JP4503712B2 - 核酸合成法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸合成法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction :以下PCRと略す)法による核酸合成法に関する。
【0002】
【従来の技術】
PCR法は、DNA鎖の中の特定の領域をはさんで、プライマーを結合させ、DNAポリメラーゼを作用させて、DNA合成反応を繰り返すことによって、目的のDNA断片を数十万倍にも増幅できる方法である。PCR法は、マリス氏らの発明である特開昭61−274697号に述べられている。
【0003】
PCR法は、種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析法に使用できる。従って、PCR法は、感染症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、PCRは移植や親子鑑定の際のDNAタイピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【0004】
PCR法の1つの欠点は色素、たんぱく、糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することである。すなわち、代表的な耐熱性DNAポリメラーゼであるThermus aquaticus 由来のTaqDNAポリメラーゼをはじめ、多くのDNAポリメラーゼは、微量の体液由来の夾雑物がPCR反応液中に混在しても、PCRが強く阻害されることが良く知られている。通常、TaqDNAポリメラーゼ用の反応液を作製するためには、あらかじめ25℃においてpH8.3の1MTris-HCl等を用いて、10倍濃度のPCR用緩衝液(100mM Tris-HCl,500mM KCl,10-40mMMgCl2 )を作製しておく。そして、使用時に、この緩衝液を1倍濃度に希釈したものに、dATP,dCTP,dGTP,dTTP をそれぞれ 200μM、必要なプライマーを0.2-1.0 μM、TaqDNAポリメラーゼを2.5units/100μl となるように添加し、さらに必要によっては、ゼラチンやBSAや界面活性剤等の添加物を加え、鋳型DNAを加えてPCRを行う。しかし、このような反応液を用いた場合、微量の体液由来の夾雑物がPCR反応液中に混在しても、PCRが強く阻害されることになる。
【0005】
そこで、PCR法によるDNA増幅に先立つて被験物から細胞、細菌、ウィルス等(以下、遺伝子包含体と称する)を分離し、そして、その遺伝子包含体からのDNAの抽出が必要である。阻害を除去するために、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物からDNAを抽出する方法が従来より使用されている。
最近ではDNA精製法として、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用されている。
【0006】
かような精製試薬キットの1つは「COLLECTAGENE」(AMRAD社)の名で市販されている。この試薬キットを用いて試料は以下の手順で前処理される。
1.抗凝固剤処理をした哺乳動物由来の全血を試験管中で「マグネティクパーティクル」とよく混合し、これにより白血球と「マグネティクパーティクル」を結合させる。
2.「マグネティクパーティクル」に結合した白血球をリン酸緩衝液で洗浄する。
3.「マグネティクパーティクル」に結合した白血球は、結合状態のままでプロテアーゼで分解し、これによりたんぱくは分解され、白血球中のDNAが遊離される。
4.試験管内容物は、プロテアーゼ残査を不活性化するため加熱し、冷却後白血球由来の遊離DNAを含む溶液を得て、この溶液はそのまま次のPCRに使用される。
【0007】
一方、RNA−PCRは、目的RNAを検出したり、その塩基配列の研究に使用され、従って、診断の他にも医学用途、産業用途、環境用途等に利用される。例えば、RNA−PCRは、肝炎の原因となるC型肝炎ウィルス(HCV)や後天性免疫不全症候群の原因となるHIVウィルスの検出に使われる。
【0008】
RNA−PCR法では、まず逆転写酵素の存在下で目的RNAを鋳型にして相補的なDNA(cDNA)が合成される。そして、このcDNAがPCRで増幅される。従来の技術では、試料中のRNAをRNA−PCR法で取り扱う場合には、RNAの精製処理は必須である。基本的にRNAは、DNA精製法と同様な方法により精製される。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法を用いて試料中のDNAやRNAの精製を行っても、不純物の完全な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。
従って、これらの問題点を解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれる。
【0010】
そこで、本発明は、生体由来試料中の目的とする遺伝子を直接増幅出来る核酸合成法を提供することを目的とする。言い換えれば、生体由来試料、特に動物体液由来試料もしくは試料中に含まれる遺伝子包含体の反応系への直接添加によっても遺伝子増幅が可能な反応法および反応試薬を提供することにある。
【0011】
さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。
要約すれば本発明の目的は、動植物組織、体液および排泄物中に存在する遺伝子、とりわけDNAの増幅に適したPCR改良法およびPCR反応試薬を提供することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本件発明者は、PCR反応液のpHを通常用いる場合より高くすることで、生体由来の夾雑物が多量に存在しても、さらには血液や唾液のような体液をPCR反応液に直接添加しても、PCRが可能になることを見いだしているが、更に本反応液中に界面活性剤を添加することにより、PCRが容易になる事を見出し、本発明をなすに至ったのである。すなわち、本発明は、全血、血漿又は血清のいずれかの生体由来試料そのものと、pH緩衝液、塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び、熱安定性DNAポリメラーゼとしてTaq DNA ポリメラーゼを含み(但し、ホルムアミド、及び、T4 ジーン 32 プロテインを除く)、前記全血、血漿又は血清のいずれかの生体由来試料そのものと混合後のpHが8.8以上となる遺伝子増幅反応液を直接混合し反応させる、阻害物質存在下でのPCR法による核酸合成法において、前記反応液中に、界面活性剤の濃度が0.5〜5%となるようにTween20を添加することを特徴とする。
【0013】
本発明において、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0014】
遺伝子増幅反応液は、通常、pH緩衝液並びにMgCl2 、KCl等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び合成酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミン等の蛋白、ジメチルスルホキシド等種々の物質が添加される場合がある。
本発明に使用することが望ましいpH緩衝液は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、トリシン、CAPSO(3-N-Cyclohexylamino-2-hydroxypropanesulfonic acid) あるいはCHES(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid)と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合せによるpH緩衝液等種々のpH緩衝液が使用され得る。
pH調整された緩衝液は、PCR反応液の中で10mMから100mMの間の濃度で使用される。
【0015】
本明細書中でプライマーは、核酸と重合用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができるし、また、生物界から単離することもできる。
本明細書中で核酸は、DNA、RNAの一本鎖、二本鎖およびDNAとRNAよりなる二本鎖を意味する。
核酸は種々の遺伝子包含体より入手できる。プライマーが準備できれば、核酸は本発明により増幅することができる。
【0016】
また、“合成酵素”は、プライマー付加による核酸を合成する酵素あるいは、かような化学合成系を意味する。適切な合成酵素としては、E.coliのDNAポリメラーゼI、E.coliのDNAポリメラーゼのクレノーフラグメント、T4DNAポリメラーゼ、TaqDNAポリメラーゼ、T.litoralis DNAポリメラーゼ、TthDNAポリメラーゼ、PfuDNAポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるものではない。
さらに、本明細書中で使用している“熱安定性”は、高温下好ましくは、65〜95℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【0017】
界面活性剤としては、Tween20が用いられる。反応液中の界面活性剤の濃度としては、0.5%〜5%である。特に5%のTween 20を含有したPCR反応液を用いることにより、10%の血液を含有したPCR反応液からも十分な量のPCR産物を得ることができる。
【0018】
なお、本発明は遺伝子増幅反応実施者が自身で反応液を調整して実施することもできるし、またこれらの反応液を構成する全部あるいは一部を試薬キットにして提供すれば、本発明の実施がより確実、容易になる。
【0019】
試薬キットは、pH緩衝液並びにプライマー、デオキシリボヌクレオチド類及びポリメラーゼを含み試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に用いる試薬キットにおいて、界面活性剤を含有したことを特徴とする。
【0020】
本発明によれば、生体由来試料、特に動物体液由来の試料の反応系への直接添加によっても遺伝子増幅が可能となる。つまり、動物体液由来の試料、例えば、全血、血漿、血清又はダ液はそのまま増幅反応用の試薬類と混合され遺伝子増幅反応が行われる。
【0021】
本発明をPCRに用いた場合、上述のいずれの試料を用いた場合も、PCRの一工程としてPCR反応液がDNAの変性の目的で高温条件にさらされたときに、遺伝子包含体は破壊されDNAが遊離される結果、プライマー等のPCRに必要な試薬がDNAに接触可能となる。この際、PCR反応液中に血液成分やダ液成分等が存在するが、それにもかかわらず、この改良されたPCR法によればDNA増幅が生ずる。
【0022】
【実施例】
本例は、血液を直接PCR反応液に添加する系において、界面活性剤添加の効果について検討したものである。
試料はヒト血液を用いた。種々の濃度の界面活性剤を添加したPCR反応液にヒト血液を 1.25 〜5μl添加し(全50μl)、PCRを行った。PCR反応液は、10mM Tris-HCl,50mM KCl, 1.5mM MgCl2 ,200μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1.0μM のprimer,2.5units/100 μl のTaq DNA ポリメラーゼ(TaKaRa Taq: Takara shuzo,Kyoto,Japan) を用い、界面活性剤添加後にpH8.8に調整した。
なお、PCRのプライマーはヒトbeta-globin coding region 内に位置するplus鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド(P1)及び minus鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド(P2)であり、PCRにより 408bpの増幅産物を得ることができる(Saiki,R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Science 239,487-491.) 。
【0023】
P1:5′GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3′
P2:5′GGAAAATAGACCAATAGGCAG3′
PCRは、94℃、2分のプレヒーティングの後、94℃ 1分間、55℃ 1分間、72℃ 1分間の条件で40サイクル、最後に72℃ 7分間のポリメライゼーションを行った。PCR終了後、反応液5μlを用いて、3%アガロースを含む、0.5μg/ml臭化エチジウム添加TAE(40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH8.0) 液中で電気泳動を行い検出した。
【0024】
抗血液凝固剤としてクエン酸ナトリウムまたはEDTA−2Kを用いて採血した血液を Tween 20 または NP40 を0.05%含有したPCR反応液に添加し、PCRを行った時の増幅産物の電気泳動図を図1に示す。図中Mは分子量マーカー(制限酵素HincIIで切断した 250ngのφX174RFDNA)、1はヒト血液1.25μl添加、2は2.5μl添加、3は5μl添加時のPCR産物の泳動レーンを示す。また、Aは界面活性剤無添加、Bは Tween 20 添加、Cは NP40 添加時の反応液を用いてPCRを行った時の結果を示している。
【0025】
クエン酸ナトリウム含有血液を用いた場合においては、反応液中の界面活性剤の有無にかかわらず、PCR反応液中に2.5μlの血液を添加するとPCR産物が検出されなかった。
一方、EDTA−2K含有血液を用いた場合においては、界面活性剤を含有しない反応液を用いた時には、5μlの血液添加でPCR産物が検出できなかったのに対し、界面活性剤を含有した反応液を用いた時には、5μlの血液添加でもPCR産物が検出できた。
【0026】
次に、クエン酸ナトリウムを用いて採血した血液を0.5% Tween 20 または5% Tween 20 を含有したPCR反応液に添加し、PCRを行った時の増幅産物の電気泳動図を図2および図3に示す。なお、図中の表示は、図1と同一である。図2において、界面活性剤を含有しない反応液を用いた時には、2.5μlの血液添加でPCR産物が検出できなかったのに対し、0.5% Tween 20 を含有した反応液を用いた時には、2.5μlの血液添加でもPCR産物が検出できたことを示している。
【0027】
また、図3において、界面活性剤を含有しない反応液を用いた時には、5μlの血液添加でPCR産物が検出できなかったのに対し、5% Tween 20 を含有した反応液を用いた時には、5μlの血液添加でもPCR産物が検出できたことを示している。
【0028】
なお、図2、図3において、界面活性剤を含有しない反応液を用いた時にPCR産物が検出できた血液の量が異なるのは、異なったヒトの血液を用いたために、PCRに対する阻害作用に差異が生じたためと考えられる。
【0029】
【発明の効果】
本発明により、生体由来の試料から粗分離した遺伝子包含体を核酸合成用反応液系に直接添加しても、効率良く、目的の遺伝子を合成することが可能となる。従って、核酸合成の際の核酸を含む試料の前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。特に血液試料の前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。
また、本発明により、遺伝子包含体を含有する生体由来試料を直接核酸合成用反応液系に添加して、目的の遺伝子を効率良く合成することが可能となる。
【0030】
更に、上述の試薬キットを使用すれば、本発明にかかる改良遺伝子増幅法が容易に実施される結果、本発明の効果である前処理の簡略化とあいまって、遺伝子増幅法が簡便に行なえるようになる。
【0031】
【配列表】
【0032】
【図面の簡単な説明】
【図1】0.05%の Tween 20 または NP-40を含有した反応液を用いて、PCRを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動図である。
【図2】0.5%の Tween 20 を含有した反応液を用いて、PCRを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動図である。
【図3】5%の Tween 20 を含有した反応液を用いて、PCRを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動図である。
Claims (1)
- 全血、血漿又は血清のいずれかの生体由来試料そのものと、pH緩衝液、塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び、熱安定性DNAポリメラーゼとしてTaq DNA ポリメラーゼを含み(但し、ホルムアミド、及び、T4 ジーン 32 プロテインを除く)、前記全血、血漿又は血清のいずれかの生体由来試料そのものと混合後のpHが8.8以上となる遺伝子増幅反応液を直接混合し反応させる、阻害物質存在下でのPCR法による核酸合成法において、前記反応液中に、界面活性剤の濃度が0.5〜5%となるようにTween20を添加することを特徴とするPCR法による核酸合成法。
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