JP7256748B2 - エラーが訂正された核酸配列決定への適用を伴う標的化核酸配列濃縮のための方法 - Google Patents
エラーが訂正された核酸配列決定への適用を伴う標的化核酸配列濃縮のための方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2017年3月23日に出願された米国仮特許出願第62/475,682号、および2017年10月23日に出願された、米国仮特許出願第62/575,958号の優先権を主張し、それらの開示は参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号R01 CA160674およびR01 CA181308、ならびに米国陸軍研究局から授与された助成金番号W911NF-15-2-0127の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語およびその他の用語の追加の定義は、明細書全体に記載されている。
<詳細な説明>
デュプレックス配列決定(DS)は、二本鎖核酸分子からエラーが訂正されたDNA配列を生成する方法であり、元は国際特許公開第WO2013/142389号および米国特許第9,752,188号に記載されており、それらの両方は、それらの全体が参照により組み込まれる。図1A~1Cに示されるように、および本技術の特定の態様では、DSを使用して、個々のDNA分子の両方の鎖を独立して配列決定し、誘導体配列読取がMPS中に同一の二重鎖核酸親分子に由来するものとして認識できるが、配列決定後に識別可能な実体として互いに区別されるようにすることができる。デュプレックスコンセンサス配列(DCS)として知られる元の二本鎖核酸分子のエラーが訂正された配列を取得する目的で、各鎖から得られた配列読取を比較する。DSのプロセスにより、元の二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖が、DCSを形成するために使用される生成された配列データ中に表されるかどうかを確認することができる。
いくつかの実施形態では、提供された方法は、エラー訂正のための分子バーコードの使用と互換性のあるPCRベースの標的化濃縮戦略を提供する。図4は、本技術の一実施形態による、配列決定のためのリンクしたテンプレートの分離PCR(「SPLiT-DS」)方法のステップを利用する配列決定濃縮戦略の概念図である。図4を参照すると、および一実施形態では、SPLiT-DSアプローチは、上記と同様の方法で、および標準的なDSライブラリー構築プロトコールに関して(例えば、図1Bに示されているように)、分子バーコードによって断片化二本鎖核酸材料(例えば、DNA試料から)を標識化(例えば、タグ付け)することで始めることができる。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸材料は断片化されている場合がある(例えば、無細胞DNA、損傷したDNAなど)が、他の実施形態では、様々なステップは、超音波処理などの機械的せん断、または本明細書でさらに説明するような他のDNA切断方法を使用した核酸材料の断片化を含むことができる。断片化された二本鎖核酸材料の標識の態様には、特定の用途で必要な場合、末端修復および3’-dA-テーリングが含まれ、その後に二本鎖核酸断片とSMIを含むDSアダプターがライゲーションされる(図4、ステップ1)。他の実施形態では、SMIは、元の核酸分子の両方の鎖からの情報を一意的に関連付けるための内因性または外因性および内因性配列の組み合わせであり得る。アダプター分子を二本鎖核酸材料にライゲーションした後、方法は増幅(例えば、PCR増幅、ローリングサークル増幅、多置換増幅、等温増幅、ブリッジ増幅、表面結合増幅など)を続けることができる(図4、ステップ2)。
様々な実施形態によれば、提供される方法および組成物は、核酸材料の各鎖上に1つ以上のSMI配列を含む。SMIは、二本鎖核酸分子から生じる一本鎖の各々によって独立して運ぶことができ、配列決定後に、各鎖の誘導体増幅産物が同一の元の実質的に固有の二本鎖核酸分子に由来するものとして認識できる。いくつかの実施形態では、SMIは追加の情報を含むことができ、および/または当業者によって理解されるような分子識別機能が有用な他の方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、SMI要素は、核酸材料へのアダプター配列ライゲーションの前、実質的に同時に、または後に組み込むことができる。
いくつかの実施形態では、二本鎖核酸材料の各鎖は、標的二本鎖核酸材料を形成する2つの一本鎖核酸の増幅産物を、配列決定後に互いに実質的に区別可能にする要素をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、SDEは、配列決定アダプター内に含まれる非対称プライマー部位であり得るか、それを含み得、または他の配置では、少なくとも1つの位置がプライマー配列内ではなくアダプター配列に導入され得、第1の鎖の標的核酸配列複合体の標的核酸配列複合体の第2の鎖のヌクレオチド配列中の少なくとも1つの位置が、増幅および配列決定後に互いに異なるようにされる。他の実施形態では、SDEは、標準的なヌクレオチド配列A、T、C、GまたはUとは異なるが、2つの増幅および配列決定された分子における少なくとも1つの標準的なヌクレオチド配列の差に変換される2つの鎖間の別の生化学的非対称性を含み得る。さらに別の実施形態では、SDEは、増幅前に2本の鎖を物理的に分離する手段であり得るか、または含み得、第1の鎖標的核酸配列および第2の鎖標的核酸配列からの誘導体増幅産物は、2つの誘導体増幅産物間の区別を維持するために互いに実質的な物理的分離中に維持される。第1および第2の鎖を区別することを可能にするSDE機能を提供するための他のそのような配置または方法論が利用されてもよい。
様々な配置において、SMI(例えば、分子バーコード)、SDE、プライマー部位、フローセル配列、および/または他の特徴を含むアダプター分子は、本明細書に開示される多くの実施形態での使用が企図される。いくつかの実施形態では、提供されるアダプターは、以下の特性の少なくとも1つを有するPCRプライマーに相補的または少なくとも部分的に相補的な1つ以上の配列(例えば、プライマー部位)であり得るか、それらを含み得る:1)高い標的特異性、2)多重化できる、3)堅牢で最小限にバイアスのある増幅を示す。
いくつかの実施形態では、以下の特性の少なくとも1つを有する1つ以上のPCRプライマー:1)高い標的特異性、2)多重化できる、3)堅牢で最小限にバイアスのある増幅を示すが、本技術の態様による、様々な実施形態での使用に企図される。多くの先行研究および市販製品は、従来のPCR-CEのこれらの基準のいくつかを満たすプライマー混合物を設計した。しかしながら、これらのプライマー混合物は、MPSでの使用に必ずしも最適ではないことに留意されたい。実際、高度に多重化されたプライマー混合物の開発は、困難で時間のかかるプロセスである。便利なことに、IlluminaとPromegaの両方が、Illuminaプラットフォーム用のマルチプレックス適合プライマー混合物を最近開発し、様々な標準および非標準のSTRおよびSNP遺伝子座の堅牢かつ効率的な増幅を示している。これらのキットは、配列決定の前にPCRを使用して標的領域を増幅するため、ペアエンド配列データの各読取の5’末端は、DNAの増幅に使用されるPCRプライマーの5’末端に対応する。いくつかの実施形態では、提供される方法および組成物には、均一な増幅を保証するために設計されたプライマーが含まれ、これには、様々な反応濃度、融解温度、二次構造、およびプライマー内/プライマー間相互作用の最小化が必要になる場合がある。MPS用途のための高度に多重化されたプライマー最適化のための多数の技術が説明されている。特に、これらの技術は、当該技術分野でよく説明されているように、ampliseq法としてしばしば知られている。
提供される方法および組成物は、様々な実施形態において、核酸材料(またはその一部、例えば特定の標的領域または座位)が増幅されて増幅された核酸材料(例えば、いくつかの数の増幅産物)を形成する少なくとも1つの増幅ステップを使用するか、またはその使用である。いくつかの実施形態では、提供される方法には、増幅された核酸材料を、例えば、第1および第2の試料に分離するステップが含まれる。
図6~図9Bは、本技術の追加の実施形態による様々なSPLiT-DS方法のステップの概念図である。上述のように、および図4-6を参照して、SPLiT-DSに関連する方法のステップは、SMIおよび複数の試料に分離できる増幅の第1の回後の非対称プライマー部位(例えば、IlluminaP5およびP7プライマーに関する、図6)を含む追加のアダプター配列でタグ付けされた第1および第2の鎖増幅産物(例えば、α、α’、β、β’、図6)を有する増幅された核酸材料をもたらす。図7は、ネステッドPCR反応が、別個の反応試料(例えば、チューブ)中の元の核酸分子のトップおよびボトム鎖の濃縮された増幅を提供できる後続のステップを示す。図7に示すように、所望の増幅産物の濃縮に加えて、いくつかの望ましくない増幅産物およびその後の配列決定読取が生成され得る。したがって、およびいくつかの実施形態では、効率が低下する場合がある(例えば、SPLiT-DSで使用するための所望の産物のパーセントは、SPLiT-DSプロトコールでは有用でない産物に比べて低い場合がある)。
特定の用途では、核酸切断点が標的特異的プライマーに近づくことができず、短い断片または完全に欠落した領域が生じる可能性があるため、標的化領域または配列は配列決定が困難な場合がある。例えば、循環腫瘍DNAまたは循環胎児DNAなどのランダムにせん断されたDNAまたは循環無細胞DNA(cfDNA)の試料には、取得できない標的配列を有する場合がある(例えば、配列決定読取で検出/または包含されない)。いくつかの実施形態では、提供される方法は、標的配列のスタガー(staggered)部分に相補的な複数の標的プライマーの使用などにより、標的配列内の複数の領域を標的化することにより、そのような課題を克服することができる(例えば、各プライマーが標的配列の異なる領域を標的化する)。短い断片に関連する課題を回避するために、そして一実施形態では、最適な配列決定に典型的に望ましくなり得るよりも大きな断片にDNAをせん断することができる。図10は、本技術のさらに別の実施形態による、より長い核酸分子の二重鎖コンセンサス配列を生成するための複数の標的化プライマーを使用するSPLiT-DS法のステップの概念図である。
いくつかの実施形態では、配列決定プロセスの効率、精確さ、および/または速度を改善するために、核酸材料を処理することが有利である。本技術のさらなる態様によれば、例えば、DSおよび/またはSPLiT-DSの効率は、標的化核酸の断片化によって増強され得る。古典的に、核酸(例えば、ゲノム、ミトコンドリア、プラスミドなど)の断片化は、物理的なせん断(例えば、超音波処理)またはDNAホスホジエステル結合を切断するために酵素カクテルを利用するやや非配列特異的な酵素的アプローチのいずれかによって達成される。上記のいずれかの方法の結果は、無傷の核酸材料(例えば、ゲノムDNA(gDNA))がランダムまたは半ランダムのサイズの核酸断片の混合物に減少された試料である。これらのアプローチは効果的であるが、可変サイズの核酸断片を生成し、増幅バイアス(例えば、短い断片は長い断片よりもPCR増幅し、ポロニー形成中にクラスターがより容易に増幅する傾向がある)および不均一な配列決定の深度をもたらし得る。例えば、図11Aは、核酸インサートのサイズと増幅後に生じるファミリーサイズとの関係をプロットしたグラフである。図11Aに示すように、より短い断片は優先的に増幅する傾向があるため、これらのより短い断片のそれぞれのより多くのコピーが生成および配列決定され、これらの領域の不均衡なレベルの配列決定の深度が提供される。さらに、より長いフラグメントでは、配列決定読取の限界間(またはペアエンド配列決定読取の末端間)のDNAの一部を調査できず、ライゲート、増幅、および捕捉に成功したにもかかわらず「暗い」である(図11B)。同様に、短い読取の場合、およびペアエンド配列決定を使用するとき、両方の読取から分子の中央で同一の配列を読み取ることで、冗長な情報が得られ、費用効率が低くなる(図11B)。ランダムまたは半ランダムな核酸断片化は、ハイブリッド捕捉のベイト鎖と相補性または相補性が低下している可能性のある断片を生成する標的分子の予測不可能な切断点をもたらし、それにより標的捕捉効率を低下させる。ランダムまたは半ランダムな断片化はまた、目的の配列を破壊、およびまたはライブラリーの調製の他の段階で失われる非常に小さいまたは非常に大きい断片をもたらし、データの収量と効率を低下させる可能性がある。
様々な制限エンドヌクレアーゼ(すなわち、酵素)のいずれかを使用して、実質的に均一な長さの核酸材料を提供できることが特に考えられている。一般に、制限酵素は通常、特定の細菌/他の原核生物によって産生され、DNAの特定のセグメントの特定の配列で、その近くで、またはその間を切断する。
標的化エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9またはCpf1などのCRISPR関連リボ核タンパク質複合体、ホーミングヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、megaTALヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、および/またはその誘導体)を使用して、配列決定用途のためにそのような標的化部分を濃縮する目的で、核酸材料の標的化部分を選択的に切断および切除することができる。いくつかの実施形態では、例えば、強化された熱安定性、耐塩性、および/またはpH耐性を提供するためのアミノ酸置換を有するなど、標的化エンドヌクレアーゼを修飾することができる。他の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、ビオチン化され、ストレプトアビジンと融合され、および/または他の親和性に基づいた(例えば、バイト/プレイ)技術を組み込んでもよい。特定の実施形態では、標的化エンドヌクレアーゼは、改変された認識部位特異性を有し得る(例えば、改変されたPAM部位特異性を有するSpCas9バリアント)。本明細書では、CRISPRベースの標的化エンドヌクレアーゼをさらに説明して、標的化エンドヌクレアーゼの使用のさらに詳細な非限定的な例を提供する。そのような標的ヌクレアーゼ周辺の命名法は流動的であることに留意されたい。本明細書の目的のために、「CRISPERベース」という用語を使用して、一般に、切断される核酸配列を再定義するためにその配列を修飾できる核酸配列を含むエンドヌクレアーゼを意味する。Cas9とCPF1は現在使用されているこのような標的化エンドヌクレアーゼの例であるが、自然界の様々な場所に存在するものがさらに多くあり、このような標的化された容易に調整可能なヌクレアーゼの様々な種類が今後数年間で急速に増加すると予想される。同様に、これらの酵素の特性を強化または改変するための、これらの酵素の複数の改変バリアントが利用可能になりつつある。本明細書では、本明細書に明示的に記載されていないか、またはまだ発見されていない実質的に機能的に類似の標的化エンドヌクレアーゼの使用を明示的に企図し、記載された開示と同様の目的を達成する。
本技術のさらなる態様は、プログラム可能なエンドヌクレアーゼCRISPR/Cas9を使用して目的の領域を濃縮する方法に関する。特に、CRISPR/Cas9(または他のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ)を使用して、1つ以上の目的の配列領域を選択的に切除でき、切除された標的領域は1つ以上の所与の長さになるように設計されているため、DSおよびSPLiT-DSなどの配列決定用途のためのライブラリーの調製前にサイズ選択を可能にする。これらのプログラム可能なエンドヌクレアーゼは、単独で、または制限エンドヌクレアーゼなどの他の形態の標的化ヌクレアーゼと組み合わせて使用することができる。CRISPR-DSと呼ばれるこの方法は、非常に高度のオンターゲット濃縮を可能にし(後続のハイブリッド捕捉ステップの必要性を減らすことができる)、時間とコストを大幅に削減し、変換効率を高めることができる。図12A~12Dは、本技術の一実施形態によるCRISPR-DS法のステップの概念図である。例えば、CRISPR/Cas9を使用して、標的配列内の1つ以上の特定の部位(例えば、PAM部位)を切断できる(図12A;この例ではTP53標的領域)。図12Bは、SPRI/Ampureビーズおよび磁石精製を使用して切除された標的部分を単離して、所与のより短い断片を残しながら高分子量DNAを除去する1つの方法を示す。他の実施形態では、ゲル電気泳動、ゲル精製、液体クロマトグラフィー、サイズ排除精製、およびろ過精製法を含むがこれらに限定されない様々なサイズ選択方法を使用して、所与の長さの切除部分を望ましくないDNA断片および他の高分子量ゲノムDNA(該当する場合)から分離することができる。サイズ選択後、CRISPR-DS法には、Aテーリング(CRISPR/Cas9切除により平滑末端が残る)、DSアダプターのライゲーション(図12C)、二重鎖増幅(図12D)、各鎖の配列決定および二重鎖コンセンサス配列(図12D)の生成前の捕捉ステップおよび指標増幅(例えばPCR)を含む、DSメソッドのステップ(例えば、図12Eを参照されたい)と一致するステップが含まれる。図12Eで明らかなワークフロー効率の改善に加えて、CRISPR-DSは高効率の増幅および配列決定ステップに最適な断片長を提供する(図12F)。
Target description:標的の説明、Name:名称、Sequence plus pam sige:配列+pam部位、
Position start:開始位置、Position end:収量位置、Zhang score:Zhangスコア
upstream of exon 11:エクソン11の上流
downstream of exon 11:エクソン11の下流
upstream of exon 10:エクソン10の上流
downstream of exon 10:エクソン10の下流
upstream of exon 9-8:エクソン9-8の上流
downstream of exon 9-8:エクソン9-8の下流
downstream of exon 7:エクソン7の下流
upstream of exon 6-5:エクソン6-5の上流
downstream of exon 6-5:エクソン6-5の下流
upstream of exon 4-3:エクソン4-3の上流
downstream of exon 4-3:エクソン4-3の下流
downstream of exon2:エクソン2の下流
いくつかの実施形態では、提供される方法は、核酸材料を提供するステップ、所与の長さの標的領域が残りの核酸材料から分離されるように標的エンドヌクレアーゼ(例えば、リボ核タンパク質複合体)により核酸材料を切断するステップと、切断された標的領域を分析することと、を含み得る。いくつかの実施形態では、提供される方法は、少なくとも1つのSMIおよび/またはアダプター配列を、所与の長さの切断された標的領域の5’または3’末端のうちの少なくとも1つにライゲートすることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、分析することは、定量および/または配列決定であり得るか、またはそれを含み得る。
本開示の一態様によれば、いくつかの実施形態は、非常に少量の核酸材料から高品質の配列決定情報を提供する。いくつかの実施形態では、提供される方法および組成物は、最大で以下の量の出発核酸材料とともに使用することができる:約1ピコグラム(pg)、10pg、100pg、1ナノグラム(ng)、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、または1000ng。いくつかの実施形態では、提供される方法および組成物は、最大で1分子コピーまたはゲノム相当、10分子コピーまたはそのゲノム相当、100分子コピーまたはそのゲノム相当、1,000分子コピーまたはそのゲノム相当、10,000分子コピーまたはそのゲノム相当、100,000分子コピーまたはそのゲノム相当、または1,000,000分子コピーまたはそのゲノム相当の投入量の核酸材料とともに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、最大で1,000ngの核酸材料が特定の配列決定プロセスに最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態では、最大で100ngの核酸材料が特定の配列決定プロセスに最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態では、最大で10ngの核酸材料が特定の配列決定プロセスに最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態では、最大で1ngの核酸材料が特定の配列決定プロセスに最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態では、最大で100pgの核酸材料が特定の配列決定プロセスに最初に提供される。例えば、いくつかの実施形態では、最大で1pgの核酸材料が特定の配列決定プロセスに最初に提供される。
種類
様々な実施形態に従って、様々な核酸材料のうちのいずれかが使用され得る。いくつかの実施形態では、核酸材料は、標準的な糖リン酸骨格内のポリヌクレオチドに対する少なくとも1つの修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸材料は、核酸材料のいずれかの塩基内に少なくとも1つの修飾を含んでもよい。例えば、非限定的な例として、いくつかの実施形態では、核酸材料は、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)のうちの少なくとも1つであるか、またはそれを含む。
様々な実施形態によれば、核酸材料は、特定の提供される方法または組成物が使用される用途に応じて、特定のステップの前、実質的に同時、または後に1つ以上の修飾を受けてもよい。
核酸材料は、任意の様々な供給源に由来し得ると考えられる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸材料は、少なくとも1つの対象(例えば、ヒトもしくは動物の対象)または他の生物学的供給源からの試料から提供される。いくつかの実施形態では、バンク寄託/保管された試料から核酸材料が提供される。いくつかの実施形態では、試料が、血液、血清、汗、唾液、脳脊髄液、粘液、子宮洗浄液、膣スワブ、鼻腔スワブ、口腔スワブ、組織擦過検体、髪の毛、指紋、尿、便、硝子体液、腹膜洗浄液、唾液、気管支洗浄液、口腔洗浄液、胸膜洗浄液、胃洗浄液、胃液、胆汁、膵管洗浄液、胆管洗浄液、総胆管洗浄液、胆嚢液、滑液、感染性創傷、非感染性創傷、考古学的な試料、法医学試料、水試料、組織試料、食品試料、バイオリアクター試料、植物試料、爪擦過検体、精液、前立腺液、卵管洗浄液、無細胞核酸、細胞内の核酸、メタゲノミクス試料、移植された異物の洗浄液、鼻洗浄液、腸液、上皮擦過検体、上皮洗浄液、組織生検、剖検試料、剖検試料、臓器試料、人物同定試料、人工的に産生された核酸試料、合成遺伝子試料、核酸データ貯蔵試料、腫瘍組織、およびそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つであるか、またはそれを含む。他の実施形態では、試料は、微生物、植物ベースの生物、または収集された環境試料(例えば、水、土壌、考古学など)のうちの少なくとも1つであるか、またはそれを含む。
本明細書に記載されるとき、提供される方法および組成物は、様々な目的のいずれかおよび/または様々なシナリオのいずれかで使用されてもよい。以下は、特定の説明のみを目的とした非限定的な用途および/またはシナリオの例である。
法医学DNA分析へのこれまでのアプローチは、PCR増幅産物のキャピラリー電気泳動分離にほとんど完全に依存して、短いタンデムリピート配列の長さの多型を識別する。このタイプの分析は、1991年に導入されて以来、非常に価値があることが証明されている。それ以来、いくつかの出版物は標準化されたプロトコールを導入し、世界中の研究室での使用を検証し、多くの異なる人種でのその使用を詳述し、miniSTRなどのより効率的なアプローチを導入してきた。
しかしながら、ごく最近まで、読取の長さがSTR座位よりも大幅に短く、長さに基づく遺伝子型を判定することができないため、これらのプラットフォームの完全な力はは法医学に限定されていた。当初、Roche 454プラットフォームなどのパイロシーケンサーは、コアSTR座位を配列決定するのに十分な読取長を持つ唯一のプラットフォームであった。しかしながら、競合する技術の読取の長さが増加しているため、法医学用途に対する有用性が発揮されている。多くの研究により、STR座位のMPS遺伝子型決定の可能性が明らかになっている。全体として、これらの全ての研究の全般的な結果は、プラットフォームに関係なく、STRを正常に分類できるため、損傷した法医学試料からでもCE分析に匹敵する遺伝子型を生成できることである。
患者の層別化は、一般に1つ以上の治療に関連しない要因に基づいて患者を分割することを指し、医学界で大きな関心を集めているトピックである。この関心の多くは、特定の治療薬候補が、部分的に試験中の患者間のこれまで認識されていなかった相違に起因してFDAの承認を取得できなかったという事実に起因する可能性がある。これらの相違は、1つの群の患者と1つ以上の他の群の患者で、治療薬の代謝が異なる、または副作用が生じるまたは悪化する1つ以上の遺伝的相違であり得るか、またはそれを含み得る。場合によっては、これらの相違の一部または全てが、同一の遺伝的プロファイルを示さない他の患者とは異なる治療薬への反応をもたらす、患者の1つ以上の異なる遺伝子プロファイルとして検出され得る。
ゲノム研究における次世代シーケンシング(NGS)の出現により、前例のない詳細を備えた腫瘍の変異状況の特性評価が可能になり、診断、予後、および臨床的に処置し得る変異のカタログ化をもたらした。まとめると、これらの変異は、個別化医療によるがん転帰の改善および潜在的な早期がんの検出とスクリーニングに大きな期待を抱かせる。本開示の前に、この分野における重大な制限は、これらの変異が低頻度で存在するときにこれらの変異を検出できないことであった。臨床生検の多くはしばしば、大部分が正常細胞で構成されており、DNA変異に基づくがん細胞の検出は、現代のNGSにとっても技術的な課題である。数千の正常なゲノムの中で腫瘍の変異を同定することは、干し草の山から針を見つけることに類似しており、これまでに知られている方法を超えるレベルの配列決定の精確さを必要とする。
インビトロ修復キットを使用したDNA損傷の除去は、NGSでの誤ったバリアントコールの数を減らすことが示されている。しかしながら、全ての変異原性病変がこれらの酵素によって認識されるわけではなく、修復の忠実度も完全ではない。重要な牽引力を得た別のアプローチは、個々のDNA断片から生じるPCRの重複を利用してコンセンサスを形成することである。「分子バーコード付け」と呼ばれる、PCRの前または最中に固有のランダムなせん断ポイントまたは外因性に導入されたランダムなDNA配列を共有する読取がグループ化され、最も一般的な配列が保持される。Kindeらは、一本鎖分子バーコード付けを使用して、バーコード配列決定を共有するPCRコピーをグループ化し、コンセンサスを形成することにより、配列決定のエラー率を低減するSafeSeqSによってこの概念を導入した。このアプローチにより、平均検出限界は0.5%になり、転移癌におけるctDNAの検出に成功したが、早期癌の約40%でのみ成功している。この検出限界は、MAFで約0.01%の低い変異を検出できるデジタルドロップレットPCR(ddPCR)で大幅に改善できる。しかしながら、変異は事前に知られている必要があり、これは複数のがんの用途を深刻に制限する。さらに、一度に試験できるのは1~4個の変異のみであり、ハイスループットスクリーニングが不可能である(表2)。
表2
本発明の具体的な実施態様をいくつか以下に例示する。
〔1〕1つ以上の二本鎖核酸分子を含む二本鎖核酸材料を提供することであって、各々の二本鎖核酸分子が、各々の鎖上の単一分子識別子配列と前記核酸分子の5’末端および/または3’末端のうちの少なくとも1つの上のアダプターとを含み、各々の核酸分子に対して、第1のアダプター配列が前記核酸分子の第1の鎖と関連し、第2のアダプター配列が前記核酸分子の第2の鎖と関連する、提供することと、
前記核酸材料を増幅することと、
前記増幅した核酸材料を、第1の試料と第2の試料とに分離することと、
前記第1のアダプター配列に特異的なプライマーの使用を通じて前記第1の試料中の前記第1の鎖を増幅して、第1の核酸産物をもたらすことと、
前記第2のアダプター配列に特異的なプライマーの使用を通じて前記第2の試料中の前記第2の鎖を増幅して、第2の核酸産物をもたらすことと、
前記第1の核酸産物および第2の核酸産物の各々を配列決定することと、
前記第1の核酸産物の配列と前記第2の核酸産物の配列とを比較することと、を含む、方法。
〔2〕前記核酸材料が、二本鎖DNAおよび二本鎖RNAのうちの少なくとも1つであるか、またはそれを含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕前記提供するステップが、
二本鎖核酸材料を少なくとも1つの縮重または半縮重バーコード配列にライゲートして、二本鎖核酸分子バーコード複合体を形成することを含み、前記バーコード配列が、前記単一分子識別子配列を含む、前記〔1〕または前記〔2〕に記載の方法。
〔4〕前記単一分子識別子配列が、前記二本鎖核酸分子を一意的に標識する、縮重もしくは半縮重バーコード配列、前記核酸材料の1つ以上の核酸断片末端、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つである、前記〔1〕または前記〔2〕に記載の方法。
〔5〕前記単一分子識別子配列が、内因性のせん断点または前記せん断点に位置的に関連する可能性のある内因性の配列を含む、前記〔1〕または前記〔2〕に記載の方法。
〔6〕前記核酸材料を増幅することが、前記第1の鎖に由来する複数の増幅産物と、前記第2の鎖に由来する複数の増幅産物とを生成することを含む、前記〔1〕~〔5〕のいずれか1項に記載の方法。
〔7〕前記第1の試料中の前記核酸材料を増幅することが、
前記第1のアダプター配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドと目的の標的配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドとを使用して、前記単一分子識別子配列が少なくとも部分的に維持されるように、元の二本鎖核酸分子からの単一の核酸鎖に由来する核酸材料を増幅することを含む、前記〔1〕~〔6〕のいずれか1項に記載の方法。
〔8〕前記第2の試料中の前記核酸材料の前記増幅することが、
前記第2のアダプター配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドと目的の標的配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドとを使用して、前記単一分子識別子配列が少なくとも部分的に維持されるように、元の二本鎖核酸分子からの単一の核酸鎖に由来する核酸材料を増幅することを含む、前記〔1〕~〔7〕のいずれか1項に記載の方法。
〔9〕前記核酸材料の少なくとも一部が損傷している、前記〔1〕~〔8〕のいずれか1項に記載の方法。
〔10〕前記損傷が、酸化、アルキル化、脱アミノ化、メチル化、加水分解、ヒドロキシル化、ニッキング、鎖内架橋、鎖間架橋、平滑末端鎖切断、付着末端二重鎖切断、リン酸化、脱リン酸化、SUMO化、グリコシル化、脱グリコシル化、プトレシニル化、カルボキシル化、ハロゲン化、ホルミル化、一本鎖ギャップ、熱による損傷、乾燥による損傷、紫外線暴露による損傷、ガンマ線による損傷、X線による損傷、電離放射線による損傷、非電離放射線による損傷、重粒子線による損傷、核崩壊による損傷、ベータ線による損傷、アルファ線による損傷、中性子線による損傷、陽子線による損傷、宇宙線による損傷、高pHによる損傷、低pHによる損傷、反応性酸化種による損傷、フリーラジカルによる損傷、過酸化物による損傷、次亜塩素酸塩による損傷、ホルマリンまたはホルムアルデヒドなどの組織固定による損傷、反応性鉄による損傷、低イオン状態による損傷、高イオン状態による損傷、緩衝されていない状態による損傷、ヌクレアーゼによる損傷、環境暴露による損傷、火災による損傷、機械的ストレスによる損傷、酵素分解による損傷、微生物による損傷、分取機械的せん断による損傷、分取酵素による断片化による損傷、生体内で自然に生じた損傷、核酸抽出中に生じた損傷、配列決定ライブラリーの調製中に生じた損傷、ポリメラーゼによって導入された損傷、核酸の修復中に導入された損傷、核酸の末端処理中に生じた損傷、核酸ライゲーション中に生じた損傷、配列決定中に生じた損傷、DNAの機械的取り扱いにより生じた損傷、ナノポアを通過する際に生じた損傷、生物の老化の一部として生じた損傷、個体の化学物質への暴露の結果として生じた損傷、変異原性物質により生じた損傷、発がん性物質により生じた損傷、染色体異常誘発物質により生じた損傷、酸素暴露による生体内炎症損傷により生じた損傷、1つ以上の鎖切断による損傷、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つであるか、またはそれを含む、前記〔9〕に記載の方法。
〔11〕前記核酸材料が、対象または生物を起源とする1つ以上の二本鎖核酸分子を含む試料により提供される、前記〔1〕~〔10〕のいずれか1項に記載の方法。
〔12〕前記試料が、体組織、生検、皮膚試料、血液、血清、血漿、汗、唾液、脳脊髄液、粘液、子宮洗浄液、膣スワブ、パップスメア、鼻腔スワブ、口腔スワブ、組織擦過検体、髪の毛、指紋、尿、便、硝子体液、腹膜洗浄液、唾液、気管支洗浄液、口腔洗浄液、胸膜洗浄液、胃洗浄液、胃液、胆汁、膵管洗浄液、胆管洗浄液、総胆管洗浄液、胆嚢液、滑液、感染性創傷、非感染性創傷、考古学的な試料、法医学試料、水試料、組織試料、食品試料、バイオリアクター試料、植物試料、細菌試料、原生動物のサンプル、真菌試料、動物試料、ウイルス試料、複数の生体の試料、爪擦過検体、精液、前立腺液、膣液、膣スワブ、卵管洗浄液、無細胞核酸、細胞内の核酸、メタゲノミクス試料、移植された異物の洗浄液またはスワブ、鼻洗浄液、腸液、上皮擦過検体、上皮洗浄液、組織生検、剖検試料、剖検試料、臓器試料、人物同定試料、非ヒト同定試料、人工的に産生された核酸試料、合成遺伝子試料、バンクに寄託または保管された試料、腫瘍組織、胎児試料、臓器移植試料、微生物培養試料、核DNA試料、ミトコンドリアDNA試料、葉緑体DNA試料、アピコプラストDNA試料、細胞小器官試料、およびそれらの任意の組み合わせであるか、またはそれを含む、前記〔11〕に記載の方法。
〔13〕前記核酸材料が、実質的に均一またはほぼ均一な長さの核酸分子を含む、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の方法。
〔14〕前記実質的に均一な長さが、約1~約1,000,000塩基である、前記〔13〕に記載の方法。
〔15〕前記核酸材料が、標的化エンドヌクレアーゼによって実質的に均一またはほぼ均一の長さの核酸分子に切断されている、前記〔13〕または前記〔14〕に記載の方法。
〔16〕前記核酸材料が、1つ以上の実質的に既知のサイズ範囲内の長さを有する核酸分子を含む、前記〔1〕~〔12〕のいずれか1項に記載の方法。
〔17〕前記核酸分子が1~約1,000,000塩基、約10~約10,000塩基、約100~約1000塩基、約100~約600塩基、約100~約500塩基、またはそれらのいくつかの組み合わせである、前記〔16〕に記載の方法。
〔18〕前記方法が、前記提供するステップの前に、
実質的に既知の長さの標的核酸断片が形成されるように、1つ以上の標的化エンドヌクレアーゼにより前記核酸材料を切断することと、
前記実質的に既知の長さに基づいて、前記標的核酸断片を単離することと、を含む、前記〔1〕~〔17〕のいずれか1項に記載の方法。
〔19〕前記1つ以上の標的化エンドヌクレアーゼが、リボ核タンパク質、Cas酵素、Cas9様酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記〔18〕に記載の方法。
〔20〕前記1つ以上の標的化エンドヌクレアーゼが、Cas9もしくはCPF1またはそれらの誘導体を含む、前記〔18〕または前記〔19〕に記載の方法。
〔21〕前記提供するステップの前に、前記アダプターを前記標的核酸断片にライゲートすることをさらに含む、前記〔18〕~〔20〕のいずれか1項に記載の方法。
〔22〕前記標的核酸断片が対象または生物を起源とする、前記〔18〕~〔21〕のいずれか1項に記載の方法。
〔23〕前記標的核酸断片が少なくとも部分的に人工的に合成されている、前記〔18〕~〔21〕のいずれか1項に記載の方法。
〔24〕前記核酸材料を切断することが、実質的に既知の長さの2つ以上の標的核酸断片が形成されるように、前記核酸材料を1つ以上の標的化エンドヌクレアーゼによって切断することを含む、前記〔18〕~〔23〕のいずれか1項に記載の方法。
〔25〕前記標的核酸断片が、異なる実質的に既知の長さである、前記〔24〕に記載の方法。
〔26〕前記標的核酸断片がそれぞれ、ゲノム中の1つ以上の異なる位置からの目的のゲノム配列を含む、前記〔24〕に記載の方法。
〔27〕前記標的核酸断片がそれぞれ、前記核酸材料内の実質的に既知の領域からの標的配列を含む、前記〔24〕に記載の方法。
〔28〕前記実質的に既知の長さに基づいて前記標的核酸断片を単離することが、ゲル電気泳動、ゲル精製、液体クロマトグラフィー、サイズ排除精製、濾過、またはSPRIビーズ精製による前記標的核酸断片の濃縮を含む、前記〔18〕~〔27〕のいずれか1項に記載の方法。
〔29〕少なくとも1つの増幅するステップが、少なくとも1つの非標準ヌクレオチドであるか、またはそれを含む少なくとも1つのプライマーを含む、前記〔1〕~〔28〕のいずれか1項に記載の方法。
〔30〕少なくとも1つのアダプター配列が、少なくとも1つの非標準ヌクレオチドであるか、またはそれを含む、前記〔1〕~〔29〕のいずれか1項に記載の方法。
〔31〕前記非標準ヌクレオチドが、ウラシル、メチル化ヌクレオチド、RNAヌクレオチド、リボースヌクレオチド、8-オキソ-グアニン、ビオチン化ヌクレオチド、デスチオビオチンヌクレオチド、チオール修飾ヌクレオチド、アクリダイト修飾ヌクレオチド iso-dC、iso dG、2’-O-メチルヌクレオチド、イノシンヌクレオチド ロックド核酸、ペプチド核酸、5メチルdC、5-ブロモデオキシウリジン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノプリンヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、5-ニトロインドールヌクレオチド、アデニル化ヌクレオチド、アジドヌクレオチド、ジゴキシゲニンヌクレオチド、Iリンカー、5’ヘキシニル修飾ヌクレオチド、5-オクタジイニルdU、光開裂性スペーサー、非光開裂性スペーサー、クリックケミストリー対応の修飾ヌクレオチド、蛍光色素、ビオチン、フラン、BrdU、フルオロ-dU、loto-dU、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、前記〔29〕または前記〔30〕に記載の方法。
〔32〕前記第1の核酸産物および第2の核酸産物の各々を配列決定することが、
前記第1の核酸産物中の複数の鎖の前記配列を比較して、第1の鎖のコンセンサス配列を決定することと、
前記第2の核酸産物中の複数の鎖の前記配列を比較して、第2の鎖のコンセンサス配列を決定することと、を含む、前記〔1〕~〔31〕のいずれか1項に記載の方法。
〔33〕前記第1の核酸産物の前記配列を、前記第2の核酸産物の前記配列と比較することが、前記第1の鎖のコンセンサス配列と前記第2の鎖のコンセンサス配列を比較して、エラーが訂正されたコンセンサス配列を提供することを含む、前記〔32〕に記載の方法。
〔34〕前記第1の核酸産物および第2の核酸産物の各々を配列決定することが、
前記第1の鎖の少なくとも1つを配列決定して、第1の鎖の配列読取を決定することと、
前記第2の鎖の少なくとも1つを配列決定して、第2の鎖の配列読取を決定することと、
前記第1の鎖の配列読取と前記第2の鎖の配列読取とを比較して、エラーが訂正された配列読取を生成することと、を含む、前記〔1〕~〔33〕のいずれか1項に記載の方法。
〔35〕前記エラーが訂正された配列読取が、前記第1の鎖の配列読取と前記第2の鎖の配列読取との間で一致するヌクレオチド塩基を含む、前記〔34〕に記載の方法。
〔36〕前記エラーが訂正された配列読取の特定の位置で生じる変動が真のバリアントとして同定される、前記〔34〕または前記〔35〕に記載の方法。
〔37〕前記第1の鎖の配列読取または前記第2の鎖の配列読取の一方のみの特定の位置で生じる変動が潜在的なアーティファクトとして同定される、前記〔34〕~〔36〕のいずれか1項に記載の方法。
〔38〕前記エラーが訂正された配列読取が、二本鎖標的核酸分子が由来する生物または対象における、がん、がんリスク、がん変異、がんの代謝状態、ミューテーターの表現型、発がん物質への暴露、毒素暴露、慢性炎症暴露、年齢、神経変性疾患、病原体、薬剤耐性バリアント、胎児分子、法医学に関連する分子、免疫学的に関連する分子、変異したT細胞受容体、変異したB細胞受容体、変異した免疫グロブリン遺伝子座、ゲノムのカタエギス部位、ゲノムの超変異部位、低頻度バリアント、サブクローンバリアント、少数の分子集団、混入源、核酸合成エラー、酵素修飾エラー、化学修飾エラー、遺伝子編集エラー、遺伝子治療エラー、核酸情報ストレージの断片、微生物の準種、ウイルスの準種、臓器移植、臓器移植拒絶、がん再発、治療後の残存がん、前がん状態、異形成状態、マイクロキメリズム状態、幹細胞移植状態、細胞療法状態、別の分子に付着した核酸標識、またはそれらの組み合わせを同定または特性評価するために使用される、前記〔34〕~〔36〕のいずれか1項に記載の方法。
〔39〕前記エラーが訂正された配列読取が、変異原性化合物または曝露を同定するために使用される、前記〔34〕~〔36〕のいずれか1項に記載の方法。
〔40〕前記エラーが訂正された配列読取が、発がん性化合物または曝露を同定するために使用される、前記〔34〕~〔36〕のいずれか1項に記載の方法。
〔41〕前記核酸材料が法医学試料に由来し、前記エラーが訂正された配列読取が法医学分析で使用される、前記〔34〕~〔36〕のいずれか1項に記載の方法。
〔42〕少なくとも1つの増幅するステップがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、前記〔1〕~〔41〕のいずれか1項に記載の方法。
〔43〕最大でも1000ngの核酸材料が最初に提供される、前記〔1〕~〔42〕のいずれか1項に記載の方法。
〔44〕最大でも10ngの核酸材料が最初に提供される、前記〔1〕~〔43〕のいずれか1項に記載の方法。
〔45〕前記第1の試料中の前記核酸材料を増幅することが、前記分離するステップの後、および前記第1の試料を前記増幅することの前に、前記核酸材料上に見られる第2のアダプター配列を破壊または崩壊することをさらに含む、前記〔1〕~〔44〕のいずれか1項に記載の方法。
〔46〕前記第2の試料中の前記核酸材料を増幅することが、前記分離するステップの後、および前記第2の試料を前記増幅することの前に、前記核酸材料上に見られる第1のアダプター配列を破壊または崩壊することをさらに含む、前記〔1〕~〔45〕のいずれか1項に記載の方法。
〔47〕前記破壊することが、酵素消化、少なくとも1つの複製阻害分子の含有、酵素的切断、一方の鎖の酵素的切断、両方の鎖の酵素的切断、切断または一方もしくは両方の鎖をもたらす酵素処理が後に続く修飾された核酸の取り込み、複製阻止ヌクレオチドの組み込み、連鎖停止剤の組み込み、光切断可能なリンカーの取り込み、ウラシルの取り込み、リボース塩基の取り込み、8-オキソ-グアニン付加物の組み込み、制限エンドヌクレアーゼの使用、標的化ヌクレアーゼの使用、およびそれらの任意の組み合わせの少なくとも1つを含む、前記〔45〕または前記〔46〕に記載の方法。
〔48〕増幅することが、ローリングサークル増幅、多置換増幅、等温増幅、ブリッジ増幅、または表面結合増幅を含む、前記〔1〕~〔47〕のいずれか1項に記載の方法。
〔49〕前記核酸材料を増幅することが、目的の配列に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド、および前記アダプターの領域に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含む、前記〔1〕~〔48〕のいずれか1項に記載の方法。
〔50〕前記核酸材料が、前記核酸材料の各々の鎖の5’末端および3’末端の各々にアダプターを含む、前記〔1〕~〔49〕のいずれか1項に記載の方法。
〔51〕前記核酸材料を増幅することが、前記第1のアダプター配列および前記第2のアダプター配列の領域に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含む、前記〔50〕に記載の方法。
〔52〕前記アダプターが、少なくとも部分的に非相補的であるか、または少なくとも1つの非標準塩基を含む少なくとも1つのヌクレオチド位置を含む、前記〔1〕~〔51〕のいずれか1項に記載の方法。
〔53〕前記アダプターが、約5個以上の自己相補型ヌクレオチドによって形成される単一の「U字型」オリゴヌクレオチド配列を含む、前記〔1〕~〔52〕のいずれか1項に記載の方法。
〔54〕二本鎖核酸材料を提供することであって、前記核酸材料が、標的化エンドヌクレアーゼによる切断の結果、約1~1,000,000塩基であり、前記核酸材料が、前記核酸材料の各々の鎖上の単一分子識別子配列と前記核酸材料の各々の鎖上の5’末端および3’末端のうちの少なくとも1つの上のアダプター配列とを含み、第1のアダプター配列が前記核酸材料の第1の鎖の5’末端または3’末端の1つの上に位置し、第2のアダプター配列が前記核酸材料の第2の鎖の反対の末端の上に位置し、前記第1の鎖と前記第2の鎖が、同一の二本鎖核酸分子を起源とする、提供することと、
前記核酸材料を増幅することと、
前記増幅した核酸材料を、第1の試料と第2の試料とに分離することと、
前記第1のアダプター配列に特異的なプライマーの使用を通じて前記第1の試料中の前記第1の鎖を増幅して、第1の核酸産物をもたらすことと、
前記第2のアダプター配列に特異的なプライマーの使用を通じて前記第2の試料中の前記第2の鎖を増幅して、第2の核酸産物をもたらすことと、
前記第1の核酸産物および第2の核酸産物の各々を配列決定することと、
前記第1の核酸産物の配列と前記第2の核酸産物の配列とを比較することと、を含む、方法。
〔55〕前記核酸材料が、2つ以上の供給源に由来する核酸材料を含む、前記〔1〕~〔54〕のいずれか1項に記載の方法。
SPLiT-DSは、デュプレックス配列決定エラー訂正(図4A)のための各鎖の分子バーコードの使用と互換性のあるPCRベースの標的濃縮戦略である。この例示的な実施形態では、SPLiT-DS分析を開始するために、1つ以上のアプローチを使用して1つ以上のDNA試料が断片化される(当技術分野で既知のこれまでに記載されたデュプレックス配列決定ライブラリー構築と同様)。断片化の後、最も一般的には末端修復と3’-dA-テーリングが行われ、続いて各DNA断片と縮重または半縮重二本鎖バーコードを含むT-テール付きDSアダプターとライゲートされる(図4、ステップ1)。代替的に、他のタイプのライゲーション突出、平滑末端ライゲーション、または国際特許公開第WO2017/100441号および米国特許第9,752,188号にこれまでに記載されたアダプターライゲーション化学を使用することができる。実質的に全てのデュエル適合DNA分子は、一本鎖アダプターテールのユニバーサルプライマー結合部位に特異的なプライマーを使用してPCR増幅され、各鎖に由来するDNA断片(「バーコード断片」)の複数のバーコードコピーをもたらす(図4、ステップ2)。反応副産物を除去した後、所与の試料を2つの別々のチューブに分割する(図4、ステップ3)(すなわち、試料を半分に分割し、各チューブが試料の内容の約半分を含む)。平均して、所与のバーコード断片のコピーの半分が各チューブに移されるが、試料の分割に伴うランダム性により、所与のバーコード断片の分布に分散が生じる可能性がある。このような分散を説明するために、超幾何分布(すなわち、置換なしでk個のバーコードコピーを選択する確率)をモデルとして使用して、各チューブが元の二重鎖の2本(つまり両方)のDNA鎖のそれぞれに由来する少なくとも1つのバーコード断片を含むということのかなり高い確率を達成するために必要な所与のバーコードのPCRコピーの最小数を決定する。超幾何モデルによると、ステップ1での4を超えるPCRサイクル(すなわち、2E4=16コピー/バーコード)により、各バーコード断片(各鎖から)が各チューブで少なくとも1回表れることが99%を超える確率を提供する可能性が高いと考えられる。これは、全てのシナリオで現実的ではないかもしれない均一でほぼ100%のPCR増幅効率を前提としているが、比較的低いインプットの高品質DNA試料(例えば、50uLのPCRあたり10ngのヒトゲノムDNA)での合理的な仮定である。試料を2本のチューブに分割した後、標的座位は、アダプター配列と目的の座位に特異的なプライマーを使用したマルチプレックスPCRで濃縮される(図4、ステップ4)。
本実施例は、短いタンデムリピート(STR)などのDNAの反復領域を遺伝子型決定する現在利用可能な方法が精確さと感度の改善から利益を得るという洞察に基づいている。本実施例は、「SPLiT-DS」アッセイ/プロトコールを作成するために、DSのための確立されたプロトコール(それ自体が「スタッター」を除去できる;図3B)を拡張および改善する。現在の例では、(1)マルチプレックスPCRで使用するためのプライマーの設計とその後の選択、(2)DNAライブラリーの調製を改善する方法、(3)例えば、減少するDNA量の使用などの提供された技術の精確さ、精度、感度、特異性の評価;(4)最終的なエラーが訂正されたデータの大幅に減少したスタッターの実証を実証した。
SPLiT-DS PCRプライマーは、好ましくは次の特性を持つように設計されている:1)高い標的特異性、2)多重化できる、3)堅牢で最小限にバイアスのある増幅を示す。従来のPCRキャピラリー電気泳動(PCR-CE)で使用するためのこれらの基準を満たす多くの既存のプライマー混合物が存在するが、MPSでは同一のプライマー混合物は信頼できない。この目的のために、利用可能なデータ(配列決定の前に標的座位を増幅する市販のキットを使用して取得した配列決定データからのマッピング座標(すなわち、ペアエンド配列決定データの各読取の5’端は、DNAを増幅するために使用されるPCRプライマーの5’端に対応する))は、この例で使用するためのプライマーを開発するために活用された。本明細書で説明する洞察とこれまでの実施例から得られたデータは、拡張CODISコア座位(CODIS20)に加えて、PentaD、PentaE、およびSE3329(簡潔に、別途示されない限り、これはまとめて単にCODIS座位と呼ばれる)の初期プライマーセットの設計を通知するために使用される。これまでに決定されたマッピング座標は、長さ、融解温度、濃度など、市販の(またはその他の)キットで使用されるプライマーに関する他の情報を提供しないため、本実施例でのプライマーの作成は、反応を多重化する前の、均一、堅牢、および特異的な増幅を達成する確率を最大にする設計に焦点を当てている。
SPLiT-DSのライブラリー調製プロトコールは、第1のPCRステップが完了するまで、デュプレックス配列決定プロトコールなどの既知の標準プロトコールに従う。本実施例は、本明細書で提供されるSPLiT-DS技術に特有の座位特異的PCRにおいて、特に、最初のデュプレックス配列決定PCRステップ後に生じるステップを改善することにより、このプロトコールを改善および拡張する。
一般的に使用される標準参照物質(SRM)DNAの精確さ、精度、感度、および特異性は、本明細書に記載される改善された技術の参照点として実施される。SPLiT-DSは、連続希釈(例えば、約50pgから約10ngの範囲内)を使用して、インプットDNAの量の減少(すなわち、感度)で実行される(例えば、アプローチの精確さと精度を評価する)。各DNAインプットに対して、少なくとも6つの異なるライブラリーが個別に調製される。配列決定およびエラー訂正(デュプレックス配列決定のSPLiT-DSバリアント用に特別に開発および設計された社内ソフトウェアを使用)後、STRait Razorを使用して以下についての精確さを評価する:(i)処理されたデータの遺伝子型決定、および/または(ii)各CODIS座位で「訂正」遺伝子型を示す読取の割合を決定(すなわち、標準化された試料から既知)。精度は、以下を決定することにより評価される:(i)ヘテロ接合座位の対立遺伝子包含率、(ii)座位間バランス、(iii)深度の変化、および/または(iv)スタッターパーセント(例えば、試料間の変化の定量化)。
本実施例はまた、外因性DNA(例えば、非ヒトDNAで混入されたヒトの法医学的DNA)による所与の試料の混入を検出するための現在利用可能なDNA評価方法の改善に焦点を当てている。SPLiT-DS分析は、混入DNA(マウス、イヌ、ウシ、トリ、Candida albicans、Escherichia coli、Staphylococcus aureusなど)の存在下でヒトDNA試料に対して行われる。分析には、10ngの混入DNAをスパイクした試料DNAが含まれ、次の比率で3回繰り返す:50:50、10:1、および100:1(混入物:試料DNA、重量比で)、ならびに100:0対照(すなわち、ヒトDNAを含まない)0:100(スパイクされていないヒトDNA)。正常に生成された各ライブラリーは配列決定され、参照ゲノムとヒトゲノム(GRCh38)に対応する所与の混入物にマッピングされる。このマッピングを使用して、各座位で正しい(例えば、参照ゲノムと一致する)遺伝子型を示す読取のパーセンテージを決定し、対照の値と比較する。アライメントは、SPLiT-DSの成功をなおも許容する混入DNAの範囲に関する情報を提供する(すなわち、SPLiT-DSの精度や強度に悪影響を与えずに存在する可能性のある混入DNAのレベル)。
SPLiT-DSが代表的なヒト集団で実行可能な高精度遺伝子型決定法として検証されるように、Personal Genome Project(PGP)から取得した細胞から精製されたDNAが使用される(例えば、表3のPGPの人口統計の詳細を参照されたい)。
表3:PGP試料の詳細
SPLiT-DSは、PGPの血縁関係のない個人の細胞株から精製されたDNAに対して、2回ずつ実行される。約110人の固有の個人からのDNAが試験される。SPLiT-DSは、前の実施例で決定された適切な量のDNAを使用して実行される(すなわち、各座位の平均60倍を超えるポストプロセッシング深度で配列決定ライブラリーを確実に(例えば、80%を超えて)産生する最小量)。本明細書に記載されている社内SPLiT-DSソフトウェアを使用して配列決定を行い、エラー訂正を実行した後、STRait Razorを使用して試料の遺伝子型を決定する。
例えば、法医学用途の配列決定法としてのSPLiT-DSの優位性を実証するために、現在利用可能な手法に対する一致研究が実施される。現在、法医学のSTR遺伝子型決定の「ゴールドスタンダード」はPCR-CEである。本明細書に記載される実施例に従って得られたSPLiT-DSの結果は、標準手順に従って、PCR-CE分析および1ngのインプットDNAを使用して遺伝子型決定された同一のDNA試料と比較される。2つのデータセット(PCR-CEおよびSPLiT-DS、適切な対照/参照(例えば、WGS PGP試料データ)が伴う)によって、2つのアプローチ間の一致のレベルを決定できる。一致の研究はまた、CODIS座位を含む63のSTRおよび95の識別性情報SNPの標的化PCR増幅を使用する市販のキット(例えば、Illumina FORENSEQ DNA Signature Prep Kit)を使用して実行される。PCR-CEとSPLiT-DSの一致の研究で使用されたのと同一の試料が使用され、遺伝子型決定はSTRait-Razorを使用して実行される。PCRスタッターも各アプローチ(PCR-CE、市販キット、SPLiT-DS)でレビューされ、真の対立遺伝子ピークの高さが少なくとも600RFU(確率的しきい値)であるが15,000RFUを超えない場合にスタッターが計算される。ヘテロ接合対立遺伝子間の繰り返し位置でのプラスおよびマイナスのスタッターの付加的な全ての効果を排除するために、2つの繰り返し単位を離れた位置は含まれない。本明細書に記載されるように、スタッターのパーセンテージは、スタッターピークのピーク高さを真の対立遺伝子のピーク高さで割ることにより計算される。市販のキットによって分析した試料の場合、60以上の観察された読取を持つ全ての対立遺伝子がコールされ、本明細書に記載されるようにスタッターのパーセンテージが計算される。比較は、試験された各座位のスタッターパーセントの間で実行される。プラットフォーム間のスタッターの結果は互いに直接比較できないが、データは各方法におけるスタッターの相対的な豊富さの合理的な推定を提供すると考えられる。
高度に損傷/分解されたDNAおよび混合物は、現在利用可能な遺伝子型決定技術を混乱させる。したがって、本実施例は、SPLiT-DSが損傷したDNAおよびDNA混合物を含む試料を正しく遺伝子型決定し、現在利用可能な方法論を改善および拡張する能力を実証する。
SPLiT-DSは、法医学的に関連する以下の3つのカテゴリーにさらされた試料DNAに対して実行される:(i)化学物質への暴露、(ii)紫外線(UV)光、および(iii)高温(従来のSTR分析に影響を与えることが知られている/以前の研究で使用された例示的な暴露方法/条件の要約については、表4を参照されたい)。損傷したDNA試料に利用できるSRMの不足により、誘発される損傷のレベルは生物学的複製間で標準化される。DNAは最初に表4に示す環境条件および時点にさらされ、所与の試料中のDNA損傷/分解の決定に使用される市販のキット(例えば、KAPA Biosystems hgDNA Quantification and QC qPCR kit(Roche/KAPA Biosystems))を使用して評価が行われる。特定の環境条件(本明細書に記載されるアッセイで決定されるような)に対して同等のレベルの損傷(観測平均値の1標準偏差以内として定義)を示す試料のみが、本実施例の分析に使用される。
表4:DNA損傷条件
広範囲のMAF比の遺伝的に無関係な2人の個人からなるDNA混合物のSPLiT-DS分析の有効性の向上(例えば、利用可能な方法と比較したときの精確さと感度の向上)が実証される。表5の各混合物については、前の例で遺伝子型決定したPGP試料から、10組の2人の組み合わせが選択される。本実施例で使用される特定のPGP試料は、以前の実施例または全ゲノム配列(PGPの一部として入手可能)により決定される特定の遺伝子型に依存する。可能であれば、8を超える座位で少なくとも2回の繰り返しの長さの異なる寄与者ペアが選択される。各試料から10ngを超えるDNAが必要になる可能性が高いと考えられる。正確な量は、以前の実施例で決定したように、各座位でSPLiT-DSがどれだけ効率的に機能するかによって決定される。
表5:DNA混合物条件
スタッター読取計数がMAF対立遺伝子の1つの95%ウィルソンスコア間隔内にある場合、座位は部分一致とみなされる。両方のMAF対立遺伝子がこの試験に失敗する場合、座位は失敗した遺伝子型コールとみなされる(MAFがスタッターと区別できない場合、ホモ接合性対立遺伝子は自動的に失敗する)。以前の実施例と同様に、SPLiT-DSのPCR-CEおよびMPSに対する比較研究、ならびにスタッター、対立遺伝子ドロップアウト、対立遺伝子内バランス、および/または遺伝子型決定の成功率の相対的な量の比較も、本明細書に記載されるように実施および評価される。次いで、2人の混合実験の結果を使用して、2人の混合分析と同じ試料選択基準と分析を使用して、3人の混合実験(例えば、表5を参照されたい)を実施する。
ホルマリン固定は、シチジン脱アミノ化、酸化的損傷、および架橋の形で極端なDNA損傷を引き起こす。現在利用可能な方法と比較してSPLiT-DSの機能を実証するために、Promega 2800M SRMのD3S1358座位でホルマリン固定された核DNAを配列決定することにより、高度に損傷したDNAの分析を実施した(図13Bおよび14A)。図13A~13Cは、本技術の一実施形態によるSPLiT-DS手順から得られたデータを示す。図13Aは、配列決定前のインサート断片サイズを示す代表的なゲルである(レーン1はラダーであり、レーン2および3は、各チューブからのPCR産物の試料である、例えば図4のステップ4を参照されたい)。図13Bおよび13Cは、CODIS遺伝子型対エラー訂正の非存在下(図13B)およびSPLiT-DSによる分析後(図13C)の配列決定読取の数を示すグラフである。図13Bは、エラー訂正の非存在下で多型が観察された試料(D3S1358)を示し、スタッター事象は黒い矢印で示される。図13Cは、SPLiT-DSによる分析後、検出可能なスタッター事象を含まない試料(D3S1358-DCS)を示す。図13Bおよび13Cのそれぞれのx軸は、CODIS遺伝子型を示し、y軸は、読取の数を示す。
本実施例は、ゲノムDNA(gDNA)の配列決定の効率を改善する方法として、標的化ゲノム断片化を実証している。SPLiT-DSゲノムの断片化は、通常、例えば物理的せん断またはDNAホスホジエステル結合の酵素消化などの方法によって達成される。そのようなアプローチは、無傷のgDNAがランダムなサイズのDNA断片の混合物に低減された試料を産生する。非常に堅牢であるが、可変サイズのDNA断片は、PCR増幅バイアス(短いフラグメントがより多く増幅する)と不均一な配列決定の深度(図11A)、ならびにDNA断片内の目的の領域と重複しない配列決定読取を引き起こす可能性がある。したがって、本実施例ではCRISPR/Cas9を使用してこれらの問題を克服する。切断部位は、あらかじめ決められた均一なサイズの断片を産生するように設計される。断片のより均質なセットは、標的化断片化を使用しない他の技術の効率に影響を与える可能性のあるバイアスおよび/または情報のない読取の存在を克服しない可能性が高いとみなされる。また、断片サイズの一貫性/差異のために、gDNAから断片を分離することにより大きなオフターゲット領域の除去が可能になる可能性が高いため、標的化断片化がライブラリー調製前に所与の試料の事前濃縮を促進する可能性が高いと考えられている。
血液中の循環腫瘍DNAの存在は何十年も認識されてきたが、がんバイオマーカー(例えば、疾患の存在/進行を診断および/または追跡するためのマーカー)の信頼できる開発のために超高感度の方法が必要である。SPLiT-DSは、様々な量の無細胞DNAを含む血液試料内の少量の循環腫瘍DNAを含む、広範な課題を克服するのに役立つ。SPLiT-DSはまた、特定の変異の事前知識を必要としないため、BEAMing、SafeSeqS、TamSeq、ddPCRなど、当該技術分野で既知のいくつかの高感度かつ特定の方法を改善および拡張する。SPLiT-DSは、低いDNAインプットで、特定の腫瘍変異に関する予備知識なしで、現在利用可能な最高レベルの精確さでがん関連変異を検出できるアプローチを提供する。
SPLiT-DSは、低インプットgDNA(10~100ng)およびcfDNA(約10ng)の精確な配列決定のためのアッセイの開発に使用される。ゲノムDNAは一般に大きな断片(1Kbを超える)で発生し、無細胞DNAはほとんど例外なく、約150bpの頻度の少ない断片として発生する。
本実施例は、低DNAインプットに対するSPLiT-DSの実現可能性と多重化への適合性を実証する。がん患者の生検から組織を入手し得るが、必要な全ての試験を完了するために、このような試料の使用は控えめにすることが好ましい。したがって、gDNAの配列決定は、低インプットの物質を必要とするSPLiT-DSが提供するプラットフォームなどの改善されたプラットフォームから恩恵を受ける。
SPLiT-DSアッセイは、TP53、KRAS、およびBRAFで既知のクローン変異を有する匿名化された腫瘍のDNA、ならびにがんのない個人の白血球gDNAを使用して、図4および5に概説されているように、gDNAで実行される。任意の最適化/検証ステップを実験して、効率と感度を試験するために、2つの異なる実験セットが実行される。
効率は、DCS読取に変換されるインプットDNA分子のパーセンテージとして定義される。本実施例の効率は、少なくとも30%であるが、50%を超えることを目標とする。10ngのインプットDNAが目的の座位全体にわたって平均1000倍のDCS深度を達成する可能性が高いと考えられる(10ng=約3200ゲノム、したがって3200×0.3効率=約1000ゲノムが配列決定される)。効率は、一部、マルチプレックスPCRの性能に依存する。インシリコアプローチを使用して、PCRプライマーは次のように設計される:i)高い標的特異性、ii)多重化する能力、iii)堅牢で最小バイアスの増幅を実行する能力。
TP53変異腫瘍gDNAは、1:2、1:10、1:100、1:1000、1:10,000の比率で、対照の非変異白血球gDNAにスパイクされる。KRASおよびBRAFのそれぞれに既知のクローン変異を含む2つの追加の腫瘍DNAを使用して、合計15の試料(3つの遺伝子ごとに5希釈)で同じ混合実験を行う。これらの15の試料は、10ngおよび100ngのインプットDNAを使用して、本明細書で記載されるようなSPLiT-DSで処理される。「期待される」MAFと「観察される」MAFを比較する(最大MAFはMAFmax=α INによって決定されるガイドラインを使用し、Nはゲノムの数であり、aはSPLiT-DSの効率であり、例えば、30%の効率で、MAFmaxが10ngのDNAに対して0.1%であり、100ngのDNAに対して0.01%である)。
本実施例は、以下の例示的ながん関連遺伝子の変異の検出のためのSPLiT-DSの使用を実証する:cfDNA中のTP53、KRAS、およびBRAF。
市販の血漿(Conversant Bio)からの無細胞DNAは、QIAamp Circulating Nucleic Acidキットを使用して抽出される。目的の3つの遺伝子のそれぞれについて既知の変異をコードする3つの異なる合成150bpのDNA分子が使用される。これらの各合成DNA分子は、1:2、1:10、1:100、1:1000、1:10,000の比率でcfDNAにスパイクされる。cfDNAのSPLiT-DSプロトコールパラメーターを最適化および検証するために、2つの異なる実験セットが実行される。
cfDNAはすでに断片化されているため、切断(例えば、CRISPR/Cas9)は必要ない。したがって、SPLiT-DSは、ネステッドPCRを追加して、以前の実施例で記載したように実行される。得られたフラグメントは、MiSeq v3で150サイクルで配列決定され、それぞれ約250万回の読取のために約10の試料がカートリッジに多重化される。
cfDNAのTP53、KRAS、およびBRAF変異のそれぞれに対する5つの混合希釈(1:2、1:10、1:100、1:1000、1:10,000)は、本実施例で設計され、10ngおよび100ngのDNAで開始する、最適化されたプライマーを使用するSPLiT-DSによって分析される。実験は、SafeSeqSと並行して実行され、技術間の感度を比較する(ctDNAの精確な配列決定のための既知の技術はSafeSeqSであり、一本鎖訂正を使用してNGSエラーを低減する)。SPLiT-DSは、MAF=0.1%および0.01%での変異の検出に関してSafeSeqSを上回る可能性が高いと考えられる。SPLiT-DSは推定平均感度0.5%でスパイク変異を検出できる可能性が高いと考えられるが(表2)、Safe-SeqSはそのような低頻度ではスパイク変異を検出できない。
本実施例は、SPLiT-DSを使用した膵管腺癌(PDAC)患者のctDNAの変異の検出時の改善(現在利用可能な方法と比較して)を示す。SPLiT-DSは、KRAS、TP53、およびBRAFを含む複数の標的遺伝子におけるddPCRの感度を向上させる。これらのアッセイの結果は、現在のアプローチでPDAC患者の95%で1つの変異を検出し、PDAC症例の50%を超えて2つの変異を検出する感度の向上を示す可能性が高いと考えられる。
PDACの40人の患者、慢性膵炎の20人の患者、および年齢が一致した20人の正常対照からの完全に特定されていないcfDNAおよび一致する白血球DNA試料が評価される。血液試料は抽出後2時間以内に処理され、2~5mlの血漿と500ulのバフィーコートを含む試料が提供される。さらに、PDAC患者の場合、腫瘍の変異を確認するために凍結腫瘍片が利用可能になる。全てのPDAC患者について、術前に血液が調達される。全ての患者は臨床的に追跡され、再発までの時間および死亡率を含む詳細な臨床病理情報が利用可能になる。患者の試料には、20人の限局性がんと20人の転移性がんが含まれる。
本実施例では、PDAC患者のcfDNAにおけるKRAS、TP53、およびBRAF変異を検出するSPLiT-DSの感度と特異性を決定する。感度を分析するために、cfDNAで見つかった変異を、SPLiT-DSで同定された腫瘍変異(クローンおよびサブクローン)と比較する。SPLiT-DSの結果は、1変異のPDAC症例のほぼ全てと2変異の症例の50%を超えて包含するため、全ての転移症例と約80%の限局性症例のcfDNAで少なくとも1つの腫瘍変異を検出するる可能性が高いと考えられ、全てのPDACに対する感度の合計が約90%となる。
以前の実施例で示したように、SPLiT-DSの感度が向上したため、以前に利用可能なアプローチとは対照的に、ctDNAはほぼ(90%)全てのPDAC患者で検出可能である可能性が高いと考えられる。ctDNAの存在に対するバイナリ変数(すなわち、はい/いいえ)の代わりに、ctDNA MAFは量的変数として分析され、MAFスコアと臨床データを比較する(例えば、MAFスコアと予後を比較する)。変異した遺伝子、コドン、および/または変異タイプが再発または死亡と相関しているかどうかも決定される。交絡因子(年齢と病期を含む)に合わせて調整された多変量COXモデルを使用して、これらの変数とその組み合わせの能力を試験し、無病生存率と全生存率を予測する。カプラン・マイヤー曲線は、カテゴリー変数の予測値を表すために使用される。
早期がんの検出、およびctDNAを使用した再発の予測
発症時の症例の約50%を占める転移性CRC(すなわち、ステージIV)では、治療の決定を導くために腫瘍の遺伝子型決定が不可欠である:KRAS、NRAS、およびBRAFの発癌性変異は、CRC患者の約50%で発生し、EGFRモノクローナル抗体セツキシマブおよびパニツムマブに対する応答の欠如を予測する。したがって、これらの遺伝子は固定と未固定の組織生検の両方で日常的に評価されるが、現在利用可能なアプローチはしばしば低品質のサブクローン解像度をもたらし、試料採取バイアスに悩まれる。その結果、サブクローン変異を有する腫瘍は見逃され、一部の患者には確実に失敗する治療法が投与される可能性がある。したがって、本実施例では、SPLiT-DSを使用したctDNAによる腫瘍遺伝子型決定により、現在利用可能な技術よりも感度が向上したアッセイが実証され、これはまた、EGFR遮断療法の患者の適格性を条件付けるSPLiT-DSの既存の耐性変異の検出により、診断と治療を改善する。
SPLiT-DSは、特定の腫瘍変異に関する予備知識なしにctDNAの変異の検出を実証するために、5つの一般的に変異したCRC遺伝子のパネルで使用される。このアッセイの結果は、はるかに単純化された検査(例えば血液検査)を使用して将来のCRC検出を通知できる可能性が高いと考えられる。
本実施例では、腫瘍の外科的切除を受けた300人を超える患者からの複数の生検タイプの患者からの試料が使用される。利用可能な生体試料には、腫瘍、血漿、バフィーコートが含まれる。試料が得られた患者を縦断的に追跡し、ベースライン切除後6、12、および24か月で血液試料を入手できる。全ての患者について、再発を含む詳細な臨床病理情報が利用可能である。全ての試料とコード化された医療情報は完全に匿名化されている。転移性疾患の患者からの試料は、セツキシマブまたはパニツムマブに対する応答の可能性を決定するために、以前にKRASおよびNRASの変異について評価された。変異が見つからなかった場合、標的化療法が適用された。耐性は、イメージング研究の進行を介して記録された。
SPLiT-DSは、cfDNAのクローン腫瘍変異について、転移性CRCからの試料を評価するために使用される。全ての腫瘍はKRASおよびNRASの変異に対して陰性であるが、本実施例に記載されるパネルで同定された少なくとも1つのクローン変異(APCまたはTP53中)を保有する可能性がある。SPLiT-DSは、EGFR療法に対する耐性を付与するctDNAの非常に低い頻度(0.1%未満)の変異の存在が検出可能かどうかを判断するためにも使用される。転移性疾患の患者からの試料は、非常に高い深度(約10,000倍)で正常にシーケンスされる可能性が高いと考えられる。SPLiT-DS分析は、腫瘍DNAのサンガー配列決定によりKRASおよびNRASが陰性であるがEGFR療法に失敗した転移性疾患患者のctDNAにおける低頻度KRAS、BRAFおよびNRAFの変異の検出も改善する。SPLiT-DSを使用して同様の高深度で腫瘍DNAを配列決定し、ctDNAにおける一次耐性変異の有無を判定する。ctDNAと腫瘍内組織由来のDNAの結果を比較する。
SPLiT-DSは、限局性(ステージI~III)がんの試料で、本明細書に記載される5つのCRC遺伝子のパネルを使用してctDNAを同定するために使用される。腫瘍DNAもSPLiT-DSを使用した配列になる。以前の実施例に記載したように、白血球細胞に由来する生物学的バックグラウンド変異の存在も決定される。
本実施例では、非常に精確で高感度の配列決定を実行するためのCRISPR-DSの作成について記載する。CRISPRベースの技術を使用して、あらかじめ決められた均一な長さで設計された標的領域を切除した(図12A)。本実施例では、使用されたCRISPR適合性ヌクレアーゼはCas9であった。このサイズコントロールを使用して、ライブラリー調製の前にサイズ選択を容易にし(図12B)、続いてエラー除去を実行するために二本鎖バーコード付け(図12C)を実行した(前述の、例えばDS法と同様)(図12D)。バーコード付けに続いて、単一回の捕捉が実行され(他の利用可能な方法とは対照的に)、非常に高いオンターゲット濃縮が行われ、完全な配列決定読取を包含する断片を産生することができる(図12Fおよび16A)。ハイブリダイゼーション捕捉の断片化は通常、超音波処理で実行され、これは、長すぎたり、目的の領域と重複しない配列決定読取、および/または短すぎたり、相互に重複し、同一の配列を再読取する配列決定読取をしばしば生成する(図12Fおよび16A)。図16Bおよび16Cは、本技術の実施形態による、標準的なDSおよびCRISPR-DSプロトコールで調製された試料の断片インサートサイズを示すヒストグラムグラフである。X軸は、最適な断片サイズ、例えば、分子バーコードとクリッピングの調整後の配列決定読取の長さに一致する断片サイズ、との差異の割合を表す。縦欄領域は、最適なサイズから10%以内の範囲にある断片サイズの範囲を示し、最適なサイズは垂直のハッシュ線で指定されます。図16Bおよび16Cに示すように、超音波処理により、最適な断片サイズからの逸脱量に大幅なばらつきが生じた(図16B)が、一方で、CRISPR/Cas9消化により、最適な断片サイズ内に大部分の読取を有する断片が得られた(図16C)。
表6.TP53ハイブリダイゼーション捕捉プローブ
Targeted exon:標的化エクソン、IDT probe name:IDTプローブ名称、IDT probe sequence:IDT プローブ配列Exon:エクソン
試料
本実施例で分析された試料には、末梢血、癌を伴うまたは伴わない膀胱、および腹水DNAからの匿名化されたヒトゲノムDNAが含まれた。患者情報は腹水試料で利用可能であり、腫瘍変異の存在を確認するために使用された。ワシントン大学婦人科腫瘍組織バンクから体液試料を入手し、ワシントン大学ヒト対象部門の治験審査委員会によって承認されたプロトコール番号27077に基づくインフォームドコンセント後に検体と臨床情報を収集した。匿名化された凍結膀胱試料は、ワシントン大学泌尿生殖器がん生物標本保管所および以前に固定または凍結されていない剖検組織から入手した。DNAは以前にQIAamp DNA Miniキット(Qiagen,Inc.,Valencia,CA,USA)で抽出されており、変性したことはなかった。DNAはQubit HS dsDNAキット(ThermoFisher Scientific)で定量化した。DNAの品質はGenomic TapeStation(Agilent,Santa Clara,CA)で評価され、DNAの完全性の数値(DIN)が決定された。DINは、1(非常に劣化)から10(劣化なし)までのゲノムDNA品質の尺度である。末梢血DNAおよび腹水DNAのDINは7を超えていた(分解のない良質のDNAを反映)。図19は、3つの異なる血液DNA試料での2つの捕捉ステップと比較して、1つの捕捉ステップでCRISPR-DSによりもたらされる標的濃縮を示す棒グラフである。
TP53エクソンを切除するgRNAは、以下の特性を有するよう設計された:TP53コード領域を包含する約500bpの断片を産生する能力、(2)最高のMIT Webサイトスコア(「MITスコア」;CRISPR.mit.edu:8079/;表1および図17A-17C)。エクソン7の場合、ガイドは、目的の領域内の近位のポリAトラクト(tract)を避けるために、より小さいサイズの断片を産生するように設計された。合計12のgRNAが設計され、TP53が7つの異なる断片に切り出された(図12A)。全てのgRNAの「MIT」スコアは60を超えていた。切断の品質は、Integative Genomics Viewerを使用して最終DCS読取のアライメントをレビューすることにより評価された。成功したガイドは、領域境界の鋭いエッジと適切なDCS深度を持つ典型的な包含パターンを産生した(図22E)。ガイドが「失敗」した場合、DCS深度の低下が観察され、予想される切断点を超える長い読取の存在が観察され、そのようなガイドは、必要に応じて再設計された。ランダムなDNA配列(表7)で挟まれた全てのgRNA配列を含む合成GeneBlock DNA断片(IDT,Coralville,IA)を使用してガイドを評価した(図21A~21B)。本明細書に記載されるCRISPR/Cas9インビトロ消化プロトコールを使用して、3ngのGeneBlock DNAを各gRNAで消化した。消化後、TapeStation 4200(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)で反応を分析した(図21C)。定義済みの断片の長さが存在し、適切なgRNAアセンブリとgRNAがその標的部位を切断する能力を確認した。
Geneblock fragment: 500bp with all of the gRNA target sequences:GeneBlock断片-全てのgRNA標的配列を含む500bp。
Spacer Sequences 17bp(frin ubtribu areas DS id TP53 exon 10:スペーサー配列17bp(TP53のエクソン10のイントロン領域DS由来)
Beginning spacer sequence (7bp):開始スペーサー配列(7bp):
Ending spacer sequencer (30bp):終了スペーサー配列(30bp)
crRNAおよびtracrRNA(IDT,Coralville,IA)をgRNAと複合体形成させ、30nMのgRNAを約30nMのCas9ヌクレアーゼ(NEB,Ipswich,MA)、1×NEB Cas9反応緩衝液、および23~27μLの水とともに、25℃で10分間インキュベートした。次いで、10~250ngのDNAを添加し、最終容量を30μLにした。反応物を37℃で一晩インキュベートした後、酵素不活性化のために70℃で10分間熱ショックを与えた。
サイズ選択を使用して、ライブラリー調製の前にターゲット濃縮のための所定の長さの断片を選択した。AMPure XPビーズ(Beckman Coulter, Brea,CA,USA)を使用して、オフターゲットの未消化高分子DNAを除去した。熱不活性化後、反応物を0.5倍比のビーズと組み合わせ、少し混合し、次いで、3分間インキュベートして高分子量DNAを結合させた。次いで、磁石でビーズを溶液から分離し、溶液(目的の長さのDNA断片を含む)を新しいチューブに移した。標準のAMPure 1.8倍比のビーズ精製を実行し、50μLのTE Lowに溶離した。
A-テーリングおよびライゲーション
断片化したDNAはA-テール化され、製造元のプロトコールに従ってNEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit(NEB,Ipswich,MA)を使用してライゲートした。NEB末端修復およびAテーリング(ERAT)反応は、20℃で30分間、および65℃で30分間インキュベートした。CRISPR-DSには末端修復は必要ない(Cas9は平滑末端を産生する)が、有用なA-テーリングのためにERAT反応が使用された。NEBライゲーションマスターミックスと15μMのDSアダプターの2.5μlを添加し、20℃で15分間インキュベートした。市販のアダプタープロトタイプ(図12C)は、これまでの研究で使用されたアダプターとは次の相違を有して合成された:(1)12bpの代わりに、10bpのランダムな二本鎖分子タグが使用された、(2)単純な3’-dT突出による以前の3’の5bp保存配列の置換を使用して、5’-dAテールDNA分子にライゲートした。ライゲーション時に、DNAを0.8倍比のAMPureビーズ精製で洗浄し、23μLのヌクレアーゼフリー水に溶離した。
KAPA Real-Time Amplification kitと蛍光標準(KAPA Biosystems,Woburn MA,USA))を使用して、ライゲートされたDNAを増幅した。KAPA HiFi HotStartリアルタイムPCRマスターミックス、23μlの事前にライゲートおよび精製されたDNA、ならびに最終濃度2μΜのDSプライマーMWS13およびMWS20を含む50μlの反応液を調製した。反応は、98℃で45秒間変性され、98℃で15秒間、65℃で30秒間、72℃で30秒間を6~8サイクルで増幅され、72℃で1分間の最終伸長が続いた。蛍光標準3(試料全体にわたる捕捉に十分な標準化された数のDNAコピーを産生し、過剰増幅を防ぎ、Cas9の切断とライゲーションの成功を示す)に達するまで試料を増幅し、通常、DNAインプットの量に応じて6~8サイクルかかる。0.8倍比のAMPure Bead洗浄を実施して増幅断片を精製し、40μLのヌクレアーゼフリー水に溶離した。PCRステップの標準DSと比較して、CRISPR-DSは以下を含む改善を提供する:(i)同様のサイズの断片を提供する(小さな断片への増幅バイアスを低減する(図22A)、(ii)目的の領域のより均一な包含の生成(図22E)、(iii)TapeStation 4200による、ライブラリー調製(所定の断片サイズ特性を使用)が成功したことの精確な評価(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。標準DSでは、PCR産物は超音波処理により幅広いサイズであり、試料間で比較するのが困難である広いスメアとして存在する(図22A)。例えば、標準的なDS(試料間で比較するのが困難である結果を産生できる)などの他のアプローチとは対照的に、CRISPR-DSは、切断とライゲーションの成功を明確に示し、試料全体にわたる品質管理の比較に適した離散ピークを産生する(図22B~D)。
TP53 xGen Lockdown Probes(IDT, Coralville,IA)を使用して、以前の研究に従ってTP53エクソンのハイブリダイゼーション捕捉を実行したが、次のように変更した:プローブ(IDT TP53 Lockdownプローブセット由来)を選択して、TP53コード領域全体を包含した(エクソン1およびエクソン11の一部はコード領域ではない)(表6)。各CRISPR/Cas9切除断片は、最小で2つのプローブと最大で5つのプローブに包含されていた(図17A~17C)。捕捉プローブプールを産生するために、所与の断片に対する各プローブを等モル量でプールし、7つの異なるプール(各断片に1つ)を生成した。次いで、7つの断片プールを再び等モル量で混合した(エクソン7とエクソン8~9のプールは例外で、それぞれ40%と90%で表れた)。これらのエクソンの捕捉プローブの減少は、エクソンの過剰表現がシーケンスで観察された場合にもたらされた。最終的な捕獲プールを0.75pmol/μlに希釈した。ハイブリダイゼーション捕捉は、次の変更を加えた標準IDTプロトコールに従って実行された:DSアダプターに特異的なブロッカーMWS60およびMSW61を使用した、75μl(100μlの代わり)のDynabeads M-270ストレプトアビジンビーズを使用した、捕捉後後PCRは、最終濃度0.8μMのMWS13およびインデックス付きプライマーMWS21を使用して、KAPA Hi-Fi HotStart PCRキット(KAPA Biosystems,Woburn,MA,USA)により実施した。反応は98℃で45秒間変性し、次いで98℃で30秒間、60℃で45秒間、72℃で45秒間を20サイクルで増幅し、72℃で60秒間の延長が後に続いた。PCR産物は0.8倍のAMPureビーズ洗浄で精製した。
Qubit dsDNA HS Assay Kitを使用して試料を定量化し、希釈し、配列決定のためにプールした。次いで、Agilent 4200 TapeStationで試料プールを視覚化して、ライブラリーの品質を確認した。TapeStationのエレクトロフェログラムは、設計されたCRISPR/Cas9切断断片の断片の長さに対応するシャープで明確なピークを示した(図22B~22D)。(このステップは、プールする前に各試料に対して個別に実行して、必要に応じて/所望なら、個々の試料の性能を検証することもできる)。最終的なプールは、KAPA Library Quantification kit(KAPA Biosystems,Woburn,MA,USA)を使用して定量化した。ライブラリーは、製造者の取扱説明書に従って、v3 600サイクルキット(Illumina,San Diego,CA,USA)を使用して、MiSeq Illuminaプラットフォームで配列決定された。各試料には、約7~10%のレーンが割り当てられ(約200万回の読み取りに対応)、各配列決定の実行には、約1%のPhiX対照DNAがスパイクされた。
未処理のFASTQファイルからテキストファイルへの分析を自動化するために、カスタムバイオインフォマティクスパイプラインが作成された(図23)。このパイプラインは、標準的なDS分析に使用される方法に類似するが、次の変更が加えられている:(i)ペア読取情報の保持が達成され、(ii)アラインメントの前にコンセンサス作製が実行される。ペアエンド読取はCRISPR-DSデータの分析に使用されるが、断片サイズの品質管理と短い断片の存在による潜在的な技術的アーティファクトの除去をもたらすので、標準的なDS分析よりも改善されている。さらに、標準的なDS分析では、全ての読取が参照ゲノムにマッピングされた後にコンセンサスが作製されるが、CRISPR-DS分析では、シーケンサーによる塩基読取のみに依存して最初のステップとしてコンセンサスが実行される。この変更により、コンセンサス作製が改善され、データ処理に必要な時間が短縮される可能性が高いと考えられる。CRISPR-DSでは、コンセンサス作製は、同一のタグに由来する全ての読取を取得し、各位置でコールされた塩基を比較し、一本鎖コンセンサス(SSCS)読取を産生するUnifiedConsensusMaker.pyと呼ばれるカスタムpythonスクリプトによって実行された。次いで、タグの各相補ペアのSSCS読取を位置ごとに比較して、二本鎖コンセンサス(DCS)読取を作成した(図12D)。得られたSSCS読取とDCS読取を含む2つのFASTQファイルが作製された(DCS読取は元のDNA分子に対応するため、平均DCS深度は配列決定されたゲノム数の推定値である)。回収率(分数ゲノム等価回収とも呼ばれる)は、平均DCS深度(配列決定されたゲノム)をインプットゲノム数(1ngのDNAが約330の半数体ゲノムに対応)で割って計算された。ゲノム座標が上流および下流のCRISPR/Cas9切断部位内にあり、いずれかの側に100bpのウィンドウが追加された読取の数を計数することにより、オンターゲットの未処理読取を計算した。ペアエンドのDCS FASTQファイルは、bwa-mem v.0.7.419をデフォルトパラメータとともに使用して、ヒト参照ゲノムv38とアライメントされた。マッピングされた読取はGATK Indel-Realignerで再アライメントされ、低品質のベースはGATK Clip-Readsで両端からクリップされた。3’末端から30塩基、5’末端から7塩基の保守的なクリッピングが行われた。さらに、TP53設計では約80bpにわたる読取ペアの重複領域は、fgbio ClipOverlappingReadsを使用してトリミングされた。このアルゴリズムは、ペアの読み取りの両端から一致するまでクリッピングを実行し、これにより、高いPHRED品質スコアを持つ配列決定塩基の使用が最大化される。SAMtools mpileupを使用して、得られたファイルからパイルアップファイルが作成された。次いで、標的化ゲノム位置のためのBEDファイルを含むカスタムPythonスクリプトを使用して、パイルアップファイルをフィルタリングした。BEDファイルは、CRISPR/Cas9のgRNAの座標を使用して簡単に作成できる。次いで、フィルタリングされたパイルアップファイルは、「mutpos」と呼ばれる変異情報を含むタブ区切りテキストファイルを作成する、カスタム作製スクリプトmut-position.1.33.pyによって処理される。mutposには、DCSの深度と配列決定された各位置の変異の概要が含まれる(CRISPR-DS分析で使用されるソフトウェアは、ハイパーテキスト転送プロトコールsecure://github.com/risqueslab/CRISPR-DSでアクセスできる)。
正常なヒト膀胱試料B9からの3つの量のDNA(25ng、100ng、および250ng)を1回および2回の捕捉で標準的なDSで配列決定し、CRISPR-DSの結果と比較した。標準的なDS分析を実施したが、末端修復とライゲーションにはKAPA Hyperprepキット(KAPA Biosystems,Woburn,MA,USA)を使用し、PCR増幅には、KAPA Hi-Fi HotStart PCRキット(KAPA Biosystems,Woburn,MA,USA)を使用した。ハイブリダイゼーション捕捉は、TP53エクソン2~11を包含するxGen Lockdownプローブを使用して実行された(標準的なDSとCRISPR-DSの両方で同一のプローブが使用された)。試料は、短い断片の長さに対応するために、HiSeq 2500 Illuminaプラットフォームの約10%で配列決定された。
CRISPR-DS標的濃縮を特徴評価するために、2つの別々の分析が実行された。
表8.標準的なDS対CRISPR-DSの比較
高分子量DNAを選択すると、CRISPR-DSで分解されたDNAの性能が向上する。この選択は、BluePippinシステム(Sage Science, Beverly,MA)を使用して実行した。DINが6および4の2つの膀胱DNAを、0.75%ゲルカセットとハイパス設定を使用して実行し、8kbを超える断片を取得した。サイズ選択はTapeStationで確認された(図20A)。次いで、BluePippinの前に250ngのDNAとBluePippinの後に250ngのDNAがCRISPR-DSによって並行して処理された。オンターゲットの未処理の読取のパーセンテージと平均DCS深度を定量化し、比較した(図20B)。
低頻度変異を検出するCRISPR-DSの能力を検証するために、卵巣癌の女性から減量手術中に4つの腹水試料を収集し、分析した。これらの試料にTΡ53腫瘍変異が存在することは、標準的なDSによってこれまでに実証されていた。100ngのDNA(標準的なDSに使用されたものより30~100倍少ない)がCRISPR-DS分析に使用され、標準的なDSに匹敵するDCS深度が得られ、TP53腫瘍変異が全ての場合で正常に同定された(表9)。回収率は6~12%の範囲で、同一のDNAによる標準的なDSと比較して15倍から200倍の増加を示した。
表9.TP53変異を含む4つの異なる試料のStandard-DS対CRISPR-DSの比較。
本実施例では、様々な患者の膀胱組織から抽出された13のDNA試料のセットでのCRISPR-DSの使用について記載する(表10)。各試料からの250ngのDNAをアッセイに使用し、回収率の中央値7.4%に相当する6,143倍の中央値のDCS深度が得られた。2つの試料(B2およびB4)の技術的な重複により、再現可能な性能が実証された。全ての試料のオンターゲットのDCS読取は98%を超えていたが、オンターゲットの未処理の読取(生の読取り)のパーセンテージは43%~98%の範囲であった。低いターゲット濃縮は、7未満のDNA Integrity Numbers(DIN)の試料に対応していた。
表11.サイズ選択による標的濃縮
本技術の実施形態の上記の詳細な説明は、網羅的であること、または技術を上記で開示された正確な形態に限定することを意図していない。本技術の特定の実施形態および実施例は、例示の目的で上述されているが、当業者が認識するように、本技術の範囲内で様々な均等の修正が可能である。例えば、ステップは所与の順序で提示されるが、代替の実施形態では異なる順序でステップを実行できる。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされてもよい。本明細書で引用される全ての参照文献は、その全てが本明細書に記述されるように、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (53)
- 1つ以上の二本鎖DNA分子を提供することであって、前記1つ以上の各々の二本鎖DNA分子が、サンプルに由来する二本鎖DNA断片、各々の鎖上の単一分子識別子配列、および前記二本鎖DNA断片の二つの末端の少なくとも一つに位置しているアダプター分子を含み、各々の二本鎖DNA分子に対して、前記二本鎖DNA分子の第1の鎖が第1のアダプター配列を含み、前記二本鎖DNA分子の第2の鎖が前記第1のアダプターに少なくとも部分的に非相補的である第2のアダプター配列を含み、
前記1つ以上の二本鎖DNA分子を増幅して、第1鎖増幅産物と第2鎖増幅産物を含む増幅産物を生成することと、
前記増幅産物を、第1の試料と第2の試料とに分離することと、
(a)前記第1のアダプター配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド、および、
(b)目的の標的配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド、
の使用により
前記第1の試料中の前記第1の鎖または第1鎖増幅産物を増幅して、第1のDNA産物をもたらすことであって、前記単一分子識別子配列が少なくとも部分的に前記第1のDNA産物中に維持され、
(a)前記第2のアダプター配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド、および、
(b)目的の標的配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド、
の使用により、
前記第2の試料中の前記第2の鎖または第2鎖増幅産物を増幅して、第2のDNA産物をもたらすことであって、前記単一分子識別子配列が少なくとも部分的に前記第2のDNA産物中に維持され、
前記第1のDNA産物および第2のDNA産物の各々を配列決定することと、
前記第1のDNA産物の配列と前記第2のDNA産物の配列とを比較することと、を含む、方法。 - 提供するステップが、
1つ以上の二本鎖DNA断片の各々に少なくとも1つの縮重または半縮重バーコード配列をライゲートして、1つ以上の二本鎖DNA分子バーコード複合体を形成することを含み、前記バーコード配列が、単一分子識別子配列を含む、請求項1に記載の方法。 - 単一分子識別子配列が、二本鎖DNA分子を一意的に標識する、縮重もしくは半縮重バーコード配列、または、1つ以上の内因性のせん断点または前記1つ以上の内因性せん断点に位置的に関連する可能性のある内因性配列、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 単一分子識別子配列が、内因性のせん断点または前記せん断点に位置的に関連する可能性のある内因性の配列を含む、請求項3に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA分子を増幅することが、前記第1の鎖に由来する複数の増幅産物と、前記第2の鎖に由来する複数の増幅産物とを生成することを含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA分子の少なくとも一つが損傷している、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 損傷が、酸化、アルキル化、脱アミノ化、メチル化、加水分解、ヒドロキシル化、ニッキング、鎖内架橋、鎖間架橋、平滑末端鎖切断、付着末端二重鎖切断、リン酸化、脱リン酸化、SUMO化、グリコシル化、脱グリコシル化、プトレシニル化、カルボキシル化、ハロゲン化、ホルミル化、一本鎖ギャップ、熱による損傷、乾燥による損傷、紫外線暴露による損傷、ガンマ線による損傷、X線による損傷、電離放射線による損傷、非電離放射線による損傷、重粒子線による損傷、核崩壊による損傷、ベータ線による損傷、アルファ線による損傷、中性子線による損傷、陽子線による損傷、宇宙線による損傷、高pHによる損傷、低pHによる損傷、反応性酸化種による損傷、フリーラジカルによる損傷、過酸化物による損傷、次亜塩素酸塩による損傷、組織固定による損傷、反応性鉄による損傷、低イオン状態による損傷、高イオン状態による損傷、緩衝されていない状態による損傷、ヌクレアーゼによる損傷、環境暴露による損傷、火災による損傷、機械的ストレスによる損傷、酵素分解による損傷、微生物による損傷、分取機械的せん断による損傷、分取酵素による断片化による損傷、生体内で自然に生じた損傷、核酸抽出中に生じた損傷、配列決定ライブラリーの調製中に生じた損傷、ポリメラーゼによって導入された損傷、核酸の修復中に導入された損傷、核酸の末端処理中に生じた損傷、核酸ライゲーション中に生じた損傷、配列決定中に生じた損傷、DNAの機械的取り扱いにより生じた損傷、ナノポアを通過する際に生じた損傷、生物の老化の一部として生じた損傷、個体の化学物質への暴露の結果として生じた損傷、変異原性物質により生じた損傷、発がん性物質により生じた損傷、染色体異常誘発物質により生じた損傷、酸素暴露による生体内炎症損傷により生じた損傷、1つ以上の鎖切断による損傷、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1つを含む、請求項6に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA分子が各々、対象または生物を起源とする試料により提供される二本鎖DNA断片を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA分子が、それぞれ、体組織、生検、皮膚試料、血液、血清、血漿、汗、唾液、脳脊髄液、粘液、子宮洗浄液、膣スワブ、パップスメア、鼻腔スワブ、口腔スワブ、組織擦過検体、髪の毛、指紋、尿、便、硝子体液、腹膜洗浄液、唾液、気管支洗浄液、口腔洗浄液、胸膜洗浄液、胃洗浄液、胃液、胆汁、膵管洗浄液、胆管洗浄液、総胆管洗浄液、胆嚢液、滑液、感染性創傷、非感染性創傷、考古学的な試料、法医学試料、水試料、組織試料、食品試料、バイオリアクター試料、植物試料、細菌試料、原生動物のサンプル、真菌試料、動物試料、ウイルス試料、複数の生体の試料、爪擦過検体、精液、前立腺液、膣液、膣スワブ、卵管洗浄液、無細胞核酸、細胞内の核酸、メタゲノミクス試料、移植された異物の洗浄液またはスワブ、鼻洗浄液、腸液、上皮擦過検体、上皮洗浄液、組織生検、生検試料、剖検試料、臓器試料、人物同定試料、非ヒト同定試料、人工的に産生された核酸試料、合成遺伝子試料、バンクに寄託または保管された試料、腫瘍組織、胎児試料、臓器移植試料、微生物培養試料、核DNA試料、ミトコンドリアDNA試料、葉緑体DNA試料、アピコプラストDNA試料、細胞小器官試料、またはそれらの任意の組み合わせから得られる二本鎖DNA断片を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA分子の各々が実質的に均一またはほぼ均一な長さの二本鎖DNA断片を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 実質的に均一な長さが、約100~約10,000塩基である、請求項10に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA分子が、それぞれ、標的化エンドヌクレアーゼによって実質的に均一またはほぼ均一の長さに切断されている二本鎖DNA断片を含む、請求項10または請求項11に記載の方法。
- 二本鎖DNA断片の長さが、1つ以上の実質的に既知のサイズ範囲内である、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA断片の長さが、約100~約1000塩基、約100~約600塩基、約100~約500塩基、またはそれらのいくつかの組み合わせである、請求項13に記載の方法。
- 提供するステップの前に、
実質的に既知の長さの標的二本鎖DNA断片が形成されるように、1つ以上の標的化エンドヌクレアーゼにより二本鎖DNA材料を切断することと、
前記実質的に既知の長さに基づいて、前記標的二本鎖DNA断片を単離することと、を含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。 - 1つ以上の標的化エンドヌクレアーゼが、リボ核タンパク質、Cas酵素、Cas9様酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 1つ以上の標的化エンドヌクレアーゼが、Cas9もしくはCPF1またはそれらの誘導体を含む、請求項15または請求項16に記載の方法。
- 提供するステップの前に、アダプターを標的二本鎖DNA断片にライゲートすることをさらに含む、請求項15~17のいずれか1項に記載の方法。
- 標的二本鎖DNA断片が対象または生物を起源とする、請求項15~18のいずれか1項に記載の方法。
- 標的二本鎖DNA断片が少なくとも部分的に人工的に合成されている、請求項15~18のいずれか1項に記載の方法。
- 二本鎖DNA材料を切断することが、実質的に既知の長さの2つ以上の標的二本鎖DNA断片が形成されるように、前記二本鎖DNA材料を1つ以上の標的化エンドヌクレアーゼによって切断することを含む、請求項15~20のいずれか1項に記載の方法。
- 標的二本鎖DNA断片が異なる実質的に既知の長さである、請求項21に記載の方法。
- 標的二本鎖DNA断片がそれぞれ、ゲノム中の1つ以上の異なる位置からの目的のゲノム配列を含む、請求項21に記載の方法。
- 標的二本鎖DNA断片がそれぞれ、1つ以上の二本鎖DNA分子内の実質的に既知の領域からの標的配列を含む、請求項21に記載の方法。
- 実質的に既知の長さに基づいて標的二本鎖DNA断片を単離することが、ゲル電気泳動、ゲル精製、液体クロマトグラフィー、サイズ排除精製、濾過、またはSPRIビーズ精製による前記標的二本鎖DNA断片の濃縮を含む、請求項15~24のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅するステップが、少なくとも1つの非標準ヌクレオチドであるか、またはそれを含む少なくとも1つのプライマーを含む、請求項1~25のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのアダプター配列が、少なくとも1つの非標準ヌクレオチドであるか、またはそれを含む、請求項1~26のいずれか1項に記載の方法。
- 非標準ヌクレオチドが、ウラシル、メチル化ヌクレオチド、RNAヌクレオチド、リボースヌクレオチド、8-オキソ-グアニン、ビオチン化ヌクレオチド、デスチオビオチンヌクレオチド、チオール修飾ヌクレオチド、アクリダイト修飾ヌクレオチド、iso-dC、iso dG、2’-O-メチルヌクレオチド、イノシンヌクレオチド、ロックド核酸、ペプチド核酸、5メチルdC、5-ブロモデオキシウリジン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノプリンヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、5-ニトロインドールヌクレオチド、アデニル化ヌクレオチド、アジドヌクレオチド、ジゴキシゲニンヌクレオチド、Iリンカー、5’ヘキシニル修飾ヌクレオチド、5-オクタジイニルdU、光開裂性スペーサー、非光開裂性スペーサー、クリックケミストリー対応の修飾ヌクレオチド、蛍光色素、ビオチン、フラン、BrdU、フルオロ-dU、loto-dU、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項26または請求項27に記載の方法。
- 第1のDNA産物および第2のDNA産物の各々を配列決定することが、
第1のDNA産物中の複数の鎖の前記配列を比較して、第1の鎖のコンセンサス配列を決定することと、
前記第2のDNA産物中の複数の鎖の前記配列を比較して、第2の鎖のコンセンサス配列を決定することと、を含む、請求項1~28のいずれか1項に記載の方法。 - 第1のDNA産物の配列を第2のDNA産物の配列と比較することが、第1の鎖のコンセンサス配列と第2の鎖のコンセンサス配列を比較して、エラーが訂正されたコンセンサス配列を提供することを含む、請求項29に記載の方法。
- 第1のDNA産物および第2のDNA産物の各々を配列決定することが、
第1のDNA産物の鎖の少なくとも1つを配列決定して、第1の鎖の配列読取を決定することと、
第2のDNA産物の鎖の少なくとも1つを配列決定して、第2の鎖の配列読取を決定することと、
前記第1の鎖の配列読取と前記第2の鎖の配列読取とを比較して、エラーが訂正された配列読取を生成することと、を含む、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。 - エラーが訂正された配列読取が、第1の鎖の配列読取と第2の鎖の配列読取との間で一致するヌクレオチド塩基を含む、請求項31に記載の方法。
- エラーが訂正された配列読取の特定の位置で生じる変動が真のバリアントとして同定される、請求項31または請求項32に記載の方法。
- 第1の鎖の配列読取または前記第2の鎖の配列読取の一方のみの特定の位置で生じる変動が潜在的なアーティファクトとして同定される、請求項31~33のいずれか1項に記載の方法。
- エラーが訂正された配列読取が、変異原性化合物または曝露を同定するために使用される、請求項31~34のいずれか1項に記載の方法。
- エラーが訂正された配列読取が、発がん性化合物または曝露を同定するために使用される、請求項31~34のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA分子の二本鎖DNA断片が法医学試料に由来し、前記エラーが訂正された配列読取が法医学分析で使用される、請求項31~34のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの増幅するステップがポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項1~37のいずれか1項に記載の方法。
- 最大でも1000ngの二本鎖DNA断片が最初に提供される、請求項1~38のいずれか1項に記載の方法。
- 最大でも10ngの二本鎖DNA断片が最初に提供される、請求項1~39のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の試料中の第1の鎖または第1鎖増幅産物を増幅することが、分離するステップの後、および前記第1の試料を増幅することの前に、前記1つ以上の二本鎖DNA分子上に見られる第2のアダプター配列を破壊または崩壊することをさらに含む、請求項1~40のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の試料中の第2の鎖または第2鎖増幅産物を増幅することが、分離するステップの後、および前記第2の試料を増幅することの前に、前記1つ以上の二本鎖DNA分子上に見られる第1のアダプター配列を破壊または崩壊することをさらに含む、請求項1~41のいずれか1項に記載の方法。
- 破壊することが、酵素消化、少なくとも1つの複製阻害分子の含有、酵素的切断、一方の鎖の酵素的切断、両方の鎖の酵素的切断、一方もしくは両方の鎖の切断をもたらす酵素処理が後に続く修飾された核酸の取り込み、複製阻止ヌクレオチドの組み込み、連鎖停止剤の組み込み、光切断可能なリンカーの取り込み、ウラシルの取り込み、リボース塩基の取り込み、8-オキソ-グアニン付加物の組み込み、制限エンドヌクレアーゼの使用、標的化ヌクレアーゼの使用、およびそれらの任意の組み合わせの少なくとも1つを含む、請求項41または請求項42に記載の方法。
- 増幅することが、ローリングサークル増幅、多置換増幅、等温増幅、ブリッジ増幅、または表面結合増幅を含む、請求項1~43のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の鎖または第1鎖増幅産物を増幅すること、または、第2の鎖または第2鎖増幅産物を増幅することが、目的の配列に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド、および前記アダプターの領域に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含む、請求項1~44のいずれか1項に記載の方法。
- 複数の1つ以上の二本鎖DNA分子が、二本鎖DNA断片の両方の末端にアダプターを含む、請求項1~45のいずれか1項に記載の方法。
- 第1の鎖または第1鎖増幅産物を増幅すること、または、第2の鎖または第2鎖増幅産物を増幅することが、第1のアダプター配列および前記第2のアダプター配列の領域に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含む、請求項46に記載の方法。
- アダプターが、少なくとも部分的に非相補的であるか、または少なくとも1つの非標準塩基を含む少なくとも1つのヌクレオチド位置を含む、請求項1~47のいずれか1項に記載の方法。
- アダプターが、約5個以上の自己相補型ヌクレオチドによって形成される単一の「U字型」オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項1~48のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の二本鎖DNA分子の二本鎖DNA断片が、2つ以上の供給源に由来する、請求項1~49のいずれか1項に記載の方法。
- エラー訂正コンセンサス配列が第1の鎖のコンセンサス配列と第2の鎖のコンセンサス配列で一致するヌクレオチド塩基を含む、請求項30記載の方法。
- エラー訂正コンセンサス配列中の特定の位置で生じる変動が真のバリアントとして同定される、請求項30記載の方法。
- 第1の鎖のコンセンサス配列または第2の鎖のコンセンサス配列の一方のみの特定の位置で生じる変動が潜在的なアーティファクトとして同定される、請求項30記載の方法。
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US20230407370A1 (en) * | 2020-11-20 | 2023-12-21 | Camena Bioscience Limited | Geometric synthesis methods and compositions for double-stranded nucleic acid sequencing |
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US11680293B1 (en) * | 2022-04-21 | 2023-06-20 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules |
US12091715B2 (en) | 2022-04-21 | 2024-09-17 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for reducing base errors of massive parallel sequencing using triseq sequencing |
WO2023225175A1 (en) * | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Predicine, Inc. | Systems and methods for cancer therapy monitoring |
WO2024015869A2 (en) * | 2022-07-12 | 2024-01-18 | University Of Washington | Systems and methods for variant detection in cells |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013142389A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Methods of lowering the error rate of massively parallel dna sequencing using duplex consensus sequencing |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100331204A1 (en) * | 2009-02-13 | 2010-12-30 | Jeff Jeddeloh | Methods and systems for enrichment of target genomic sequences |
CN102482668A (zh) | 2009-08-20 | 2012-05-30 | 群体遗传学科技有限公司 | 分子内核酸重排的组合物和方法 |
US20160153039A1 (en) | 2012-01-26 | 2016-06-02 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
WO2013112923A1 (en) | 2012-01-26 | 2013-08-01 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation |
EP2820155B1 (en) * | 2012-02-28 | 2017-07-26 | Population Genetics Technologies Ltd. | Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample |
ES2905448T3 (es) * | 2012-05-10 | 2022-04-08 | Massachusetts Gen Hospital | Métodos para determinar una secuencia nucleotídica |
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JP6571665B2 (ja) * | 2013-12-28 | 2019-09-04 | ガーダント ヘルス, インコーポレイテッド | 遺伝的バリアントを検出するための方法およびシステム |
EP3363904B1 (en) * | 2014-01-31 | 2019-10-23 | Swift Biosciences, Inc. | Improved methods for processing dna substrates |
BR112016019267B8 (pt) * | 2014-02-18 | 2023-01-10 | Illumina Inc | Método para construir um perfil de dna, biblioteca de ácido nucléico, método para construir uma biblioteca de ácido nucléico, pluralidade de iniciadores e kit |
US10465241B2 (en) * | 2015-06-15 | 2019-11-05 | The Board Of Trustees Of The Leleand Stanford Junior University | High resolution STR analysis using next generation sequencing |
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