JP2533969B2 - タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法 - Google Patents

タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞物質またはビリオン物質から核酸を抽出
するための迅速かつ有効な方法に関する。また、こうし
て抽出された核酸を増幅または検出するための方法にも
関する。従って、これらの方法は診断の目的に使用する
ことができる。
〔従来の技術〕
生物学的な診断、検査および分析操作の技術分野で
は、生物学的な被検体、例えば全血またはそれらの画分
に由来する核酸の調査が必要である。このような試験管
内操作は、第一段階として核酸の単離が必要である。例
えば、遺伝疾患の試験を行うためには相当純粋なゲノム
DNA試料が必要であり、組み換え技術にはベクターDNAお
よびクローン化せしめるDNAの両方を単離することが必
要である。幹線体、例えば細菌性およびウィルス性感染
細胞の検出におけるDNA診断操作は、一般に、細胞溶解
次いで放出DNAの検出が必要である。
一般的に、細胞中でDNAは遊離の分子として存在しな
いで、DNA,RNAおよびタンパク質の複雑な会合物として
存在する。これは、遺伝情報の担体としてDNAが果す役
割の結果であり、機能上RNAと各種タンパク質とその掛
かわりの結果である。
被検体中におけるDNAと他の物質の複雑な会合物のた
め、効果的な抽出には、DNAが破壊された細胞壁および
細胞膜から放出され、DNA−タンパク質複合体が変性ま
たはタンパク質分解によって分離され、次いでDNAが他
の巨大分子から分離されることが必要である。１以上の
これらの結果を達成するために種々の手段が当該技術分
野で使用されている。例えば、細胞溶解は凍結−解凍、
超音波手段、剪断作用および他の機械的な技法による
か、あるいは酵素、界面活性剤またはキレート化剤で処
理することにより行うことができる。プロテアーゼおよ
び他の加水分解性剤が使用してタンパク質からDNAを分
離することができる。残存タンパク質や他の巨大分子は
各種溶媒、例えばフェノールまたは他のアルコール類を
使用して抽出することができる。
幾つかのDNA単離法は、例えば、ヨーロッパ特許公開
第145356号、同240191号および同245945号公報に記載さ
れており、これらのすべては一連の特定の工程でアルコ
ールおよび酵素的タンパク質分解剤を使用する。一般
に、これらの操作はウィルスDNAの抽出に向けられてお
り、すべての利用可能なDNAを得るには精密に実施しな
ければならない数多くの複雑な工程を伴う。従って、既
知方法の多くは労働集約的であり、望ましくない溶媒の
使用が必要であるため簡単には自動化できない。
興味の対象となる核酸の単離または抽出は、ポリメラ
ーゼ連鎖反応を用いる核酸の増幅および検出に関して最
近開発された方法の利点を取り入れることが必要であ
る。米国特許第4,683,195号および同4,683,202号明細書
は、ポリメラーゼを用いる様々な生物学的被検体に見い
出される核酸に対する有用な増幅および検出方法を記載
する。標準的な核酸抽出方法は、Maniatisらの、Molecu
lar Cloning:A Laboratry Manual（New York:Cold Spri
ng Harbor Laboratry,1982）,280〜281ページを引例と
して挙げる。この引例は、溶解細胞に対するプロテアー
ゼの使用およびフェノール／クロロホルム抽出を含む標
準的な抽出方法に向けられており、一般に、その全操作
を行うのには多くの時間がかかり、そして危険な有機溶
媒の使用を要する。また、NunbergらのProc.Natl.Acad.
Sci.USA,75（11）,5553〜5556ページ（1978）によれば
ハムスター卵巣細胞から、SaikiらのBio/Technology,
３,1008〜1012ページ（1985）によれば全血液被検体の
軟層から、そしてBellらのProc.Natl.Acad.Sci.USA,78
（９）,5759〜5763ページ（1981）によれば全血からDNA
を抽出するのに前記方法が使用されている。
診断試験を商業的に実施可能ならしめるには、それが
経済的な競争性を有することも必要である。このこと
は、操作の全態様が単純で、使用が容易で、かつある程
度自動化されねばならないことを意味する。被検体から
DNAの抽出は、その被検体から最大限のDNAを得と同時に
経済的な利益を上げるために入念な開発が必要な態様の
１つである。さらに、診断結果が急いで必要な場合に
は、抽出操作を迅速にしなければならない。
従って、前述の冗長で時間のかかる工程および有機溶
媒の使用を回避する改良された抽出方法を開発するのに
相当な精力が注がれてきた。かくして、KoganらのN.En
g.J.Med.,317（16）,985〜990ページ（1987）は、遠心
によって全血から取り出された細胞を煮沸することによ
る遺伝疾患を検出するためのDNA抽出を記載する。この
抽出されたDNAは、その後増幅にかけられる。
同様に、SaikiらのNature,324,163〜166ページ（198
6）は、β−グロビンを増幅するのに全血の緩衝化軟層
（末梢血単核細胞および顆粒球を含む）の煮沸を記載す
る。類似の仕事は、鎌状赤血球およびHLA DNAの検出に
関するヨーロッパ特許公開第237362号公報に示されてい
る。ある場合には、軟層の細胞は鉱油で被覆された後、
加熱工程にかけられる。
これらの操作では、前述した危険なフェノール／クロ
ロホルム抽出を避け、そして迅速（2,3分で行われる）
であるが、HLAまたはβ−グロビンDNAのような全血試料
中に多量存在するDNA抽出に対して非常に有用であるに
すぎない。目的のDNAが多くの感染体（例えば、ウィル
ス）の存在する場合のごとき非常に少量で存在するとき
は、全血または軟層画分からの抽出にさらなる改良が高
感度検出にとって必要である。さらに、増幅前に全血か
ら除去することが必要なポリメラーゼ活性に対する妨害
物も多く存在する。
最近の技術革新は平成２年４月16日出願の特願平２−
97789号明細書に記載されている。これらの出願は、DNA
の抽出のための全血またはそれらの末梢血単核細胞画分
（PBMC）の煮沸に向けられている。このような操作は被
検体からDNAを抽出することが見い出されているが、感
度のさらなる改良が必要である。
さらに、当該技術分野における他の最近の進歩は、非
イオン溶解性洗剤およびタンパク質分解酵素（例えば、
プロティナーゼＫ）の使用を必要とする。この方法の基
本的な利点の１つは、DNA抽出時間の２時間未満への短
縮化である。この操作もまた、HiguchiのAmplification
s,A Forum for PCR Uses,2号、１および３ページ、５月
（1989）に記載されている。
〔発明が解決しようとする課題〕
この改良は当該技術分野で広く受け入れられている
が、特にDNAが被検体中で非常に低濃度で存在する場合
には、さらにDNA抽出操作を簡略化することが依然と必
要である。就中、終了まで１または２時間を必要としな
いような核酸の迅速かつ効果的な抽出方法の必要性が存
在する。従って、相当短縮化されそして簡略化された試
料調製方法がほとんどの診断状況にとって必要である。
〔課題を解決するための手段〕
従来技術の抽出操作が包含する課題は、 Ａ）タンパク質分解酵素の不存在下で、１種以上の核酸
を含有する細胞またはビリオン試料を、 （１）pH4〜10に下記溶解性組成物を維持する有機緩衝
剤、 （２）DNAポリメラーゼ活性に対する触媒量の補因子
源、 （３）安定化剤、 （４）前記細胞またはビリオンから核酸を放出するのに
十分量で存在する少なくとも１種の適合性非イオン界面
活性剤であって、抽出される核酸や溶解性組成物中で使
用される他のいずれの物質とも適合する前記非イオン界
面活性剤、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、 Ｂ）得られる混合物を５〜15分間水の沸点またはその付
近で加熱する工程、ならびに、 Ｃ）その加熱された混合物から核酸を回収する工程、 からなる細胞またはビリオンからの核酸の迅速抽出方法
によって解決される。
この発明はまた、次の各段階を含んでなるポリメラー
ゼ連鎖反応を用いる核酸の増幅方法をも提供する。
Ａ）タンパク質分解酵素の不存在下で、１種以上の核酸
を含有する細胞またはビリオン試料を、 （１）pH4〜10に下記溶解性組成物を維持する有機緩衝
剤、 （２）DNAポリメラーゼ活性に対する触媒量の補因子
源、 （３）安定化剤、 （４）前記細胞またはビリオンから核酸を放出するのに
十分量で存在する少なくとも１種の適合性非イオン界面
活性剤であって、抽出される核酸や溶解性組成物中で使
用される他のいずれの物質とも適合する前記非イオン界
面活性剤、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、 Ｂ）得られる混合物を５〜15分間水の沸点またはその付
近で加熱する工程、ならびに、 Ｃ）その加熱された混合物から核酸を回収する工程、 からなる抽出段階、ならびに II.回収した核酸をポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅
する段階。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明は、いずれかの起源（ヒト、動物もしくは植物
組織または流体）に由来する細胞そのもの、ビリオンま
たはそれらの成分を含有するいずれかの被検体から１種
以上の核酸の抽出または増幅に向けられる。好ましく
は、全血またはその成分が核酸源である。本発明の主目
的は診断にあるとはいえ、抽出された核酸は各種の検
査、医学的研究分野でDNAまたはメッセンジャーRNAのク
ローニングあるいはゲノムDNAの配列決定にも使用する
ことができる。抽出された核酸の他の用途は当業者に自
明であろう。
核酸は、ゲノムDNAあるいは細菌、ウィルスまたは酵
母などの感染体によって細胞または体液中で発生するDN
Aであることができる。核酸を含有する試料は、新鮮な
患者の試料、新鮮もしくは凍結細胞ペレットであること
ができ、あるいはいずれか他の適当な状態で提供されう
る。処理される被検体が全血である場合、一般に、抽出
される核酸はゲノムDNAである。しかしながらこの発明
は、感染体（ほとんどは、ヘルペス、サイトメガロウィ
ルス、エプスタイン−バールウィルス、ならびにHIVI、
HIV−IIおよびHTLV−Ｉのようなレトロウィルスなどの
ウィルス）に侵された細胞に由来するDNAの抽出および
検出にとって特に有用である。好ましくは、サイトメガ
ロウィルス、エプスタイン−バールウィルスおよびHIV
ウィルスのDNAが本発明によって抽出されそして検出さ
れるが、HIV−ＩウィルスのDNAの抽出および検出が最も
興味深いものである。
核酸源でありうる全血のある成分は、末梢血単核細胞
画分（PBMC）である。これは、標準的な操作を用いる遠
心によって全血からフィコール・パキュ（Ficoll−Paqu
e、商標）（Pharmacia Inc.,Piscataway,N.J.）のクッ
ション上に得られる。それは単球とリンパ球からなるも
のと信じられている。
細胞またはビリオン含有試料は、それらの細胞または
ウィルス粒子の溶解を促進する温度で溶解組成物と混合
される。一般に、この温度は15〜30℃であり、室温が最
も有用である。
この発明の方法ではタンパク質分解酵素がまったく使
用されないことに特徴がある。このような酵素は、タン
パク質の加水分解を触媒するいずれかの酵素または酵素
調製品として米国特許出願第178,202号に概述されてい
る。
この溶解組成物は、pH4〜10、好ましくはpH7〜９を維
持する１種以上の有機緩衝剤を含む。限定されるもので
ないが、有用な緩衝剤としては、３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）エタ
ンスルホン酸、トリシン、グリシン、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンおよび当業者に自明の他の緩衝
剤が挙げられる。好ましくは、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンが使用される。使用される緩衝剤量
は、pKaに依存しそして目的のpHを維持するに必要な量
である。一般に、１〜100ミリモル濃度で存在する。
DNAポリメラーゼに対する補因子源もまた本発明の組
成物に含められる。有用な補因子は、一般的に金属イオ
ン、例えばマグネシウムイオンおよびマンガンイオンで
ある。それらは遊離イオンとして、または塩化マグネシ
ウム、酢酸マグネシウム、臭化マグネシウム、硫酸マグ
ネシウム、塩化マンガン、臭化マンガンもしくは当業者
に自明の他の塩として供給することができる。含まれる
補因子量は、DNAポリメラーゼ活性を効果的に発揮する
のに必要な量である触媒量で存在する限り、増幅に使用
される他の試薬、例えば、ポリメラーゼ、プライマーお
よび当業者にとって自明の他の考慮されるものによって
変動可能である。一般的にこの量は少なくとも0.5ミリ
モル濃度、好ましくは１〜20ミリモル濃度である。マグ
ネシウムイオンは塩化マグネシウムの状態にあるのが好
ましい。
安定化剤もまたこの組成物に含められる。この剤はバ
インダー物質とも考えることができる。それは１種以上
の合成または天然の水溶性または水分散性高分子物質、
例えば、抽出された核酸と複合化しないタンパク質、ゼ
ラチンもしくはその誘導体、セルロースもしくはその誘
導体、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール
および当業者に自明の他のものであることができる。こ
の安定化剤は、一般に、組成物1ml当たり0.1〜10mgの量
で存在する。
溶解組成物は、試験検体中の細胞またはウィルス粒子
の細胞質膜または核膜から核酸を放出するのに十分量で
存在する１種以上の適合性非イオン界面活性剤を含む。
「適合性」とは、抽出される核酸や溶解組成物中で使用
される他の材料のいずれにも界面活性剤が悪影響を及ぼ
さないことを意味する。
この組成物で使用できる各種の界面活性剤が存在し、
限定されるものでないがこれらとしてポリオキシエチレ
ソルビタン誘導体、ポリオキシエチレンエーテル類、ポ
リグリコールエーテル類、ポリフルオロアルキルポリオ
キシエチレン類、フッ化アルキルアルコキシレート類お
よびフッ化アルキルエーテル化合物類が挙げられる。界
面活性剤の他の有用な種やこれらの具体例は、当業者に
自明であろうが、特に界面活性剤に対する標準的な引用
例、McCutchen′s Emulsifiers and Detergents 1986,
（North American Edition,McCutcheon Division Publi
shing Co.,Clen Rock,N.J）を参照すればなおさら自明
となろう。
限定されるものでないが、代表的なポリオキシエチレ
ンソルビタン誘導体としては、ポリオキシエチレン（2
0）ソルビタンモノラウレート〔Tween（商標）20として
販売されている〕、ポリオキシエチレン（４）ソルビタ
ンモノラウレート〔Tween（商標）21として販売されて
いる〕、ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノパル
ミテート〔Tween（商標）40として販売されている〕お
よびポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノステアレ
ート〔Tween（商標）60として販売されている〕ならび
にその他ICI Americas,Inc.によって商標Tweenの下で販
売されているものが挙げられる。
代表的なポリグリコールエーテル類としては、限定さ
れるものでないが、Tergitol（商標）非イオン界面活性
剤〔例えば、Tergitol（商標）NPXおよびTergitol（商
標）NP−７〕としてUnion Carbideから販売されている
ものが挙げられる。
前述のフッ化物類に属する代表的な界面活性剤として
は、限定されるものでないが、Zonyl（商標）FSNおよび
Zonyl（商標）FST−100のようなZonyl（商標）系の界面
活性剤（DuPont製）、3M社から市販されているFluorad
（商標）系の界面活性剤、例えばFluorad（商標）FC−1
70−Ｃ、Fluorad（商標）FC−170、Fluorad（商標）FC
−430、Fluorad（商標）FC−431およびFluorad（商標）
FC−740が挙げられる。
有用なポリオキシエチレンエーテル類としては、限定
されるものでないが、オクチルフェノキシポリエトキシ
エタノール〔Triton（商標）Ｘ−100もしくはTriton
（商標）Ｘ−102としてまたはSigma ChemicalにNonidet
（商標）NP−40として販売されている〕ようなRohm＆Ha
asのTriton（商標）系界面活性剤、またはノニルフェノ
キシポリエトキシエタノール〔Triton（商標）−Ｎとし
て販売されている〕のようなもの、あるいはICI Americ
ans,Inc.,のBrij（商標）系界面活性剤、例えばポリオ
キシエチレン（２）セチルエーテル〔Brij（商標）52と
して販売されている〕などが挙げられる。
一般的に、それぞれ２種の相違する部類に属する界面
活性剤に由来するものである少なくとも２種の非イオン
界面活性剤が使用される。好ましい部類のものは、ポリ
オキシエチレンエーテル類とポリオキシエチレンソルビ
タン誘導体である。従って、好ましい態様としては、Tr
iton（商標）Ｘ−100またはNonidet（商標）NP−40とTw
een（商標）20との組み合わせの如き前記２つの部類の
各々に由来する界面活性剤が挙げられる。
この溶解組成物中の非イオン界面活性剤の量は、存在
するものと信られている細胞またはウィルス体の量に応
じて変動しうる。これが抽出された核酸の検出にとって
増幅操作がどれ程の感度をもつかを大きく左右する。一
般に、それは少なくとも0.1重量％、好ましくは0.1〜５
重量％（総組成物重量基準）の量で存在する。界面活性
剤に多様性が存在するので、界面活性剤量は必要により
個々の界面活性剤について調整することができる。界面
活性剤が１種の部類より多くに由来するときには、それ
らの界面活性剤が等量で存在するのが好ましい。
任意ではあるが、この溶解組成物は１〜150ミリモル
の量で塩を含むことが好ましく、より好ましくは50〜10
0ミリモルの塩を含む。このような塩としては、高濃度
で水性溶液中でイオン化されるものであって、一価の
塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび当業者
に既知の他の塩が挙げられる。アルカリ金属塩が好まし
く、塩化カリウムが最も好ましい。また、すべての条件
下で完全にイオン化されないかも知れないが、この溶液
組成物のpHで十分にイオン化される化合物もまた使用で
きるであろう。このような化合物の具体例としては、ト
リシン、グリシン、グリシンナトリウム塩、トリシンナ
トリウム、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
ナトリウム塩および当業者に既知の他の塩のような緩衝
剤が挙げられる。これらの化合物の混合物も使用でき
る。さらに、この塩の追加の化合物としてというよりも
溶解組成物の列挙した成分の１種以上と共に供給しても
よい。
試験試料と溶解組成物を十分な時間（一般に、10分未
満）混合した後、この発明の抽出方法における主要な工
程は、十分な時間水の沸点またはその近傍で前記混合物
を加熱して試料中のタンパク質を破壊しそしてすべての
細胞を溶解することである。この工程の温度は、大気
圧、煮沸時間および他の環境的要因に応じて変動するで
あろう。一般的に海水面レベルでは、加熱温度は100℃
またはその近傍であるが、80℃程度の低温および120℃
程度の高温であることもできる。
前記温度で試料を維持する時間は、試料中のタンパク
質を変性しそして細胞およびビリオンを溶解して核酸を
放出するのに必要な時間である。これは、加熱工程中に
試料の一部を採取して完全なタンパク質が残存するか否
かを測定することによって容易に決定することができ
る。この時間も使用される温度によって変動する。すな
わち、低温では加熱時間はより長くなる。一般的に、試
料は目的の温度で少なくとも５分で15分未満、そして好
ましくは８〜12分加熱され、10分が最適である。
加熱は試料を保持する寸法として十分でありそして加
熱処理に耐えることのできるいずれか適当な容器中で行
うことができる。例えば、それはフラスコ、試験管、遠
心管、毛細管、ビーカ、キュベットおよび他の標準的な
実験室の備器で行うことができる。好ましくは、加熱お
よび化学反応を含む種々の処理用に設計された自蔵式反
応容器中で行われる。このような容器の殆どは当該技術
分野で知られている。
加熱後、放出された核酸（一般に、DNA）は適当な方
法で回収される。過、遠心、デカントまたは吸引を初
めとする、いずれか適当な方法で可溶性DNA分子を含有
する流体から細胞物質および凝集した細胞破砕残渣を分
離する。過は、標準的な過装置または過膜を備え
た各種デバイスを用いて行うことができる。特に有用な
分離手段は、微孔質過膜、例えば、Pall Corp.製のポ
リアミド膜〔例、Loprodyne（商標）膜およびBiodyne
（商標）膜〕である。それらは、分析操作を促進する界
面活性剤または他の材料の未塗布または予備塗布された
ものを使用することができる。
これらの膜は、アッセイの他の工程を実施するための
適当なコンテナーの分離基材として使用することもでき
る。しかしながら、試験装置の一部として固定されてい
るのが好ましい。米国特許第3,825,410号、同3,888,629
号、同3,970,429号および同4,446,232号明細書に記載さ
れるものを初めとする各種の試験装置が当該技術分野で
知られている。特に有用な装置は、ヨーロッパ特許公開
第308,231号公報に記載されている。
この発明の方法は、前記概述した工程を含み、一般に
は他の工程は不要である。しかしながら、全血被検体が
用いられる場合には、適当な方法で赤血球細胞を除去す
ることが望ましいかも知れない。他の任意の遠心工程
は、前記混合または加熱工程のいずれかに先立って主な
妨害物または細胞破砕残渣を除去する方法として有用で
あるかも知れない。
患者の被検体からHIV−I DNAの迅速な抽出に対するこ
の発明の好ましい態様では、その方法は次の工程を含ん
でなる。
A. タンパク質分解酵素の不存在下で、HIV−Ｉ感染細
胞を含むことが信られる患者の被検体を、溶解性組成物
であって、 （１）その組成物をpH4〜10に維持する有機緩衝剤、 （２）少なくとも0.5ミリモル濃度のマグネシウムイオ
ン源、 （３）安定化剤、および （４）細胞の細胞質膜と核膜からHIV−I DNAを放出する
のに十分量で存在する適合性界面活性剤少なくとも１
種、を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、 B. 水の沸点またはその付近で得られた混合物を５〜15
分間加熱する工程、ならびに C. 加熱された混合物からHIV−DNAを回収する工程。
より具体的には、細胞またはビリオンからの核酸の迅
速抽出方法は次の工程を含んでなる。
A. タンパク質分解酵素の不存在下で、１種以上の核酸
を含有する細胞またはビリオンの試料を、溶解性組成物
であって、 （１）その組成物をpH7〜９に維持するためのトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン、 （２）塩化カリウム１〜150ミリモル濃度、 （３）マグネシウムイオン0.5〜20ミリモル濃度、 （４）組成物1ml当たりゼラチン0.1〜10mg、 （５）総組成物重量基準で、ポリオキシエチレンソルビ
タン誘導体の非イオン界面活性剤0.1〜５重量％、およ
び （６）総組成物重量基準で、ポリオキシエチレンエーテ
ル非イオン界面活性剤0.1〜５重量％、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、 B. 水の沸点またはその付近で８〜12分間得られた前記
混合物を加熱する工程、ならびに C. 加熱された混合物から核酸を回収する工程。
本明細書でプライマー、プローブまたは検出される核
酸フラグメントとして称して使用される「オリゴヌクレ
オチド」の語は、２種以上、好ましくは３種を越えるデ
オキシリボヌクレオチド類またはリボヌクレオチド類を
称する。その厳密な寸法は、オリゴヌクレオチドの最終
用途または機能を初めとする多くの要因によって左右さ
れるので限定的でない。このオリグヌクレオチドは合成
的に誘導されてもクローニングにより誘導されてもよ
い。
「プライマー」の語は、天然に見い出されるか合成産
品であるかを問わず、ある核酸鎖に相補的なプライマー
エクステンション産物の合成が誘導される条件下に置か
れた場合に合成の開始点として働きうるオリゴヌクレオ
チドをいう。このような条件には、ヌクレオチド（例え
ば、４種の標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン
酸）やDNAポリメラーゼのような重合用試薬の存在、適
当な温度およびpHが含まれる。
この発明の実施に際して、プライマー、プローブおよ
びフラグメントは全血またはPBMC画分から抽出される標
的核酸の特異的核酸配列に実質的に相補性である。「実
質的に相補性（的）」とは、ハイブリダイゼーションの
形成が起こりうるように適合する十分な数の塩基が相補
的物質上に存在することを意味する。しかしながら、す
べての塩基対が適合することを意味しない。
ある態様では、この検出方法で使用されるプライマー
類（またはそれらの塩）少なくとも１種は、特異的に結
合するリガンドで標識されている。「標識されている」
の語は、リガンドは簡単には脱離しないような状態でこ
のプライマーに付着されていることを称する。この特異
的係合リガンドは、ビオチンもしくはその誘導体、レク
チン、糖、タンパク質、ハプテン、薬剤または抗体もし
くは抗原性物質のような免疫学的な種であることができ
る。
本発明は、２つの相補的の鎖を有する標的核酸の増幅
または検出に有用である。既に興味の対象とされている
殆どの核酸配列は、DNAにおいて見られるもののように
二本鎖である。しかしながら、一本鎖の核酸配列、例え
ば、mRNAも同様に増幅しそして検出することができる。
特異的核酸配列は、鎖型としての配列を含有する核酸
を用いて生成される。この核酸が２つの鎖を含む場合に
は、分離工程としてかまたはプライマーエクステンショ
ン産物の形成と同時にそれらの鎖を分離すること（変性
と称される）が必要である。変性は、従来技術文献に記
載されるようないずれか適当な物理的、化学的または酵
素的手段を用いて行うことができる。適当な温度に加熱
することが好ましい手段である。
一度び分離された鎖が使用可能になったなら、一般に
pH7〜９の緩衝化された水性溶液中で２種以上のプライ
マー（標識されているかまたは未標識）を用いて付加核
酸鎖の合成を行うことができる。好ましくは、過剰モル
量の２種のプライマーが緩衝化された溶液に加えられ
る。その具体的な量は、従来技術文献（例えば、米国特
許第4,683,202号明細書）に教示されている。前記デオ
キシリボヌクレオシド三リン酸類（dATP,dCTP,dGTPおよ
びdTTP）も適当量前記合成混合物に加えられ、こうして
得られる溶液は10分未満、好ましくは１〜４分間90〜10
0℃に加熱される。マグネシウムイオンまたはマンガン
イオンなどの酵素の補因子も前記三リン酸類に対して過
剰モル量存在するのが好ましい。この加熱後、溶液を室
温まで冷却することが好ましく、次いでプライマーエク
ステンション産物の形成を誘導（または触媒）する適当
な試薬が入れられる。この誘導試薬は、一般に重合剤と
して当該技術分野で知られている。これらの産物を形成
する反応は、既知の条件（一般に、室温からもはや重合
が起らなくなる温度まで）下で行われる。
この重合剤は、酵素（例えば、大腸菌DNAポリメラー
ゼＩ、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウポリメラーゼ、逆
転写酵素および当該技術分野で既知の他の酵素）を初め
とするプライマーエクステンション産物の合成を行うこ
とのできるいずれかの化合物または試薬類の組み合わせ
であってよい。特に有用な酵素は、クローン化されるか
または天然に見い出される、例えば各種のサーマス（Th
ermus）属およびメタノサーマス（Methanothermus）属
の細菌種に由来するものである。他の重合剤は、米国特
許第4,683,202号明細書に記載されている。
好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアティカス
（Thermus aquticus）またはサーマス・サーモフィルス
（Thermus thermophilus）に由来する天然のDNAポリメ
ラーゼか、あるいは微生物のいずれかのゲノムからクロ
ーン化された遺伝子から合成的に産生される。一般的
に、エクステンション産物の合成は、各プライマーの
３′末端で開始され合成が終了するまで鋳型に沿って
５′から３′の方向に進行する。ある重合剤（例えば、
逆転写酵素）は前記鋳型に沿って３′から５′の方向に
進行するかも知れない。
新たに合成された鎖類とそれらの各プライマーを含ん
でなる新たに形成されたプライマーエクステンション産
物は、この方法の次の工程で使用される最初の標的鎖を
有する二本鎖分子を形成する。次に、前述したようにこ
れらの鎖を変性によって分離して一般鎖分子を提供し、
その上に前述のように新たな核酸を合成する。この増幅
工程の進行を継続するには追加の試薬が必要であるかも
知れないが、その後のエクステンション産物の殆どは２
種のプライマーと結合された特異的核酸配列からなるで
あろう（すなわち、相補的産物）。
鎖の分離およびエクステンション産物の合成工程は必
要とされるだけ繰り返して、使用、例えば検出に必要な
特異的核酸の所定量を生成することができる。一般的
に、一連の工程は少なくとも１度、好ましくは最低10回
から50回まで繰り返される。
１種より多くの標的核酸の増幅が必要な場合には、前
述の一般的な操作中で数粗の適当なプライマーが使用さ
れる。
サザーンブロット、ゲル電気泳動、染色および当該技
術分野で既知の他の手段を初めとする各種の検出手段を
用いて、検出可能なハイブリッドの存在を測定すること
ができる。
少なくとも１種のプライマーエクステンション産物が
生じた後のこの発明の方法におけるある時点でその産物
を検出可能なプーブ（後述する）とハイブリッドを形成
することができる。
一般に、興味の対象となる核酸配列の所定量が生じた
とき、そのプライマーエクステンション産物を最後に分
離し、最初のプライマーエクステンション産物を、検出
のために標識されそしてそれらに相補的であるオリゴヌ
クレオチドプローブと接触して生成物を形成する。この
プローブは、標的核酸配列と相補的であるオリゴヌクレ
オチドを含んでなる。これらのプローブ類はいずれか適
当な鎖長の核酸であることができるが、好ましくは15〜
40個の核酸を有する。それらは、特異的な結合リガンド
とその受容体の複合化を妨げないであろう適当な検出可
能物質で標識される（通常、５′末端）。
認識を付着される操作およびプローブを調製する方法
は、当該技術分野で周知であり、例えば、AgrawalらのN
ucleic Acid Res.,14,6227〜6245ページ（1986）および
プライマーに特異的結合リガンドを付着させることに関
して前述した引用文献に記載されている。有用な標識と
しては、放射性同位体、電子稠密体、発色体、蛍光体、
リン光成分、フェリチンおよび他の磁性粒子、化学発光
成分および酵素（このものが好ましい）が挙げられる。
有用な酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファターゼお
よび当該技術分野で既知の他の酵素が挙げられる。この
ような酵素に対する基質および色素生成組成物も周知で
ある。
特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであ
り、そしてアッセイのある時点で過酸化水素および適当
な色素生成組成物を加えて検出可能な色素を提供させ
る。例えば、有用な色素生成試薬としては、テトラメチ
ルベンジジンおよびその誘導体、ならびに米国特許第4,
089,747号明細書に記載されるようなトリアリールイミ
ダゾールロイコ染料のごときロイコ染料またはペルオキ
シダーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素を提供す
る他の化合物が挙げられる。特に有用な色素生成組成物
は、国際公開第88/02806号、同88/0.2807号および特開
平１−100453号公報に記載されている。
相補的産物中にあるプローブの存在の検出は、適当な
既知の検出装置および方法を用いて行うことができる。
特定のプローブは検出装置を使用することなく肉眼で見
ることができる。
相補的産物中のプローブを検出するためには、反応媒
体中の他の物質から相補的産物を分離することがしばし
ば重要である。これは、適当な不溶化手段、例えば、本
発明の方法のある時点で固体材料に付着するかまたは付
着を起こしうるプライマーまたはプローブを用いること
によって行うことができる。得られる不溶化複合化生成
物は、過、遠心または他の適当な分離手段によって未
複合化物から分離することができる。
特に有用な分離手段は、Pall Corp.によって販売され
ているポリアミド膜（前述）のような微孔質過膜であ
る。これらの膜は、アッセイの他の工程を実施するのに
適するコンテナーの分離基材としても使用できる。しか
しながら、それらは前述したように試験装置の一部とし
て固定されることが好ましい。
本明細書で開示する方法を使用して、生物学的被検体
中に見い出される感染症、遺伝疾患または細胞疾患（例
えばガン）に付随する特異的核酸の検出または特性決定
を行うことができる。それはまた法医学的捜査における
DNAの類別および組織の類別に使用できるかも知れな
い。この発明の対象には、いずれかの器官に由来するヒ
トゲノムDNAの特異的な欠陥または変異、例えば鎌状赤
血球血症、嚢胞性線維症、α−サラッセミア、β−サラ
ッセミアおよび当業者に自明の他の疾患を含む。各種の
感染症も、それが酵母、細菌またはウィルスに起因する
か否かを問わず、存在する細胞または少量の生体を特徴
付ける特異的なDNA配列によって診断することができ
る。このような細菌としては、限定されるものでない
が、サルモネラ（Salmonella）、クラミジア（Chlamydi
a）、ゴノローエ（Gonorrhea）、シゲラ（Shigella）お
よびリステリア（Listeria）が挙げられる。限定される
ものでないが検出可能なウィルスとしては、ヘルペス、
サイトメガロウィルス、エプスタン−バールウィルス、
肝炎ウィルスならびにHTLV−ＩおよびHIV−Ｉのような
レトロウィルスが挙げられる。寄生性原虫、酵母および
カビも検出可能である。他の検出可能な種は当業者にと
って自明であろう。
〔実施例〕
以下の例はこの発明の実施を具体的に説明する目的で
含めるものであって、いずれかの方法に限定することを
意味しない。
例で使用した材料は以下のものであった。
電気泳動の移動性緩衝液（pH8）は、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン（89ミリモル濃度）、ホウ酸
（89ミリモル濃度）およびエチレンジアミン四酢酸（２
ミリモル濃度）から構成した。
ハンクス・バランスド（Hanks balanced）塩溶液は、
Sigma Chemical Co.から入手した。
DNA定量に用いた色素は、Calbiochemから入手した２
−〔２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−ベンズイミ
ダゾール〕−６−（１−メチル−４−ピペラジル）ベン
ズイミダゾールの３塩酸塩であった。
Leucoprep（商標）チューブは、Becton Dickerson La
bware（Lincoln Park,N.J）から入手した。
細胞は、Spectra Services（Rochester,N.Y.）由来の
Olympus BH−２顕微鏡を使用して数えた。
DNAは以下のように定量した： 遠心後、DNA含有上澄（５μ）を前記にイミダゾー
ル色素含有緩衝溶液（2ml）に加えた（最終濃度0.1g/m
l）。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（10ミ
リモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃
度）および塩化ナトリウム（0.1モル濃度）を含む緩衝
液を、塩酸でpH7.4に調整した。蛍光はTKO 100蛍光測定
器（Hoefer Scientific,San Francisco）で測定し、検
量線と比較してDNAを定量した。
増幅に使用したプライマーは、下記配列を有してい
た。
プライマー1:5′−UGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTCTTC−３′ プライマー2:5′−UAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA−
３′ プライマー3:5′−AGCAGCAGGAAGCAGTATGG−３′および プライマー4:5′−UCCAGACTGTGAGTTGCAACAG−３′.5 プライマー１および２はHIV−I DNAのgag領域の核酸
配列を増幅するが、プライマー３および４はHIV−I DNA
のenv領域の核酸配列を増幅する。
アガロースゲル３％SuSieve（商標）および１％Seake
m（商標）は、FMA BioProducts（Rockland,Maine）から
入手した。
対照溶解組成物（前述のHiguchiのものと類似）は次
のように調製した。
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩緩衝
液（10ミリモル濃度、pH8.3）、塩化カリウム（50ミリ
モル濃度）、塩化マグネシウム（2.5ミリモル濃度）、
ゼラチン（0.1μg/ml）、Nonidet（商標）Ｐ−40非イオ
ン界面活性剤（0.45重量％）およびTween（商標）20非
イオン界面活性剤（0.45重量％）を混合して溶液とし
た。この溶液をオートクレーブにかけ、凍結状態で保存
した。使用前にそれを解凍し、次いでプロティナーゼＫ
溶液（10mg/ml）を加えた（解凍液100μ当たり酵素溶
液0.6μ）。
この発明で有用な溶解組成物は、その使用前にプロテ
ィナーゼＫを添加しない他は対照組成物と同様に調製し
た。
増幅に使用したPCR溶液は、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン塩酸塩緩衝液（100ミリモル濃度、pH
8）、ゼラチン（１μg/ml）、塩化カリウム（500ミリモ
ル濃度）、塩化マグネシウム（100ミリモル濃度）、dNT
P（各dNTPの1.5ミリモル濃度を含有する６μ）、サー
マス・アクアティカス由来のDNAポリメラーゼ（7.4単
位、４単位/ml）および前述のプライマー類（各10マイ
クロモル濃度）を含めた。
例１ 患者の全血試料からのHIV−I DNAの抽出 この例は、本発明の抽出方法の実施をHiguchi（前
述）の溶解組成物を用いる従来技術と比較で例示する。
以下の操作を用いて他方病院のHIV−Ｉ感染患者から
得られた数種の各種全血試料を試験した。各試料（8m
l）はLeucoprep（商標）チューブに集め、室温にて20分
間18,000×ｇで遠心し、そして得られた血漿と細胞層
（約6ml）を慎重に取り出して15mlのコニカル・チュー
ブに移した。ハンクス・バランスド塩溶液の等量を加
え、数回転回して溶液を混合した。次に、室温で10分間
300×ｇにて遠心し、取り出し廃棄した。ペレットをハ
ンクス・バランスド塩溶液（3ml）に再懸濁し、回転さ
せ完全な細胞懸濁液を得た。次に細胞を教え次いで溶液
を２つの容量に分割した（各約1.5ml）。これらの２つ
の容量を10分間14,000r.p.m.にて遠心し、各上澄を採取
廃棄した。得られた細胞のペレットを−20℃で凍結し、
後者のDNA抽出についてすぐさま評価した。１つの細胞
ペレットをこの発明の方法を用いて抽出し、もう一つを
対照方法（プロティナーゼＫ溶解組成物を用いる）を用
いて抽出した。
この発明の方法を次のように行った。
前述のように得られた細胞ペレットをプロティナーゼ
Ｋを欠く溶解組成物（50μ）に加え、回転させてペレ
ットを解体した。次に、得られた溶液を10分間100℃で
加熱し、14,000r.p.m.で約２秒間遠心した。こうして得
られたDNAを定量し、反応チューブ当たりDNA約１μｇを
以下に記載するようなポリメラーゼ連鎖反応を用いて増
幅した。
前述の各患者試料の第二細胞ペレットを対照組成物
（50μ）に加え、次いで回転させペレットを解体し
た。得られた溶液を１時間50〜60℃にてインキュベーシ
ョンし、次いで10分間95℃にてインキュベーションし
た。約２秒間1,400r.p.m.にて遠心した後、DNAを定量し
た。反応チューブ当たりDNA約１μｇを下記のようなポ
リメラーゼ連鎖反応を用いて増幅した。
対照抽出操作は相違する温度で２度別々に加熱する工
程で１時間を越えることが観察された。本発明の操作
は、１度の加熱工程が必要であるにすぎず、そして10分
間の加熱を含め単に約12分必要であるにすぎない点でよ
り簡略化された。これらの利点は、抽出および増幅が限
定された人員によって限定された期間で多くの患者試料
が試験されるであろう臨床研究所および医院で実施され
る場合に特に重要である。従ってこの発明の抽出方法は
膨大な量の試験にとってより現実的である。
例２ 抽出されたHIV−I DNAの増幅 この例は、例１で抽出されたDNAをポリメラーゼ連鎖
反応を用いる増幅を具体的に説明する。
本発明ならびに対照抽出方法に由来する例１で抽出さ
れたDNA試料（各１μｇ）を、次の方法のポリメラーゼ
連鎖反応を用いて増幅した。
これらのDNA試料（25μ）をPCR溶液（前記200μ
）と混合しそして32周期で増幅した。各周期は、１分
間かけて97℃まで加熱し、30秒間97℃に保持し、1.5分
かけて55℃まで冷却し、30秒間55℃に保持し、45秒かけ
て70℃まで加熱し、次いで１分間70℃に保持した。次
に、アリコート（６μ）を抜き出し、予めエチジウム
ブロマイド（水1ml当たり10mg、４μ）で染色した４
％アガロースゲルにかけた。移動緩衝液にはエチジウム
ブロマイド溶液（24μ）を含めた。このゲルを１時間
120ボルトで電気泳動し、次いで写真をとりそして吸収
帯を可視化した。
すべての複製において本発明は、Higuchiの対照方法
である従来技術（前述）よりも遥かに迅速かつ簡単であ
った。ある場合には、本発明のエチジウムブロマイドの
吸収帯は対照方法で得られる吸収帯より遥かに強烈であ
ったが、この比較はすべての複製について見られなかっ
た。
〔発明の効果〕
この発明の抽出方法は、種々の患者の被検体における
細胞またはビリオンから核酸を抽出するのに迅速かつ有
効である。この方法は15程の短時間で実施でき、そうす
ることで従来の危険な操作を避けることができる。有機
溶媒が不要であり、それが自動化しやすくするように操
作工程が少なく、例えばある種の輸送容器にかけやす
い。オペレーターはこの発明の方法を容易に使用するこ
とができ、迅速な診断結果を得ることができる。
この発明ではプロティナーゼＫのような高価なタンパ
ク質分解酵素の使用が回避される。意外にもこの操作は
２〜３分間以内で実施され、Higuchi（前述）の１〜２
時間と全く異なる。タンパク質分解酵素の存在を伴うこ
となく、時間のかかる不活化工程が必要であり、あるい
は時ならぬ酵素を失活する試薬を避ける必要がない。
これらの利点は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅で普通に
使用される試薬を含む特殊な抽出組成物の使用によって
達成される。本発明の組成物は患者の被検体と容易に混
合され、２〜３分間煮沸され、次いで放出された核酸が
適当な方法で容易に単離される。前記平成２年４月16日
出願の特願平２−97789号明細書に記載された希釈組成
物をこの発明によっても避けれる。前述したように、抽
出後未反応混合物は増幅が容易である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開89／577（ＷＯ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，1982［４ ］，Ｐ．263−275

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ａ）タンパク質分解酵素の不存在下で、１
    種以上の核酸を含有する細胞またはビリオン試料を、 （１）pH4〜10に下記溶解性組成物を維持する有機緩衝
    剤、 （２）DNAポリメラーゼ活性に対する触媒量の補因子
    源、 （３）安定化剤、 （４）前記細胞またはビリオンから核酸を放出するのに
    十分量で存在する少なくとも１種の適合性非イオン界面
    活性剤であって、抽出される核酸や溶解性組成物中で使
    用される他のいずれの物質とも適合する前記非イオン界
    面活性剤、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、 Ｂ）得られる混合物を５〜15分間水の沸点またはその付
    近で加熱する工程、ならびに、 Ｃ）その加熱された混合物から核酸を回収する工程、 からなる細胞またはビリオンからの核酸の迅速抽出方
    法。
  2. 【請求項２】Ａ）タンパク質分解酵素の不存在下で、１
    種以上の核酸を含有する細胞またはビリオン試料を、 （１）pH4〜10に下記溶解性組成物を維持する有機緩衝
    剤、 （２）DNAポリメラーゼ活性に対する触媒量の補因子
    源、 （３）安定化剤、 （４）前記細胞またはビリオンから核酸を放出するのに
    十分量で存在する少なくとも１種の適合性非イオン界面
    活性剤であって、抽出される核酸や溶解性組成物中で使
    用される他のいずれの物質とも適合する前記非イオン界
    面活性剤、 を含んでなる溶解性組成物と混合する工程、 Ｂ）得られる混合物を５〜15分間水の沸点またはその付
    近で加熱する工程、ならびに、 Ｃ）その加熱された混合物から核酸を回収する工程、 からなる抽出段階、ならびに II.回収した核酸をポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅
    する段階、 を含んでなるポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸の増幅
    方法。
JP2277920A 1989-10-18 1990-10-18 タンパク質分解酵素を用いない核酸の抽出およびｐｃｒ増幅方法 Expired - Lifetime JP2533969B2 (ja)

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CA (1) CA2025845A1 (ja)
DE (1) DE69029563T2 (ja)
FI (1) FI905145A0 (ja)
HK (1) HK113997A (ja)
IE (1) IE903743A1 (ja)
SG (1) SG91238A1 (ja)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5231015A (en) * 1989-10-18 1993-07-27 Eastman Kodak Company Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme
EP0488243A1 (en) * 1990-11-30 1992-06-03 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. Method of extracting virus genome from sample derived from living body infected with the virus and detecting the genome
JPH04200400A (ja) * 1990-11-30 1992-07-21 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd ヒト生体由来の試料からのウイルスゲノムの抽出法及び該ウイルスゲノムの検出法
GB9100551D0 (en) * 1991-01-10 1991-02-20 Amersham Int Plc Method and reagent for eliminating analytical interference in enzymatic analysis from substances used for extraction of intracellular metabolites
DE69214243T2 (de) * 1991-09-23 1997-02-06 Pfizer Verfahren für die Detektion von spezifische mRNS und DNS in Zellen
AU664050B2 (en) * 1991-12-18 1995-11-02 Becton Dickinson & Company Process for lysing mycobacteria
DE4212555A1 (de) * 1992-04-15 1993-10-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
US5629154A (en) * 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5837453A (en) * 1992-05-13 1998-11-17 Geron Corporation Telomerase activity assays
JPH08510004A (ja) * 1993-05-06 1996-10-22 アボツト・ラボラトリーズ 直接溶解緩衝液およびｈｉｖ−１血漿ウィルス血症の検出
CA2121659C (en) * 1993-05-11 2000-11-28 Michael C. Little Sample processing method for mycobacteria
EP0630973A3 (en) * 1993-05-14 1995-04-26 Eastman Kodak Co Diagnostic compositions, elements, methods and kits for amplification and detection tests of two or more DNA's using primers at suitable melting temperatures.
US5804380A (en) * 1993-11-12 1998-09-08 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5863726A (en) * 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
JP3866762B2 (ja) * 1993-11-29 2007-01-10 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド 広範な生物からの核酸抽出法
CA2184270C (en) * 1994-03-10 1999-08-17 Daniel Louis Kacian Method for suppressing inhibition of enzyme-mediated reactions by ionic detergents
US5622822A (en) 1994-09-13 1997-04-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same
US5705366A (en) 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
US5582988A (en) 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US5538870A (en) * 1994-09-21 1996-07-23 Boehringer Mannheim Corporation Method for preparing nucleic acids for analysis and kits useful therefor
WO1997015687A1 (en) * 1995-06-07 1997-05-01 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5989813A (en) * 1995-07-13 1999-11-23 Molecular Innovations, Inc. Detection of amplified nucleic acid sequences using bifunctional haptenization and dyed microparticles
DE19644302A1 (de) * 1995-11-28 1997-06-05 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität
US5942425A (en) * 1996-03-12 1999-08-24 Walters; Adriann H. Method to access nucleic acids from cells
AU739710B2 (en) * 1996-08-23 2001-10-18 Boston Scientific Limited Stent delivery system having stent securement apparatus
ES2126513B1 (es) * 1997-03-14 1999-12-01 Consejo Superior Investigacion Procedimiento para la deteccion de hongos y bacterias en conductos de aire acondicionado.
WO1999033559A1 (en) 1997-12-24 1999-07-08 Cepheid Integrated fluid manipulation cartridge
US6368871B1 (en) * 1997-08-13 2002-04-09 Cepheid Non-planar microstructures for manipulation of fluid samples
EP0953635B1 (en) * 1998-04-28 2012-08-29 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Improved methods for extracting nucleic acids from tissue samples and paraffin-embedded tissues
JP4050870B2 (ja) 1998-09-08 2008-02-20 タカラバイオ株式会社 Ｄｎａの合成方法
US6431476B1 (en) 1999-12-21 2002-08-13 Cepheid Apparatus and method for rapid ultrasonic disruption of cells or viruses
US6887693B2 (en) 1998-12-24 2005-05-03 Cepheid Device and method for lysing cells, spores, or microorganisms
US7914994B2 (en) * 1998-12-24 2011-03-29 Cepheid Method for separating an analyte from a sample
WO2000050564A2 (en) * 1999-02-26 2000-08-31 Myriad Genetics, Inc. Method for extracting dna from dried specimens
US6469159B1 (en) 1999-04-26 2002-10-22 Robert T. Belly Methods for extracting nucleic acids from tissue samples and paraffin-embedded tissues
JP4643023B2 (ja) * 1999-05-04 2011-03-02 オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド 細胞溶解剤を使用せずに試料からｄｎａを迅速に効率よく捕捉する方法
US20040200909A1 (en) * 1999-05-28 2004-10-14 Cepheid Apparatus and method for cell disruption
US8815521B2 (en) 2000-05-30 2014-08-26 Cepheid Apparatus and method for cell disruption
US9073053B2 (en) 1999-05-28 2015-07-07 Cepheid Apparatus and method for cell disruption
CA2373249C (en) 1999-05-28 2011-08-02 Cepheid Apparatus and method for cell disruption
US6383783B1 (en) 1999-09-21 2002-05-07 3M Innovative Properties Company Nucleic acid isolation by adhering to hydrophobic solid phase and removing with nonionic surfactant
DE19954181A1 (de) * 1999-11-10 2001-05-31 Eppendorf Geraetebau Netheler Verwendung nichtionogener Tenside zur Durchführung enzymatischer Reaktionen
AU4312201A (en) * 1999-12-10 2001-06-18 Genespan Corporation Isolation and purification of nucleic acids
US7262006B1 (en) 2000-05-01 2007-08-28 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Rapid and efficient capture of DNA from sample without using cell lysing reagent
KR20020029477A (ko) * 2000-10-13 2002-04-19 박제철 한 단계에 의한 유전자 추출방법
KR20020029476A (ko) * 2000-10-13 2002-04-19 박제철 한 단계에 의해 유전자를 추출하기 위한 라이시스버퍼시약
KR100426544B1 (ko) * 2000-12-08 2004-04-13 바이오코아 주식회사 혈청 또는 혈장으로부터 바이러스의 핵산을 추출하는 방법및 그 방법에 사용되는 핵산 추출용 조성물
US7074333B2 (en) * 2001-01-19 2006-07-11 Millipore Corporation Recovery of linear nucleic acids by salt dilution and/or reduced pressure prior to continuous pressure differential ultrafiltration
FR2822477B1 (fr) * 2001-03-23 2003-08-08 Inst Nat Sante Rech Med Methode de genotypage sans extraction de l'adn
US20040106109A1 (en) * 2001-10-02 2004-06-03 Belly Robert T Detection of ras mutations
US20040038213A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-26 Kwon Jai W. Genotyping by in situ PCR amplification of a polynucleotide in a tissue biopsy
KR100481357B1 (ko) * 2002-10-28 2005-04-07 주식회사 바이오세움 바이러스 핵산 추출용 조성물
US20050042660A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-24 Hall Gerald Edward Devices and methods for isolating RNA
EP2402089A1 (en) 2003-07-31 2012-01-04 Handylab, Inc. Processing particle-containing samples
WO2005084534A1 (en) 2003-09-03 2005-09-15 Life Patch International, Inc. Personal diagnostic devices and related methods
US20050130177A1 (en) 2003-12-12 2005-06-16 3M Innovative Properties Company Variable valve apparatus and methods
US7727710B2 (en) 2003-12-24 2010-06-01 3M Innovative Properties Company Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface
US7939249B2 (en) 2003-12-24 2011-05-10 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step
US8852862B2 (en) 2004-05-03 2014-10-07 Handylab, Inc. Method for processing polynucleotide-containing samples
US20060024712A1 (en) * 2004-06-25 2006-02-02 Invitrogen Corporation Separation of nucleic acid
US20060099605A1 (en) * 2004-11-11 2006-05-11 Hall Gerald E Jr Devices and methods for isolating RNA
US8615368B2 (en) 2005-03-10 2013-12-24 Gen-Probe Incorporated Method for determining the amount of an analyte in a sample
EP1930730B1 (en) 2005-03-10 2019-08-14 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes
CA2606723A1 (en) * 2005-05-09 2006-11-16 Panomics, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
US8632970B2 (en) 2005-05-09 2014-01-21 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
US7803541B2 (en) 2005-05-12 2010-09-28 Panomics, Inc. Multiplex branched-chain DNA assays
US20060270843A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Hall Gerald E Jr Methods for isolation of nucleic acids
US20060269929A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Hall Gerald E Jr Methods and kits for DNA purification on polymeric membranes at low ionic strength
EP3042963A1 (en) * 2005-06-20 2016-07-13 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Methods of detecting nucleic acids in individual cells and of identifying rare cells from large heterogeneous cell populations
WO2007044427A2 (en) * 2005-10-05 2007-04-19 Panomics, Inc. Detection of nucleic acids from whole blood
ES2692380T3 (es) 2006-03-24 2018-12-03 Handylab, Inc. Método para realizar PCR con un cartucho con varias pistas
US10900066B2 (en) 2006-03-24 2021-01-26 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US11806718B2 (en) 2006-03-24 2023-11-07 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
US7998708B2 (en) 2006-03-24 2011-08-16 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US8883490B2 (en) 2006-03-24 2014-11-11 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
CA2647566C (en) 2006-03-29 2017-01-03 Merial Limited Vaccine against streptococci
WO2008061165A2 (en) 2006-11-14 2008-05-22 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge and method of making same
US8287820B2 (en) 2007-07-13 2012-10-16 Handylab, Inc. Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system
US8105783B2 (en) 2007-07-13 2012-01-31 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge
US8182763B2 (en) 2007-07-13 2012-05-22 Handylab, Inc. Rack for sample tubes and reagent holders
WO2009012185A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Handylab, Inc. Polynucleotide capture materials, and methods of using same
US9186677B2 (en) 2007-07-13 2015-11-17 Handylab, Inc. Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples
US8731841B2 (en) 2008-10-31 2014-05-20 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for therapeutic delivery with frozen particles
US8731840B2 (en) * 2008-10-31 2014-05-20 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for therapeutic delivery with frozen particles
US9060934B2 (en) 2008-10-31 2015-06-23 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for surface abrasion with frozen particles
US20100111857A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Boyden Edward S Compositions and methods for surface abrasion with frozen particles
US9060931B2 (en) 2008-10-31 2015-06-23 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for delivery of frozen particle adhesives
US9050317B2 (en) 2008-10-31 2015-06-09 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for therapeutic delivery with frozen particles
US9060926B2 (en) 2008-10-31 2015-06-23 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for therapeutic delivery with frozen particles
US8721583B2 (en) 2008-10-31 2014-05-13 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for surface abrasion with frozen particles
US9050070B2 (en) 2008-10-31 2015-06-09 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for surface abrasion with frozen particles
US8551505B2 (en) 2008-10-31 2013-10-08 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for therapeutic delivery with frozen particles
US8409376B2 (en) 2008-10-31 2013-04-02 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for surface abrasion with frozen particles
US8603495B2 (en) 2008-10-31 2013-12-10 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for biological remodeling with frozen particle compositions
US8788211B2 (en) 2008-10-31 2014-07-22 The Invention Science Fund I, Llc Method and system for comparing tissue ablation or abrasion data to data related to administration of a frozen particle composition
US9072688B2 (en) * 2008-10-31 2015-07-07 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for therapeutic delivery with frozen particles
US8545855B2 (en) 2008-10-31 2013-10-01 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for surface abrasion with frozen particles
US8784385B2 (en) 2008-10-31 2014-07-22 The Invention Science Fund I, Llc Frozen piercing implements and methods for piercing a substrate
US8551506B2 (en) * 2008-10-31 2013-10-08 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for administering compartmentalized frozen particles
US8793075B2 (en) 2008-10-31 2014-07-29 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for therapeutic delivery with frozen particles
US9050251B2 (en) 2008-10-31 2015-06-09 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for delivery of frozen particle adhesives
US8725420B2 (en) 2008-10-31 2014-05-13 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for surface abrasion with frozen particles
US9072799B2 (en) 2008-10-31 2015-07-07 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for surface abrasion with frozen particles
US8788212B2 (en) 2008-10-31 2014-07-22 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for biological remodeling with frozen particle compositions
US8545857B2 (en) * 2008-10-31 2013-10-01 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for administering compartmentalized frozen particles
US8762067B2 (en) 2008-10-31 2014-06-24 The Invention Science Fund I, Llc Methods and systems for ablation or abrasion with frozen particles and comparing tissue surface ablation or abrasion data to clinical outcome data
US8256233B2 (en) * 2008-10-31 2012-09-04 The Invention Science Fund I, Llc Systems, devices, and methods for making or administering frozen particles
JP5916610B2 (ja) 2009-09-03 2016-05-11 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 直接的な化学的溶解のための方法および組成物
CN107365847A (zh) 2010-10-21 2017-11-21 领先细胞医疗诊断有限公司 用于原位检测核酸的超灵敏方法
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
BR122020001802B1 (pt) 2010-10-22 2021-05-18 T2 Biosystems, Inc métodos para detectar a presença de um patógeno em uma amostra de sangue total e para detectar um analito em uma amostra
US8409807B2 (en) 2010-10-22 2013-04-02 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
WO2012083175A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-21 Wisconsin Alumni Research Foundation One-step method of elution of dna from blood samples
CN106148512B (zh) 2011-04-15 2020-07-10 贝克顿·迪金森公司 扫描实时微流体热循环仪和用于同步的热循环和扫描光学检测的方法
CN104040238B (zh) 2011-11-04 2017-06-27 汉迪拉布公司 多核苷酸样品制备装置
EP3524692A1 (en) 2012-04-20 2019-08-14 T2 Biosystems, Inc. Compositions and methods for detection of candida species
US11078528B2 (en) 2015-10-12 2021-08-03 Advanced Cell Diagnostics, Inc. In situ detection of nucleotide variants in high noise samples, and compositions and methods related thereto
WO2017127731A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 T2 Biosystems, Inc. Nmr methods and systems for the rapid detection of bacteria

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4677054A (en) * 1983-08-08 1987-06-30 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for simple analysis of relative nucleic acid levels in multiple small samples by cytoplasmic dot hybridization
US4750982A (en) * 1985-03-21 1988-06-14 Lifecodes Corp. Process and apparatus for purifying and concentrating DNA from crude mixtures containing DNA
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US4900677A (en) * 1986-09-26 1990-02-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for rapid isolation of high molecular weight DNA
WO1989000577A1 (en) * 1987-07-22 1989-01-26 Imperial Cancer Research Technology Ltd. Digestion method
EP0368684B2 (en) * 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5334499A (en) * 1989-04-17 1994-08-02 Eastman Kodak Company Methods of extracting, amplifying and detecting a nucleic acid from whole blood or PBMC fraction
US5231015A (en) * 1989-10-18 1993-07-27 Eastman Kodak Company Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９８２［４］，Ｐ．２６３−２７５

Also Published As

Publication number Publication date
DE69029563D1 (de) 1997-02-13
EP0428197A2 (en) 1991-05-22
US5231015A (en) 1993-07-27
FI905145A0 (fi) 1990-10-18
KR910008135A (ko) 1991-05-30
DE69029563T2 (de) 1997-05-22
EP0428197B1 (en) 1997-01-02
EP0428197A3 (en) 1991-05-29
HK113997A (en) 1997-08-29
US5543305A (en) 1996-08-06
CA2025845A1 (en) 1991-04-19
IE903743A1 (en) 1991-04-24
SG91238A1 (en) 2002-09-17
JPH03133379A (ja) 1991-06-06
ATE147108T1 (de) 1997-01-15

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