JP5281293B2 - 尿中のウイルス特異的核酸を検出するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
現在、病原体の検出のために広く用いられる3種類のインビトロの診断システムが、存在する。これらは、生物学的試料からの病原性因子の直接的培養;感染性因子の産物または抗原の検出に基づく免疫学的アッセイ;および感染中に感染性因子に対して産生される抗体を検出し得る間接的免疫学的アッセイである。
本発明は、被験体由来の尿における腎臓通過性ウイルス核酸特異的配列を検出および定量することによる、被験体におけるウイルス感染の診断およびモニタリングのための方法に関する。一実施形態では、上記核酸は、単離または精製される。この精製は、化学的方法または物理的方法を用いて行われ得る。これらの方法は、有機溶媒での抽出、濾過、沈殿、上記核酸に対するアフィニティを有する固体マトリックス上での吸収、およびクロマトグラフィーを含む。これらの方法において用いられる固体マトリックスは、シリカに基づく樹脂、イオン交換樹脂、またはヒドロキシアパタイトから構築され得る。別の実施形態では、上記固体マトリックスはシリカに基づく樹脂であり、上記単離または精製はカオトロピック因子存在下で行われる。別の実施形態では、上記核酸の分解を阻害する1つ以上の物質は、尿試料に添加される。これらの物質は、イオンキレート剤、変性剤、およびイオン性洗浄剤を含む。本発明の方法において用いられるイオンキレート剤の例は、EDTAである。本発明の方法において用いられる変性剤の例は、グアニジンHClまたはグアニジンイソチオシアネートである。本発明の方法において用いられるイオン性洗浄剤の例は、N−ラウリルサルコシンまたはドデシル硫酸ナトリウムである。一実施形態では、単離または精製された核酸は、ウイルス核酸の検出のために用いられる。
本定義は、本発明の目的のために提供されている:
アンプリコン:(例えば、PCRにより)複製される任意の比較的小さいDNAフラグメントに対する用語。
Tm=3℃×(G+C)+2×(A+T)。
本発明は、ウイルス感染の後、ウイルス核酸またはウイルス起源の核酸は切断されて、尿中に見出される比較的短いフラグメントになるという知見に基づいている。これら病原体特異的核酸の多くは腎臓通過性障壁を通過し(これらの核酸は、一般的に、TrNAまたはTrDNAまたはTrRNAと呼ばれる)、分子的方法により、尿中に無細胞低分子量フラグメント(この長さは、1000ヌクレオチド未満であるが、好ましくは、500bp未満の長さであり、より好ましくは、250〜300bp未満の長さであるかまたは250bp未満の長さである)として検出され得る。これらの腎臓通過性核酸は、被験体の尿路外部に位置するウイルスに由来する。本明細書中で用いられる場合、用語「ウイルス核酸」は、ウイルス起源の核酸を含む。他のウイルス特異的核酸は、腎臓内にあるウイルスまたは細胞からはく落し得、従って、尿中で検出されるために腎臓通過性障壁を通過する必要がない。さらに、いくつかのウイルス特異的核酸は、腎臓通過性障壁を通過すること、または腎臓においてウイルスにより産生されることの他に、他の機構により尿中で見出され得る。
用語核酸は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそのフラグメント/部分を指し、および天然(例えば、ゲノムの)起源または合成起源のDNAまたはRNAを指す。核酸は、二重らせんまたは一重らせんを有し得、配列のセンス方向またはアンチセンス方向、平行らせん(5’→3’);逆平行らせん(3’→5’)も表し得る。用語オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸ポリマーは、均等であり、2個より多いデオキシリボ核酸塩基またはリボ核酸塩基からなる分子を指すと理解される。ヌクレオチド(塩基)の数およびオリゴヌクレオチドフラグメントの長さは、変化し得る。これらは、異なる方法で合成され得る。それらの配列は、慣習的に、5’で開始し、3’で終止すると定義される。これらの数は、配列の方向を示す。
尿試料の調製および腎臓通過性DNAの解析についての全工程を、室温で行った。簡単に言うと、約50〜60mlの尿試料を、本研究に参加する各患者から収集した。尿試料中に存在し得るヌクレアーゼを阻害する目的で、収集後30分以内に、0.5M EDTAおよび0.5M Tris−HClからなる、8.0〜8.5の範囲にわたるpHの溶液を、10mMの終濃度で添加した。少なくとも3つの核分解酵素であるDNase I、DNase IIおよびホスホジエステラーゼが、尿において同定された。EDTAは、DNase Iおよびホスホジエステラーゼの活性を、二価の金属(例えば、Mg2+、Ca2+)および/またはそれらの活性に必要な他のものをキレート化することによって阻害する。DNase IIは、酸性環境において、最大限に活性である。尿にTris−HCl pH8.0緩衝液を補うことは、尿のpHを上昇させ、それによってDNase IIの活性を阻害する。
定量的Tr−DNA解析を含むTr−DNAに基づく適用には、尿の分画がしばしば必要となる。尿の分画は、Tr−DNA/タンパク質複合体、Tr−DNA全体、または特異的遺伝子マーカーの正確な定量に対する、尿中に存在する細胞由来の核タンパク質の影響を減少させる。我々の実験において、我々は、尿の分画、遠心分離および濾過についての2つの手順を用いた。両方の手順を、尿の収集の直後、検体にEDTA−Tris安定化混合物を補う前に実行した。尿の細胞が無傷であり、それらの成分が尿中に漏れ出ず、細胞性DNAをTr−DNAに混入させない限り、この条件で、尿を維持し得る。
我々の実験において、我々は、2つの異なるフォーマットのシリカに基づくDNA抽出プロトコールを用いた。1つ目は真空駆動式であって、2つ目は遠心分離駆動式であった。
尿試料に、6M グアニジンチオシアネート(GITC)(AMRESCO,カタログ番号0380)を、終濃度3M以上になるまで添加した。この溶液を激しく混合し、10mlの開始尿容量につき0.25mlのWizardシリカ懸濁液(PROMEGA,カタログ番号A7141)を補った。DNAを捕捉するために、この混合物を連続的に1時間室温で回転させた。真空ラインにとり付けたミニカラム(PROMEGA,カタログ番号A7211)シリンジアセンブリにこの混合物を充填することにより、DNAを捕捉した樹脂を回収した。真空を適用することにより樹脂を回収し、5mlの3M GITC溶液で2回洗浄した。この樹脂を、さらに2回、80%エタノールおよび50mM NaClからなる溶液で洗浄した。次いで、上記ミニカラムを取り外し、上記樹脂を、1.5mlチューブにおいてベンチトップマイクロ遠心分離機により、さらに2回、96%エタノールで洗浄した。DNAを、尿開始容量1/20以下の容量のお湯を用いた短時間の遠心分離により溶出させた。
尿試料に、6M グアニジンチオシアネート(GITC)(AMRESCO,カタログ番号0380)を、終濃度3M以上になるまで添加した。この溶液を激しく混合し、10mlの開始尿容量につき0.25mlのWizardシリカ懸濁液(PROMEGA,カタログ番号A7141)を補った。DNAを捕捉するために、この混合物を連続的に1時間室温で回転させた。約4000×gでの約5分間の室温での遠心分離により、DNAを捕捉した樹脂を回収した。ペレットにした樹脂を、GITC溶液で1回、洗浄緩衝液で1回洗浄し、次いで、ミニカラムに移し、さらに1回、96%エタノールで洗浄した。DNAを、お湯を用いた短時間の遠心分離により、マイクロ遠心分離チューブに溶出させた。DNAを、尿開始容量1/20以下の容量のお湯を用いた短時間の遠心分離により溶出させた。
PCRの使用に基づいたTr−DNAの解析のためのプライマーを、2つの異なるサイズの標的フラグメント(すなわち、一方は60〜120bpの範囲内であり、他方は250〜400bpの範囲内である)のために選択した。また、全ての上記プライマーを、完全ヒトゲノム配列に対して比較した。上記プライマーを、FastPCRソフトウェアパッケージ(biocenter.helsinki.fi/bi/bare−1_html/oligos)を用いて設計した。ネステッドPCR解析のためのプライマーを、frodo.wi.mit.edu/cg−i−bin/primer3/primer3_www.cgiサイトで入手可能であるPrimer 3パッケージを用いて、内部のネステッドプライマーの融解温度が外部のプライマーの融解温度以上であるように、選択した。
DNAを、上記の実施例に記載されている通り、HIVに感染した10人の患者の尿試料から単離した。HIVウイルスに特異的な抗体の存在を検出するための標準臨床分子的試験の使用により、これらの患者を、HIVに感染していると臨床的に診断した。
特定の実施形態が本明細書中に詳細に開示されているが、これは、説明の目的のみのための例として行われており、開示された発明の明確な形態、または上記の添付された特許請求の範囲についての範囲に関して制限することを意図されていない。特に、発明者によって、本発明に対する様々な置換、変更および改変が、特許請求の範囲に規定されている発明の精神および範囲を逸脱することなく行われ得ることは、意図されている。本発明に対する様々な変化および改変は、本明細書中に記載される実施形態の知識を有する当業者にとって、慣用の事柄であると考えられる。他の局面、利点および改変は、上記の特許請求の範囲についての範囲内であると考えられる。
Claims (24)
- 以下の工程を含む、被験体由来の尿試料において腎臓通過性ウイルス核酸を検出する方法:
a)被験体由来の尿試料から無細胞画分を取得する工程;および
b)配列番号1乃至11からなる群より選択される2以上のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応(ネステッドPCR)、セミネステッドポリメラーゼ連鎖反応(セミネステッドPCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)および鎖置換増幅(SDA)からなる群から選択される方法により、該尿試料の無細胞画分において、約300bp未満の長さの腎臓通過性ウイルス核酸を検出する工程。 - 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記腎臓通過性ウイルス核酸は、DNAである、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、さらに、前記腎臓通過性ウイルス核酸を定量する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記取得工程は、前記尿試料の濾過および遠心分離からなる群から選択される方法により行われる、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記腎臓通過性ウイルス核酸は、DNAフラグメントを含み、該フラグメントの長さは、約100bpと約200bpとの間である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、さらに、前記腎臓通過性ウイルス核酸の単離または精製の工程を包含する、方法。
- 請求項6に記載の方法であって、ここで、前記精製は、化学的方法または物理的方法により行われる、方法。
- 請求項6に記載の方法であって、ここで、前記単離または精製は、有機溶媒での抽出、濾過、沈殿、前記核酸に対するアフィニティを有する固体マトリックス上での吸収、およびクロマトグラフィーからなる群から選択される方法を用いて行われる、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、ここで、前記固体マトリックスは、シリカに基づく樹脂、イオン交換樹脂またはヒドロキシアパタイトからなる、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、ここで、前記固体マトリックスは、シリカに基づく樹脂であり、前記単離または精製は、カオトロピック因子の存在下で行われる、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、さらに、前記核酸の分解を阻害する1つ以上の物質での、前記尿試料の前処理を包含する、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、ここで、前記物質は、イオンキレート剤、変性剤、およびイオン性洗浄剤からなる群から選択される、方法。
- 請求項12に記載の方法であって、ここで、前記イオンキレート剤は、EDTAであり;前記変性剤は、グアニジンHClまたはグアニジンイソチオシアネートであり;そして、前記イオン性洗浄剤は、N−ラウリルサルコシンまたはドデシル硫酸ナトリウムである、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記ウイルスは、HIV−1である、方法。
- 被験体におけるウイルス感染をモニタリングするための方法であって、以下の工程:
a)該被験体由来の第一の尿試料の第一の無細胞画分および該被験体由来の第二の尿試料の第二の無細胞画分を別々の時間に取得する工程;
b)配列番号1乃至11からなる群より選択される2以上のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応(ネステッドPCR)、セミネステッドポリメラーゼ連鎖反応(セミネステッドPCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)および鎖置換増幅(SDA)からなる群から選択される方法により、該尿試料の無細胞画分において、約300bp未満の長さの腎臓通過性ウイルス核酸の存在を検出する工程、および
c)該第一の尿試料における該核酸および該第二の尿試料における該核酸を定量し、該核酸の量の変化をモニタリングする工程、
を包含する方法。 - 請求項15に記載の方法であって、ここで、前記取得工程は、前記尿試料の遠心分離を含む、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、ここで、前記腎臓通過性ウイルス核酸は、DNAフラグメントを含み、該フラグメントの長さは、約100bpと約200bpとの間である、方法。
- 請求項15に記載の方法であって、ここで、前記被験体は、再発性ウイルス感染の発症の危険に瀕している、方法。
- a)300bp未満の核酸を単離するシリカに基づく樹脂を含むマトリックス、および該核酸の分解を阻害する物質を含む、2以上の試薬または材料、ならびに
b)配列番号1乃至11からなる群より選択される2以上のプライマー、
を含む、キット。 - 請求項19に記載のキットであって、核酸のハイブリダイゼーション、サイクリングプローブ反応、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応(ネステッドPCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)からなる群から選択される技術を行うための試薬を更に含む、キット。
- 請求項19に記載のキットであって、ウイルス性因子をコードする核酸に特異的なプライマーをさらに含む、キット。
- 請求項19に記載のキットであって、カオトロピック因子をさらに含む、キット。
- 請求項19に記載のキットであって、該核酸の分解を阻害する物質が、イオンキレート剤、変性剤、およびイオン性洗浄剤からなる群から選択される物質である、キット。
- 請求項23に記載のキットであって、前記イオンキレート剤は、EDTAであり、前記変性剤は、グアニジンHClおよびグアニジンイソチオシアネートからなる群より選択され、前記イオン性洗浄剤は、N−ラウリルサルコシンおよびドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される、キット。
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