述的任何合适的试剂。在一些情况中，试剂包括链霉亲和素、亲和素或生物素。在一些情况中，分子标签是生物素并且特异性结合分子标签的试剂包括亲和素。在一些情况中，分子标签包括生物素并且特异性结合分子标签的试剂包括链霉亲和素。在一些情况中，分子标签包括亲和素并且特异性结合分子标签的试剂包括生物素。在一些情况中，分子标签包括链霉亲和素并且特异性结合分子标签的试剂包括生物素。
在一些情况中，与分子特异性结合的试剂包括蛋白质。在一些情况中，蛋白质是抗体。在一些情况中，与分子标签特异性结合的试剂包括核酸。在一些情况中，与分子标签特异性结合的试剂包括小分子。
在一些情况中，本文所述的组合物还包括基材。基材可以是本文所述的任何合适的基材。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂固定于基材。在一些实施方式中，分子标签固定于基材。在一些情况中，基材是珠。在一些情况中，基材是孔。在一些情况中，基材是载玻片。
示例性实施方式
在一些实施方式中，本文公开了用于识别生物样品中目标分析物(例如，核酸)位置的方法，该方法包括(a)将多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，其中多个核酸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)分析物结合部分条形码或其互补物的部分；并且多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含结构域，其特异性结合(i)核酸或其互补物中目标序列的全部或部分，和分子标签；(b)使用基材捕获和/或分离与核酸特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物，所述基材包含与分子标签特异性结合的试剂；和(c)确定(i)空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)分析物结合部分条形码的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)所确定的序列识别生物样品中分析物的位置。
在一些实施方式中，本文公开了用于富集生物样品中目标分析物(例如，核酸)的方法，该方法包括(a)将多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，其中多个核酸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)分析物结合部分条形码或其互补物的部分；并且多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含结构域，其特异性结合(i)核酸或其互补物中目标序列的全部或部分，和分子标签；(b)使用基材捕获和/或分离与核酸特异性结合的诱饵寡核苷酸的复合物，所述基材包含与分子标签特异性结合的试剂；从而富集生物样品中的分析物(例如，核酸)。
在一些实施方式中，来自生物样品的分析物与疾病或病症相关。在一些实施方式中，诱饵寡核苷酸的结构域包括总共约10个核苷酸至约300个核苷酸。在一些实施方式中，分子标签包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是生物素。在一些实施方式中，分子标签包括小分子。在一些实施方式中，分子标签包括核酸。在一些实施方式中，分子标签包括碳水化合物。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的5′位置。在一些实施方式中，分子标签位于诱饵寡核苷酸中结构域的3′位置。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是抗体。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂包括链霉亲和素或亲和素。在一些实施方式中，与分子标签特异性结合的试剂附接到基材。在一些实施方式中，基材是珠、载玻片或孔。在一些实施方式中，核酸是DNA。在一些实施方式中，核酸还包括引物结合序列或其互补物。在一些实施方式中，核酸还包括独特分子序列或其互补物。在一些实施方式中，核酸还包括其他引物结合序列或其互补物。
在一些实施方式中，生物样品是组织样品。在一些实施方式中，组织样品是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品或冷冻的组织样品。在一些实施方式中，生物样品预先使用可检测标记物染色。在一些实施方式中，生物样品预先使用苏木精和伊红(H&E)染色。在一些实施方式中，生物样品是透化的生物样品。在一些实施方式中，透化的生物样品已经用透化试剂透化。在一些实施方式中，透化剂选自有机溶剂、交联剂、去污剂和酶或其组合。
在一些实施方式中，透化剂选自有机溶剂、交联剂、去污剂和酶或其组合。在一些实施方式中，分析物是RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子是mRNA分子。在一些实施方式中，步骤(c)中的确定包括对(i)空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)分析物结合部分条形码的全部或部分序列进行测序。在一些实施方式中，测序是高通量测序。在一些实施方式中，测序包括将衔接子与核酸连接。
在一些实施方式中，该方法还包括生成多个核酸，其包括：(a)将多个分析物捕获剂与置于基材的生物样品接触，其中，多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含(i)与分析物特异性结合的分析物结合部分，(ii)分析物结合部分条形码，和(iii)分析物捕获序列；基材包含多个捕获探针，其中，多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，其中，捕获域与分析物捕获序列特异性地结合；和(b)使用分析物结合部分条形码作为模板延伸捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和(c)扩增延伸的捕获探针以产生核酸。在一些实施方式中，扩增是等温的。在一些实施方式中，产生的核酸释放自延伸的捕获探针。在一些实施方式中，分析物是在癌细胞中失调或差异表达的分析物。在一些实施方式中，分析物是在免疫细胞中失调或差异表达的分析物。在一些实施方式中，分析物是在细胞信号转导通路中失调的分析物。在一些实施方式中，分析物是在神经细胞中失调或差异表达的分析物。
实施例
实施例1：靶向空间基因表达
图7显示了示例性靶向空间基因表达工作流程。通常，将其上附着组织的载玻片于-80℃储存少于一周。解冻后，将生物样品在甲醇中固定，并使用H&E(苏木精和伊红)染色，使用明场显微镜成像并透化。
在通过透化获得胞内分析物(例如，mRNA)后，通过附着于载玻片的捕获探针捕获分析物，在这种情况中，进行第一和第二链cDNA合成，其中第二链cDNA可用作捕获的分析物(例如，mRNA)的替代物。在cDNA合成后，使双链分析物(例如，cDNA分子)变性并从载玻片转移并通过qPCR进行定量。在对cDNA进行定量后，将cDNA分析物片段化并进行末端修复。衔接子与cDNA分子连接，并进行样品索引(SI)PCR。SI-PCR之后，可以干燥如上制备的文库。
包括对癌症靶标、免疫靶标、通路靶标或神经学靶标具有特异性的诱饵寡核苷酸的组与cDNA分析物杂交。诱饵寡核苷酸与生物素相关联。cDNA分析物与生物素化诱饵寡核苷酸杂交后，用亲和素或链霉亲和素珠捕获生物素化的诱饵。去除未结合的分析物的洗涤步骤后，将保留文库重新扩增为新的核酸文库。然后对纯化的靶向文库集进行测序。
如图8A-8B所示，使用两个不同的组(200个基因的癌症组(即hl1k.200)和400个基因的免疫组)，来自多个样品(即心脏、乳腺、乳腺癌和淋巴)的空间文库显示出非常高的中靶和映射读取百分比、富集和UMI复杂性(相对于亲本样品)。这些数据证明本文公开的用于靶向杂交富集方法的组与制备的空间文库兼容。
实施例2：靶向基因捕获
在另一示例中，靶向寡核苷酸杂交的步骤可以在衔接子连接和SI-PCR步骤之前进行。
图9显示了示例性工作流程。该工作流程利用从基因表达文库中获得的多个空间生成的文库分子。任选地，通过PCR扩增文库以增加用于靶向富集的文库分子的数量。在该示例中，在富集之前将多达8个不同的文库汇集。任选地，使封闭寡核苷酸与文库杂交以防止靶向序列的修饰，从而防止测序应用期间的下游干扰。合并的文库在SpeedVac中干燥2-4小时，这使得样品在不加热的情况下在低压干燥。添加生物素化的诱饵寡核苷酸，并在65℃下与汇集的文库样品杂交2小时。提供亲和素或链霉亲和素涂覆的珠以在65℃下捕获生物素化的寡核苷酸/靶向捕获复合物5分钟。洗涤亲和素或链霉亲和素珠以去除任何未结合的序列读数并进行捕获后PCR以重新扩增目标文库(例如，扩增与生物素化的寡核苷酸诱饵杂交并随后通过亲和素或链霉亲和素珠捕获的目标序列)，然后SPRI清理15分钟。然后对纯化的靶向文库集进行测序。
实施例3：使用靶向组的杂交和捕获
使用空间基因表达文库的杂交和捕获方法的示例性工作流程显示在图10中。
具体地，使用本文所述合适的方法获得生物样品(例如，组织切片)，例如通过组织样品的冷冻切片。然后对组织切片进行染色，例如通过H&E染色，并使用本文所述任何合适的方法(例如明场显微镜)成像。然后使用本文所述适当的方法对染色的组织切片进行脱色。
在对组织切片进行成像和脱色后，将其透化，然后与包含多个捕获探针的阵列接触。各捕获探针包含空间条形码和与组织切片中mRNA分析物的多聚(A)尾杂交的多聚(T)序列，从而捕获阵列上的多个mRNA分析物。然后将捕获的mRNA逆转录成cDNA并使用本文所述合适的方法进行扩增。因此，构建了用于空间基因表达分析的cDNA文库(来自GEX空间阵列的最终文库)。
随后，进行使用诱饵集合的杂交和捕获。使封闭寡核苷酸与文库中的分析物杂交以防止测序相关位置的修饰，从而防止测序应用期间的下游干扰。然后将文库在SpeedVac中干燥2-4小时，这使得样品在不加热的情况下在低压干燥。添加生物素化的诱饵集合，以在65℃下与文库杂交2小时。提供亲和素或链霉亲和素涂覆的珠以在65℃下捕获生物素化的诱饵集合-序列读数复合物5分钟。在65℃下洗涤亲和素或链霉亲和素珠，以去除任何未结合的序列读数。或者，添加生物素化诱饵集合以在65℃下与文库样品杂交过夜(例如，至少8小时)，并在60℃下洗涤亲和素或链霉亲和素珠以去除任何未结合的序列读数。对亲和素或链霉亲和素珠进行15分钟的PCR，以重新扩增靶向文库(例如，扩增与生物素化的诱饵杂交并随后通过亲和素或链霉亲和素珠捕获的序列读数)，然后进行15分钟的SPRI净化。然后对纯化的靶向文库集进行测序。
实施例4：小鼠组织和神经组空间转录组学
生成诱饵寡核苷酸的小鼠神经胶质组，并在小鼠脑组织切片上进行靶向基因表达。如10X基因组靶向基因表达-空间用户指南协议中所述进行实验，除了使用小鼠脑组织代替人体组织并使用小鼠神经胶质细胞组。
在Visium阵列上运行全转录组组(对照)相对靶向的65个神经基因小鼠神经胶质组。如图11中所示，对照(Visium全转录组试验)相比靶向基因组，具有非常高质量的UMI回收效率和空间分布保留。图12A-12B图示了相较于靶向基因组文中的OLIG2基因(图12B)，对照文库(图12A)中的OLIG2空间基因分布。对于对照，有大约72k个读数/点具有2211个UMI计数，而靶向基因组有大约3.5k个读数/点具有3315个UMI计数。OLIG2基因编码少突胶质细胞转录因子2，其在少突胶质细胞脑细胞中表达，并且在人类中，OLIG2基因在脑少突胶质细胞肿瘤中表达。该结果证明同样的靶向基因表达富集方法也可以使用小鼠组织样品中的小鼠诱饵寡核苷酸进行。
实施例5：应用于人体组织切片的靶向基因组
靶向基因组用于从Visium阵列靶向捕获不同人组织中的基因表达。遵循如10X基因组靶向基因表达空间用户指南协议中所述的靶向基因表达方法。
图13A-13B显示了相较于常规全转录组对照Visium(非靶向)空间阵列，对在人胶质母细胞瘤组织切片上使用四种不同基因组的靶标富集进行比较时的一般数据结果。对于所有四个组(即，泛癌、免疫学、基因特征和神经科学富集基因组)，不同基因的中靶读数介于70％-90％之间，而与使用的靶向组无关(图13A)。如Visium对照所示，大约3％-10％的全转录组映射的读数对应靶向组中的基因。此外，当比较Visium对照和泛癌靶向组(作为代表性的靶向组，但对所有组都有实证)之间的相关性时，观察到表达谱具有高度可重复性和相关性(R2为0.98)(图13B)。
为了证明多种组织类型与靶向基因富集工作流程兼容，针对Visium对照全转录组空间试验，评估了四个靶向基因组(图14A-14B)各自的十二种不同的组织类型。测试的十二种组织类型均来自人：乳腺IDC、乳腺ILC、三阴性乳腺癌、小脑、结肠直肠癌、皮质、胶质母细胞瘤、心、肾疾病、肺、卵巢肿瘤和脊髓。无论组织类型或靶向基因富集组如何，相对于对照Visium全转录组试验，回收超过90％的靶向基因(图14A)，并且UMI匹配超过80％(图14B)。因此，多种组织类型与本文所述靶向基因富集工作流程兼容。
为了证明进行本文所述靶向基因富集方法时聚类的保持，将人大脑皮层组织上的Visium全转录组空间阵列与神经科学小组靶向基因富集空间阵列进行比较。如图15A(Visium全转录组对照)和图15B(神经科学组)所示，聚类是可比较的。事实上，对于神经科学小组，只需要5k个原始测序读数/点即可重新概括全转录组试验中所示主要生物学模式(全转录组对照为50k个读数/点)。图15C证实了该数据，证明了针对各基因绘制的UMI的两个数据集合之间优异的关联性。
下一个问题是靶向基因组富集方案是否可以细化组织中相关基因的子类别，以及其将如何与病理学家对样本的注释进行比较。因此，如本文所述对人乳腺癌组织切片进行实验。图16A显示了病理学家对乳腺癌组织中不同细胞的注释：鉴定了DCIS、脂肪、纤维组织、免疫细胞、侵袭性癌细胞和正常腺体细胞。具体地，代表侵袭性癌细胞、纤维组织和免疫细胞的区域分别用虚线、点虚线和实线圈出。图16B显示了病理学家的注释转换为Visium全转录组数据。图16C显示了来自泛癌基因富集组的196个乳腺癌基因，缩小到来自泛癌富集组的ERBB2基因的表达(图16D)。如图所示，靶向泛癌组以及来自该组的196个乳腺癌基因证明靶向基因表达与病理学家的注释相当，进一步表明ERBB2如所预期在入侵性癌隔室中最丰富地表达。此外，相较于Visium全转录组的50k个读数/点，仅使用5k个读数/点获得所有数据。这种效率需要一小部分进行全转录组空间分析的测序成本，因此不仅有利于靶向基因表达，而且还可以节省成本。
因此，该数据证明，对于不同的靶向基因组以及所有靶向组，使用具有Visium空间基因表达的靶向基因组来识别与癌症和对人健康和疾病重要的其他疾病相关的特定基因靶标的基因表达信息的能力。
实施例6.癌症组
图17A-17D详述了癌症组中各探针的序列表。癌症组代表SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：1041963中序列读数的子集。癌症组中的各条目是序列表中发现的癌症组中的探针的SEQ ID NO。因此，癌症组的条目843是序列表中的SEQ ID NO：843。转向序列表中的SEQ IDNO：843，可以看到该序列的名称是探针ENSG00000002016_0。探针ENSG00000002016_0的基础部分ENSG00000002016代表Ensembl版本101数据库中的基因ENSG00000002016或RAD52，即该探针ENSG00000002016_0设计用于在靶向测序期间拉下(pull down)的基因。参见，Cunningham等，Ensembl 2019，PubMed PMID：30407521，doi：10.1093/nar/gky1113，将其通过引用纳入，获取Ensembl数据库的详细信息。序列表中的各序列都提供了Ensembl数据库中为其设计探针的对应基因的条目的名称。为简明起见，在图17A-17D中，当癌症组包括序列的连续范围时，例如SEQ ID NO：843-887，将其列为843-887，而不是列出各序列列表(例如，843、844、845、…、887)。然而，癌症组包括在图17A-17D中提供的各范围内的各探针。癌症组中的遗传靶标与癌症有关。参见例如，Kandoth等，2013，“12种主要癌症类型的突变概况和意义(Mutational landscape and significance across 12 major cancertypes)，”Nature 502(7471)，第333-339页；Hoadley等，2018，“细胞起源模式主导33种癌症的10,000各肿瘤的分子分类(Cell-of-Origin Patterns Dominate the MolecularClassification of 10,000 Tumors from 33 Types of Cancer)，Cell 173(2)，第291-304页；Bailey等，2018，“癌症驱动基因和突变的综合表征(ComprehensiveCharacterization of Cancer Driver Genes and Mutations)，”Cell 173(2)，第371-385页，其各自通过引用纳入。.还参见，癌症基因组图谱研究网络(Cancer Genome AtlasResearch Network)、Illumina TruSight 500、Nanostring nCounter泛癌症通路、IDTxGen泛癌症和Agilent ClearSeq综合癌症。
实施例7.免疫学探针组
图18A-18D详述了免疫学探针组中各探针的序列表。免疫学探针组代表SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：1041963中序列读数的子集。免疫学探针组中的各条目是序列表中发现的免疫学探针组中的探针的SEQ ID NO。因此，免疫学探针组的条目888是序列表中的SEQID NO：888。转向序列表中的SEQ ID NO：888，可以看到该序列的名称是探针ENSG00000002549_0。探针ENSG00000002549_0的基础部分ENSG00000002549代表Ensembl版本101数据库中的基因ENSG00000002549或LAP3，即该探针ENSG00000002549设计用于在靶向测序期间拉下的基因。参见，Cunningham等，Ensembl 2019，PubMed PMID：30407521，doi：10.1093/nar/gky1113，将其通过引用纳入，获取Ensembl数据库的详细信息。序列表中的各序列都提供了Ensembl数据库中为其设计探针的对应基因的条目的名称。为简明起见，在18A-18D中，当免疫学探针组包括序列的连续范围时，例如SEQ ID NO：888-894，将其列为888-894，而不是列出各序列列表(例如，888、889、890、…、894)。然而，免疫学探针组包括在图18A-18D中提供的各范围内的各探针。免疫学探针组中的遗传靶标与免疫学有关。参见例如，Thorsson等，2018，“癌症的免疫概况(The Immune Landscape of Cancer)，”Immunity48(4)，第812-830页，将其通过引用纳入。还参见BD(T细胞，免疫反应)和HTG(HTG EdgeSeq免疫肿瘤学试验)，Nanostring(泛癌免疫谱分析，适应性免疫，先天免疫)。
实施例8.通路组
图19A-19D详述了通路组中各探针的序列表。通路组代表SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：1041963中序列读数的子集。通路组中的各条目是序列表中发现的通路组中的探针的SEQ ID NO。因此，通路组的条目1是序列表中的SEQ ID NO：1。转向序列表中的SEQ ID NO：1，可以看到该序列的名称是探针ENSG00000000003_0。探针ENSG00000000003_0的基础部分ENSG00000000003代表Ensembl版本101数据库中的基因ENSG00000000003或TSPAN6，即该探针ENSG00000000003设计用于在靶向测序期间拉下的基因。参见，Cunningham等，Ensembl2019，PubMed PMID：30407521，doi：10.1093/nar/gky1113，将其通过引用纳入，获取Ensembl数据库的详细信息。序列表中的各序列都提供了Ensembl数据库中为其设计探针的对应基因的条目的名称。为简明起见，在19A-19D中，当通路组包括序列的连续范围时，例如SEQ ID NO：1-37，将其列为1-37，而不是列出各序列列表(例如，1、2、3、…、37)。然而，通路组包括在图19A-19D中提供的各范围内的各探针。通路组中的遗传靶标与生物学通路有关。参见例如，Behan等，2019，“使用CRISPR-Cas9筛选癌症治疗靶点的优先级(Prioritizationof cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens)，Nature 568，第511-516页；Sanchez-Vega等，2018，“癌症基因组图谱中的致癌信号转导通路(OncogenicSignaling Pathways in The Cancer Genome Atlas)，”Cell 173(2)，第321-337页；和Fang等，2019，“遗传学主导方法定义30个免疫相关性状的药物靶点概况(A genetics-ledapproach defines the drug target landscape of 30 immune-related traits)，”Nature Genetics 51(7)；第1082-1091页，其各自通过引用纳入。
实施例9.神经组
图20A-20D详述了神经组中各探针的序列表。神经组代表SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：1041963中序列读数的子集。神经组中的各条目是序列表中发现的神经组中的探针的SEQ ID NO。因此，神经组的条目632是序列表中的SEQ ID NO：632。转向序列表中的SEQ IDNO：632，可以看到该序列的名称是探针ENSG00000001626_0。探针ENSG00000001626_0的基础部分ENSG00000001626代表Ensembl版本101数据库中的基因ENSG00000001626或CFTR，即该探针ENSG00000001626设计用于在靶向测序期间拉下的基因。参见，Cunningham等，Ensembl 2019，PubMed PMID：30407521，doi：10.1093/nar/gky1113，将其通过引用纳入，获取Ensembl数据库的详细信息。序列表中的各序列都提供了Ensembl数据库中为其设计探针的对应基因的条目的名称。为简明起见，在图20A-20D中，当神经组包括序列的连续范围时，例如SEQ ID NO：632-705，将其列为632-705，而不是列出各序列列表(例如，632、633、634、…、705)。然而，神经组包括在图20A-20D中提供的各范围内的各探针。神经组中的遗传靶标与神经生物学有关。
在神经组中代表的基因是ABAT、ABCA1、ABCA7、ABCB1、ABCG2、ABI3、ABL1、ACAA1、ACE、ACHE、ACIN1、ACTG1、ACTN1、ACVRL1、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADARB1、ADCY5、ADCY8、ADCY9、ADCYAP1、ADGRG1、ADM、ADORA1、ADORA2A、ADRA2A、ADRA2C、ADRB1、ADRB2、AGER、AGT、AGTR1、AIF1、AK3、AKT1、AKT1S1、AKT2、AKT3、ALB、ALDH1A1、ALDH1L1、ALDH7A1、ALK、ALOX12、ALOX12B、ALOX15、ALS2、AMIGO1、AMPH、ANG、ANGPT2、ANO3、ANXA11、AP1S1、AP2A2、AP2B1、AP3M2、AP3S1、AP4S1、APAF1、APBB1、APC、APEX1、APOA1、APOD、APOE、APP、APTX、AQP1、AQP4、AR、ARC、ARHGAP44、ARHGEF10、ARMC10、ARRB2、ARSA、ARX、ASCL1、ASCL2、ASPM、ATCAY、ATF4、ATF6、ATG5、ATM、ATP13A2、ATP1A2、ATP1A3、ATP2B3、ATP6AP2、ATP6V0C、ATP6V0D1、ATP6V0E1、ATP6V0E2、ATP6V1A、ATP6V1D、ATP6V1E1、ATP6V1G2、ATP6V1H、ATP7A、ATP8A2、ATRN、ATRX、ATXN2、ATXN3、ATXN7、AVP、B4GALT6、BACE1、BACE2、BAD、BAI1、BAX、BCAS1、BCAS2、BCHE、BCL2、BCL2L1、BDNF、BECN1、BID、BIN1、BIRC5、BMI1、BNIP3、BRAF、BRMS1L、BTNL2、C21ORF2、C3、C5、C6、C9ORF72、CA1、CA2、CAB39、CACNA1A、CACNA1B、CACNA1 C、CACNA1D、CACNA1F、CACNA1S、CACNB2、CACNB4、CADM3、CADPS、CALB1、CALB2、CALCA、CALM1、CALML5、CAMK2B、CAMK2D、CAMK2G、CAMK4、CAPN1、CASK、CASP1、CASP3、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASS4、CAST、CAV1、CBS、CCK、CCKBR、CCL2、CCL5、CCND1、CCNH、CCR2、CCR5、CCS、CD11B、CD14、CD163、CD2AP、CD31、CD33、CD34、CD39、CD4、CD40、CD44、CD68、CD8A、CD9、CDC27、CDC40、CDC6、CDH1、CDH2、CDK2、CDK5、CDK5R1、CDK5RAP2、CDK5RAP3、CDK7、CDKL5、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDS1、CELF1、CEND1、CENPJ、CEP135、CEP41、CER1、CERS1、CERS2、CERS4、CERS6、CFTR、CHAT、CHCHD10、CHCHD2、CHD4、CHGA、CHI3L1、CHL1、CHMP1A、CHMP2B、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM5、CHRNA1、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA5、CHRNA7、CHRNB2、CKB、CLCN6、CLDN15、CLDN5、CLN3、CLN5、CLN8、CLU、CNKSR2、CNP、CNR1、CNR2、CNTF、CNTN1、CNTN4、CNTNAP1、CNTNAP2、COL4A1、COL4A2、COMT、COQ2、CP、CPLX1、CPT1B、CR1、CREB1、CREBBP、CRH、CRHR1、CRP、CRTC2、CRYAB、CSF1、CSF1R、CSF2RB、CSNK1A1、CSPG4、CSTB、CTNNB1、CTNS、CTSC、CTSD、CTSE、CUL1、CUL2、CUL3、CX3CL1、CX3CR1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL16、CXCL8、CXCR4、CXXC1、CYBB、CYCS、CYP19A1、CYP27A1、CYP46A1、CYP4X1、DAGLA、DAO、DBH、DBNL、DCC、DCTN1、DCX、DDC、DDIT3、DDX23、DES、DGKB、DGKE、DHCR7、DISC1、DKK1、DLAT、DLD、DLG3、DLG4、DLGAP1、DLL4、DLX1、DLX2、DMBT1、DMD、DMPK、DNAH1、DNAJA2、DNAJC5、DNAJC6、DNM1L、DNM2、DNMT1、DOT1L、DRD1、DRD2、DRD4、EDN1、EDNRB、EEF1A1、EFHC1、EFNA1、EFNA5、EFNB3、EFR3A、EGF、EGFL7、EGFR、EGLN1、EGLN3、EGR1、EGR2、EHMT1、EIF2S1、EIF4G1、ELAVL1、EMCN、EMP2、EN2、ENG、ENO2、ENTPD2、ENTPD4、EP300、EPAS 1、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHB2、EPO、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERCC1、ERG、ERLEC1、ERO1L、ESAM、ESR1、ESR2、F2、F2RL1、FA2H、FAM126A、FAM174A、FANCF、FAS、FASLG、FBXO7、FERMT2、FGF12、FGF14、FGF2、FGFR1、FGFR3、FIG4、FKTN、FLNA、FLT1、FLT4、FMR1、FN1、FOLH1、FOLR1、FOS、FOXG1、FOXP2、FRMPD4、FUS、FXN、FYN、GAA、GABRA1、GABRA2、GABRA4、GABRA5、GABRB2、GABRB3、GABRG 1、GABRG2、GABRP、GABRR1、GABRR3、GAD1、GAD2、GAK、GAL、GAL3ST1、GALC、GATA2、GBA、GCG、GCH1、GDNF、GDPD2、GFAP、GFPT1、GGA1、ENSG00000100031、ENSG00000286070、GHRL、GIGYF2、GJA1、GJB1、GLRB、GLS、GLUD1、GNAI1、GNAI2、GNAI3、GNAO1、GNAQ、GNAS、GNB5、GNG2、GNGT1、GNPTAB、GNPTG、GNRH1、GNRHR、GPD1L、GPHN、GPR37、GPR4、GPR84、GPRASP1、GRIA1、GRIA2、GRIA3、GRIA4、GRIK2、GRIN1、GRIN2A、GRIN2B、GRIN2C、GRIN2D、GRIN3B、GRM1、GRM2、GRM3、GRM5、GRM8、GRN、GSK3B、GSN、GSR、GSS、GSTP1、GTF2A1、GTF2B、GTF2H1、GTF2H3、GTF2IRD1、GUCY1B3、GUSB、HAP1、HCN1、HDAC1、HDAC2、HDAC6、HDAC7、HEXB、HGF、HIF1A、HIF3A、HLA-DRA1、HLA-DRB1、HLA-B、HLA-A、HMGB1、HMOX1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPM、HOMER1、HOXA2、HPCAL1、HPGDS、HRAS、HRH3、HSPA6、HSPB1、HTR1A、HTR1B、HTR2A、HTR2C、HTR3A、HTR4、HTR5A、HTRA2、HTT、ICAM1、ICAM2、IDE、IDH1、IDH2、IDO1、IFNG、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IKBKB、IL10、IL10RA、IL13RA1、IL15RA、IL18、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1RN、IL2、IL4、IL4R、IL6、IL6R、INA、INHBB、INPP4A、INPP5D、INPP5F、INS、INSR、IPCEF1、IRF8、ISLR2、ITGA5、ITGA7、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB3、ITM2B、ITPR1、ITPR2、ITPR3、JAM3、JUN、KATNA1、KCNA1、KCNB1、KCNC3、KCND3、KCNJ10、KCNK9、KCNMA1、KCNN3、KCNQ2、KCNQ3、KDELR2、KDR、KEAP1、KEL、KIAA1161、KIF3A、KIF5A、KIFBP、KIT、KLK6、KNL1、KRAS、L1CAM、LAMA2、LAMB2、LAMP1、LARGE1、LCLAT1、LDHC、LDLR、LEP、LEPR、LGALS3、LGI1、LIF、LINGO1、LMNA、LMNB1、LOX、LPAR1、LPL、LRP1、LRRC25、LRRC4、LRRC61、LRRK2、LSM2、LSM7、LSR、LTBR、LYPLA1、MAG、MAGEE1、MAL、MAN2B1、MAP2、MAP2K1、MAP2K2、MAPK1、MAPK10、MAPK3、MAPK8、MAPK9、MAPKAPK2、MAPT、MARCO、MARK2、MARK4、ENSG00000015479、ENSG00000280987、MBP、MDM2、MEAF6、MECP2、MED10、MEF2C、MET、MFN2、MFSD8、MGMT、MIF、MKI67、MKS1、MME、MMP12、MMP14、MMP16、MMP19、MMP2、MMP24、MMP3、MMP9、MMRN2、MNAT1、MOG、MPZ、MS4A4A、MS4A6E、MSH6、MSI1、MSN、MT-ATP6、MT-ND1、MT1H、MTA1、MTA2、MTHFR、MTOR、MUTYH、MYC、MYCN、MYCT1、MYD88、MYH10、MYRF、NAGLU、NAMPT、NAPSA、NCAM1、NCF1、NCL、NEFH、NEFL、NEGR1、NEK1、NELFA、NELL2、NEO1、NES、NEUN、NF1、NFE2L2、NFKB1、NFKBIA、NFKBIB、NGF、NGFR、NINJ2、NKX2-1、NKX6-2、NLGN4X、NLRP3、NMB、NME5、NME8、NMNAT2、NOG、NOL3、NOS1、NOS2、NOS3、NOSTRIN、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NOVA1、NPAS4、NPC1、NPC2、NPHP1、NPPB、NPR1、NPTN、NPY、NQO1、NR3C1、NR3C2、NR4A2、NRG1、NRP1、NRP2、NRXN1、NSF、NTF3、NTN1、NTNG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、NTS、NWD1、OCLN、OLFM3、OLIG2、OLR1、ONECUT2、OPA1、OPHN1、OPRK1、OPRM1、OPTN、ORC4、ORC6、OSMR、OTUD4、OXR1、OXTR、P2RX4、P2RX7、P2RY12、P4HA1、PADI2、PAFAH1B1、PAH、PAK1、PALM、PANK2、PARK2、PARK5、PARK7、PARP1、PAX2、PAX3、PAX6、PCDH19、PCNA、PCNT、PCSK2、PDE1B、PDE4D、PDGFRA、PDGFRB、PDPK1、PECAM1、PFN1、PGAM1、PGK1、PHF19、PHF2、PHF21A、PICALM、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、PINK1、PKN1、PLA2G16、PLA2G2A、PLA2G2E、PLA2G2F、PLA2G4A、PLA2G4B、PLA2G4C、PLA2G4D、PLA2G4E、PLA2G4F、PLA2G6、PLAU、PLAUR、PLCB1、PLCB2、PLCB3、PLCB4、PLCG2、PLCL2、PLEKHG4、PLEKHO2、PLLP、PLOD2、PLP1、PLS1、PLXNB3、PLXNC1、PMCH、PMP22、PNKD、POC1A、PODNL1、POLG、POLR2B、POLR2H、POLR2J、POLR2K、POLR2L、POMC、POMGNT1、POU5F1、PPARG、PPARGC1A、PPM1L、PPP1R1B、PPP2CA、PPP2R5C、PPP2R5E、PPP3CA、PPP3CB、PPP3CC、PPT1、PQBP1、PRF1、PRKAA2、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKAR1B、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCG、PRKCQ、PRKCSH、PRKN、PRKRA、PRL、PRNP、PROM1、PRPF3、PRPF31、PRPH、PRRT2、PSEN1、PSEN2、PSMB8、PSMB9、PTDSS1、PTDSS2、PTEN、PTGDS、PTGS2、PTK2、PTK2B、PTPRN、PTPRN2、PTPRR、PVALB、PVRL2、QKI、RAB2A、RAB38、RAB39B、RAB3A、RAB3C、RAB7L1、RABGEF1、RAC1、RAD23B、RAF1、RAN、RAPGEF2、RARS2、RASGRP1、RB1、RBBP8、RBFOX3、RCAN1、RDX、RELA、RELN、REST、RET、RHEB、RHOA、RIMS1、RIN3、RING1、RIT2、RNF216、ROBO1、RPL39L、RPP25、RRAS、RTN4、RYR1、RYR2、RYR3、S100G、S100B、SARM1、SART1、SCAMP2、SCARB2、SCN1A、SCN2A、SCN5A、SCN8A、SCN9A、SEC23A、SEMA3A、SERPINB6、SERPINE1、SERPINI1、SETX、SF3A2、SF3B2、SF3B4、SGK1、SGPL1、SGTA、SH3TC2、SHANK2、SHH、SIGMAR1、SIRT1、SIRT2、SIRT7、SIX3、SLA、SLC11A1、SLC12A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC18A2、SLC18A3、SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC24A4、SLC25A19、SLC2A1、SLC2A3、SLC32A1、SLC4A10、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A6、SLC8A1、SLC9A6、SLIT1、SLIT2、SLIT3、SLU7、SMARCB1、SMN1、SMPD4、SMYD1、SNAP91、SNCA、SNCAIP、SNCB、SNRPA、SOD1、SOD2、SORCS3、SORL1、SOX10、SOX2、SOX9、SP1、SP100、SPAG4、SPARC、SPAST、SPG11、SPI1、SPP1、SPTBN2、SQSTM1、SRC、SRGAP1、SRGAP2、SRGAP3、SRI、SRSF4、SRY、SST、ST3GAL3、ST3GAL5、STAB1、STAMBPL1、STAT1、STAT3、STC1、STC2、STIL、STX1A、STX1B、STX2、SUCLA2、SYN1、SYNJ1、SYP、SYT1、SYT13、SYT4、SYT7、TAC1、TACR1、TAF1、TAF10、TAF4、TAF4B、TAF6L、TAF9、TARDBP、TAU、TAZ、TBC1D24、TBK1、TBP、TBPL1、TBR1、TCERG1、TCIRG1、TENM2、TERT、TF、TFAM、TGFB1、TGFB2、TGFBR2、TGIF1、TGM2、TH、THAP1、THY1、TIA1、TIE1、TLR2、TLR3、TLR4、TMEM106B、TMEM119、TMEM216、TMEM230、TMEM237、TMEM67、TNC、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10D、TNFRSF11B、TNFRSF12A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFSF10、TNNI3、TNR、TOMM40、TOR1A、TP53、TP53INP1、TP73、TPH1、TPH2、TPM1、TPP1、TRADD、TREM1、TREM2、TRIM28、TRIM37、TRIP4、TRPA1、TRPM2、TRPV1、TRPV4、TSC1、TSC2、TSEN34、TSPAN13、TSPO、TUBA4A、TUBA8、TUBB3、TWISTNB、TWNK、TXNL1、TYROBP、U2AF2、UBB、UBE2K、UBE2N、UBE3A、UBQLN1、UBQLN2、UCHL1、UGCG、UGT8、UNC13A、USP21、USP30、VAPB、VCP、VEGFA、VEGFB、VHL、VIP、VPS13C、VPS13D、VPS35、WDR62、WFDC2、WFS1、WNT10A、WNT6、WT1、XAB2、XBP1、XIAP、XK、ZBED6CL、ZCWPW1、ZEB2、ZIC2和ZNF24。

Claims (47)

1.一种用于识别生物样品中分析物丰度和位置的方法，所述方法包括：
(a)将多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，其中
所述多个核酸包括延伸的核酸，其包含(i)空间条形码或其互补物，和(ii)所述分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列；和
所述多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含：
(i)与所述分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列杂交的捕获域，和
(ii)分子标签；
(b)使用基材捕获与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸，所述基材包含与所述分子标签结合的试剂；和
(c)确定(i)所述空间条形码或其互补物的全部或部分序列，和(ii)所述延伸的核酸的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)所确定的序列识别所述生物样品中分析物的丰度和位置。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述分析物是核酸。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述方法还包括生成多个核酸，其包括：
(a)将所述生物样品与包含多个附接的捕获探针的基材接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)与所述核酸中存在的序列结合的捕获域；
(b)使所述捕获探针与核酸杂交；
(c)使用与所述捕获域结合的核酸作为模板延伸所述捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和
(d)扩增所述延伸的捕获探针以产生延伸的核酸。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述延伸的核酸释放自所述延伸的捕获探针。
5.如权利要求1所述的方法，其中，分析物是蛋白质。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述分析物衍生物是寡核苷酸，其包含分析物结合部分条形码，和分析物捕获序列。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述方法还包括生成多个核酸，所述方法包括：
(a)将多个分析物捕获剂与所述生物样品接触，其中：
所述多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含(i)结合蛋白质的分析物结合部分和(ii)包含分析物结合部分条形码和分析物捕获序列的寡核苷酸；
(b)使所述多个分析物捕获剂与基材接触，所述基材包含多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，其中所述捕获域结合分析物捕获序列；
(c)使用所述分析物结合部分条形码作为模板延伸所述捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和
(d)扩增所述延伸的捕获探针以产生延伸的核酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述延伸的核酸释放自所述延伸的捕获探针。
9.如权利要求7所述的方法，其中，步骤(a)和步骤(b)基本上同时进行。
10.一种用于富集生物样品中分析物或分析物衍生物的方法，所述方法包括：
(a)将多个核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，其中
所述多个核酸包括延伸的核酸，其包含(i)空间条形码或其互补物，和(ii)所述分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列；和
所述多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含：
(i)与所述分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列杂交的捕获域，和
(ii)分子标签；
(b)使用基材捕获与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸的复合物，所述基材包含与所述分子标签结合的试剂；和
(c)分离所述与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸的复合物，从而富集所述生物样品中的分析物或分析物衍生物。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述分析物是核酸。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述方法还包括生成多个核酸，其包括：
(a)将所述生物样品与包含多个附接的捕获探针的基材接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)与所述核酸中存在的序列结合的捕获域；
(b)使所述捕获探针与核酸杂交；
(c)使用与所述捕获域结合的核酸作为模板延伸所述捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和
(d)扩增所述延伸的捕获探针以产生延伸的核酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述延伸的核酸释放自所述延伸的捕获探针。
14.如权利要求10所述的方法，其中，分析物是蛋白质。
15.如权利要求10或14所述的方法，其中，所述分析物衍生物是寡核苷酸，其包含分析物结合部分条形码，和分析物捕获序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述方法还包括生成多个核酸，所述方法包括：
(a)将多个分析物捕获剂与所述生物样品接触，其中：
所述多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含(i)结合蛋白质的分析物结合部分和(ii)包含分析物结合部分条形码和分析物捕获序列的寡核苷酸；
(b)使所述多个分析物捕获剂与基材接触，所述基材包含多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，其中所述捕获域结合分析物捕获序列；
(c)使用所述分析物结合部分条形码作为模板延伸所述捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和
(d)扩增所述延伸的捕获探针以产生延伸的核酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述延伸的核酸释放自所述延伸的捕获探针。
18.如权利要求16所述的方法，其中，步骤(a)和步骤(b)基本上同时进行。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，来自所述生物样品的分析物与疾病或病症相关。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述诱饵寡核苷酸的捕获域结合所述分析物、分析物衍生物或其互补物的序列的3′部分、5′部分、内含子、外显子、3′非翻译区或5′非翻译区。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述诱饵寡核苷酸的捕获域包括总共约10个核苷酸至约300个核苷酸。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述分子标签包括蛋白质、小分子、核酸或碳水化合物。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述分子标签是链霉亲和素、亲和素、生物素或荧光团。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，所述与分子标签结合的试剂包括蛋白质(例如，抗体)、核酸或小分子。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述分子标签是生物素并且所述与分子标签结合的试剂是亲和素或链霉亲和素。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中，所述与分子标签特异性结合的试剂附接到所述基材。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述基材是珠、载玻片或孔。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，所述延伸的核酸是DNA分子(例如，cDNA分子)。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中，所述延伸的核酸还包含引物序列或其互补物；独特分子序列或其互补物；或其他引物结合序列或其互补物。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是选自福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样品或冷冻的组织样品的组织样品。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中，所述生物样品预先使用可检测标记物、苏木精和伊红(H&E)染料、免疫荧光或免疫组织化学染色。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是透化的生物样品。
33.如权利要求1-9和19-32中任一项所述的方法，其中，所述确定步骤包括对(i)所述空间条形码或其互补物的全部或部分序列和(ii)来自所述生物样品的核酸的全部或部分序列进行测序。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述测序是高通量测序。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，所述分析物在癌细胞、免疫细胞、细胞信号转导通路或神经细胞中失调或差异表达。
36.一种用于识别生物样品中核酸丰度和位置的方法，所述方法包括：
(a)将所述生物样品与包含多个附接的捕获探针的基材接触，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)与所述核酸中存在的序列结合的捕获域；
(b)使所述捕获探针与核酸杂交；
(c)使用与所述捕获域结合的核酸作为模板延伸所述捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；和
(d)扩增所述延伸的捕获探针以产生延伸的核酸；其中所述延伸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)核酸或其互补物的全部或部分序列；
(e)由所述延伸的捕获探针释放延伸的核酸；
(f)将多个释放的核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，所述释放的核酸包含来自步骤(e)的延伸的核酸，其中
所述多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含：
(i)与所述核酸或其互补物的全部或部分序列杂交的捕获域，和
(ii)分子标签；
(g)使用基材捕获与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸，所述基材包含与所述分子标签结合的试剂；和
(h)确定(i)所述空间条形码或其互补物的全部或部分序列，和(ii)所述延伸的核酸的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)所确定的序列识别所述生物样品中核酸的丰度和位置。
37.一种用于识别生物样品中蛋白质丰度和位置的方法，所述方法包括：
(a)将多个分析物捕获剂与所述生物样品接触，其中：
所述多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含(i)结合蛋白质的分析物结合部分和(ii)包含分析物结合部分条形码和分析物捕获序列的寡核苷酸；
(b)使所述多个分析物捕获剂与基材接触，所述基材包含多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域，其中所述捕获域结合分析物捕获序列；
(c)使用所述分析物结合部分条形码作为模板延伸所述捕获探针的3′端以生成延伸的捕获探针；
(d)扩增所述延伸的捕获探针以产生延伸的核酸；其中所述延伸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物和(ii)寡核苷酸或其互补物的全部或部分序列；
(e)由所述延伸的捕获探针释放延伸的核酸；
(f)将多个释放的核酸与多个诱饵寡核苷酸接触，所述释放的核酸包含来自步骤(e)的延伸的核酸，其中
所述多个诱饵寡核苷酸的诱饵寡核苷酸包含：
(i)与所述核苷酸或其互补物的全部或部分序列杂交的捕获域，和
(ii)分子标签；
(g)使用基材捕获与延伸的核酸结合的诱饵寡核苷酸，所述基材包含与所述分子标签结合的试剂；和
(h)确定(i)所述空间条形码或其互补物的全部或部分序列，和(ii)所述延伸的核酸的全部或部分序列，并使用(i)和(ii)所确定的序列识别所述生物样品中蛋白质的丰度和位置。
38.一种包含诱饵寡核苷酸和延伸的核酸的组合物，其中，所述诱饵寡核苷酸与所述延伸的核酸结合，
其中所述延伸的核酸包含(i)空间条形码或其互补物，和(ii)分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列；和
其中所述诱饵寡核苷酸包含分子标签，其中所述分子标签选自链霉亲和素、亲和素、生物素或荧光团。
39.如权利要求38所述的组合物，其中，所述诱饵寡核苷酸通过捕获域与延伸的核酸结合，所述捕获域与所述分析物、分析物衍生物或其互补物的全部或部分序列杂交。
40.如权利要求38或39所述的组合物，其包含与分子标签结合的试剂。
41.如权利要求40所述的组合物，其中，所述与分子标签结合的试剂包括蛋白质(例如，抗体)、核酸或小分子。
42.如权利要求40所述的组合物，其中，所述分子标签是生物素并且所述与分子标签结合的试剂是亲和素或链霉亲和素。
43.如权利要求38-42中任一项所述的组合物，其还包含基材，其中所述与分子标签特异性结合的试剂附接到所述基材。
44.如权利要求43所述的组合物，其中，所述基材是珠、孔或载玻片。
45.一种试剂盒，其包括：
包括多个捕获探针的阵列，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域；
多个诱饵寡核苷酸；和
用于进行权利要求1-4、10-13和19-36中任一项所述方法的说明书。
46.一种试剂盒，其包括：
多个分析物捕获剂，其中所述多个分析物捕获剂的分析物捕获剂包含分析物结合部分、分析物结合部分条形码和分析物捕获序列；
包括多个捕获探针的阵列，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含空间条形码和捕获域；
多个诱饵寡核苷酸；和
用于进行权利要求1、5-9、10、14-35和37中任一项所述方法的说明书。
47.如权利要求45或46所述的试剂盒，其还包括用于进行所述方法的试剂和/或酶。
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