CN112795699A - 一种rt-raa荧光法检测hiv-1病毒不同亚型通用引物、探针及检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测HIV‑1病毒核酸的恒温荧光扩增引物组探针组、试剂盒及检测方法，具有耗时短、易于操作的特点。引物探针组的核苷酸序列为：上游引物的基因序列为SEQ ID NO.1，下游引物的基因序列为SEQ ID NO.2；探针的的基因序列为SEQ ID NO.3。探针具体为核苷酸序列的第30位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。试剂盒含有上述引物组探针组。本发明的引物探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。本发明的RT‑RAA一步法检测HIV‑1病毒RNA，30分钟内可以完成检测，可成为HIV‑1病毒核酸的现场快速检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测热技术领域，特别是涉及一种用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物组、探针、方法及试剂盒。
背景技术
目前HIV-1病毒核酸检测应用最为广泛的方法为聚合酶链式反应(PCR)技术，包括多重PCR、巢氏PCR以及实时荧光定量PCR技术在内的HIV-1核酸PCR检测方法等,需要经过变性、退火、延伸等热循环过程才能实现核酸的扩增检测，不仅需要专业的仪器设备以及技术人员，而且整个检测时间通常在2-4小时，限制了其在基层的应用和现场快速检测的需要。近年来发展起来的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)采用链置换活性的DNA聚合酶，根据DNA复性及延伸在60-65℃完成，且核酸在该温度下处于动态平衡状态的原理，实现在该温度条件下恒温扩增的目的，不需要专业的热循环扩增仪器且避免了热循环而造成的时间损失，扩增过程通常在30-60分钟内完成。而且LAMP技术针对目标序列的6个区域设计4条特异性的引物，扩增效率高，灵敏度和特异性较好，但是与传统的PCR方法相比，对引物设计的要求较高。
因此，针对现有技术不足，提供一种耗时短、易于操作的用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物组、探针、方法及试剂盒以克服现有技术不足甚为必要。
说明本发明的目的(客观评价)：
本发明的目的在于提供一种耗时短、易于操作的快速检测HIV-1病毒核酸的引物和探针组及检测方法。本发明采用逆转录-重组酶介导的扩增技术一步法检测HIV-1病毒RNA。该技术的原理是反应体系中的重组酶、单链结合蛋白、引物形成的复合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋，单链结合蛋白阻止单链DNA复性，在能量和dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶介导完成链的延伸。本发明检测过程是在RAA反应体系中加入逆转录酶，以病毒RNA为模板，实现DNA的扩增，无需先将HIV-1病毒RNA逆转录为cDNA，再高温使DNA解旋，只需在37～42℃条件下同步进行逆转录及等温扩增，30分钟内可以完成检测。该技术不依赖于传统PCR方法的热循环解链，主要由重组酶和聚合酶介导完成，可以实现恒温扩增，不需要专业的热循环扩增仪器且避免了热循环而造成的时间损失。同时在反应体系中加入荧光探针，随着扩增产物的增加，荧光信号随之累积，实现实时检测。相对于LAMP技术，扩增温度更低，且对引物的设计要求更低。在本发明中，我们通过对从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中下载的60条，包括HIV-1主要基因型和中国常见的流行重组病毒(circulating recombinantforms,CRF)全基因序列分析后，选择较为保守的pol基因序列进行引物和探针设计。通过筛选，优选出最佳的引物探针组可以同时实现目前中国比较流行的HIV-1B、HIV-1CRF01-AE，HIV-1CRF-07BC，HIV-1CRF-08BC亚型样本的核酸检测。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物探针组、试剂盒及检测方法，具有耗时短、易于操作的特点。
本发明的目的通过以下技术措施实现。
提供一种用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物探针组，引物探针组的核苷酸序列为：
上游引物：5’-TACAAATGGCAGTATTYATYCACAATTTTAA-3’；
下游引物：5’-TCTCTGCTGTCYCTGTAATAAACCCGRAAAT-3’；
探针的核苷酸序列为：
5’-GATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATARTAGAYATAATAGCAAC-3’。
优选的，探针具体为核苷酸序列的第30位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质，并对探针的3’末端进行C3-Spacer修饰。
优选的，探针第30位碱基修饰的荧光报告基团为FAM，第33位碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明的第二个目的是提供一种检测HIV-1病毒的试剂盒，含有上述的引物探针组。
优选的，检测HIV-1病毒的试剂盒，上游引物浓度为20-50μM，下游引物浓度为20-50μM，探针浓度为10-30μM。
优选的，上游引物浓度为30μM，下游引物浓度为30μM，探针浓度为20μM。
优选的，上述的检测HIV-1病毒的试剂盒，还包括荧光RT-RAA反应单元、反应缓冲液、醋酸镁，阴性对照以及阳性对照；
所述荧光RT-RAA反应单元含有：ATP、dNTPs、重组酶、单链结合蛋白、核酸外切酶、DNA聚合酶、逆转录酶。
本发明还提供一种检测HIV-1病毒的方法，通过如下步骤进行：
(1)提取待检样本的RNA；
(2)以提取的RNA为模板，采用权利要求1至3任意一项所述的上游引物、下游引物、探针、以及权利要求5至7任意一项所述的试剂盒，进行RT-RAA扩增，获得扩增曲线；
(3)对扩增曲线进行分析，判断样品中是否含有HIV-1病毒。
优选的，步骤(2)中的扩增体系为：2.1μL的HIV-1上游引物，2.1μL的HIV-1下游引物，0.6μL的HIV-1探针与40.7μL的缓冲液混合后所得的缓冲液溶解RT-RAA反应单元，醋酸镁2.5μL，RNA模板2ul，RT-RAA反应单元为冻干粉；
步骤(2)中所述的扩增程序为：39-42℃孵育4-6min，扩增37-42℃，检测时间为30min。
优先的步骤(3)中的判断标准是，有扩增曲线且斜率值K≥20时，判定为阳性；无扩增曲线或扩增曲线斜率值K＜20时判定为阴性。
在本发明中，所述待测样品为可能含有HIV-1病毒核酸的样本，本发明对待测样本的提取方法没有特殊限定，采用病毒RNA的常规提取方法即可。
本发明提供的引物探针检测HIV-1病毒时与沙眼衣原体、梅毒螺旋体、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒无交叉反应，特异性强，为100％。检测灵敏度为20拷贝/反应。且本发明提供的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于基层及现场快速诊断。
本发明提供的引物探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。本发明提供的RT-RAA一步法检测HIV-1病毒RNA，无需先将HIV-1病毒RNA逆转录为cDNA，再高温使DNA解旋，只需在37～42℃条件下同步进行逆转录及等温扩增，30分钟内可以完成检测，可成为HIV-1病毒核酸的现场快速检测方法。
本发明采用逆转录-重组酶介导的扩增技术一步法检测HIV-1病毒RNA。该技术的原理是反应体系中的重组酶、单链结合蛋白、引物形成的复合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋，单链结合蛋白阻止单链DNA复性，在能量和dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶介导完成链的延伸。本发明检测过程是在RAA反应体系中加入逆转录酶，以病毒RNA为模板，实现DNA的扩增，无需先将HIV-1病毒RNA逆转录为cDNA，再高温使DNA解旋，只需在37～42℃条件下同步进行逆转录及等温扩增，30分钟内可以完成检测。该技术不依赖于传统PCR方法的热循环解链，主要由重组酶和聚合酶介导完成，可以实现恒温扩增，不需要专业的热循环扩增仪器且避免了热循环而造成的时间损失。同时在反应体系中加入荧光探针，随着扩增产物的增加，荧光信号随之累积，实现实时检测。相对于LAMP技术，扩增温度更低，且对引物的设计要求更低。在本发明中，我们通过对从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中下载的60条，包括HIV-1主要基因型和中国常见的流行重组病毒(circulating recombinant forms,CRF)全基因序列分析后，选择较为保守的pol基因序列进行引物和探针设计。通过筛选，优选出最佳的引物探针组可以同时实现目前中国比较流行的HIV-1B、HIV-1CRF01-AE，HIV-1CRF-07BC，HIV-1CRF-08BC亚型样本的核酸检测。
说明书附图
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1为最佳引物探针组1×101-1×103拷贝/ul的HIV-1病毒01AE型重组DNA质粒扩增图。
图2为最佳引物探针组1×101-1×103拷贝/ul的HIV-1病毒B型重组DNA质粒扩增图。
图3为最佳引物探针组1×101-1×103拷贝/ul的HIV-1病毒07BC型重组DNA质粒扩增图。
图4为最佳引物探针组1×101-1×103拷贝/ul的HIV-1病毒08BC型重组DNA质粒扩增图。
图5为本发明实施例3提供的HIV-1病毒的特异性检测结果图。
图6为本发明实施例4提供的HIV/AIDS临床核酸样本的检测结果图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1。
提供一种用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物探针组，引物探针组的核苷酸序列为：
上游引物：5’-TACAAATGGCAGTATTYATYCACAATTTTAA-3’；
下游引物：5’-TCTCTGCTGTCYCTGTAATAAACCCGRAAAT-3’；
探针的核苷酸序列为：
5’-GATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATARTAGAYATAATAGCAAC-3’。
探针具体为核苷酸序列的第30位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质，并对探针的3’末端进行C3-Spacer修饰。探针第30位碱基修饰的荧光报告基团具体为FAM，第33位碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1。
以一具体实例说明RT-RAA引物组和探针的设计。
通过对从美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)中下载的60条，包括HIV-1主要基因型和中国常见的流行重组病毒(circulating recombinant forms,CRF)全基因序列分析后，选择较为保守的pol基因序列进行引物和探针设计。筛出HIV-1病毒序列中保守度及特异性俱佳的区间SEQ ID NO.4(01AE亚型)、SEQ ID NO.5(B亚型)、SEQ ID NO.6(07BC亚型)、SEQ ID NO.7(08BC亚型)。在已选择的区间上优先进行探针的设计，探针设计的方法与原则为：探针长度选择46-52个碱基，荧光报告基团和荧光淬灭基团修饰在碱基T上，荧光报告基团和荧光淬灭基团间隔距离不超过5个碱基，间隔碱基越少，荧光本底干扰就越小，根据以上设计要求确定探针位置，设计探针序列。
探针序列：
5’-GATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATARTAGAYATAATAGCAAC(SEQ ID NO.3)-3’。
探针具体为核苷酸序列的第30位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质，并对探针的3’末端进行C3-Spacer修饰。探针第30位碱基修饰的荧光报告基团具体为FAM，第33位碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1。
确定探针以后进行引物设计，引物设计方法与原则为：引物长度必须≥30个碱基且需避免发卡结构和引物二聚体的形成，针对区间SEQ ID NO.4设计了16对特异性引物和探针进行引物探针灵敏度筛选。
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成HIV-1病毒重组DNA质粒(pUC-57-01AE、pUC-57-B、pUC-57-07BC、pUC-57-08BC质粒)，质粒大小均为3221bp；将合成的质粒用紫外分光光度计进行浓度测定，计算拷贝数后，梯度制备工作标准品备用，分别为：工作标准品1-3，分别含有1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/ul的HIV-1病毒01AE型重组DNA质粒。用工作标准品进行引物探针组合的筛选，通过筛选，优选出灵敏度达到20拷贝/反应的引物探针组，具体实施方法为：
(1)按探针20μM和引物30μM浓度配制16对引物探针组溶液，准备好工作标准品和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数设置为温度42℃，反应时间为30min。
(3)配制每个反应的扩增体系，取2.1μL的HIV-1上游引物，2.1μL的HIV-1下游引物，0.6μL的HIV-1探针，40.7μL的缓冲液混合，得到本发明所述的反应缓冲液，将配制好的45.5μL试剂加入到F00R01冻干反应单元中，使其充分溶解并混匀，取醋酸镁2.5μL置于管盖(孵育时离心至反应体系中)；实际进行配制时的具体操作为：16对引物探针组分别用工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3进行灵敏度筛选时，可以按每次5个扩增反应体系进行配制，用移液器吸取203.5μL通用反应缓冲液中加入3μL配制好的探针和21μL引物混合，再分装至反应单元中重溶，分别取醋酸镁2.5μL置于各管盖(孵育时离心至反应体系中)。
(4)用工作标准品进行引物探针筛选时加样量为2μL。将2μL工作标准品加入所述步骤(3)中得到的反应扩增体系，置于RAA-B6100仪器中孵育并混匀后，置于检测仪器RAAF1620进行荧光信号检测。
(5)有扩增曲线且斜率值K≥20时，判定为阳性；无扩增曲线或扩增曲线斜率值K＜20时判定为阴性。
经过筛选，最终确定的引物探针序列如下：
上游引物:5’-TACAAATGGCAGTATTYATYCACAATTTTAA-3’(SEQ IDNO.1)；
下游引物:5’-TCTCTGCTGTCYCTGTAATAAACCCGRAAAT-3’(SEQ IDNO.2)。
探针序列为：
5’-GATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATARTAGAYATAATAGCAAC-3’(SEQ ID NO.3)。
探针具体为核苷酸序列的第30位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质，并对探针的3’末端进行C3-Spacer修饰。探针第30位碱基修饰的荧光报告基团具体为FAM，第33位碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1。
实施例2。
提供一种检测HIV-1病毒的试剂盒，含有实施例1中的引物探针组。该检测HIV-1病毒的试剂盒，上游引物浓度为20-50μM，下游引物浓度为20-50μM，探针浓度为10-30μM。
优选上游引物浓度为30μM，下游引物浓度为30μM，探针浓度为20μM。
该检测HIV-1病毒的试剂盒，还包括荧光RT-RAA反应单元、反应缓冲液、醋酸镁，阴性对照以及阳性对照；所述荧光RT-RAA反应单元含有：ATP、dNTPs、重组酶、单链结合蛋白、核酸外切酶、DNA聚合酶、逆转录酶。
通过本发明检测HIV-1病毒的方法，含有如下步骤：
(1)提取待检样本的RNA；
(2)以提取的RNA为模板，采用上述的上游引物、下游引物、探针、以及本实施例的试剂盒，进行RT-RAA扩增，获得扩增曲线；
(3)对扩增曲线进行分析，判断样品中是否含有HIV-1病毒。
其中，步骤(2)中的扩增体系为：2.1μL的HIV-1上游引物，2.1μL的HIV-1下游引物，0.6μL的HIV-1探针与40.7μL的缓冲液混合后所得的缓冲液溶解RT-RAA反应单元，醋酸镁2.5μL，RNA模板2ul，RT-RAA反应单元为冻干粉；
扩增程序为：39-42℃孵育4-6min，扩增37-42℃，检测时间为30min。
步骤(3)中的判断标准是，有扩增曲线且斜率值K≥20时，判定为阳性；无扩增曲线或扩增曲线斜率值K＜20时判定为阴性。
在本发明中，待测样品为可能含有HIV-1病毒核酸的样本，本发明对待测样本的提取方法没有特殊限定，采用病毒RNA的常规提取方法即可。
下面就检测HIV-1病毒试剂盒的灵敏度分析进行说明。
本实施例提供的检测HIV-1病毒试剂盒中，含有反应单元及反应缓冲液两部分；反应缓冲液中含有实施例1确定的HIV-1病毒特异性引物探针组。
反应缓冲液是在江苏奇天基因生物科技有限公司提供的货号为F00R01试剂盒中的通用反应缓冲液中加入本申请所述的特异性引物探针组配制而成，反应缓冲液中组份为：上游引物、下游引物、探针、Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 20000。
反应单元为江苏奇天基因生物科技有限公司提供的货号为F00R01试剂盒中的通用反应单元，主要包括以下组分：ATP、dNTPs、重组酶、单链结合蛋白、核酸外切酶、DNA聚合酶、逆转录酶。
用移液器取45.5μL反应缓冲液加入冻干反应单元中配制成扩增体系，取醋酸镁2.5μL置于管盖(孵育时离心至反应体系中)，再加入2μL的HIV-1重组质粒样本，在等温条件下孵育并混匀后，置于荧光检测仪中进行实时检测。引物探针采用实施例1确定的引物探针。
HIV-1病毒重组DNA质粒阳性标准品制备好的不同浓度的工作标准品，分别为：
工作标准品1-3，分别含有1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL的HIV-1病毒01AE型重组DNA质粒，工作标准品4-6，分别含有1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL的HIV-1病毒B型重组DNA质粒，工作标准品7-9,分别含有1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL的HIV-1病毒07BC型重组DNA质粒，工作标准品10-12,分别含有1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL的HIV-1病毒08BC型重组DNA质粒。
实施方法：(1)按探针0.02mM和引物0.03mM浓度配制13个反应单元(第13反应单元加入样品为阴性质控品，第1-3个单元加入样品分别为工作标准品1-3、4-6、7-9、10-12)的引物探针组溶液，准备好工作标准品和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒备用，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数设置温度为42℃，反应时间为30min。
(3)配制每个反应的扩增体系，从F00R01试剂盒中取529.1μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mL PE管，再加入7.8μL配制好的探针和各54.6μL的上下游引物，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(4)反应扩增体系配制:准备13个F00R01荧光反应单元，吸取步骤(3)中混匀的反应缓冲液45.5μL分别加入到准备好的13个荧光反应单元中，使冻干粉充分溶解并混均，成为反应扩增体系,分别取醋酸镁2.5μL置于各管盖(孵育时离心至反应体系中)。
(5)加样反应:在以上13个配制好的反应扩增体系中分别加入2μL阴性质控品、2μL工作标准品12、2μL工作标准品11、2μL工作标准品10、2μL工作标准品9、2μL工作标准品8、2μL工作标准品7为模板、2μL工作标准品6、2μL工作标准品5、2μL工作标准品4、2μL工作标准品3、2μL工作标准品2、2μL工作标准品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。
将反应管置于RAA-B6100振荡混匀仪中孵育并混匀，再置于RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为42℃，反应时间30分钟。根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，有扩增曲线且斜率值K≥20时，判定为阳性；无扩增曲线或扩增曲线斜率值K＜20时判定为阴性。检测结果如图1至图4所示。结果显示01AE、B、07BC、08BC型HIV病毒重组质粒的最低灵敏度均可达到20拷贝/反应，表明本发明灵敏度高，检测时间短。
实施例3。
本实施例检测HIV-1病毒试剂盒的特异性分析，采用的引物探针与实施例2相同。特异性实验中样本选择为沙眼衣原体、梅毒螺旋体、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒核酸样本。
实施方法：
(1)按探针20μM和引物30μM浓度进行配制5个反应单元的引物探针组溶液，准备好特异性实验的样本核酸、质粒和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数设置为温度42℃，反应时间30min。
(3)配制每个反应的扩增体系，从F00R01试剂盒中取244.2μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mL PE管，再加入3.6μL配制好的探针和各25.2μL的上下游引物，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(4)反应扩增体系配制:准备6个F00R01荧光反应单元，吸取步骤3中混匀的反应缓冲液45.5μL分别加入到准备好的6个荧光反应单元中，使冻干粉充分溶解并混均，成为反应扩增体系，分别取醋酸镁2.5μL置于各管盖(孵育时离心至反应体系中)，并作好标记。
(5)加样反应:在以上6个配制好的反应扩增体系中分别加入2μL阴性质控品(无核酶水)、2μL HIV-1病毒重组DNA质粒(pUC-57-01AE)、2ul沙眼衣原体DNA样本、2ul梅毒螺旋体DNA样本、2ul丙型肝炎病毒DNA样本以及2ul乙型肝炎病毒DNA质粒，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。将反应管置于RAA-B6100振荡混匀仪中孵育并混匀，再置于RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为42℃，反应时间30分钟。
检测结果如图5所示。结果显示除了HIV病毒质粒有明显的扩增外，沙眼衣原体、梅毒螺旋体、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及阴性质控品无扩增曲线且斜率值均K＜20，显示特异性良好。
实施例4。
利用本发明开发的试剂盒对HIV/AIDS患者样本进行检测，引物探针及阳性质控品序列与实施例2相同。
实施方法：
(1)按探针20μM和引物30μM浓度进行配制9个反应单元的引物探针组溶液，准备好工作标准品和江苏奇天基因生物科技有限公司生产的货号为F00R01的RT-RAA荧光基础试剂盒，该试剂盒中配备有反应缓冲液和反应单元。
(2)选用无锡奇天仪器生产的恒温振荡混匀仪RAA-B6100替代手动混匀；检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温基因扩增仪RAA-F1620，将以上两仪器接通电源进行预热，反应参数进行设置，温度为42℃，反应时间：30min。
(3)配制每个反应的扩增体系，从F00R01试剂盒中取366.3μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mL PE管，再加入5.4μL配制好的探针和各37.8μL上下游引物，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(4)反应扩增体系配制:准备9个F00R01荧光反应单元，吸取步骤3中混匀的反应缓冲液45.5μL分别加入到准备好的9个荧光反应单元中，使冻干粉充分溶解并混均，成为反应扩增体系，分别取醋酸镁2.5μL置于各管盖(孵育时离心至反应体系中)，并作好标记。
(5)加样反应:在以上9个配制好的反应扩增体系中其中1个反应扩增体系中加入2μL阴性质控品(无核酶水)、其他8个反应扩增体系中依次加入2μl HIV/AIDS患者(样本1-8)血清中提取的RNA模板，加好样后每个反应管充分混匀，每个反应管总体积为50μL。
(6)将反应管置于RAA-B6100振荡混匀仪中39-42℃孵育4-6分钟，混匀后置于RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为42℃，反应时间30分钟。检测结果如图6所示。结果显示8个HIV/AIDS患者样本均有明显的扩增曲线且斜率值K≥20，表明本发明在临床样本检测中具有良好的检测性能。
本发明提供的引物探针检测HIV-1病毒时与沙眼衣原体、梅毒螺旋体、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒无交叉反应，特异性强，为100％。检测灵敏度为20拷贝/反应。且本发明提供的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于基层及现场快速诊断。
本发明提供的引物探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。本发明提供的RT-RAA一步法检测HIV-1病毒RNA，无需先将HIV-1病毒RNA逆转录为cDNA，再高温使DNA解旋，只需在37～42℃条件下同步进行逆转录及等温扩增，30分钟内可以完成检测，可成为HIV-1病毒核酸的现场快速检测方法。
本发明采用逆转录-重组酶介导的扩增技术一步法检测HIV-1病毒RNA，通过反应体系中的重组酶、单链结合蛋白、引物形成的复合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋，单链结合蛋白阻止单链DNA复性，在能量和dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶介导完成链的延伸。本发明检测过程是在RAA反应体系中加入逆转录酶，以病毒RNA为模板，实现DNA的扩增，无需先将HIV-1病毒RNA逆转录为cDNA，再高温使DNA解旋，只需在37～42℃条件下同步进行逆转录及等温扩增，30分钟内可以完成检测。该技术不依赖于传统PCR方法的热循环解链，主要由重组酶和聚合酶介导完成，可以实现恒温扩增，不需要专业的热循环扩增仪器且避免了热循环而造成的时间损失。同时在反应体系中加入荧光探针，随着扩增产物的增加，荧光信号随之累积，实现实时检测。相对于LAMP技术，扩增温度更低，且对引物的设计要求更低。在本发明中，我们通过对从美国国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)中下载的60条，包括HIV-1主要基因型和中国常见的流行重组病毒(circulating recombinant forms,CRF)全基因序列分析后，选择较为保守的pol基因序列进行引物和探针设计。通过筛选，优选出最佳的引物探针组可以同时实现目前中国比较流行的HIV-1B、HIV-1CRF01-AE，HIV-1CRF-07BC，HIV-1CRF-08BC亚型样本的核酸检测。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 一种RT-RAA荧光法检测HIV-1病毒不同亚型通用引物、探针及检测方法
<130> GZZRH0504-21-1-1136
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacaaatggc agtattyaty cacaatttta a 31
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctctgctgt cyctgtaata aacccgraaa t 31
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat artagayata atagcaac 48
<210> 4
<211> 502
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgctgcagtt aaagcagcct gttggtgggc caatgtccga caggaatttg ggatccccta 60
caatccccaa agtcaaggag tagtagaatc tatgaataag gaattaaaga aaatcatagg 120
gcaggtaaga gagcaagctg aacaccttaa gacagcagta caaatggcag tatttattca 180
caattttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa taatagatat 240
aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt 300
tcgggtttat tacagggaca gcagagaccc aatttggaaa ggaccagcaa aactactctg 360
gaaaggtgaa ggggcagtag taatacaaga caatagtgat ataaaagtag taccaagaag 420
aaaagcaaag atcattaggg attatggaaa acagatggca ggtgatgatt gtgtggcagg 480
tagacaggat gaggattaga ac 502
<210> 5
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttaaagccg cctgttggtg ggcggggatc aagcaggaat ttggcattcc ctacaatccc 60
caaagtcaag gagtagtaga gtctatgaat aatgaattaa agaaaattat aggacaggta 120
agagatcaag ctgaacatct taagacagca gtacaaatgg cagtattcat ccacaatttt 180
aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca 240
acagacatac aaactagaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt 300
tattacaggg acagcagaga tccactttgg aaaggaccag caaagctcct ttggaaaggt 360
gaaggggcag tagtaataca agataatagt gacataaaag tagtgccaag aagaaaagca 420
aagatcatta gggactatgg aaaacagatg gcaggtgatg attgtgtggc aagtagacag 480
gatgaggatt agaacatgga a 501
<210> 6
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtaatttcac cagtgctgca gttaaggcag cctgttggtg ggcaggtctc caacaggaat 60
ttggaattcc ctacaatccc caaagtcagg gagtagtaga atccatgaat aaagagttaa 120
agaaaattat agggcaggta agagatcaag ctgagcacct taagacagca gtacaaatgg 180
cagtattcat tcacaatttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt gcaggagaaa 240
gaataataga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa 300
aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg acagcagaga tccaatttgg aaaggaccag 360
caaaactact ctggaaaggt gaaggggcag tagtaataca agacaatagt gatataaaag 420
tagtaccaag aagaaaagca aagatcatta gggattatgg aaaacagatg gcaggtgatg 480
attgtgtggc aggtagacag g 501
<210> 7
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtatccaac aggactttgg aattccctac aatccccaaa gtcagggagt agtagaatcc 60
atgaataaag aattaaagaa aattataggg caggtaagag atcaagctga gcaccttaag 120
acagcagtac aaatggcagt attcattcac aattttaaaa gaaaaggggg gattgggggg 180
tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac tagagaacta 240
caaaaacaaa ttataaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagagacag cagagacccc 300
atttggaaag gaccagccaa actactctgg aaaggtgaag gggcagtagt aatacaagat 360
aatagtgaca taaaggtagt gccaaggagg aaagcaaaaa tcattaggga ctatggaaaa 420
cagatggcag gtgctgattg tatggcaggt agacaggatg aagattagaa catggaatag 480
tttagtaaaa caccatatgt a 501
Claims (10)
1.一种用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物探针组，其特征在于，引物探针组的核苷酸序列为：
上游引物：5’-TACAAATGGCAGTATTYATYCACAATTTTAA-3’；
下游引物：5’-TCTCTGCTGTCYCTGTAATAAACCCGRAAAT-3’；
探针的核苷酸序列为：
5’-GATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATARTAGAYATAATAGCAAC-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物探针组，其特征在于，探针具体为核苷酸序列的第30位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质，并对探针的3’末端进行C3-Spacer修饰。
3.根据权利要求2所述的用于检测HIV-1病毒核酸的恒温荧光扩增引物探针组，其特征在于，探针第30位碱基修饰的荧光报告基团为FAM，第33位碱基修饰的荧光淬灭基团为BHQ1。
4.一种检测HIV-1病毒的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1至3任意一项所述的引物探针组。
5.根据权利要求4所述的检测HIV-1病毒的试剂盒，其特征在于，上游引物浓度为20-50μM，下游引物浓度为20-50μM，探针浓度为10-30μM。
6.根据权利要求5所述的检测HIV-1病毒的试剂盒，其特征在于，上游引物浓度为30μM，下游引物浓度为30μM，探针浓度为20μM。
7.根据权利要求4所述的检测HIV-1病毒的试剂盒，其特征在于，还包括荧光RT-RAA反应单元、反应缓冲液、醋酸镁，阴性对照以及阳性对照；
所述荧光RT-RAA反应单元含有：ATP、dNTPs、重组酶、单链结合蛋白、核酸外切酶、DNA聚合酶、逆转录酶。
8.一种检测HIV-1病毒的方法，其特征在于，通过如下步骤进行：
(1)提取待检样本的RNA；
(2)以提取的RNA为模板，采用权利要求1至3任意一项所述的上游引物、下游引物、探针、以及权利要求5至7任意一项所述的试剂盒，进行RT-RAA扩增，获得扩增曲线；
(3)对扩增曲线进行分析，判断样品中是否含有HIV-1病毒。
9.根据权利要求8所述的检测HIV-1病毒的方法，其特征在于，
步骤(2)中的扩增体系为：2.1μL的HIV-1上游引物，2.1μL的HIV-1下游引物，0.6μL的HIV-1探针与40.7μL的缓冲液混合后所得的缓冲液溶解RT-RAA反应单元，醋酸镁2.5μL，RNA模板2ul，RT-RAA反应单元为冻干粉；
步骤(2)中所述的扩增程序为：39-42℃孵育4-6min，扩增37-42℃，检测时间为30min。
10.根据权利要求8所述的检测HIV-1病毒的方法，其特征在于，步骤(3)中的判断标准是，有扩增曲线且斜率值K≥20时，判定为阳性；无扩增曲线或扩增曲线斜率值K＜20时判定为阴性。
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