CN115735008A - 连续聚合酶链式反应用组合物及利用其的基因扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及连续聚合酶链式反应用组合物及利用其的基因扩增方法，上述连续聚合酶链式反应用组合物包含模板基因、DNA聚合酶、dNTP、第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物以及第三反向引物，由此，可在一个容器中诱导连续聚合酶链式反应。与以往的巢式(nested)PCR不同地，在本发明的连续聚合酶链式反应中省略反应物添加步骤，从外部流入的污染物质少，可提高基因的聚合酶链式反应(PCR)的收率，即使存在非常低的基因，也可获得重现性高的聚合酶链式反应结果。

Description

连续聚合酶链式反应用组合物及利用其的基因扩增方法
技术领域
本发明涉及连续聚合酶链式反应用组合物及利用其的基因扩增方法，更详细地，涉及如下的方法：在一个容器准备包含模板基因、DNA聚合酶、dNTP、第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物及第三反向引物的组合物，由此，可连续执行聚合酶链式反应，可根据温度调节各聚合酶链式反应，并可在一个容器依次进行，当扩增基因时，从外部流入的污染物质少，并可提高基因的聚合酶链式反应(PCR)的收率。
背景技术
分子诊断为通过分析基因来诊断疾病的领域，目前，在体外诊断领域中呈最高的增长趋势。实际上，随着被推测为快速的环境污染及气候变化导致的新型病毒的迅速扩散，正积极研究具有如下的优点的分子诊断：在体外诊断领域中确保最高的诊断准确度，在出现新型病毒的情况下，可迅速确认是否被感染。
为了分析碱基序列或碱基的变异，具有各种方法，但在使用所有方法之前，基本上需要获得大量的基因试样。目前，研究人员为了获得基因试样而最普遍使用的方法为利用DNA聚合酶的聚合酶链式反应(以下，称为“PCR”)。上述方法可通过设计能够与模板结合的引物来仅扩增基因的所要的部位。确定从基因所要扩增的区域，并确定可与所确定的部位的3'末端的碱基序列互补结合的碱基序列来设计引物。
在PCR的应用技术中，巢式(nested)PCR为可增加PCR扩增的特异性和灵敏度的技术，通常用于扩增纯度低的DNA或RNA时使用。在该方法中，利用目标基因的引物(primer)作为通过两种引物的连续PCR来执行第一聚合酶链式反应，通过使用与第一个PCR产物结合的二次引物来执行第二聚合酶链式反应。尤其，巢式PCR方法为利用第一个扩增引物进行扩增后，再次添加二次引物来进行扩增的方法，是提高灵敏度或需要特殊目的的扩增时普遍使用的方法。但是，巢式PCR通常使用两次不同的管，因此具有如下的问题：实验人员的操作步骤多且不便，且在处理扩增产物的过程中造成污染。相比于以往的PCR，需要如下的PCR方法：减少从外部的污染，并减少模板基因的扩增时间且增加扩增量，解决为了检测点突变而使用的通常的聚合酶链式反应中的收率(PCR YIELD)问题(通常，当进行用于检测点突变的PCR时，以低浓度使用引物的量，以略高于通常退火步骤的温度执行退火步骤，从而具有PCR收率减少的问题)。
发明内容
技术问题
分子诊断为通过分析基因来诊断疾病的领域，目前，在体外诊断领域中呈最高的增长趋势。实际上，随着被推测为快速的环境污染及气候变化导致的新型病毒的迅速扩散，正积极研究具有如下的优点的分子诊断：在体外诊断领域中确保最高的诊断准确度，在出现新型病毒的情况下，可迅速确认是否被感染。
为了分析碱基序列或碱基的变异，具有各种方法，但在使用所有方法之前，基本上需要获得大量的基因试样。目前，研究人员为了获得基因试样而最普遍使用的方法为利用DNA聚合酶的聚合酶链式反应(以下，称为“PCR”)。上述方法可通过设计能够与模板结合的引物来仅扩增基因的所要的部位。确定从基因所要扩增的区域，并确定可与所确定的部位的3'末端的碱基序列互补结合的碱基序列来设计引物。
在PCR的应用技术中，巢式PCR为可增加PCR扩增的特异性和灵敏度的技术，通常用于扩增纯度低的DNA或RNA时使用。在该方法中，利用目标基因的引物作为通过两种引物的连续PCR来执行第一聚合酶链式反应，通过使用与第一个PCR产物结合的二次引物来执行第二聚合酶链式反应。尤其，巢式PCR方法为利用第一个扩增引物进行扩增后，再次添加二次引物来进行扩增的方法，是提高灵敏度或需要特殊目的的扩增时普遍使用的方法。但是，巢式PCR通常使用两次不同的管，因此具有如下的问题：实验人员的操作步骤多且不便，且在处理扩增产物的过程中造成污染。相比于以往的PCR，需要如下的PCR方法：减少从外部的污染，并减少模板基因的扩增时间且增加扩增量，解决为了检测点突变而使用的通常的聚合酶链式反应中的收率问题(通常，当进行用于检测点突变的PCR时，以低浓度使用引物的量，以略高于通常退火步骤的温度执行退火步骤，从而具有PCR收率减少的问题)。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供连续聚合酶链式反应的执行方法，上述连续聚合酶链式反应包括：在一个容器准备包含模板基因、DNA聚合酶、dNTP、第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物及第三反向引物的组合物的步骤；第一聚合酶链式反应步骤；以及第二聚合酶链式反应步骤。
根据本发明的一实施例，上述第一聚合酶链式反应可包括：步骤a)，模板基因的双螺旋被解开来进行第一改性；步骤b)，在上述步骤a)的模板基因结合第一正向引物及第一反向引物来进行第一退火；以及步骤c)，通过在上述步骤b)中结合的第一正向引物及第二反向引物复制模板基因来合成第一产物。上述第二聚合酶链式反应步骤可包括：步骤d)，上述第一产物的双螺旋被解开来进行第二改性；步骤e)，在上述步骤d)的第一产物结合第一正向引物及第二反向引物来进行第二退火；步骤f)，通过在上述步骤e)中结合的第一正向引物及第二反向引物复制第一产物来合成第二产物；以及步骤g)，在上述第二产物结合第一正向引物来合成第三产物，在第三产物结合第三反向引物来合成最终产物。
本发明的上述第一聚合酶链式反应及第二聚合酶链式反应可根据温度调节，上述步骤e)的执行温度可高于步骤b)的执行温度。根据本发明的一实施例，上述步骤e)可在比上述步骤b)高5℃至30℃的温度下执行。根据本发明的再一实施例，当上述步骤b)在40℃以上且小于50℃的温度下执行时，上述步骤e)在50℃以上且72℃以下的温度下执行，当上述步骤b)在40℃以上且小于60℃的温度下执行时，上述步骤e)可在60℃以上且72℃以下的温度下执行。
根据本发明的一实施例，除与模板基因结合的序列之外，上述第二反向引物还可包含任意基因(衔接基因)序列。上述第二反向引物还包含任意基因序列，由此，在第二产物或第三产物可包含上述任意基因序列或其互补序列。
包含在本发明的上述第二反向引物中的任意基因序列并不特别受限，但不包含与第一产物的基因序列互补的基因序列，因此优选地，不与第一产物结合。
根据本发明的一实施例，上述组合物还可包含与上述第三产物结合的探针。在本发明中，与上述探针结合的第三产物的基因序列可以为与包含在第二反向引物中的任意基因序列互补的基因序列或其一部分序列。在本发明中，上述探针与基因序列(其与上述任意基因序列互补)结合，由此可确认第二产物是否存在，即，是否进行第二聚合酶链式反应。
根据本发明的一实施例，提供连续聚合酶链式反应用组合物，其包含模板基因、DNA聚合酶、dNTP，第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物及第三反向引物。
本发明还提供连续聚合酶链式反应用试剂盒，其包含模板基因、DNA聚合酶、dNTP、第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物及第三反向引物。
发明的效果
与以往的巢式PCR不同地，本发明的连续聚合酶链式反应用试剂盒及利用其的基因扩增方法省略反应物添加步骤，减少从外部流入的污染物质，并可缩短扩增时间。
在本发明的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的特征在于，在存在低浓度的靶基因(在相应PCR中成为复制对象的基因)的情况下，也具有高重现性。
例如，在常规103copy RT-PCR的情况下，当存在102copy的靶基因(targettemplate)时，才会示出具有重现性的PCR结果。相反，在本发明的连续聚合酶链式反应中，利用第二聚合酶链式反应、第二反向引物引物及第三反向引物，由此，在靶基因的浓度低的情况下，示出高重现性。
根据本发明的连续聚合酶链式反应方法具有如下的优点：降低第二反向引物的浓度，并提高第三反向引物的浓度，由此，可快速合成更多的产物，并可解决为了检测点突变而使用的常规聚合酶链式反应中的收率问题。
并且，本发明的聚合酶链式反应用试剂盒具有如下的优点：容易扩增少量(低浓度)的基因，由此，灵敏度高。
附图说明
图1为本发明一实施例的连续聚合酶链式反应的示意图。
图2为本发明一实施例的第一聚合酶链式反应的示意图。
图3为本发明一实施例的连续聚合酶链式反应的流程图。
图4为本发明再一实施例的连续聚合酶链式反应的流程图。
图5为示出本发明一实施例的连续聚合酶链式反应的T790M基因的扩增结果的图表。
图6为利用一实施例的常规聚合酶链式反应示出T790M基因的扩增结果的图表。
图7为本发明另一实施例的连续聚合酶链式反应步骤的示意图。
图8为利用再一实施例的常规聚合酶链式反应示出T790M基因的扩增结果的图表。
图9为本发明还有一实施例的连续聚合酶链式反应步骤的示意图。
图10为利用本发明另一实施例的常规聚合酶链式反应示出T790M基因的扩增结果的图表。
图11为本发明一实施例的连续聚合酶链式反应产物的电泳图片。
附图标记的说明
10：模板基因
20：第一正向引物
21：第一产物
30：第一反向引物
40：第二反向引物
50：第三反向引物
60：探针
具体实施方式
以下，详细说明本发明的优选实施例。参照后述的实施例，将可明确本发明的优点、特征以及实现上述优点、特征的方法。但是，本发明并不限定于以下所公开的实施例，可由互不相同的各种形式实现，本实施例仅使本发明的公开更加完整，并为了向本发明所属技术领域的普通技术人员完整地告知发明的范畴而提供，本发明仅被发明要求保护范围的范畴定义。在说明书全文中，相同的附图标记指代相同的结构要素。
除非另行定义，在本说明书中使用的所有术语(包括技术术语及科学术语)能够以本发明所属技术领域的普通技术人员共同理解的含义使用。并且，除非明确定义，由通常使用的词典定义的术语不应异常解释或过度解释。在本说明书中使用的术语用于说明实施例，并不限定本发明。在本说明书中，除非在语句中特别提及，否则单数型还包括复数型。
在本说明书中，“聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)”为扩增所要检测的特定模板基因的方法，作为聚合酶链式反应的变形方法包括以RNA为对象且利用逆转录酶合成互补的(complementary)DNA，并将其用作模板来实施聚合酶链式反应的逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)，以及在使用荧光物质扩增DNA的同时检测扩增产物的实时聚合酶链式反应等。
在本说明书中，除非特别提及，否则本发明的连续聚合酶链式反应包括利用本领域通常使用的方法进行的过程。
例如，用于本发明的连续聚合酶链式反应中的酶可包含具有核酸外部水解酶(exonuclease)活性的DNA Taq-聚合酶，这可同样用于第一聚合酶链式反应和第二聚合酶链式反应。
在本发明中，“引物”是指如下的短核酸序列：可由具有所要复制写短游离3'末端羟基(free 3'hydroxyl group)的核酸序列形成互补的模板和碱基对，并执行用于复制模板基因的开始位置的功能。上述引物的长度及序列应允许开始延伸产物的合成。引物的具体长度及序列不仅依赖所需的DNA或RNA靶的复杂性(complexity)，还依赖如温度及离子强度的引物利用条件。
在本说明书中，“模板基因”可包含双链DNA、单链RNA、cDNA、miRNA，最优选地，模板基因为DNA形式。
在本说明书中，“产物”是指根据聚合酶链式反应合成的基因。
在本说明书中，探针或引物的“分解”是指探针或引物的结构被物理或化学变形或破坏。
与普遍周知的聚合酶链式反应技术相同地，一个PCR步骤由3个步骤形成。在经过借助利用热量分离基因的热改性过程(denaturation，改性步骤)后，降低温度来使引物与所要扩增的序列末端结合(annealing，退火步骤)，略微提升热量来进行合成基因的聚合反应(polymerization or extension，基因合成步骤)。依次进行上述热改性步骤、退火步骤及基因合成步骤，将各步骤进行一次视为进行了一个循环(cycle)。例如，在本发明的第一聚合酶链式反应的情况下，在95℃的温度下执行改性步骤15秒钟、在65℃的温度下执行退火步骤30秒钟、在72℃的温度下执行基因合成步骤30秒钟后，此时，可视为第一聚合酶链式反应执行1循环(次)。
本发明的“连续聚合酶链式反应”可包括：在一个容器准备包含模板基因、DNA聚合酶、dNTP、第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物及第三反向引物的组合物的步骤；第一聚合酶链式反应步骤；以及第二聚合酶链式反应步骤。
本发明的上述第一聚合酶链式反应步骤可包括：步骤a)，模板基因的双螺旋被解开来进行第一改性；步骤b)，在上述步骤a)的模板基因结合第一正向引物及第一反向引物来进行第一退火；以及步骤c)，通过在上述步骤b)中结合的第一正向引物及第二反向引物复制模板基因来合成第一产物。上述第二聚合酶链式反应步骤可包括：步骤d)，上述第一产物的双螺旋被解开来进行第二改性；步骤e)，在上述步骤d)的第一产物结合第一正向引物及第二反向引物来进行第二退火；步骤f)，通过在上述步骤e)中结合的第一正向引物及第二反向引物复制第一产物来合成第二产物；以及步骤g)，在上述第二产物结合第一正向引物来合成第三产物，在第三产物结合第三反向引物来合成最终产物。
在本说明书中，“容器”包括能够诱发聚合酶链式反应的所有形式的实验工具。本发明的特征在于，在一个容器内，连续或单独进行互不相同的聚合酶链式反应。
在本说明书中，“连续聚合酶链式反应(以下，称为“转换(switching)PCR”)”是指连续、依次产生使模板基因扩增的第一聚合酶链式反应及使第一聚合酶链式反应的产物扩增的第二聚合酶链式反应的反应，可根据温度调节各聚合酶链式反应是否开始。本发明的连续聚合酶链式反应可追加进行至第三聚合酶链式反应、第四聚合酶链式反应或之后的步骤为止。
在本发明的续聚合酶链式反应中，排除第一聚合酶链式反应与第二聚合酶链式反应之间的单独的反应物添加步骤，可在一个容器内，连续、单独进行第一聚合酶链式反应和第二聚合酶链式反应。与现有的巢式(nested PCR)反应不同地，本发明的“连续聚合酶链式反应”省略了添加反应物的中间步骤，可缩短基因扩增时间，并可防止外部物质引起的污染。
上述第一聚合酶链式反应或第二聚合酶链式反应可进行多个循环，在本发明的连续聚合酶链式反应中，作为一部分，可利用巢式PCR技术。本发明经过多个PCR步骤，即使模板基因以低浓度存在，也可快速扩增基因。
如常规聚合酶链式反应，本发明的主要目的为扩增模板基因的量，可将本发明的“连续聚合酶链式反应”的第一聚合酶链式反应和第二聚合酶链式反应执行数次来合成大量的最终基因(最终产物)。如上所述，在本发明的各步骤中，所合成的基因用于之后的反应或者残留。
在本发明中，表示引物的合成开始方向的“正向”或“反向”是指各引物之间的合成方向不同或相同，并不特定复制对象基因(例如模板基因)的5'->3'或3'->5'的基因合成方向。即，根据复制对象基因的引物的基因合成方向可不同，但反向引物之间的合成方向相同，与正向引物相反。
例如，在模板基因为双链的情况下，第一正向引物及第一反向引物分别可复制互补的模板基因链(第一聚合酶链式反应)。之后，第一正向引物与通过第一反向引物合成的第二产物结合，第二反向引物与通过第一正向引物合成的第二产物结合，由此，可复制基因链(第二聚合酶链式反应)。上述第一正向引物可通过第二反向引物与所合成的第二产物结合来开始第三产物的合成，此时，当在第二反向引物中追加包含任意基因序列时，在第三产物中可附加合成与任意基因序列互补的基因序列。第三反向引物可与通过第一正向引物合成的第三产物结合来开始最终产物的合成。此时，若在第三产物中所包含的“与任意基因序列互补的序列”结合探针及第三反向引物，则根据第三反向引物的基因合成开始，上述探针从第三产物中脱落并发光。在此情况下，第三产物合成才能确认通过探针的发光，因此，可知已进行第二聚合酶链式反应。
如前述内容可知，本发明的第一产物或第二产物可由双链构成，本发明的各引物与基因序列(其与各个基因互补)结合来进行之后的反应。
在本说明书中，“第一正向引物”及“第一反向引物”是指与模板基因结合来使模板基因开始的引物。根据第一正向引物及第一反向引物的模板基因复制开始合成第一产物。在本发明中，“第一反向引物”设计成仅与模板基因结合，但“第一正向引物”不仅与模板基因结合，还可与第一产物、第二产物或第三产物结合来开始复制。
在本说明书中，“第二反向引物”是指与上述第一产物结合的引物，第二反向引物设计成如下：可与模板链结合，但可通过调节活性温度及第一退火步骤的温度来使其不参与第一聚合酶链式反应。在模板基因为DNA的情况下，第一产物也为双链，第一正向引物与第一产物基因链(结合有第二反向引物)的互补链结合来开始第一产物基因的复制。此时，第二反向引物还可包含并不包含在第一产物或模板基因中的任意基因(衔接基因)序列，上述任意基因可位于第二反向引物的5'末端。因此，通过第二反向引物合成的第二产物中可包含并不包含在模板基因中的上述任意基因序列。
通过上述第二反向引物合成的第二产物可与第一正向引物结合来开始第三产物的合成。
在本说明书中，“第三反向引物”是指与上述第三产物结合的引物。上述第三反向引物可与存在于“第三产物”中的“与上述任意基因序列互补的基因序列”结合。根据本发明，第三反向引物与上述“与任意基因序列互补的基因序列”结合，并不参与第一聚合酶链式反应。
当进行聚合酶链式反应时，为了检测模板基因的点突变(point mutation)，通常降低所利用的引物的浓度，在此情况下，具有减少最终生成的产物的量(收率)的问题。为了解决如上所述的问题，本发明利用包含任意基因的第二反向引物及第三反向引物。在本发明中，第二反向引物(优选地，在5'末端)可包含任意基因(衔接基因)，将第一产物用作模板来开始第二聚合酶链式反应。根据本发明，在通过上述第二反向引物合成的第二产物中可结合第一正向引物，由此，合成包含“与任意基因(衔接基因)互补的基因”的上述第三产物。第三反向引物与包含在上述第三产物中的“与任意基因(衔接基因)互补的基因”结合来开始最终产物的合成，第三反向引物的浓度可与点突变无关地以高浓度利用，因此，可生成更多的产物。即，为了解决用于检测点突变的常规聚合酶链式反应中的收率问题(通常，当进行用于检测点突变的PCR时，以低浓度使用引物的量，以略高于常规退火步骤的温度执行退火步骤，由此具有减少PCR收率的问题。)，降低所利用的第二反向引物的浓度，并可提高第三反向引物的浓度，因此，可快速合成更多的产物。
在本说明书中，引物的“设计”是指以使引物在特定条件(例如，温度)下激活或封闭(blocking)的方式制备引物，可利用本领域通常使用的引物设计方法。上述设计方法中包括调节引物的长度(mer)或序列的方法，但并不限定于此。
在本说明书中，“封闭”可以是指在靶基因(在相应PCR中成为复制对象的基因(template))中引物未被退火。
图1为本发明一实施例的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的示意图。参照图1，第一引物与模板基因结合，诱导引物可与第一产物结合来合成第二产物。图1仅为由一个示意图示出第一聚合酶链式反应和第二聚合酶链式反应步骤，第一聚合酶链式反应和第二聚合酶链式反应并不是同时进行。
在本发明中，第一聚合酶链式反应和第二聚合酶链式反应的各退火步骤的温度可设置得不同，优选地，第二聚合酶链式反应的退火步骤的温度高于第一聚合酶链式反应的退火温度。例如，上述第二聚合酶链式反应的退火步骤可在比上述第一聚合酶链式反应的退火步骤高5℃至30℃的温度下执行。根据本发明，各引物被激活的温度可互不相同。此时，优选地，第一正向引物的激活温度以最宽的范围设计，优选地，第二反向引物及第三反向引物的激活温度应设计得高于第一反向引物的激活温度。例如，第二反向引物或第三反向引物的激活温度可设计成比第一反向引物的激活温度高5℃至30℃。
本发明的第一聚合酶链式反应的退火步骤可在比第二聚合酶链式反应的退火步骤低5℃至30℃的温度下进行，通过第一反向引物的基因合成开始，激活核酸外部水解酶。即，在第一聚合酶链式反应中，仅可由第一正向引物及第一反向引物合成第一产物。第二聚合酶链式反应的退火步骤可在比第一聚合酶链式反应的退火步骤高5℃至30℃的温度下进行，通过相对高的温度，不进行通过第一反向引物的反应，相反，第二反向引物可与第一产物结合，由此仅进行第二聚合酶链式反应。
具体地，图3及图4示出本发明的连续聚合酶链式反应的示意图。
根据图3，在第一聚合酶链式反应中，在模板基因链10结合第一正向引物20及第一反向引物30来开始基因合成。根据第一聚合酶链式反应合成第一产物21，再次在第一产物结合第一正向引物20及第二反向引物40来进行第二聚合酶链式反应。参照图3，第一反向引物30在第一聚合酶链式反应中激活，但在第二聚合酶链式反应中不被激活。
参照图4，可在根据第二聚合酶链式反应的第一产物结合第一正向引物20及第二反向引物40来合成基因。此时，除与第一产物结合的基因序列(或与模板基因结合的基因序列)之外，第二反向引物40还可包含任意基因序列。除模板基因之外，通过第二反向引物合成的第二产物还包含任意基因序列。本发明的探针可与在第二产物中合成的任意基因结合。在第三反向引物50与第二产物结合来开始基因的合成的情况下，上述探针的从第二产物脱落并示出特定信号，掌握相应信号，可知已进行第二聚合酶链式反应。
根据本发明的一实施例，第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物、第三反向引物及探针可由如下述表1的序列构成。
表1
Figure BDA0004014535250000121
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本领域技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。
实施例1
1-1：利用以往浓度的模板基因的转换PCR反应
向PCR管添加10μl的qPCR反应混合物(Master mix)。之后，添加1μl的模板基因DNA(T790M)，并添加各1μl的浓度为10uM的第一正向引物及第一反向引物、1ul的浓度为10uM的第二反向引物、1ul的第三反向引物、0.5ul的探针。向上述管还添加7μl的蒸馏水后，进行移液(pipetting)(将此时制备的试剂盒称为实验组1)。之后，向PCR机器(Bio-Rad CFX96TM)的孔(well)放入管，将温度调节得如下述表2来进行20次第一聚合酶链式反应、40次第二聚合酶链式反应。
表2
Figure BDA0004014535250000131
1-2：利用稀释浓度的模板基因的转换PCR反应
将模板基因DNA(T790M)设置成1/2μl(实验组2)、1/4μl(实验组3)、1/6μl(实验组4)、1/8μl(实验组5)、1/10μl(实验组6)浓度来制备实验组，剩余条件设置得与实验例1-1相同来进行实验。
实施例1-1、实施例1-2的结果值如下述表3及表4。图5为示出根据本发明的实施例1-1、实施例1-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的T790M基因的扩增结果的图表。
表3
Figure BDA0004014535250000132
Figure BDA0004014535250000141
表4
Figure BDA0004014535250000142
1-3：利用标准浓度的模板基因的标准PCR反应
向PCR管添加10μl的qPCR Master mix。之后，添加1μl的模板基因DNA(T790M)，并添加各0.5μl的浓度为10uM的第一正向引物及第一反向引物。向上述管还添加7μl的蒸馏水后，进行移液(将此时制备的试剂盒称为对照组1)。之后，向PCR机器(Bio-Rad CFX96TM)的孔放入管，将温度调节得如下述表5，由此，进行60次PCR。
表5
Figure BDA0004014535250000151
1-4：利用稀释浓度的模板基因的标准PCR反应
将模板基因DNA(T790M)设置成1/2μl(实验组2)、1/4μl(实验组3)、1/6μl(实验组4)、1/8μl(实验组5)、1/10μl(实验组6)浓度来制备实验组，剩余条件设置得与实验例2-1相同来进行实验。
实施例1-3、实施例1-4的结果值如下述表6及表7。图6为示出根据本发明的实施例1-3、实施例1-4的T790M基因的扩增结果的图表。
表6
Figure BDA0004014535250000152
表7
Figure BDA0004014535250000153
Figure BDA0004014535250000161
参照图5，实施例1-1、实施例1-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的结果T790M基因示出18循环至24循环的Cq或Ct值，参照图6，当根据实施例1-3、实施例1-4的标准PCR方法扩增T790M基因时，在48循环至50循环中扩增。这与表3、表4、表6及表7的内容相同。在本发明的连续聚合酶链式反应(转换PCR)中，考虑在第二聚合酶链式反应中进行扩增，可知实施例1-1、实施例1-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的结果T790M基因在38循环至44循环(第一聚合酶链式反应进行20循环)中具有Cq或Ct值。在实施例1-1至实施例1-4，作为模板基因的T790M基因浓度越低，Cq或Ct值增加，与浓度无关地，实施例1-1及实施例1-2的扩增循环值低于实施例1-3及实施例1-4的值。因此，可知本发明的连续聚合酶链式反应(转换PCR)方法可在一个实验器具独立进行第一聚合酶链式反应和第二聚合酶链式反应。
实施例2
2-1：利用标准浓度的模板基因的转换PCR反应
以与实施例1-1相同的条件进行了PCR。
2-2：利用稀释浓度的模板基因的转换PCR反应
以与实施例1-2相同的条件进行PCR。
实施例2-1、实施例2-2的结果值如下述表8及表9。图7为示出根据本发明的实施例2-1、实施例2-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的T790M基因的扩增结果的图表。
表8
Figure BDA0004014535250000171
表9
Figure BDA0004014535250000172
Figure BDA0004014535250000181
2-3：利用标准浓度的模板基因的标准PCR反应
以与实施例1-3相同的条件进行PCR。
2-4：利用稀释浓度的模板基因的标准PCR反应
以与实施例1-4相同的条件进行PCR。
实施例2-3、实施例2-4的结果值如下述表10及表11。图8为示出根据本发明的实施例2-3、实施例2-4的T790M基因的扩增结果的图表。
表10
Figure BDA0004014535250000182
Figure BDA0004014535250000191
表11
Figure BDA0004014535250000192
参照图7，实施例2-1、实施例2-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的结果T790M基因示出18循环至24循环的Cq或Ct值，参照图8，当根据实施例2-3、实施例2-4的标准PCR方法扩增T790M基因时，在48循环至60循环示出Cq或Ct值。这与表8、表9、表10及表11的内容相同。在本发明的连续聚合酶链式反应(转换PCR)中，考虑在第二聚合酶链式反应中进行扩增，可知实施例2-1、实施例2-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的结果T790M基因在38循环至44循环(第一聚合酶链式反应进行20循环)中具有Cq或Ct值。在实施例2-1至实施例2-4，作为模板基因的T790M基因浓度越低，Cq或Ct值增加，与浓度无关地，实施例2-1及实施例2-2的Cq或Ct值低于实施例2-3及实施例2-4的值。因此，可知本发明的连续聚合酶链式反应(转换PCR)方法可提高基因聚合酶链式反应(PCR)的收率，在存在非常低的基因的情况下，也可获得重现性高的聚合酶链式反应结果。
实施例3
3-1：利用标准浓度的模板基因的转换PCR反应
以与实施例1-1相同的条件进行PCR。
3-2：利用稀释浓度的模板基因的转换PCR反应
以与实施例1-2相同的条件进行PCR。
实施例3-1、实施例3-2的结果值如下述表12。图9为示出根据本发明的实施例3-1、实施例3-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的T790M基因的扩增结果的图表。
表12
Figure BDA0004014535250000201
3-3：利用标准浓度的模板基因的标准PCR反应
以与实施例1-3相同的条件进行PCR。
3-4：利用稀释浓度的模板基因的标准PCR反应
以与实施例1-4相同的条件进行PCR。
实施例3-3、实施例3-4的结果值如下述表13。图10为示出根据本发明的实施例3-3、实施例3-4的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的T790M基因的扩增结果的图表。
表13
Figure BDA0004014535250000211
参照图9，实施例3-1、实施例3-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的结果T790M基因示出18循环至24循环的Cq或Ct值，参照图10，当根据实施例3-3、实施例3-4的标准PCR方法扩增T790M基因时，在48循环至60循环中具有Cq或Ct值。这与表12及表13的内容相同。在本发明的连续聚合酶链式反应(转换PCR)中，考虑在第二聚合酶链式反应中进行扩增，可知实施例3-1、实施例3-2的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的结果T790M基因在38循环至44循环(第一聚合酶链式反应进行20循环)中具有Cq或Ct值。在实施例3-1至实施例3-4，作为模板基因的T790M基因浓度越低，Cq或Ct值增加，与浓度无关地，实施例3-1及实施例3-2的Cq或Ct值低于实施例3-3及实施例3-4的值。因此，可知本发明的转换PCR方法可缩短基因扩增时间，可提高基因聚合酶链式反应(PCR)的收率，在存在非常低的基因的情况下，也可获得重现性高的聚合酶链式反应结果。
并且，在本发明的实施例3-2中，连续聚合酶链式反应(转换PCR)在1/8％(实验组5)、1/10％(实验组6)两种浓度中均示出100％检测率，在实施例3-4的标准PCR的情况下，在1/8％的浓度中示出75％的检测率，在1/10％的浓度中示出80％的检测率，由此，可知在两种浓度中均示出低于95％的检测率。即，在本发明的连续聚合酶链式反应(Switching PCR)中，在模板基因(template)的浓度低的情况下，也容易扩增，利用本发明的试剂盒的连续聚合酶链式反应(转换PCR)的灵敏度更高。
实施例4
4-1：利用标准浓度的模板基因的标准PCR反应
向PCR管添加10μl的qPCR Master mix。之后，添加100fg/μl的模板基因DNA(T790M)，并添加各0.5μl的浓度为10uM的第一正向引物及第一反向引物、1ul的浓度为10uM的第二反向引物、1ul的浓度为10uM的第三反向引物及0.5ul的探针。向上述管还添加7μl的蒸馏水后，进行移液。之后，向PCR机器(Bio-Rad CFX96TM)的孔放入管，将温度调节得如下述表14来进行40循环的PCR。
表14
Figure BDA0004014535250000221
4-2：利用标准浓度的模板基因的标准PCR反应
将温度设置得如下述表15，将其他实验条件设置得与实施例4-1相同，由此进行PCR。
表15
Figure BDA0004014535250000222
4-3：利用标准浓度的模板基因的标准PCR反应
将温度设置得如下述表16来进行第一聚合酶链式反应及第二聚合酶链式反应，将其他实验条件设置得如实施例4-1来进行PCR。
表16
Figure BDA0004014535250000231
4-4：利用标准浓度的模板基因的标准PCR反应
将模板基因DNA(T790M)的浓度设置成0，并将其他实验条件设置成如实施例4-1来进行PCR。
图11为本发明一实施例的PCR产物的电泳图片。图11的①示出实施例4-1的结果，②示出实施例4-2的结果，③示出实施例4-3的结果，④示出实施例4-4的结果。参照图11，①中示出110bp中的荧光，②中示出131bp附近的带，④中未示出带。基于此，若判断③，带在110bp中示出得弱，带在131bp附近示出得强，由此可知均生成110bp、131bp大小的产物。即，可知，在①及②中，分别可仅合成一个产物，在③中，可合成①、②的产物。
在图11的上述①中，第二反向引物在第一聚合酶链式反应中未被激活，仅形成第一产物(110bp)，在②中，第一反向引物因高温而未激活，由此，仅合成第二产物(131bp)。相反，在图11的③中，可确认，第一聚合酶链式反应进行10循环，第二聚合酶链式反应进行30循环，且与所执行的循环成比的基因的带共存(110bp、131bp)。根据本发明的实施例4-3，设计可在各聚合酶链式反应的退火温度中激活的引物，在第一聚合酶链式反应中激活第一正向引物及第一反向引物，在第二聚合酶链式反应中激活第一正向引物及第二反向引物，由此可知，第一产物及第二产物均形成。
以上，说明了本发明的实施例，本发明所属技术领域的普通技术人员应理解的是，在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下，可实施为其他具体形式。因此，应理解的是，以上所描述的实施例在所有方面仅为例示，并不是限定性的。

Claims (10)

1.一种连续聚合酶链式反应的执行方法，上述连续聚合酶链式反应包括：
在一个容器准备包含模板基因、DNA聚合酶、dNTP、第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物及第三反向引物的组合物的步骤；
第一聚合酶链式反应步骤；以及
第二聚合酶链式反应步骤，
上述连续聚合酶链式反应的执行方法的特征在于，
上述第一聚合酶链式反应步骤包括：
步骤a)，模板基因的双螺旋被解开来进行第一改性；
步骤b)，在上述步骤a)的模板基因结合第一正向引物及第一反向引物来进行第一退火；以及
步骤c)，通过在上述步骤b)中结合的第一正向引物及第二反向引物复制模板基因来合成第一产物，
上述第二聚合酶链式反应步骤包括：
步骤d)，上述第一产物的双螺旋被解开来进行第二改性；
步骤e)，在上述步骤d)的第一产物结合第一正向引物及第二反向引物来进行第二退火；
步骤f)，通过在上述步骤e)中结合的第一正向引物及第二反向引物复制第一产物来合成第二产物；以及
步骤g)，在上述第二产物结合第一正向引物来合成第三产物，在第三产物结合第三反向引物来合成最终产物。
2.根据权利要求1所述的连续聚合酶链式反应的执行方法，其特征在于，
上述步骤e)在高于上述步骤b)的温度下执行，
上述第二反向引物设计成在高于上述第一反向引物的温度下被激活。
3.根据权利要求1所述的连续聚合酶链式反应的执行方法，其特征在于，上述步骤e)在比上述步骤b)高5℃至30℃的温度下执行。
4.根据权利要求1所述的连续聚合酶链式反应的执行方法，其特征在于，上述第一聚合酶链式反应及第二聚合酶链式反应根据温度被调节。
5.根据权利要求1所述的连续聚合酶链式反应的执行方法，其特征在于，除与模板基因互补的序列之外，上述第二反向引物还包含任意基因序列。
6.根据权利要求5所述的连续聚合酶链式反应的执行方法，其特征在于，
与上述任意基因序列互补的基因序列包含在第二产物中，
上述第三反向引物和包含在上述第二产物中的与任意基因序列互补的基因序列结合来合成最终产物。
7.根据权利要求1所述的连续聚合酶链式反应的执行方法，其特征在于，
上述组合物还包含与上述第三产物结合的探针，
上述探针所结合的第三产物的基因序列为与包含在第二反向引物中的任意基因序列互补的基因序列。
8.根据权利要求7所述的连续聚合酶链式反应的执行方法，其特征在于，上述探针根据第三反向引物的基因合成被分解并发光。
9.一种连续聚合酶链式反应用组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的模板基因、DNA聚合酶、dNTP、第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物及第三反向引物。
10.一种连续聚合酶链式反应用试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的模板基因、DNA聚合酶、dNTP、第一正向引物、第一反向引物、第二反向引物及第三反向引物。
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