KR100481357B1 - 바이러스 핵산 추출용 조성물 - Google Patents

바이러스 핵산 추출용 조성물 Download PDF

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KR100481357B1 KR10-2002-0065802A KR20020065802A KR100481357B1 KR 100481357 B1 KR100481357 B1 KR 100481357B1 KR 20020065802 A KR20020065802 A KR 20020065802A KR 100481357 B1 KR100481357 B1 KR 100481357B1
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Abstract

본 발명은 바이러스 핵산 추출용 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 용이하게 바이러스 핵산을 추출할 수 있으며 PCR 반응에 간섭작용을 하지 않아 신속하고 정확하게 바이러스 감염여부를 진단할 수 있는 다이메칠 설폭사이드 및 세틸트리메틸암모니움 브로마이드를 포함하는 바이러스 핵산 추출용 조성물을 제공한다.

Description

바이러스 핵산 추출용 조성물{COMPOSITION FOR EXTRACTING VIRAL NUCLEIC ACID}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 바이러스 핵산 추출용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈청, 소변, 척수액, 타액 및 눈물과 같은 임상검체로부터 신속하고 정확하게 바이러스 핵산을 추출할 수 있는 다이메칠 설폭사이드 및 세틸트리메틸암모니움 브로마이드를 포함하는 바이러스 핵산 추출용 조성물에 관한 것이다.
[종래기술]
사람을 포함한 동물은 여러 가지 바이러스에 의해 감염되며, 바이러스들은 다양한 질병을 매개하고 있다. 바이러스 감염을 확인할 수 있는 방법들이 개발되었으며, 그중에서도 최근에는 분자생물학적인 방법을 이용한 바이러스 감염여부의 진단방법이 가장 많이 사용되고 있다. 대표적인 분자생물학적 진단방법은 PCR을 이용한 진단이다.
PCR을 이용한 바이러스 감염 진단방법은 검체내 바이러스 핵산의 함유여부를 PCR로 확인하는 것으로, 이러한 방법은 PCR 실시이전에 바이러스의 DNA 또는 RNA의 추출이 선행되어야 한다. 그러나 검체로부터 바이러스 핵산을 정제하는 과정에 다음과 같은 문제들이 발생하여 PCR 반응에 영향을 줄 수 있으며, 많은 수의 검체로부터 핵산들을 각각 분리하기까지 많은 시간과 시약들이 소모되고 있다.
바이러스 핵산 정제과정에서 발생가능한 문제로는 먼저, 과도한 물리적처리에 의한 핵산의 깨짐현상을 들 수 있다. 물리적처리는 바이러스의 세포벽을 파괴하여 핵산을 추출하는 방법으로 기계적인 비드 비팅(bead beating)이나 초음파 처리 등이 대표적인데, 이러한 방법들을 핵산의 깨짐현상을 유발할 수 있어, 바이러스가 감염된 검체를 PCR 하더라도 바이러스 핵산이 증폭되지 않아 정상으로 진단될 수 있다(Liesack, W., and E. Stackebrandt. 1992. J. Bacteriol. 174: 5057-5078; Ogram, A., G. S.Sayler, and T. Barkay. 1987. J. Microbiol. Methods. 7: 57-66; Simonet, P., M.-C. Grosjean, A. K. Misra, S. Nazaret, B. Cournoyer, and P.Normand. 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57: 3278-3286).
두 번째로는 과도한 유기용매사용을 들 수 있다. 원핵세포와 진핵세포로부터 핵산을 추출하는데 전통적으로 사용되는 것이 페놀 및 클로로포름과 같은 유기 용매이다. 핵산추출은 단백질 분해효소로 변성시키므로 이온 계면활성제로 세포를 깬 다음 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물을 혼합하여 유기용매 상과 물 상이 분리시키고, 핵산이 포함된 물 상만을 회수하여 알콜로 침전시켜 수득하게 된다. 페놀 및 페놀/클로로포름 혼합물은 인간 피부 등을 파괴하고, 위험한 폐기물로 간주되어 취급에 주의가 요하는 물질이다.
다음으로, 정제된 바이러스 핵산에 간섭물질이 포함될 수 있다. 간섭물질은 효소작용을 방해하여 이후 진단과정을 용이하게 실시하기 어렵다(Zhou, J., M. A. Bruns, and J. M. Tiedje. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62. 316-322; Young, C. C., R. L. Burghoff, L. G. Keim, V. Minak-Bernero, J. R. Lute, and S. M. Hinton. 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59. 1972-1974; Tsai, Y-L., and B. H. Olson. 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58: 2292-2295). 특히, 혈청에는 다량의 간섭물질이 포함되어 있으며, 이것에 오염되면 PCR 반응에서 효소작용이 방해받게 된다. 또한 간섭물질은 핵산의 추출단계에서부터 같이 추출되어 공존하기 때문에 분자생물학적인 과정을 수행하기 위해서는 반드시 제거해주어야 한다. 지금까지 여러 종류의 핵산 정제방법이 개발되었지만 간섭물질을 완벽하게 제거해 낼 수 있는 방법은 미완된 상태이다. 일반적으로 많이 사용되는 방법은 페놀을 이용한 화학적인 처리 아가로스 젤 상에서의 전기영동, 젤의 절단과 추출 정제 컬럼 통과 등의 과정을 순차적으로 수행하는 것이었다. 그러나 이러한 방법 또한 문제점을 가지고 있는데 시료의 종류에 따라 제거 효율이 달라진다거나 추출되는 핵산의 양의 감소 실험시간의 증가 등을 들 수 있다.(Young, C. C., R. L. Burghoff, L. G. Keim, V. Minak-Bernero, J. R. Lute, and S. M. Hinton. 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59. 1972-1974; Tsai, Y-L., and B. H. Olson. 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57: 1070-1074;.Wise, M. G., J. V. McArthur, and L. J. Shimkets. 1997. Appl. Environ. Microbiol. 63. 1505-1514).
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 바이러스 핵산을 안전하게 추출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 PCR 반응에 영향을 미치지 않는 바이러스 핵산추출 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 검체로부터 신속, 정확하게 바이러스 핵산을 추출하여 진단과정을 단축시키고, 시간 및 비용을 절약할 수 있는 바이러스 핵산추출 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다이메칠설폭사이드 및 세틸트리메칠암모니움 브로마이드를 포함하는 핵산추출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 사람을 포함하는 동물로부터 검체를 채취하는 단계, (b) 검체에 상기의 핵산 추출용 조성물을 혼합하고 열을 가하는 단계, (c) 상기 열이 가해진 혼합물을 시료로 PCR을 실시하는 단계 및 (d) 상기 PCR 결과를 전기영동으로 확인하여 바이러스 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는 바이러스 검출방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 핵산추출용 조성물은 다이메칠설폭사이드(Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 및 세틸트리메칠암모니움 브로마이드(Cethyltrimethylammonium Bromide, CTAB)가 증류수에 각각 250 내지 400 mM 및 0.1 내지 5 mM로 포함된 것이다.
상기 다이메칠 설폭사이드의 농도가 250 mM 미만으로 포함될 경우 핵산 추출이 효율적으로 이루어지지 않을 수 있으며, 400 mM 초과하여 포함될 경우 핵산 안정성에 악영향을 미치거나 추후 진행되는 PCR 반응에 영향을 줄 수 있다. 바람직한 다이메칠설폭사이드의 농도는 300 내지 350 mM이다.
또한 세틸트리메칠암모니움 브로마이드의 농도가 0.1 mM 미만으로 포함될 경우 검체내에 포함된 간섭물질의 작용을 효과적으로 억제할 수 없어 이후 진행되는 PCR 반응을 저해할 수 있으며, 5 mM 초과하여 포함될 경우 핵산추출 및 PCR 반응에 악영향을 미칠 수 있다. 바랍직한 세틸트리메칠암모니움 브로마이드 농도는 0.5 내지 1 mM이다.
상기 증류수는 2차 또는 3차 멸균된 증류수이며, 바람직하게는 DEPC가 0.1 % 내지 0.2 %로 처리된 것이다.
본 발명의 핵산추출용 조성물은 통상의 바이러스로부터 DNA 또는 RNA를 추출하며, 대표적인 바이러스로는 간염바이러스(A, B, C, D, E, G형 간염바이러스), 사이토메갈로바이러스(CMV), 에이즈바이러스(HIV), 풍진바이러스, 개 디스템퍼 바이러스이다.
본 발명의 핵산추출용 조성물은 사람을 포함하는 동물조직, 세포 또는 타액 등에 사용하여 포함된 바이러스 핵산을 추출할 수 있다. 보다 구체적으로는 임상시험에서 사용하는 검체, 특히 혈청, 소변, 척수액, 타액, 눈물에 0.5 내지 10 부피배로 핵산추출용 조성물을 혼합하고, 90 내지 95 ℃의 열을 1 내지 2 분간 가하여 바이러스 핵산을 추출할 수 있다.
본 발명의 핵산추출용 조성물은 신속, 정확하게 바이러스 핵산을 검출할 수 있어 검체로부터 바이러스 감염여부를 확인하는 진단방법에 사용하여 진단시간, 비용 및 정확성을 향상시킬 수 있다.
또한 본 발명은 사람을 포함하는 동물로부터 검체를 채취하는 단계, 검체에 상기의 핵산 추출용 조성물을 혼합하고 열을 가하는 단계, 상기 열이 가해진 혼합물을 시료로 PCR을 실시하는 단계 및 상기 PCR 결과를 전기영동으로 확인하여 바이러스 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는 바이러스 검출방법을 제공한다.
상기 PCR 과정은 통상의 방법으로 실시될 수 있으며, 검사하고자 하는 바이러스의 종류에 따라 PCR 조건 및 PCR에 사용되는 효소 등의 조성물을 달리 적용하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 핵산추출용액 제조
DEPC 처리된 증류수에 다이메틸설폭사이드 및 세틸트리메칠암모니움을 최종농도 350 mM 및 1 mM로 각각 혼합하여 제조하였으며, 최종부피는 1000 ㎕이다. 핵산추출용액을 동결시켜 보관하였다.
실시예 2: 바이러스 핵산 추출
2-1. 혈청검체
혈액을 취하여 원심 분리한 후 혈청 10 ㎕에 실시예 1에서 제조한 핵산추출 용액 5 ㎕를 혼합하였다.
2-2. 소변, 척수액, 눈물 및 타액
각 검체를 원심분리한 후 침전액 10 ㎕에 실시예 1에서 제조한 핵산추출 용액 5 ㎕를 혼합하였다.
실험예
실시예 1 및 2의 방법으로 추출할 경우의 핵산 추출 효율을 검정하기 위하여, 이를 이용하여 PCR을 실시하였다.
실험예 1. 개 디스템퍼바이러스(CDV)의 PCR
디스템퍼로 진단된 개 8마리 및 정상인 개 4마리로부터 눈물을 각각 수득하고, 이를 원심분리하였다. 침전액에 1/2 부피배의 핵산추출 용액을 혼합하고, 이를 시료로 하기의 RT-PCR 반응 조성물을 혼합하여 RT-PCR을 실시하였다. 프라이머는 공지된 것을 사용하였다(Frisk, A. L., M. Konig, and W. Baumgartner. 1999. J Clin Microbiol. 37. 3634-3643).
CDV RT-PCR 조성물 함량(㎕)
증류수 12.3
10X 완충액 3.0
2 mM dNTP 1.5
10 pmol 프라이머세트 1.0
100 mM 다이싸이오쓰레이톨 1.5
10 U AMV RT 0.3
40U RNasin 0.3
5 U Taq 0.1
눈물시료 10
핵산추출용액 5
총 30
RT-PCR은 42 ℃, 30분 -> 95 ℃, 3분 -> (94 ℃, 1분 -> 63 ℃, 1분-> 72 ℃, 1분), 30회 ->72 ℃, 5분으로 실시하였다.
1차 RT-PCR이 끝난 RT-PCR 산물은 하기 표 2의 조성물로 혼합한 다음 2차 PCR을 실시하였다.
CDV 1차 PCR 조성물 함량(㎕)
증류수 13.9
10X 완충액 2.0
2 mM dNTP 1.0
10 pmol 프라이머 1.0
5 U Taq 0.1
1차 PCR 산물 2.0
총 20
2차 PCR반응은 95 ℃, 3분 -> (94 ℃, 1분 -> 63 ℃, 1분-> 72 ℃, 1분), 25회 ->72 ℃, 5분으로 실시하였다. 프라이머는 공지된 것을 사용하였다(Frisk, A. L., M. Konig, and W. Baumgartner. 1999. J Clin Microbiol. 37. 3634-3643).
2차 PCR 산물은 2 % 아가로즈 젤상에 100 V로 15 내지 20분간 전기영동하여 본 발명의 핵산추출용액으로 바이러스 핵산을 추출할 경우 PCR에 미치는 영향을 확인하였다.
도 1은 개 디스템퍼 바이러스 핵산을 본 발명의 핵산추출용액으로 추출한 다음 PCR한 결과를 나타낸 전기영동사진이다. 도 1에서, 레인 1번에서 8번은 디스템퍼로 진단된 개들로부터 채취한 눈물을 사용한 것이고, 레인 9 내지 12는 정상인 개들로부터 채취한 눈물을 사용한 것으로, 전기영동결과, 개 디스템퍼 바이러스에 감염된 시료에서는 PCR 산물이 증폭됨이 확인되었으나 비감염시료에서는 PCR 산물이 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 핵산추출용매는 효율적으로 바이러스 핵산을 추출하며, 이후 PCR 반응에 아무런 간섭영향을 미치지 않음을 확인할 수 있다.
실험예 2. B형 간염 바이러스
B형 간염 바이러스에 간염된 환자 8명 및 정상인 4명으로부터 각각 혈액을 채취하고, 원심분리한 후 혈청에 실시예 1에서 제조한 핵산추출 용액을 1/2 부피배로 혼합하고, PCR 조성물을 더욱 혼합하여 하기 표 3의 조성물로 PCR을 실시하였다.
HBV PCR 조성물 함량(㎕)
증류수 15.9
10x 완충액 2.0
2mM dNTP 1.0
10 pmol 프라이머 1.0
5 U Taq 0.1
혈청시료 10
핵산추출용액 5
총 30
PCR 조건은 95 ℃, 3분 -> (94 ℃, 1분 -> 56 ℃, 1분-> 72 ℃, 1분), 35회 ->72 ℃, 5분이다. 사용한 프라이머는 공지된 것이다(Pas, S. D., and H. G. Niesters 2002. J. Clin. Virol. 25. 93-94).
PCR 산물은 2 % 아가로즈 젤상에 100 V로 15 내지 20분간 전기영동하여 본 발명의 핵산추출용액으로 바이러스 핵산을 추출할 경우 PCR에 미치는 영향을 확인하였다.
도 2는 B형 간염 바이러스 핵산을 본 발명의 핵산추출용액으로 추출한 다음 PCR한 결과를 나타낸 전기영동사진이다. 도 2에서, 레인 1번에서 8번은 B형 간염환자들로부터 채취한 혈청을 사용한 것이고, 레인 9 내지 12는 정상인들로부터 채취한 혈청을 사용한 것으로, 전기영동결과 B형 간염 바이러스에 감염된 시료에서는 PCR 산물이 증폭됨이 확인되었으나 비감염시료에서는 PCR 산물이 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 핵산추출용매는 효율적으로 바이러스 핵산을 추출하며, 이후 PCR 반응에 아무런 간섭영향을 미치지 않음을 확인할 수 있다.
실험예 3. 사이토메갈로 바이러스(CMV)
사이트메갈로 바이러스에 간염된 환자 8명 및 정상인 4명으로부터 각각 척수액을 채취하고, 원심분리한 후 침전물에 실시예 1에서 제조한 핵산추출 용액을 1/2 부피배로 혼합하고, PCR 조성물을 더욱 혼합하여 하기 표 4의 조성물로 PCR을 실시하였다.
CMV PCR 조성물 함량(㎕)
증류수 15.9
10x 완충액 2.0
2mM dNTP 1.0
10 pmol 프라이머 1.0
5 U Taq 0.1
척수액시료 10
핵산추출용액 5
총 30
PCR 조건은 95 ℃, 3분 -> (94 ℃, 1분 -> 68 ℃, 1분-> 72 ℃, 1분), 35회 ->72 ℃, 5분이다. 사용한 프라이머는 공지의 것이다(Kearns, A. M., A. J. Turner, G. J. Eltringham, and R. Freeman. 2002. J Clin Virol. 24. 131-134).
PCR 산물은 2 % 아가로즈 젤상에 100 V로 15 내지 20분간 전기영동하여 본 발명의 핵산추출용액으로 바이러스 핵산을 추출할 경우 PCR에 미치는 영향을 확인하였다.
도 3은 사이트메갈로 바이러스 핵산을 본 발명의 핵산추출용액으로 추출한 다음 PCR한 결과를 나타낸 전기영동사진이다. 도 3에서, 레인 1번에서 8번은 사이트메갈로 바이러스 간염환자들로부터 채취한 척수액을 사용한 것이고, 레인 9 내지 12는 정상인들로부터 채취한 척수액을 사용한 것으로, 전기영동결과 사이트메갈로 바이러스에 감염된 시료에서는 PCR 산물이 증폭됨이 확인되었으나 비감염시료에서는 PCR 산물이 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 핵산추출용매는 효율적으로 바이러스 핵산을 추출하며, 이후 PCR 반응에 아무런 간섭영향을 미치지 않음을 확인할 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이 본 발명의 핵산추출용액은 검체에 단순 혼합하는 방법으로 사용하여 용이하게 바이러스 핵산을 추출할 수 있을 뿐만 아니라 검체에 핵산추출용액을 혼합한 다음 바로 PCR시료로 사용할 수 있다. 또한 PCR 반응에 간섭작용을 하지 않아 신속하고 정확한 결과를 도출시킬 수 있어 각종 임상검사에 적용가능하다.
도 1은 개 디스템퍼 바이러스 핵산을 본 발명의 핵산추출용액으로 추출한 다음 PCR한 결과를 나타낸 전기영동사진이고,
도 2는 B형 간염 바이러스 핵산을 본 발명의 핵산추출용액으로 추출한 다음 PCR한 결과를 나타낸 전기영동사진이고,
도 3은 사이토메갈로 바이러스 핵산을 본 발명의 핵산추출용액으로 추출한 다음 PCR한 결과를 나타낸 전기영동사진이다.

Claims (4)

  1. 다이메칠설폭사이드 및 세틸트리메칠암모니움 브로마이드를 포함하는 바이러스 핵산추출용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 다이메칠설폭사이드가 250 내지 400 mM로, 세틸트리메칠암모니움 브로마이드가 0.1 내지 5 mM로 증류수에 혼합된 것인 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 핵산추출용 조성물은 바이러스 DNA 또는 RNA를 추출하는 것인 조성물.
  4. (a) 사람을 포함하는 동물로부터 검체를 채취하는 단계;
    (b) 검체에 상기 제 1항 내지 3항중 어느 한항에 따른 핵산 추출용 조성물을 혼합하고 열을 가하는 단계;
    (c) 상기 열이 가해진 혼합물을 시료로 PCR을 실시하는 단계; 및
    (d) 상기 PCR 결과를 전기영동으로 확인하여 바이러스 감염여부를 판단하는 단계
    를 포함하는 바이러스 검출방법.
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