JP4388061B2

JP4388061B2 - Ｅ型肝炎ウイルスを検出するためのｌａｍｐ増幅用核酸プライマーセット

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Publication number: JP4388061B2
Application number: JP2006350363A
Authority: JP
Inventors: みちえ橋本; 和明高橋; 夏生安倍; 俊治三代; 裕彦太田
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2006-12-26
Filing date: 2006-12-26
Publication date: 2009-12-24
Anticipated expiration: 2026-12-26
Also published as: CN101210269A; JP2008154566A

Description

本発明は、Ｅ型肝炎ウイルスを迅速に検出する手段に関する。

Ｅ型肝炎の原因となるＥ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＥＶ」とも記す）は、１９９０年にその遺伝子がクローニングされたウイルスである。ＨＥＶは世界中に偏在して見られるが、感染経路は水系汚染を生じる局地における経口感染が主であった。このことから、日本や欧米のような先進諸国においては発見されることは稀であるとされてきた。ところが、近年、新規日本固有株の存在が明らかとなり、それに起因すると考えられる肝炎患者も国内で確認され始めた（非特許文献１）。このウイルスによる肝炎は、病態がほとんど見られない軽度なものから、急性肝炎、さらには劇症肝炎を生じる症例もある。従って、迅速に原因ウイルスを特定し、そのウイルス型から予後を推測し、適切な治療を開始する必要がある。

また、最近の報告では、輸血によるＥ型肝炎ウイルスの感染も確認されている（非特許文献２、３）。そのため、大規模スクリーニングにも適応できるようなＥ型肝炎ウイルスの簡便且つ高感度な検出法を開発する必要が高まってきている。

現在のところ、ＨＥＶの主な検出法は、患者血清中に存在する抗体を測定するか、若しくはＰＣＲによって遺伝子を増幅する方法がとられている。しかしながら、抗体の検査では、既に治癒した患者も陽性と判定してしまうだけでなく、実際にＥ型肝炎ウイルスが陽性の時期にも拘らず、抗体産生のタイミングが遅いために陰性としてしまうこともある。一方、ウイルスゲノムを直接測定するＰＣＲ法では、ゲノム抽出から逆転写反応、ＰＣＲ増幅反応の後電気泳動という工程を経て、漸く結果が得られるという煩雑さが問題である。そればかりではなく、ＨＥＶＲＮＡには株によって多くの変異が確認されているにも拘わらず、それらさまざまな遺伝子型を一度に安定して検出できる増幅系が必ずしも使用されているとは言えない。従って、それによる陽性率の低さも問題となっている。

現在のところ、Ｅ型肝炎ウイルスを検出する検査方法で、健康保険が適用されている系はまだ開発されていない。しかしながら、現実には日本人においても、年齢が上がるにつれて抗体陽性率が上がっている。そのようには現状に鑑みると、Ｅ型肝炎ウイルスに感染している人は、医療関係者が把握しているよりも多い可能性が高い。従って、簡便で高感度で、且つ安価な検査系の整備が求められている。
Takahashi K, Iwata K, Watanabe N, et al. Viroligy; 2001; 287; 9-12 Matsubayashi K, Nagaoka Y, Sakata H, et al. Transfusion 2004; 44(6); 934-940 Mitsui T, Tsukamoto Y, Yamazaki C, et al. J. Med. Virol. 2004; 74(4); 563-572

本発明の課題は、迅速且つ正確にＥ型肝炎ウイルスを検出するための手段を提供することである。

上記の課題を解決するために本発明者は以下のような手段を見出した。即ち、
（１）Ｅ型肝炎ウイルスを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーはＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーまたはＢ３プライマーからなり、配列番号１〜６７またはその相補配列からなる群より少なくとも１を選択して、その配列中の１５塩基以上の連続する配列を用いて、配列Ｆ１、配列Ｆ２、配列Ｆ３、配列Ｂ１、配列Ｂ２および配列Ｂ３からなるＬＡＭＰプライマーの何れかの構成単位とする核酸プライマー。

（２）（１）の核酸プライマーを含むＥ型肝炎ウイルスを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記プライマーセットはＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーとからなり、前記ＦＩＰプライマーは配列Ｆ１ｃおよび配列Ｆ２を含む配列Ｆ１ｃ−ｘ−Ｆ２であり（ここで、ｘは０以上の整数個の塩基の核酸である）、前記Ｆ３プライマーは配列Ｆ３であり、前記ＢＩＰプライマーは配列Ｂ１ｃおよび配列Ｂ２を含む配列Ｂ１ｃ−ｙ−Ｆ２であり（ここで、ｙは０以上の整数個の塩基の核酸である）、前記Ｂ３プライマーは配列Ｂ３であり、配列Ｆ１ｃ、配列Ｆ２、配列Ｆ３、配列Ｂ１ｃ、配列Ｂ２および配列Ｂ３は、配列番号１〜配列番号１３およびそれらの相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、且つ配列Ｆ３、配列Ｆ２、配列Ｆ１ｃ、配列Ｂ１ｃ、配列Ｂ２および配列Ｂ３の順で上位の配列番号で示される配列またはその相補配列が選択されるＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセット；
ここで、配列Ｆ３が、配列番号１〜５よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であるとき、
配列Ｆ２は、配列番号２〜７よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、
配列Ｆ１ｃは、配列番号３〜８の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、
配列Ｂ１ｃは、配列４〜９よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、
配列Ｂ２は、配列６〜１１の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および
配列Ｂ３は、配列７〜１３の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である、または、
ここで、配列Ｆ３が、配列番号１〜５の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であるとき、
配列Ｆ２は、配列番号２〜７の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、
配列Ｆ１ｃは、配列番号３〜８よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、
配列Ｂ１ｃは、配列４〜９の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、
配列Ｂ２は、配列６〜１１よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および
配列Ｂ３は、配列７〜１３よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である：
である。

本発明により、迅速且つ正確にＥ型肝炎ウイルスを検出するための手段が提供された。

１．用語の説明
ここで使用される「核酸」とは、天然由来のＤＮＡおよびＲＮＡなど、一部分または完全に人工的に合成および／または設計された人工核酸など、並びにそれらの混合物などであってよい。

また、ここで使用される「検体試料」または「検体」とは、これらに限定するものではないが、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等であってよく、または何らかのそれ自身公知の手段によって、前記の何れかまたはその混合物から核酸成分に抽出されたものであってもよい。

本発明においては、ヒト、家畜、ペット等の動物の体内でのＥ型肝炎ウイルスの有無、更には治療方針の決定に役立つウイルスの遺伝子型などのＥ型肝炎ウイルスに関する情報を迅速且つ正確に測定する手段が提供される。従って、特に、検体試料は以上の手段に供するための試料であればどのようなものであってもよい。

ここで使用される「ＬＡＭＰ法」とは、Loop-Mediated Isothermal Amplificationの略であり、標的遺伝子の６つの領域に対して４種類のプライマー、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーおよびＢＩＰプライマーを設定して、鎖の置換反応を利用し、一定温度で反応させる方法（即ち、等温遺伝子増幅法の一種）である。本発明において使用されるＬＡＭＰ法は一般的に当業者に公知の方法、またはその一部改変法した方法などを含んでよい。ＬＡＰＭ法の基本的な説明は後述するが、例えば、特開2002-186481などの文献を参照されてもよい。ここで、引用される文献はこの参照によって本発明に含まれる。

また、ここで使用される「ＲＴ−ＬＡＭＰ」法は、Reverse-Transcribed Loop-Mediated Isothermal Amplificationの略である。当該方法はＬＡＭＰ法を応用した方法であり、標的遺伝子がＲＮＡである場合に、ｃＤＮＡへの合成も、当該増幅と同時または所望に応じて時差を以っておこない、並びに検出に利用できる方法である。当該技術分野において公知の何れのＲＴ−ＬＡＭＰおよびその改変法も本発明において利用してよい。

次に、基本的なＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を用いて説明する。なお、本図面、本明細書および本特許請求の範囲において「ｃ」が付された記号は、「ｃ」の付されていない同一の記号と互いに相補的であることを示す。例えば、「Ｆ１ｃ」と「Ｆ１」は互いに相補的である。

図１を参照されたい。検出しようとする被検核酸が２本鎖である場合、何れかの１本鎖、ここでは１本鎖核酸にターゲット配列が含まれると設定する。更に、このターゲットを挟むように、プライマーがハイブリダイズするための配列であるプライマー領域Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３を設定する。これらの配列に対してハイブリダイズするためのプライマー、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＢＩＰプライマーを設計する。次に、前記４種類のプライマーと鋳型核酸である被検核酸とを適切な増幅が得られる条件下でＬＡＭＰ増幅を行う。これにより得られるＬＡＭＰ増幅産物は、図２に示すようにターゲット配列を増幅産物のステム・アンド・ループ構造の中央に位置するように含む増幅産物とその相補鎖である（図２参照されたい）。

また、増幅スピードを速める目的で、図３に示すようなループプライマーを使用してもよい。被検核酸においてループプライマーがハイブリダイズするための位置は、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間（ここで、ループプライマーの配列はＦ２ｃ領域を含んでもよい）、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間（ここで、ループプライマーの配列はＢ２ｃ領域をふくんでもよい）のいずれかの位置にであってよい。図３に示すように、例えば、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃの間に設定された場合には、該当するループプライマーは、ループプライマーＦＬｃである。また、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間に設定された場合には、該当するプライマーはループプライマーＢＬｃである。ループプライマーは２箇所全てを同時に使用しても、そのうちの少なくとも１を使用してもよい。

本発明におけるループプライマーのハイブリダイズする領域は、増幅産物のダンベル構造における１本鎖ループの位置にある領域である。ＬＡＭＰ法を行う際に、この１本鎖領域の鎖に相補的なＤＮＡ断片であるループプライマーを存在させることにより、必要な立体構造が保たれ、そのために目的とする増幅がスムーズに進む。従って、ループプライマーの使用は本発明において好ましい。

２．Ｅ型肝炎ウイルスゲノム
Ｅ型肝炎ウイルスは、そのゲノムがＲＮＡである。従って、従来の何れの増幅法においても逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成を行うことが不可欠である。従って、ＲＴ−ＬＡＭＰを利用すればより好ましい。ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、それ自身公知のＬＡＭＰ反応液に逆転写酵素を添加すれば、別工程の逆転写反応を行うことなく被検核酸を含む被検試料、例えば、血液からの抽出産物などから直接に目的とする核酸の増幅を開始することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡ合成を行った後にＬＡＭＰ法を行ってもよく、そのような方法も本発明の範囲内である。

また、ＬＡＭＰ法におけるＤＮＡ合成酵素による伸長反応において、副産物としてピロリン酸が生成され、反応溶液中に存在しているマグネシウムイオンと結合することが知られている。本発明に使用するＬＡＭＰ法では、増幅産物の生成量が多いため、ピロリン酸マグネシウムが溶解度積を超えて白濁を生じる。この白濁（即ち、濁度）を機器で測定すれば、より容易に増幅の有無をリアルタイムに確認することが可能である。そのような態様も好ましい本発明の１態様である。

３．ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマー
本発明に従うＬＡＭＰ増幅用核酸プライマー（単に「プライマー」または「ＬＡＭＰプライマー」とも称する）は、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＢＩＰプライマーであり、それらの構成単位として、ＦＩＰプライマーには配列Ｆ１と配列Ｆ２、Ｆ３プライマーには配列Ｆ３、ＢＩＰプライマーには配列Ｂ１と配列Ｂ２、並びにＢ３プライマーには配列Ｂ３が含まれてよい。また、本発明に従うＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーは、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＢＩＰプライマーの他に更にループプライマーを含んでもよい。

本発明に従うと、患者体内におけるＨＥＶの有無を検出する一方でウイルスの遺伝子型判定することが可能である。そのために、一方では、ウイルスの有無を判定する場合には、全ての株間で保存性の高い領域を選ぶことが必要である。他方、ウイルスの遺伝子型を判定する場合には、遺伝子型の中での保存性は高く、遺伝子型間の違いがより大きい配列を選択することが好ましい。それらを満たす領域として本発明者らは、上述の２つの領域を選択した。主に、図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃの領域は、ウイルスの有無を検出するためのユニバーサルプライマーを提供するために有用である。また、図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃの領域は、ウイルスの型判定に用いるための型判定用プライマーを提供するために有用である。

ここで、図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃに亘り示した配列は連続した配列であり、ＨＥＶゲノムの５’末端からオープン・リーディング・フレーム１（ここでは「ＯＲＦ−１」とも記載する）にかけての塩基配列を種々の株で比較したものである。同様に、図５Ａ、図５Ｂおよび図５Ｃに亘り示した配列は連続した配列であり、オープン・リーディング・フレーム２（ここでは「ＯＲＦ−２」とも記す）の一部の塩基配列を種々の株で比較したものである。ＨＥＶは、その遺伝子の特徴から、現在４種類の遺伝子型に分類されることが知られている。

これらの各領域中に増幅に係る単位配列として使用可能な配列を領域番号００１、００２、００４、００５の４箇所で設定し、それぞれについて配列Ｆ３、配列Ｆ２、配列Ｆ１、配列Ｂ１、配列Ｂ２、配列Ｂ３に対応するように実線または点線により枠組みして示した。これらの配列を基に、必要な４種類のプライマー、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーおよびＢＩＰプライマーを設計した。また、図４の何れにも示していないが、領域番号００３として、図４Ａに示す配列の１位〜１９３位までの領域を使用してプライマーを設計した。

また、上記のプライマー設計の際に、株により、または領域によっては、配列に細かい変異が見られる場合があった。従って、必要に応じて混合塩基を用いたり、プライマーを選択した配列の一部の配列を組み合わせて設計する必要があった。ここで「混合塩基を用いる」とは、変異に対応する、或いは対応しそうな塩基で置換した複数の配列を混合して、または混合せずに使用することをいう。このような検討の末、Ｅ型肝炎ウイルスを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットを構成するのに有効な配列が設計された。その結果を表１−１〜表１−２に示す。表１−２は表１−１の続きである。また、ここでは、表１−１および表１−２を合わせて表１と称す。

表１における領域番号は、図４Ａ〜図５Ｃまでに記載された領域００１〜００５に相当する。例えば、表１の領域番号１の配列番号１４は、図４Ａの領域番号００１−Ｆ３に対応し、Ｆ３プライマーのＦ３配列として使用される。同様に表１の００１−Ｆ３−１は、領域番号００１の配列であることを示し、更にＦ３プライマーのＦ３配列として使用されてもよく、または配列番号１４の連続した配列と配列番号１５の連続した配列を組み合わせて合計して１５塩基以上の核酸からなるＦ３プライマーとして使用してもよい。その場合、配列番号１４に由来する配列と配列番号１５に由来する配列の何れか５’側に来てもよい。同様の使い方を、表１における「ＨＥＶ用ＬＡＭＰプライマー配列」の欄に記載される末尾枝番号の「−１」〜「−１３」について行うことが可能である。即ち、それら末尾枝番号「−１」〜「−１３」を単独でそれに含まれる連続する１５塩基以上の配列を構成単位としてもよく、それらの少なくとも２にそれぞれ含まれる連続した配列を何れかを５’側にして結合し、１５塩基以上の配列として、構成単位としてしようしてもよい。また、末尾の枝番号の何れか１の配列、またはそのうちの連続した１５以上の配列を目的のプライマーとして使用してもよい。

従って、本発明の１態様に従うと、Ｅ型肝炎ウイルスを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーはＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーまたはＢ３プライマーからなり、配列番号１４〜６７またはその相補配列からなる群より少なくとも１を選択して、その配列中の１５塩基以上の連続する配列を用いて、配列Ｆ１、配列Ｆ２、配列Ｆ３、配列Ｂ１、配列Ｂ２および配列Ｂ３からなるＬＡＭＰプライマーの何れかの構成単位とする核酸プライマーが提供される。

また、表１に記載される配列番号１４〜６７またはその相補配列を構成単位とする場合、それにより設計される核酸プライマーは、プライマーとしての機能が妨げられない限り、少なくとも１の変異、欠失、付加があってもよい。そのような変異、欠失、付加のある配列を含むＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーも本発明の範囲内である。

また、Ｅ型肝炎ウイルスの遺伝子型として存在する亜種（即ち、サブタイプ）を特定するためにサブタイプ別の特徴を示す箇所にプライマーを設計する必要もある。このようなプライマーは型分け用プライマーとして使用することが可能である。詳しくは後述するが、そのようなプライマーに利用することが可能な配列の例を表２に示す。

（１）ユニバーサルプライマー
表１に示した配列は、何れもユニバーサルプライマーとして、ＨＥＶの有無を検出するために有効な領域である。ここで、ユニバーサルプライマーとは、ＨＥＶの遺伝子型に左右されずに包括的にＨＥＶを検出するこことが可能なプライマーである。このようなユニバーサルプライマーの提供によって、対象におけるＨＥＶの洩れのない検出を可能にする。このようなユニバーサルプライマーに使用するための領域は、表１に示した配列が好ましい。本発明者らは、これらの領域が、何れのプライマー、特に保存性の高いＨＥＶゲノムの他の領域よりも顕著に増幅効率がよいという実験結果を得ている。しかしながら、何故、本発明のプライマーが非常に優れているのかについて説明できるような何らかの機序は一切分かっていない。機序に関するこのような知見は、ＨＥＶに限らず、ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーの何れについても同様であり、何れのプライマーが顕著に有効であるかは、実験的な検討を以ってしか分からないのが現状である。

上述の通り、表１に示した各プライマー領域は、ＨＥＶの有無を検出するために有効な領域であることが確認された。その中でも最も増幅スピードが速く効率のよいプライマー領域は領域００２（ここでは、「領域番号００２」とも記す）であった。領域００２は、ＨＥＶゲノムの５’末端からオープン・リーディング・フレーム１の２位から１９０位に亘る領域である。この領域は、前述の領域００１、００２、００３、００４、００５の５つの領域の中で最も効率がよいというだけではなく、ＨＥＶゲノム全体に対して設計した何れのプライマーと比較しても最も優れたＬＡＭＰ用プライマー領域であった（実施例３に詳細は記する）。

よって、この領域における変異箇所を避けて、本発明に従うプライマーの各構成単位を設計した結果、以下の配列が得られた。

配列番号１：ＧＧＣＡＧＡＣＣＡＣＮＴＡＴＧＴＧＧ
配列番号２：ＴＣＧＡＮＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡ
配列番号３：ＣＡＧＴＴＮＡＴＮＡＡＧＧＣＴＣＣＴＧ
配列番号４：ＧＣＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＴＧＡＧ
配列番号５：ＧＣＧＴＣＡＣＮＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＡＧ
配列番号６：ＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣ
配列番号７：ＡＧＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＣ
配列番号８：ＧＣＣＴＴＧＧＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＧ
配列番号９：ＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＮＴＴ
配列番号１０：ＣＡＡＡＣＣＧＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＴ
配列番号１１：ＣＡＧＡＣＡＧＡＧＡＴＡＣＴＴＡＴＴＡＡＣ
配列番号１２：ＴＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＣＣＧＧＣＡＧＴＴＧ
配列番号１３：ＮＴＧＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴ
ここで、配列番号１の１１位の「Ｎ」は「Ａ」または「Ｇ」の何れかの塩基を示す。配列番号２の５位の「Ｎ」は「Ｃ」または「Ｔ」の何れかの塩基を示す。配列番号３の６位の「Ｎ」は「Ｃ」または「Ｔ」の何れかの塩基を示し、同９位の「Ｎ」は「Ａ」または「Ｔ」の何れかの塩基を示す。配列番号５の８位の「Ｎ」はＡまたはＴの何れかの塩基を示す。配列番号９の１７位の「Ｎ」はＧまたはＴの何れかの塩基を示す。配列番号１３の１位の「Ｎ」は「Ｃ」または「Ｔ」の何れかの塩基を示す。

ここで、配列番号４と配列番号５、配列番号６と配列番号７、配列番号１０と配列番号１１、および配列番号１２と配列番号１３は、それぞれ同じ箇所に設定したプライマーであるが、当該領域に存在する種々の変異に対応できるように２種を混在させることが好ましい。

配列番号１〜配列番号１３のこれらの配列は、保存性の高い領域の中でも点在する変異を避けるように、また避けきれない変異は増幅への影響の少ない箇所に位置するように領域を分けて設定した。また、混合塩基の使用も必要最小に抑えてあるなどの工夫を施した。本発明において、様々なプライマー設定での検討を繰り返すことによって、これらの領域分けを可能とした。

本発明の１態様に従うＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーは、配列番号１〜１３またはその相補配列からなる群より少なくとも１を選択して、その配列中の１５塩基以上の連続する配列を用いて、配列Ｆ１、配列Ｆ２、配列Ｆ３、配列Ｂ１、配列Ｂ２および配列Ｂ３からなるＬＡＭＰプライマーの何れかの構成単位とする核酸プライマーであればよい。また、本発明に従うプライマーは、目的とするプライマーとしての機能を妨げない限りにおいて配列番号１〜１３の何れの配列にも少なくとも１の更なる変異、欠失、付加があってもよい。そのような変異、欠失、付加のある配列を含むＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーも本発明の範囲内である。

本発明に従う上記配列のＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットとしての使い方は、例えば以下の通りである。まず、ＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが、ＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーとからなるように設計される場合、前記ＦＩＰプライマーは配列Ｆ１ｃおよび配列Ｆ２を含む配列Ｆ１ｃ−ｘ−Ｆ２である。ここで、ｘは０以上の整数個の塩基の核酸であり、好ましくは、０〜３塩基の任意の塩基であり、例えば、「ＴＴＴ」、「ＡＡＡ」、「ＣＣＣ」および「ＧＧＧ」などの配列が好ましい例であり、より好ましくは０塩基である。即ち、ｘの存在しないプライマーが、自己分子内高次構造の形成を防止するために最も好ましい。また、前記Ｆ３プライマーは配列Ｆ３である。更に、前記ＢＩＰプライマーはＢ１ｃは配列Ｂ１ｃおよび配列Ｂ２を含む配列Ｂ１ｃ−ｙ−Ｆ２である。ここで、ｙは０以上の整数個の塩基の核酸であり、好ましくは、０〜３塩基の任意の塩基であり、例えば、「ＴＴＴ」、「ＡＡＡ」、「ＣＣＣ」および「ＧＧＧ」などの配列が好ましい例であり、より好ましくは０塩基である。ｘと同様の理由からｙは存在しない方が好ましい。また、前記Ｂ３プライマーは配列Ｂ３である。配列Ｆ１ｃ、配列Ｆ２、配列Ｆ３、配列Ｂ１ｃ、配列Ｂ２および配列Ｂ３は、配列番号１〜配列番号１３およびそれらの相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、且つ配列Ｆ３、配列Ｆ２、配列Ｆ１ｃ、配列Ｂ１ｃ、配列Ｂ２および配列Ｂ３の順で上位の配列番号で示される配列またはその相補配列が選択される。例えば、配列Ｆ３が配列番号１の場合、配列Ｆ２は配列番号２、配列Ｆ１ｃは配列番号３、配列Ｂ１ｃは配列番号４、配列Ｂ２は配列番号５、配列Ｂ３は配列番号６などであればよい。

例えば、ここで、配列Ｆ３が、配列番号１〜５よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であるとき、配列Ｆ２は、配列番号２〜７よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、配列Ｆ１ｃは、配列番号３〜８の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、配列Ｂ１ｃは、配列４〜９よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、配列Ｂ２は、配列６〜１１の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および配列Ｂ３は、配列７〜１３の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

或いは、同上の場合、配列Ｆ３が、配列番号１〜８の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であるとき、配列Ｆ２は、配列番号２〜９の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、配列Ｆ１ｃは、配列番号３〜１０よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、配列Ｂ１ｃは、配列４〜１１の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、配列Ｂ２は、配列５〜１２よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および配列Ｂ３は、配列６〜１３よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

また、変異箇所「Ｎ」を含む配列については、上記の何れの塩基である配列の一方を使用してもよく、混合塩基（即ち、ミックス塩基とも称する）として両方の塩基を各々含むような配列で作製した複数のプライマーを１つの反応系に同時に入れてもよい。

また、本発明に従うＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、ＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーとからなってもよく、これらのプライマーに更にループプライマーを合わせてＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットと称してもよい。ループプライマーの合成は、上述したとおりのそれ自身公知の何れの方法により行ってよい。そのようなループプライマーを含むＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットも本発明の範囲内であり、ループプライマーを含むまたは含まないＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットを使用した核酸増幅方法およびＨＥＶ検出方法も本発明の範囲内である。

以下に表１の各領域を使用する場合のプライマーセットについて説明する。また、表１の各領域に使用に有利なループプライマーの例を表３に示す

（ａ）表１の領域番号１を使用する場合
更に、表１の領域番号１の配列を使用する場合のプライマーセットは次の通りである。上述した通り、Ｅ型肝炎ウイルスを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが、ＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーとからなる場合であり、前記ＦＩＰプライマーは配列Ｆ１ｃおよび配列Ｆ２を含む配列Ｆ１ｃ−ｘ−Ｆ２であり、（ここで、ｘは０以上の整数個の塩基の核酸であり、好ましくは、０〜３塩基の任意の塩基であり、例えば、「ＴＴＴ」、「ＡＡＡ」、「ＣＣＣ」および「ＧＧＧ」などの配列が好ましい例であり、より好ましくは０塩基である。即ち、ｘの存在しないプライマーが、自己分子内高次構造の形成を防止するために最も好ましい。）、また、前記Ｆ３プライマーは配列Ｆ３であり、更に、前記ＢＩＰプライマーはＢ１ｃは配列Ｂ１ｃおよび配列Ｂ２を含む配列Ｂ１ｃ−ｙ−Ｆ２であり（ここで、ｙは０以上の整数個の塩基の核酸であり、好ましくは、０〜３塩基の任意の塩基である。例えば、「ＴＴＴ」、「ＡＡＡ」、「ＣＣＣ」および「ＧＧＧ」などの配列が好ましい例であり、より好ましくは０塩基である。ｘと同様の理由からｙは存在しない方が好ましい。）、また、前記Ｂ３プライマーは配列Ｂ３である場合において、表１の領域番号１を使用する場合は次の通りであってよい。

即ち、前記Ｆ３プライマーは、配列番号１４および配列番号１５よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号１６および配列番号１７よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号１８〜２０よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号２１および配列番号２２よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

または、同上の場合、前記Ｆ３プライマーは、配列番号１４および配列番号１５の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号１６および配列番号１７の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号１８〜２０の相補配列の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号２１および配列番号２２の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

また、表１の領域番号１を利用する場合には、ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットに、更に、表３に記載の配列を利用したループプライマーが具備されてもよい。例えば、配列番号１０２および／または１０３の配列からなるループプライマーを使用することが好ましい。そのようなループプライマーを含むＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットも本発明の範囲内であり、ループプライマーを含むまたは含まないＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットを使用した核酸増幅方法およびＨＥＶ検出方法も本発明の範囲内である。

（ｂ）表１の領域番号２を使用する場合
また、同上のような場合に、表１の領域番号２を用いるとき、本発明に従うＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。前記Ｆ３プライマーは、配列番号２３に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号２４〜２６よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号２７〜３０よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号３１および配列番号３２よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号２３の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号２４〜２６の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号２７〜３０の相補配列の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号３１および配列番号３２の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

更に、表１の領域番号２を利用する場合には、ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットととして、更に、表３に記載の配列を利用したループプライマーが具備されてもよい。例えば、配列番号１０４および／または１０５の配列からなるループプライマーを使用することが好ましい。そのようなループプライマーを含むＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットも本発明の範囲内であり、ループプライマーを含むまたは含まないＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットを使用した核酸増幅方法およびＨＥＶ検出方法も本発明の範囲内である。

（ｃ）表１の領域番号３を使用する場合
また、同上の場合に、表１の領域番号３を用いる場合には、本発明に従うＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。前記Ｆ３プライマーは、配列番号２３に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号３３に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号３４に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号３５に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号２３の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号３３の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号３４の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号３５の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

（ｄ）表１の領域番号４を使用する場合
また、同上のような場合に、表１の領域番号４を用いる場合には、本発明に従うＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、次の通りであってよい。前記Ｆ３プライマーは、配列番号３６〜３８よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号３９〜５１よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号５２〜５４よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号５５および配列番号５６よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号３６〜３８の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号３９〜５１の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号５２〜５４の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号５５および配列番号５６の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

更に、表１の領域番号４を利用する場合には、ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットに更に、表３に記載の配列を利用したループプライマーが具備されてもよい。例えば、配列番号１０６〜１１４の配列よりなる群より少なくとも１選択された配列からなるループプライマーを使用することが好ましい。そのようなループプライマーを含むＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットも本発明の範囲内であり、ループプライマーを含むまたは含まないＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットを使用した核酸増幅方法およびＨＥＶ検出方法も本発明の範囲内である。

（ｅ）表１の領域番号５を使用する場合
また、同上のような場合に、表１の領域番号５を用いる場合には、本発明に従うＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、次の通りであってよい。前記Ｆ３プライマーは、配列番号５７〜５９よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号６０〜６３よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号６４および配列番号６５よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号６６および配列番号６７よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号５７〜５９の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号６０〜６３の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号６４および６５の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号６６および配列番号６７の相補配列よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

更に、表１の領域番号５を利用する場合には、ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットに、更に、表３に記載の配列を利用したループプライマーが具備されてもよい。例えば、配列番号１１６〜１１７の配列よりなる群より少なくとも１選択された配列からなるループプライマーを使用することが好ましい。そのようなループプライマーを含むＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットも本発明の範囲内であり、ループプライマーを含むまたは含まないＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットを使用した核酸増幅方法およびＨＥＶ検出方法も本発明の範囲内である。

また、本発明に従う増幅反応は、１チューブ当り１プライマーセットで行ってもよく、或いは、１チューブに複数種類のプライマーセットを混在させて行ってもよい。更に、後述する型分け用プライマーセットも同時に混在させて行ってもよく、後述するような型分け用プライマーセットのみの複数種類を１チューブに混在させて行ってもよい。また、１チューブに型分け用プライマーセットを単独の種類のみ存在させて反応を行ってもよい。複数のＥ型肝炎ウイルスのサブタイプを一度に特定する必要がある場合は、複数の型分け用プライマーセットを同時に１チューブに存在させる方法で行うことが効率的である。そのような増幅反応を利用するＨＥＶ検出方法および増幅方法も本発明の範囲内である。

（２）型分け用プライマー
本発明の更なる態様として、ＨＥＶの遺伝子型として存在する亜種、即ち、サブタイプを特定するためにサブタイプ別の特徴を示す箇所にプライマー、即ち、型分け用プライマーを設計した。

上述したように、ＨＥＶの遺伝子型として存在する亜種、即ち、サブタイプ、を特定するためには、サブタイプ別の特徴を示す箇所にプライマーを設計する必要がある。そのための型分け用プライマーは、図５Ａ〜Ｃに記載のオープン・リーディング・フレーム２の一部分の配列を用いて作製した。作製されたプライマーに含まれる好ましい各配列を表２に示した。これらの配列により製造したプライマーは、各型用の反応チューブを準備し、それぞれに個別の型用プライマーを使用して個別の反応を行ってよい。増幅産物が得られたチューブに添加されたプライマーの型に依存して、即ち、プライマーセットの型に対する特異性に依存して、試験に供された検体試料のＨＥＶ遺伝子型が判定することが可能となる。また、型毎に検出可能な標識物質を付与することを利用して型毎に検出してもよい。そのような方法は、それ自身公知の何れの従来の手段を利用することが可能である。

また、ＨＥＶのサブタイプによっては、更に細かくグループ分けされることもある。より厳密な型分けが必要な場合にも、図５Ａ〜Ｃのオープン・リーディング・フレーム２の領域が有効であると考える。その場合にも、それぞれの型に特異的な配列を選んで個別プライマーを設計することが可能である。そのような詳細な型分け用のプライマーセットも本発明の範囲内である。このような詳細な型分け用のプライマーセットは、より少量混在した型をも検出するために有効であり、反応特異性の高いＬＡＭＰ法により有効に使用することが可能である。

また、上述した通り、型分け用プライマーセットとして、ＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーの他に、更にループプライマーを合わせて使用されてもよい。そのようなＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびループプライマーを具備するＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットも本発明の範囲内である。また、ループプライマーを含むまたは含まないＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットを使用した核酸増幅方法およびＨＥＶ検出方法も本発明の範囲内である。

以下に表２の各領域を使用する場合のプライマーセットについて説明する。

（ａ）表２の領域番号４を使用する場合
（i）Ｉ型用のプライマーセット
表２の領域番号４の配列を使用して提供されるＨＥＶＩ型用のプライマーセットは次の通りである。

Ｅ型肝炎ウイルスを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが、ＦＩＰプライマーとＦ３プライマーとＢＩＰプライマーとＢ３プライマーとからなる場合であり、前記ＦＩＰプライマーは配列Ｆ１ｃおよび配列Ｆ２を含む配列Ｆ１ｃ−ｘ−Ｆ２であり、（ここで、ｘは０以上の整数個の塩基の核酸であり、好ましくは、０〜３塩基の任意の塩基であり、例えば、「ＴＴＴ」、「ＡＡＡ」、「ＣＣＣ」および「ＧＧＧ」などの配列が好ましい例であり、より好ましくはｘは存在しない）、また、前記Ｆ３プライマーは配列Ｆ３であり、更に、前記ＢＩＰプライマーはＢ１ｃは配列Ｂ１ｃおよび配列Ｂ２を含む配列Ｂ１ｃ−ｙ−Ｆ２であり（ここで、ｙは０以上の整数個の塩基の核酸であり、好ましくは、０〜３塩基の任意の塩基である。例えば、「ＴＴＴ」、「ＡＡＡ」、「ＣＣＣ」および「ＧＧＧ」などの配列が好ましい例であり、より好ましくはｙは存在しない）、また、前記Ｂ３プライマーは配列Ｂ３である場合において、表２の領域番号２を使用してＩ型のＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。

例えば、前記Ｆ３プライマーは、配列番号６８に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号７２に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号７６に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号８１に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号６８の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号７２の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号７６の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号８１の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

（ii）II型用プライマーセット
Ｉ型用プライマーセットと同様な場合において、表２の領域番号４を使用してＩＩ型のＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。

即ち、前記Ｆ３プライマーは、配列番号６９に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号７３に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号７７に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号８２に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号６９の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号７３の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号７７の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号８２の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

（iii）III型用のプライマーセット
Ｉ型用プライマーセットと同様な場合において、表２の領域番号４を使用してIII型のＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。

前記Ｆ３プライマーは、配列番号８７に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号９１および配列番号９２よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号９６に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号１００に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号８７の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号９１の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号９６の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号１００の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

（iV）IV型プライマーセット
Ｉ型用プライマーセットと同様な場合において、表２の領域番号４を使用してIV型のＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。

即ち、前記Ｆ３プライマーは、配列番号７１に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号７５に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号８０に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号８４に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号７１の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号７５の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号８０の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号８４の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

（ｂ）表２の領域番号５を使用する場合
（i）Ｉ型用のプライマーセット
表２の領域番号５の配列を使用して提供されるＨＥＶＩ型用のプライマーセットは次の通りである。

例えば、前記Ｆ３プライマーは、配列番号８５に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号８９に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号９４に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号９８に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号８５の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号８９の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号９４の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号９８の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

（ii）II型用プライマーセット
Ｉ型用プライマーセットと同様な場合において、表２の領域番号５を使用してＩＩ型のＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。

例えば、前記Ｆ３プライマーは、配列番号８６に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号９０に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号９５に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号９９に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

（iii）III型用プライマーセット
Ｉ型用プライマーセットと同様な場合において、表２の領域番号５を使用してＩＩＩ型のＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。

例えば、前記Ｆ３プライマーは、配列番号８７に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号９１および配列番号９２よりなる群から選択される少なくとも１の配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号９６に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号１００に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であってよい。

（iV）IV型用プライマーセット
Ｉ型用プライマーセットと同様な場合において、表２の領域番号５を使用してＩＶ型のＨＥＶを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは次の通りであってよい。

例えば、前記Ｆ３プライマーは、配列番号８８に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号９２に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号９７に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号１０１に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

または、前記Ｆ３プライマーは、配列番号８８の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＦＩＰプライマーは、配列番号９２の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、前記ＢＩＰプライマーは、配列番号９７の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸であり、および前記Ｂ３プライマーは、配列番号１０１の相補配列に含まれる連続する配列で示される１５塩基以上の核酸である。

以上のような本発明に従うプライマーセットにより、迅速且つ正確にＨＥＶを検出することおよび／または感染したＨＥＶの遺伝子型を決定することが可能な手段が提供される。また、ここで、何れのプライマーセットに使用される構成単位の配列に、目的とするプライマーとしての機能を妨げない限りにおいて、少なくとも１の変異、欠失、付加があってもよい。そのような変異、欠失、付加のある配列を含むＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーおよび／またはプライマーセットも本発明の範囲内である。また、そのようなプライマーまたはプライマーセットを利用した核酸増幅方法およびＨＥＶ検出方法も本発明の範囲内である。

４．ＨＥＶ検出方法
上述したような本発明に従うＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットからなる群より少なくとも１選択されるプライマーセットを用いることにより、Ｅ型肝炎ウイルスを検出するための方法が提供される。また、型分けプライマーセットを使用することによりＨＥＶの検出と共に、または検出とは別にＨＥＶの型分けを行うことも可能である。

本発明に従う方法は、本発明に従うプライマーセットを適切に増幅が得られる条件下でＬＡＭＰ反応を行って検体試料の核酸増幅反応を行うことと、前記増幅反応後または反応工程中に増幅産物を検出することを行えばよい。

検体試料は、必要であれば核酸増幅反応を行う前にそれ自身公知の抽出手段により核酸成分にされてもよい。例えば、そのような抽出手段の例は、フェノール−クロロホルム法などの液−液抽出法、単体を用いる固−液抽出法などを使用してよいが、これに限定するものではない。また、市販の核酸抽出キットＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（医学生物学研究所社製）などを利用することも可能である。また、検体試料が、核酸成分である場合には抽出工程は不要である。

核酸成分である検体試料を、ＬＡＭＰ増幅する場合には、例えば、次のような条件で行うことが好ましい。ＬＡＭＰ増幅の温度は、ＬＡＭＰ法を開発した栄研化学社が推奨する約６０℃〜約６５℃の間の温度も好ましく、例えば、５８℃〜５９℃の反応温度も好ましい。

ＨＥＶの型分けを行う場合には、適切に増幅が得られる条件下でＬＡＭＰ反応を行って検体試料の核酸増幅反応を行い、前記増幅反応後または反応工程中にプライマーセット特異的な増幅産物を検出することと、前記プライマーセット特異性に依存してＥ型肝炎ウイルスの遺伝子型を決定することを行えばよい。例えば、プライマーセット特異的な増幅産物を検出するための手段は、１チューブに１種類の遺伝子型を特定するためのプライマーセットを存在させて反応を行い、増幅の有無を確認すればよい。それによって、プライマーセット特異性、即ち、プライマーセットの型特異性に依存した検出が可能になる。

また、増幅産物の検出は、例えば、増幅反応時または増幅反応後に、反応液の濁度を検出してもよく、または、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの種々の光学的な手段を利用することが可能である。それらの手段は、それ自身当業者には公知である。

また、増幅の有無を濁度を測定することによって行ってもよい。例えば、濁度を測定する場合には、これらに限定するものではないが、例えば、テラメックス株式会社製のＬｏｏｐａｍｐリアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００やモリテックス社製のＲｅａｌｏｏｐ−３０などを使用することが可能である。また、２本鎖ＤＮＡに取り込まれて蛍光発光するようなエチジウムブロマイド、サイバーグリーンＩなどを用いてモニターすることも可能である。これらの方法により、リアルタイムに増幅産物の合成量をモニターすることが可能である。

上述の本発明に従う方法により迅速且つ正確にＨＥＶを検出することおよび／または感染したＨＥＶの遺伝子型を決定することが可能である。

５．アッセイキット
本発明に従うと、本発明の方法を実行するためのアッセイキットが提供される。そのようなアッセイキットの例は、少なくとも上述した通りの本発明に従うプライマーセットを具備し、更に、その他に、核酸増幅酵素、逆転写酵素、増幅酵素の基質、逆転写酵素の基質、反応用緩衝液、反応用緩衝剤および／または反応容器などを具備すればよい。

そのようなアッセイキットの提供により、より簡便に迅速且つ正確なＨＥＶの検出および／または感染したＨＥＶの遺伝子型の決定を行うことが可能になる。

［例］
例１
プライマー領域に対応する配列は、表１および表２に示した配列で示される核酸群を使用した。更に、ループプライマーとして表３に示した配列で示される核酸を使用した。

以下に、本発明による核酸検出方法を実施例により具体的に説明する。

（１）合成オリゴヌクレオチド
表１、表２に記載された配列を使用して、ＨＥＶの検出および遺伝子型を分類するために用いる核酸プライマーを作製する。このようなプライマーの合成は、当業者に既知の何れの方法を使用して行うこともできる。

（２）ＬＡＭＰ反応液
本例においてはＲＴ−ＬＡＭＰ法をＬＡＭＰ法として使用した。ＬＡＭＰ反応液は以下の組成とした。

ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭＫＣＬ
８ｍＭＭｇＳＯ_４
１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
０．８ＭＢｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭｄＮＴＰｓ。

このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込む。

プライマー添加量
ＦＩＰプライマー４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー５ｐｍｏＬ。

実施例に使用したプライマーは、領域番号００２の配列を使用した。ＦＩＰプライマーは配列番号２４、ＢＩＰプライマーは配列番号２７、Ｆ３プライマーは２３、Ｂ３プライマーは配列番号３１を使用した。

更に、総量２５μＬにて反応を行う際には、酵素混合物として、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（New England Bio Labs社製）とＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（タカラバイオ社製）を同比または何れかの比率で混合した酵素液、もしくは栄研化学社製のRNA増幅試薬キットに添付されているEnzyme Mixを１μＬずつ各反応系に添加した。被検試料は、ＨＥＶに感染した患者１、患者２および患者３からそれぞれに採取した血清から、スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（医学生物学研究所社製）を使用して抽出して得たＨＥＶＲＮＡを使用した。

（３）ＬＡＭＰ法による核酸増幅
温度は６３℃、時間は１．５時間に設定して核酸増幅を行った。このとき、血清からの抽出産物の代わりに滅菌水を添加した試料をネガティブコントロールとした。増幅したＬＡＭＰ産物をアガロースゲル電気泳動で確認した。その結果、患者からの被検試料を含む反応系から得られたサンプルは、ＬＡＭＰ産物に典型的なラダー状のパターンが現れた（図６）。一方、鋳型ＤＮＡを含まないネガティブコントロールの場合には、全く増幅が見られなかった（図６中のｎのレーン）。以上の結果より、選択したプライマーセットを用いて、配列特異的にＨＥＶゲノムの増幅が可能となったことが明らかである。

（４）ＬＡＭＰ法による濁度測定
ＬＡＭＰ法による増幅を濁度測定によって検出した。濁度測定は、テラメックス社製の濁度測定装置ＬＡ−２００を用いて、領域番号００２の配列を構成単位として使用したプライマーセットを用いて行ったＬＡＭＰ法の増幅を検出した。その結果を図７に示す。図中の凡例において領域番号００２に「Ｌ」が表記されたものには、当該反応系に表３の配列番号１０４のループプライマーを添加した。また、凡例中の末尾の番号はそれぞれに下記の鋳型濃度を示している。

１：１０^３コピー／反応系
２：１０^２コピー／反応系
３：１０^１コピー／反応系
４：１０^０コピー／反応系。

これらの結果から、ループプライマーを添加した場合の方が、添加しない場合よりも増幅開始が早く、鋳型濃度が高い方が低い場合よりも増幅開始が早いことが確認された。

例２
ＬＡＭＰ法によるＨＥＶ検出における指摘反応温度を求めるための検討を行った。使用したプライマーを以下に記す。

実施例に使用したプライマーは、領域番号００２の配列を使用した。ＦＩＰプライマーは配列番号２４、ＢＩＰプライマーは配列番号２７、Ｆ３プライマーは２３、Ｂ３プライマーは配列番号３１、ループプライマーは１０４を使用した。

ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーは、例１と同じ濃度で使用し、ループプライマーは２０ｐｍｏＬ／２５μＬ反応系で持ち込んだ。

反応温度は６３℃と５９℃とし、増幅開始のタイミングを測定した。その結果を図８に示した。図中の凡例において、６３と表記したものは６３℃で反応した場合であり、５９と表記したものは５９℃で反応をしたときの結果である。

また、凡例中の末尾の番号は、それぞれ以下のような鋳型の濃度である。

２：１０^２コピー／反応系
１：１０^１コピー／反応系
０：１０^０コピー／反応系
ｎ：ネガティブコントロールとして水を添加。

これらの結果より、十分な鋳型濃度がある場合には、６３℃で反応した場合の増幅開始が早かった。しかしながら、鋳型濃度が低下すると増幅しないという現象が見られた。一方、５９℃で反応した場合には、鋳型濃度が１００倍違っても、増幅開始のタイミングは１０分も変わらなかった。よって、領域番号００２の上記プライマーを組み合わせた系においては、６３℃よりも５９℃での反応の方が適していると考えられる。

例３
ＬＡＭＰ法によるＥ型肝炎ウイルスの検出法において、配列番号１から１３までを使用した領域番号００２が、他のどの領域よりも増幅効率の点で優れていることを示すための実験を行った。

以下、本検討に用いたプライマー領域と各領域に設定したプライマー配列を表４−１〜表４−３にしめす第４配列群に示す。表４−２および表４−３は順に表４−１に続くものであり、ここでは、表４−１〜表４−３を合わせて表４と記す。

また、配列番号１から１３までを使用する領域番号００２のプライマーとしては、下記の配列番号を使用した。

Ｆ３：配列番号１
ＦＩＰ：配列番号２と配列番号４
ＢＩＰ：配列番号６と配列番号９
Ｂ３：配列番号１２
ループプライマーはなし。

（１）ＬＡＭＰ反応溶液
本実験では、ＲＴ−ＬＡＭＰ法をＬＡＭＰ法として使用した。ＬＡＭＰ反応溶液は以下の組成の通りである。

ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応溶液組成
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭＫＣｌ
８ｍＭＭｇＳＯ_４
１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
０．８ＭＢｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭｄＮＴＰｓ。

この組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度で表４のそれぞれのプライマーを持ち込んだ。

プライマー添加量
ＦＩＰプライマー４０ｐｍｏｌ
ＢＩＰプライマー４０ｐｍｏｌ
Ｆ３プライマー５ｐｍｏｌ
Ｂ３プライマー５ｐｍｏｌ
ループプライマーの添加はなし。

さらに、酵素混合液として、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼとAMV リバーストランスクリプターゼを混合した酵素液、即ち、栄研化学社製のRNA増幅試薬キットに添付されているEnzyme Mixを、総量２５μＬにて反応を行う際には、１μＬずつ添加した。

テンプレートには、Ｅ型肝炎ウイルスが感染した患者１(Type III, JRA-1)、患者２(Type III, JKN-1)、の血清から、スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（医学生物学研究所社製）を使用して抽出したＨＥＶＲＮＡを使用した。

（２）ＬＡＭＰ法による核酸増幅
温度は６０℃、時間は１００分として設定し核酸増幅を行った。この時、血清からの抽出産物の代わりに滅菌水を添加したものをネガティブコントロールとした。

（３）ＬＡＭＰ法による濁度測定
濁度測定結果の例として、テラメックス社製の濁度測定装置ＬＡ−２００を用いて、領域番号１０１から１１５までの配列を用いて設計したプライマーと、領域００２内に設定したプライマー（組成は上記の例３（１）に記載したものと同様）を用いた場合の増幅の立ち上がりをリアルタイムで測定した。その結果を図９に示す。図中の凡例において、ＪＲＡとした結果は患者１からのものを示し、ＪＫＮとした結果は患者２からのものである。凡例の末尾に付した１０１から１１５および００２の番号は、使用したプライマーの領域番号を示す。

（４）検討に使用したプライマー領域の保存性と増幅開始時間との比較
表５に、本検討に使用したプライマーの領域とそれぞれの患者検体における増幅立ち上がり時間、および当該領域の配列保存性についてまとめた。

表５に示した結果から、本発明で最も効率が良いとした領域番号００２よりも領域番号１１４の方が、増幅立ち上がり時間が早く良好な結果を示した。しかしながら、この領域番号１１４は、領域番号００２に比して変異が集積した領域であり、型間だけでなく同じ型の内部でさえも異なった配列を示すことが多い領域である。従って、今回扱ったＪＲＡ−１株とＪＫＮ−１株以外の型を増やした場合には、増幅効率が低下する可能性が高い。それに比べると、領域番号００２付近は、型間でも型内でも変異が少ない領域であることは実験データから明らかである。よって、領域番号００２が、型間、型内の変異が少ないだけでなく、そこに設計したプライマーによる増幅の立ち上がりが早いという点からも、最もＨＥＶのＬＡＭＰ増幅に適したプライマー設定領域であると証明された。

例４
ＨＥＶゲノム中の他の保存性の高い領域を使うことにより、図４に示す領域番号００２の領域を使用して増幅を行った方が、より増幅開始のタイミングが速いことを示す検討を行った。

ＨＥＶゲノムには、図４に示す５’末端からオープン・リーディング・フレーム１にかけての領域に保存性の高い領域がある。しかしながら、それ以外にもオープン・リーディング・フレーム２領域の一部にも同程度に保存性の高い領域がある（図５）。これら２領域各々でＬＡＭＰ増幅系を組んだ場合、増幅効率としての増幅の立ち上がりはどのように違うかについて検討を行った。

（１）オープン・リーディング・フレーム２領域中の２種類のプライマーセットの検討
オープン・リーディング・フレーム２に、領域番号００４と領域番号００５の２種類のプライマーセットを設計し、増幅立ち上がりを比較した。

ＬＡＭＰ反応溶液は以下の組成とした。

さらに、酵素混合液として、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼとＡＭＶリバーストランスクリプターゼを混合した酵素液、即ち、栄研化学社製のRNA増幅試薬キットに添付されているEnzyme Mixを、総反応液２５μＬあたり１μＬずつ添加した。さらに同じく総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを添加して持ち込んだ。

プライマー添加量
ＦＩＰ４０ｐｍｏｌ
ＢＩＰ４０ｐｍｏｌ
Ｆ３５ｐｍｏｌ
Ｂ３５ｐｍｏｌ。

また、それぞれの領域で、反応に持ち込んだプライマーは、下記の通りであった。

領域番号００４：
配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４２、配列番号５２、
配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６
領域番号００５：
配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、
配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７。

保存性が高い中でも、わずかに存在する変異に対応するため、型別プライマーを混合して使用した。ループプライマーは持ち込まなかった。

テンプレートには、予めウイルス濃度が分かったＥ型肝炎ウイルス陽性患者２０例の血清から、スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（医学生物学研究所社製）を使用して抽出したＨＥＶＲＮＡを、段階希釈して使用した。

反応温度は、６０℃として、増幅開始のタイミングを測定した。結果を図１０に示す。

図１０の凡例中の末尾番号は、それぞれに下記の鋳型濃度を示している。

１：１０^２コピー／反応系
２：１０^１コピー／反応系
３：１０^０コピー／反応系
４：ネガティブコントロールとして水を添加。

これらの結果より、鋳型の濃度が十分に存在する場合には、領域番号００５のプライマーの方がわずかに増幅の立ち上がりが早いが、鋳型が減少するにしたがって領域００５プライマーの立ち上がりが大幅に遅れてしまう傾向が確認された。一方の領域番号００４は、鋳型濃度が減少しようとも鋳型さえ存在すれば１時間以内に増幅が立ち上がっており、領域００５のプライマーセットよりも優れていると思われた。

以上の結果から、オープン・リーディング・フレーム２においては、領域番号００４で設計したプライマーセットが優れているという結果を得た。

（２）領域番号００４と領域番号００２とでそれぞれ設計されたプライマーセットでの増幅立ち上がりを比較した。

ＬＡＭＰ反応溶液組成は例４の（１）の通りとした。持ち込みプライマーは、領域番号００４に関しては例４に（１）の通りとした。領域番号００２は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３１を使用した。また、ループプライマーとして、領域番号００４の反応には配列番号１０７、１０８、１０９を持ち込み、領域番号００２の反応には配列番号１０４を持ち込んだ。持ち込み量は、２０ｐｍｏＬ／２５μＬ反応系とした。

増幅反応における鋳型として、ＨＥＶに感染した患者２１、患者２２、患者２４の血清から、スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（医学生物学研究所社製）を使用して抽出したＨＥＶＲＮＡを使用した。

反応温度は、６０℃として、増幅開始のタイミングを測定した。得られた結果は図１１に示した。図１１中、凡例中の末尾番号は患者番号を示す。

図１１に示した結果より、各３例の患者検体抽出サンプルからの増幅において、領域番号００４のプライマーセットでは、ループプライマーを持ち込んでも４８分から１時間強の時間を増幅の立ち上がりに要した。一方の領域番号００２では２０分から３０分の短い時間で増幅の立ち上がりが確認されることが分かった。すなわち、同じく保存性の高いこれら２つの領域であっても、増幅の立ち上がりに必要な時間は大きく異なり、領域番号００２に設計したプライマーセットの方が、早い時間で増幅を開始できることが分かった。

よって、５’末端からオープン・リーディング・フレーム１にかけての領域をＬＡＭＰ増幅に使用することは、ＨＥＶ検出系のためのより優れたプライマーを設計するために重要なポイントであったといえる。

実際のところ、これら２つの保存性の高い領域には、実はＧＣ含量において大きな差が見られる。ＧＣ含量が多いと、鋳型が高次構造をとりやすく、また高次構造が解除されにくくなる現象が見られる。その場合、鋳型が高次構造をとらない場合より、増幅に必要な１本鎖の形状にほどけるためのエネルギーがより多く必要となる。今回のＬＡＭＰ増幅のような等温増幅法では、一旦形成された高次構造は元々解除しにくい傾向があるため、鋳型が高次構造をとりにくい配列であることが、優れたプライマー設計を行う上でのポイントとなる。よって、同じ程度に保存性が高い領域であっても、領域番号００２のある５’末端領域を選ぶことは重要な知見であるといえる。

ＬＡＭＰ法に使用されるプライマーと被検核酸との関係を示す模式図。ＬＡＭＰ法を用いて得られる増幅産物を示す模式図。ループプライマーを用いる場合のＬＡＭＰ法において使用されるプライマーと被検核酸との関係を示す図。ＨＥＶＲＮＡにおける５’非コーディング領域からＯＲＦ−１までの配列とプライマー設定領域を示す模式図。図４Ａの続きを示す図。図４Ｂの続きを示す図。ＨＥＶＲＮＡにおけるＯＲＦ−２領域の一部の配列とプライマー設定領域を示す模式図。図５Ａの続きを示す図。図５Ｂの続きを示す図。ＬＡＭＰ増幅結果を示す電気泳動写真の一例を示す図。ＬＡＭＰ増幅結果を濁度計で測定した結果の例を示すグラフ。ＬＡＭＰ増幅における反応温度の影響を示すための結果を示すグラフ。ＨＥＶのＬＡＭＰ増幅の最適領域を決定するための実験結果を示すグラフ。ＯＲＦ−２（即ち、領域番号４および領域番号５）の保存性の高い領域における、最も増幅の立ち上がりが早いプライマーセットを選択する検討結果を示すグラフ。領域番号００４と領域番号００２でのプライマーセットで、患者検体からの抽出産物を鋳型に行ったＬＡＭＰ増幅の立ち上がり速度を比較したグラフ。

Claims

包括的にＥ型肝炎ウイルスを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーがＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびループプライマーを備え、且つ
前記ＦＩＰプライマーが配列番号２４で示される核酸からなり、
前記Ｆ３プライマーが配列番号２３で示される核酸からなり、
前記ＢＩＰプライマーが配列番号２７で示される核酸からなり、
前記Ｂ３プライマーが配列番号３１で示される核酸からなり、
前記ループプライマーが配列番号１０４で示される核酸からなる
プライマーセット。
包括的にＥ型肝炎ウイルスを検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーがＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびループプライマーを備え、且つ
前記ＦＩＰプライマーが配列番号４１で示される核酸および／または配列番号４２で示される核酸からなり、
前記Ｆ３プライマーが配列番号３６で示される核酸、配列番号３７で示される核酸および／または配列番号３８で示される核酸からなり、
前記ＢＩＰプライマーが配列番号５２で示される核酸および／または配列番号５３で示される核酸からなり、
前記Ｂ３プライマーが配列番号５５で示される核酸および／または配列番号５６で示される核酸からなり、
前記ループプライマーが配列番号１０７で示される核酸、配列番号１０８で示される核酸および／または配列番号１０９で示される核酸からなる；
プライマーセット。
請求項１または２に記載のＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットを用いてＥ型肝炎ウイルスを包括的に検出するための方法であって、ＬＡＭＰ反応を行って検体試料の核酸増幅反応を行うことと、前記増幅反応後または反応工程中に増幅産物を検出することを具備するＥ型肝炎ウイルスを包括的に検出する方法。
請求項３に記載のＥ型肝炎ウイルスを包括的に検出する方法であって、前記増幅産物を検出することがLAMP反応溶液の濁度を測定することにより行われる方法。
請求項３または４に記載の方法を行うためのアッセイキットであって、請求項１または請求項２に記載のＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットと、核酸増幅酵素とを具備するアッセイキット。