KR20080066727A - Ｒｎａ의 추출방법 및 ｒｎａ의 검출방법 - Google Patents
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Abstract
생체시료(특히 배설물시료) 등의 시료, 또는 그로부터 RNA 포함체의 분리 등을 행하여 얻은 생체 유래 시료(특히 배설물 유래 시료) 등의 시료 중에 보편적으로 존재하는 RNase를 불활성화시키는 방법, 당해 시료로부터 RNA를 추출 및 검출하는 방법을 제공한다. RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료와, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약의 혼합물로서, pH가 8.1 이상인 혼합물을, 가열조건하에서 얻는 공정과, 상기 혼합물을 상기 가열조건하에서 유지함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 RNA 포함체로부터의 RNA 추출을 행하는 공정을 포함하는, RNA의 추출방법. 당해 추출방법에 의해서 추출된 RNA를 포함하는 시료 처리액과, 증폭용 반응액을 혼합하여 RNA 증폭반응을 행하는 RNA 검출방법.
Description
본 발명은 시료 등 중에 존재하는 RNA 분해효소를 불활성화(失活)시키는 방법, 당해 시료 중에 존재하는 RNA 포함체(세포, 진균, 세균, 바이러스 등)로부터, 또는 당해 시료로부터 분리된 RNA 포함체로부터, RNA를 간편하고 용이하며 또한 안정적으로 추출하는 방법, 당해 RNA를 검출하는 방법, 및 그들 방법에 사용하는 시약에 관한 것이다. 본 발명은 RNA 증폭법, 특히 역전사-폴리머라아제 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction: 이하 RT-PCR이라고 약칭한다)법에 의한 RNA 증폭법에 관한 것이다.
분자생물학적인 해석에 사용하는 RNA를 조제하기 위해서는, RNA 분해효소(RNase)가 작용하지 않는 환경하에서 RNA를 조제할 필요가 있다. 통상, 시험대상물로부터 세포, 진균, 세균, 바이러스 등(이하, RNA 포함체라고 총칭한다.)을 분리 회수한 후, 그 RNA 포함체 내부로부터 RNA를 추출하고, 추출한 RNA를 정제하는 과정이 필요로 된다. 그러나, RNase는 편재할 뿐 아니라 불활성화가 매우 곤란한 물질이다. 이 때문에, 생체 등 시료 중의 RNA 포함체로부터 RNA를 정제할 때에는, RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출과정에 있어서의 RNase 제어(활성의 억제)와 RNase 제거를 행해야만 하여, 매우 엄격하고 번잡한 방법이 필요하였다. 따라서, 이 과정을 행하는 방법으로서, 종래부터 효소, 계면활성제, 카오트로픽(chaotropic agent)제 등에 의해 생체시료를 처리한 후, 페놀 또는 페놀·클로로포름 등을 사용하여 RNA를 추출 및 정제하는 방법이 사용되고 있다. 최근에는 RNA 추출 및 정제의 과정에 있어서, 이온교환 수지, 유리필터, 유리비즈, 자기비즈(magnetic beads) 또는 단백 응집작용을 갖는 시약 등이 사용되는 방법도 보고되고 있다. RNA의 추출 및 정제법은 촘친스키(Chomczynski) 및 사치(Sacchi), 「애널리티컬·바이오케미스트리(Analytical Biochemistry)」, 1987년, 제162권, p. 156-159.(애시드·구아니디늄·티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)법: AGPC법)이나 조셉·샘브룩(Joseph. Sambrook) 및 데비드·W·러셀(David W. Russell), 「분자 클로닝: 실험실 매뉴얼 제3판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Edition)」 2001년 등에 기재되어 있다.
RT-RCR법은 역전사효소(Reverse Transcriptase)를 사용하여 RNA를 상보적인 DNA(cDNA)로 전환한 후, PCR법으로 cDNA를 증폭하는 방법이다. RT-PCR법은 미량의 RNA로도 정량적으로 해석할 수 있기 때문에, 오늘날 가장 검출감도가 높은 정량성이 우수한 해석법의 하나로서 사용되고 있다. 예를 들면, RNA를 유전자로서 보유하고 있는 바이러스의 검출, mRNA의 정량적 검출, mRNA의 염기서열 결정에 의한 발현 유전자의 해석, 더 나아가서는 cDNA의 클로닝에 의한 발현 산물의 해석 및 생산 등에는 불가결한 기술이 되어 있다.
RT-PCR법에 있어서, RT반응에 이어서 행하는 PCR법은, DNA 사슬 중의 특정 영역을 사이에 둔 프라이머간의 DNA 합성반응을 반복함으로써 목적의 DNA 단편을 수십만배나 증폭할 수 있는 방법이다. PCR법은 마리스씨 등의 발명인 일본국 특허공개 소61-274697호 공보에 기술되어 있다.
그러나 상기의 방법을 비롯한 RNA 증폭법은 모두 효소반응을 베이스로 하고 있기 때문에, 생체시료 중에 존재하는 색소, 단백, 당류 또는 미지의 협잡물에 의해서 반응이 강하게 저해되는 것이 널리 알려져 있다.
또한, RNA는 모든 생체시료 중에 보편적으로 존재하는 RNA 분해효소(RNase)에 의해 용이하게 분해된다.
따라서, 전술한 바와 같이, 상기의 RNA 증폭에 앞서 시험대상물로부터 세포, 진균, 세균, 바이러스 등(이하, RNA 포함체라고 칭한다)을 분리한 후, 그 RNA 포함체로부터 RNA를 추출 정제하는 과정이 필요로 된다. 예를 들면, 미국특허 제6825340호 명세서나 미국특허 제6777210호 명세서에는 환원제의 존재하, 가열처리를 행함으로써 RNase의 불활성화, 및 PBS로 세정한 후의 배양세포로부터의 RNA 추출과 RT-PCR이 개시되어 있다.
한편으로, 일본국 특허공개 제2001-29078호 공보에는 RNA 포함체를 포함하는 시료로부터의 직접 RT-PCR이 개시되어 있다.
RNA 증폭을 수반하지 않는 바이러스 검출기술에 관해서는, 일본국 특허공개 제2004-301684호 공보에 알칼리성 버퍼를 사용한 노로바이러스 검체용 희석액, 및 이 희석액을 사용한 항원항체 반응에 의한 노로바이러스 검출이 개시되어 있다.
비특허문헌 1: 촘친스키(Chomczynski) 및 사치(Sacchi), 「애널리티컬·바이오케미스트리(Analytical Biochemistry)」, 1987년, 제162권, p. 156-159
비특허문헌 2: 조셉·샘브룩(Joseph. Sambrook) 및 데비드·W·러셀(David W. Russell), 「분자 클로닝: 실험실 매뉴얼 제3판(Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Edition)」 2001년
특허문헌 1: 일본국 특허공개 소61-274697호 공보
특허문헌 2: 미국특허 제6825340호 명세서
특허문헌 3: 미국특허 제6777210호 명세서
특허문헌 4: 일본국 특허공개 제2001-29078호 공보
특허문헌 5: 일본국 특허공개 제2004-301684호 공보
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
RNA는 생체 내는 물론, 그 생체가 존재하는 모든 환경 중에 보편적으로 존재하고 있는 RNase에 의한 분해의 위험성에 항상 노출되어 있다. 따라서, RNA 포함체 내부로부터의 RNA 추출시, 신속한 RNase 불활성화 처리를 행해야 하는 것은 물론, 정제과정 및 정제 후에 있어서도, RNase가 혼입되지 않도록 엄중한 조작이나 관리가 요구된다.
그러나, 종래의 방법을 사용하여 시료 중의 RNA의 정제를 행하여도, 협잡물의 제거가 곤란한 경우나 시료 중의 RNA의 회수량이 일정하지 않은 경우도 많다. 특히 시료 중의 목적으로 하는 RNA의 함량이 적은 경우에는 계속되는 RNA 해석이 곤란한 경우도 있다. 또한, 이들 정제법은 조작이 번잡하여 시간을 요하기 때문에, 조작 중의 오염의 기회가 높다. 이들의 이유로, 종래의 정제법은 숙련함을 요한다. 따라서, 이들의 문제점을 해결하기 위해서는, 보다 간편하고 또한 효과적인 시료 전처리법이 요망되고 있었다.
본 발명의 목적은 생체시료, 배설물시료, 환경시료 등의 시료, 또는 그로부터 RNA 포함체의 분리 등을 행하여 얻은 생체 유래 시료, 배설물 유래 시료, 환경 유래 시료 등의 시료 중에 보편적으로 존재하는 RNase를 불활성화시키는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적은 생체시료, 배설물시료, 환경시료 등의 시료, 또는 그로부터 RNA 포함체의 분리 등을 행하여 얻은 생체 유래 시료, 배설물 유래 시료, 환경 유래 시료 등의 시료 중에 존재하는 RNA 포함체로부터 RNA를 효율적으로 추출하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적은 상기 시료로부터 RNA를 효율적으로 추출함으로써, 더 나아가서는 핵산 합성반응에 대한 저해물질의 작용을 억제하고, 상기 시료 중의 RNA를 효율적으로 증폭시킴으로써, 간편하고, 신속하며 또한 안정적으로 시료 중에 존재하는 RNA를 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적은 이들의 방법에 사용할 수 있는 처리시약을 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자 등은 예의 검토한 결과, 생체시료 중의 RNase의 불활성화와 RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출을 일공정으로 행하고, 계속해서 RNA 증폭을 행함으로써, 상기 본 발명의 목적이 달성되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
<RNA 분해효소 불활성화 방법>
하기는 RNA 분해효소(RNase)의 불활성화 방법에 관한 것이다. 하기의 RNA 분해효소 불활성화 방법은 RNA 분해효소가 포함되는 시료에 대해, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약을 사용하여, 가열조건하에서 상기 RNA 분해효소의 불활성화를 행하는 RNA 분해효소의 불활성화 방법이다.
RNA 분해효소가 포함되는 시료와, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약(treating reagent)의 혼합물로서, pH가 8.1 이상인 혼합물을, 가열조건하에서 얻는 공정과,
상기 혼합물을 상기 가열조건하에서 유지함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화를 행하는 공정을 포함하는, RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 처리시약의 알칼리성 정도는, 시료와 혼합되어 혼합물이 되었을 때 혼합물의 pH가 8.1 이상(25℃인 경우)이 되는 정도이다. 30℃ 이상의 가열조건하에서 상기 처리시약을 사용하는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 처리시약은 트리스(Tris) 완충액, 굿(Good) 완충액, 붕산염 완충액, 및 탄산염 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리 버퍼(alkaline buffer)를 포함하는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 처리시약은 수산화물, 암모니아, 및 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리물질을 포함하는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 수산화물이 수산화나트륨 및/또는 수산화칼륨인, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 알칼리물질이 0.1 mM~포화농도로 상기 처리시약에 포함되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 알칼리물질로서 수산화나트륨 및/또는 수산화칼륨이 1 mM~100 mM로 상기 처리시약에 포함되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 환원제가 티올형 환원제인, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
여기에서, 티올형 환원제란, 티올기를 갖는 환원제의 총칭이다.
상기 티올형 환원제가 디티오트레이톨 및 메르캅토에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 환원제가 0.1 mM~포화농도로 상기 처리시약에 포함되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 환원제로서 디티오트레이톨이 1 mM~100 mM로 상기 처리시약에 포함되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 시료가 생체시료, 생체 유래 시료, 환경시료, 및 환경 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 시료가 배설물시료 및 배설물 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 RNA 포함체는 세포, 진균, 세균, 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 RNA 바이러스는 레트로바이러스, 노로바이러스(SRSV), 로타바이러스, 및 C형 간염 바이러스(HCV)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 RNA 바이러스가 레트로바이러스인 경우, 상기 레트로바이러스는 에이즈바이러스(HIV)인, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
상기 RNA가 mRNA인, 상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법.
RNA 분해효소가 포함되는 시료를, 적어도 환원제를 포함하는 용액 중에 혼재시키는 공정과, 상기 시료와 상기 환원제의 혼합액을, 25℃에 있어서의 pH가 8.1 이상이 되도록 조정하는 공정과,
pH 조정된 상기 혼합액을 가열조건하에 제공함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화를 행하는 공정을 포함하는, RNA 분해효소의 불활성화 방법.
즉, 상기 방법에 있어서의 RNA 분해효소의 불활성화는, 시료를 환원제가 존재하는 pH 8.1 이상의 알칼리성 환경에 제공함으로써 행해진다.
<RNA 추출방법>
하기 (1)~(11)은 RNA의 추출방법에 관한 것이다. 즉 본 발명의 추출방법은 RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료에 대해, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약을 사용하여, 가열조건하에서 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 상기 RNA 포함체로부터의 RNA의 추출을 행하는, RNA의 추출방법이다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서, RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출이란, RNA 포함체의 막 구조를 파괴함으로써 막 구조 중에 포함되어 있던 RNA를 추출하고, 막 외의 환경으로 노출시키는 것으로서 정의한다. 그리고, 노출된 RNA나, 노출된 RNA가 처해 있는 외부환경에 대해 어떠한 처리를 행하는 것은, 본 발명에 있어서의 추출의 정의에 포함하지 않는다.
(1) RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료와, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약(treating reagent)의 혼합물로서, pH가 8.1 이상인 혼합물을, 가열조건하에서 얻는 공정과,
상기 혼합물을 상기 가열조건하에서 유지함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 RNA 포함체로부터의 RNA 추출을 행하는 공정을 포함하는, RNA의 추출방법.
상기 처리시약의 알칼리성 정도는, 시료와 혼합되어 혼합물이 되었을 때 혼합물의 pH가 8.1 이상(25℃인 경우)이 되는 정도이다.
상기 가열조건은 30℃ 이상인 상기 RNA의 추출방법.
(2) 상기 처리시약은 트리스(Tris) 완충액, 굿(Good) 완충액, 붕산염 완충액, 및 탄산염 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리 버퍼를 포함하는, (1)에 기재된 RNA의 추출방법.
(3) 상기 처리시약은 수산화물, 암모니아, 및 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리물질을 포함하는, (1) 또는 (2)에 기재된 RNA의 추출방법.
상기 수산화물이 수산화나트륨 및/또는 수산화칼륨인, 상기 RNA의 추출방법.
상기 알칼리물질이 0.1 mM~포화농도로 상기 처리시약에 포함되는, 상기 RNA의 추출방법.
상기 알칼리물질로서 수산화나트륨 및/또는 수산화칼륨이 1 mM~100 mM로 상기 처리시약에 포함되는, 상기 RNA의 추출방법.
(4) 상기 환원제가 티올형 환원제인, (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 RNA의 추출방법.
여기에서, 티올형 환원제란, 티올기를 갖는 환원제의 총칭이다.
상기 티올형 환원제가 디티오트레이톨 및 메르캅토에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 RNA의 추출방법.
상기 환원제가 0.1 mM~포화농도로 상기 처리시약에 포함되는, 상기 RNA의 추출방법.
상기 환원제로서 디티오트레이톨이 1 mM~100 mM로 상기 처리시약에 포함되는, 상기 중 어느 하나에 기재된 RNA의 추출방법.
(5) 상기 시료가 생체시료, 생체 유래 시료, 환경시료, 및 환경 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 RNA의 추출방법.
(6) 상기 시료가 배설물시료 및 배설물 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 RNA의 추출방법.
(7) 상기 RNA 포함체는 세포, 진균, 세균, 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 RNA의 추출방법.
(8) 상기 RNA 바이러스는 레트로바이러스, 노로바이러스(SRSV), 로타바이러스, 및 C형 간염 바이러스(HCV)로 이루어진 군으로부터 선택되는, (7)에 기재된 RNA의 추출방법.
(9) 상기 RNA 바이러스가 레트로바이러스인 경우, 상기 레트로바이러스는 에이즈바이러스(HIV)인, (8)에 기재된 RNA의 추출방법.
(10) 상기 RNA가 mRNA인, (1)~(9) 중 어느 하나에 기재된 RNA의 추출방법.
(11) RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료를, 적어도 환원제를 포함하는 용액 중에 혼재시키는 공정과, 상기 시료와 상기 환원제의 혼합액을, 25℃에 있어서의 pH가 8.1 이상이 되도록 조정하는 공정과,
pH 조정된 상기 혼합액을 가열조건하에 제공함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 상기 RNA 포함체로부터의 RNA의 추출을 행하는 공정을 포함하는, RNA의 추출방법.
즉, 상기 (1)~(10)에 있어서의 RNA 분해효소의 불활성화 및 RNA 추출은, 시료를 환원제가 존재하는 pH 8.1 이상의 알칼리성 환경에 제공함으로써 행해진다.
<RNA 검출방법>
하기 (12)~(22)는 RNA 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 RNA 검출방법은 RNA 포함체 및 RNA 분해효소(RNase)가 포함되는 시료에 대해, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약을 사용하여, 가열조건하에서 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 상기 RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출을 행하고, 시료 처리액을 얻어, 상기 시료 처리액과 증폭용 반응액을 혼합하여 RNA 증폭반응을 행하는, RNA 검출방법이다.
여기에서, RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출이란, RNA 포함체의 막 구조를 파괴함으로써 막 구조 중에 포함되어 있던 RNA를 취출(取出)하여, 막 외의 환경으로 노출시키는 것으로서 정의한다. 그리고, 노출된 RNA나 노출된 RNA가 처해 있는 외부환경에 대해 어떠한 처리를 행하는 것은, 본 발명에 있어서의 추출의 정의에 포함하지 않는다.
(12) RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료와, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약(treating reagent)의 혼합물로서, pH가 8.1 이상인 혼합물을, 가열조건하에서 얻는 공정과,
상기 혼합물을 상기 가열조건하에서 유지함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 RNA 포함체로부터의 RNA 추출을 행하여, 추출된 RNA를 포함하는 시료 처리액(treated sample liquid)을 얻는 공정과,
상기 시료 처리액과 증폭용 반응액을 혼합하여 RNA 증폭반응을 행하는, RNA 검출방법.
상기 처리시약의 알칼리성 정도는, 시료와 혼합되어 혼합물이 되었을 때 혼합물의 pH가 8.1 이상(25℃인 경우)이 되는 것이다.
상기 가열조건은 30℃ 이상인 상기의 RNA 검출방법.
(13) 상기 처리시약은 트리스(Tris) 완충액, 굿(Good) 완충액, 붕산염 완충액, 및 탄산염 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리 버퍼를 포함하는, (12)에 기재된 RNA 검출방법.
(14) 상기 처리시약은 수산화물, 암모니아, 및 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리물질을 포함하는, (12) 또는 (13)에 기재된 RNA 검출방법.
상기 수산화물이 수산화나트륨 및/또는 수산화칼륨인, 상기의 RNA 검출방법.
상기 알칼리물질이 0.1 mM~포화농도로 상기 처리시약에 포함되는, 상기의 RNA 검출방법.
상기 알칼리물질로서 수산화나트륨 및/또는 수산화칼륨이 1 mM~100 mM로 상기 처리시약에 포함되는, 상기의 RNA 검출방법.
(15) 상기 환원제가 티올형 환원제인, (12)~(14) 중 어느 하나에 기재된 RNA 검출방법.
여기에서, 티올형 환원제는 티올기를 갖는 환원제의 총칭이다.
상기 티올형 환원제가 디티오트레이톨 및 메르캅토에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기의 RNA 검출방법.
상기 환원제가 0.1 mM~포화농도로 상기 처리시약에 포함되는, 상기의 RNA 검출방법.
상기 환원제로서 디티오트레이톨이 1 mM~100 mM로 상기 처리시약에 포함되는, 상기의 RNA 검출방법.
(16) 상기 시료가 생체시료, 생체 유래 시료, 환경시료, 및 환경 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, (12)~(15) 중 어느 하나에 기재된 RNA 검출방법.
(17) 상기 시료가 배설물시료 및 배설물 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, (12)~(16) 중 어느 하나에 기재된 RNA 검출방법.
(18) 상기 RNA 포함체는 세포, 진균, 세균, 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, (12)~(17) 중 어느 하나에 기재된 RNA 검출방법.
(19) 상기 RNA 바이러스는 레트로바이러스, 노로바이러스(SRSV), 로타바이러스, 및 C형 간염 바이러스(HCV)로 이루어진 군으로부터 선택되는, (18)에 기재된 RNA 검출방법.
(20) 상기 RNA 바이러스가 레트로바이러스인 경우, 상기 레트로바이러스는 에이즈바이러스(HIV)인, (19)에 기재된 RNA 검출방법.
(21) 상기 RNA가 mRNA인, (12)~(20) 중 어느 하나에 기재된 RNA 검출방법.
상기 시료 처리액과 상기 증폭용 반응액의 혼합액이, 황산화다당, 폴리아민, 알부민, 및 비이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가물을 추가로 포함하는, 상기의 RNA 검출방법.
상기 비이온 계면활성제가 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기의 RNA 검출방법.
상기 처리시약이 추가로 황산화다당을 포함하는, 상기의 RNA 검출방법.
(22) RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료를, 적어도 환원제를 포함하는 용액 중에 혼재시키는 공정과,
상기 시료와 상기 환원제의 혼합액을, 25℃에 있어서의 pH가 8.1 이상이 되도록 조정하는 공정과,
pH 조정된 상기 혼합액을 가열조건하에 제공함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 상기 RNA 포함체로부터의 RNA의 추출을 행하여, 추출된 RNA를 포함하는 시료 처리액을 얻는 공정과,
상기 시료 처리액과 상기 증폭용 반응액을 혼합하여 RNA 증폭반응을 행하는 공정을 포함하는, RNA 검출방법.
즉, 상기 (12)~(21)의 방법에 있어서의 RNA 분해효소의 불활성화 및 RNA 추출은, 시료를 환원제가 존재하는 pH 8.1 이상의 알칼리성 환경에 제공함으로써 행해진다.
<처리시약>
하기는 RNA 분해효소를 포함하는 시료에 대한 처리시약에 관한 것이다.
적어도 알칼리물질 및/또는 알칼리 버퍼와 환원제를 포함하는, RNA 분해효소를 포함하는 시료의 처리시약.
상기 RNA 분해효소의 불활성화 방법, (1)~(11) 중 어느 하나에 기재된 RNA의 추출방법, 또는 (12)~(22) 중 어느 하나에 기재된 RNA 검출방법에 사용하기 위한, 적어도 알칼리물질 및/또는 알칼리 버퍼와 환원제를 포함하는, RNA 분해효소를 포함하는 시료의 처리시약.
발명의 효과
본 발명에 의하면, 생체시료, 환경시료 등의 시료, 또는 그로부터 RNA 포함체의 분리 등을 행하여 얻은 생체 유래 시료 등의 시료 중에 보편적으로 존재하는 RNase를 불활성화시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 생체시료, 환경시료 등의 시료, 또는 그로부터 RNA 포함체의 분리 등을 행하여 얻은 생체 유래 시료 등의 시료 중에 존재하는 RNA 포함체로부터 RNA를 효율적으로 추출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 시료 중의 RNase의 불활성화와 RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출을 일공정으로 행함으로써, 간편·안정적·효율적 또한 신속하게 시료 중에 존재하는 RNA를 증폭하는 것이 가능해진다. 그리고, 핵산합성에 대한 저해물질의 작용을 억제함으로써, 더욱 간편·안정적·효율적 또한 신속하게 시료 중에 존재하는 RNA를 증폭하는 것이 가능해진다. 이것에 의해, 간편·안정적·효율적 또한 신속하게 시료 중의 RNA를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 이들의 방법에 사용할 수 있는 처리시약을 제공할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 실시예 1에서, 인간 혈청에 RNA 포함체를 첨가한 검체에 대해서, 증류수, 또는 조성이 상이한 3종의 처리시약을 사용하여 처리를 행한 후, RNA 증폭을 행함으로써 RNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 2는 본 실시예 2에서, 실시예 1에 있어서 증류수, 또는 조성이 상이한 3종의 처리시약을 사용하여 처리한 후의 검체를 냉장에서 1일 보존한 후, RNA 증폭을 행함으로써 RNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 3은 본 실시예 3에서 얻어진, 가열처리의 온도 및 시간과, RNA 검출량의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 실시예 4에서 얻어진, 85℃에서의 가열처리의 시간과, RNA 검출량의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 실시예 5에서 얻어진, 가열처리의 온도 및 시간과, RNA 검출량의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 실시예 8에서, 인간 혈청에 RNA 포함체를 첨가한 검체에 대해서, 조성이 상이한 15종의 처리시약을 사용하여 처리를 행한 후, RNA 증폭을 행함으로써 RNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 7은 본 실시예 9에서, 인간 혈청에 RNA 포함체를 첨가한 검체에 대해서, 실시예 8에 있어서의 처리시약의 하나를 사용한 처리를 다양한 가열조건하에서 행한 후, RNA 증폭을 행함으로써 RNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 8은 본 실시예 9에서, 인간 혈청에 RNA 포함체를 첨가한 검체에 대해서, 실시예 8에 있어서의 처리시약의 하나에 추가로 EGTA를 포함시킨 처리시약을 사용한 처리를 다양한 가열조건하에서 행한 후, RNA 증폭을 행함으로써 RNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 9는 실시예 10에 있어서, 유사 노로바이러스(pseudo-norovirus) 양성의 분변시료가 혼합된 분변시료액에 대해서, NaOH의 농도가 각각 상이한 조성을 갖는 8종의 처리시약을 사용한 처리를 행한 후, RNA 증폭을 행함으로써 RNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 10은 실시예 11에 있어서, 유사 노로바이러스 양성의 분변시료가 혼합된 분변시료액에 대해서, DTT의 농도가 각각 상이한 조성을 갖는 7종의 처리시약을 사용한 처리를 행한 후, RNA 증폭을 행함으로써 RNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 11은 실시예 12에 있어서, 바이러스 농도가 상이한 감염 분변시료에 대해서 RNA 비정제로 실시한 RNA 검출결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 12는 실시예 12에 있어서, 바이러스 농도가 상이한 노로바이러스 감염 분변시료에 대해서 RNA를 정제하여 실시한 RNA 검출결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 13은 실시예 13에 있어서, 노로바이러스에 감염되어 있는 18개의 상이한 검체에 각각 유래하는 노로바이러스 감염 분변시료를 사용한 RNA 검출결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 14는 실시예 13에 있어서, 노로바이러스에 감염되어 있지 않은 10개의 상이한 검체에 각각 유래하는 노로바이러스 비감염 분변시료를 사용한 RNA 검출결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 15는 실시예 14에 있어서, 유사 노로바이러스 양성의 분변시료가 혼합된 분변시료액에 대해, 처리시약을 사용한 처리를 다양한 가열조건하에서 행한 후, RNA 증폭을 행함으로써 RNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 도면이다.
도 16은 실시예 14에 있어서, 증폭된 RNA를 실시간 PCR로 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 실시예 8에 있어서의, 모델 검체를 15종류의 각 처리시약과 혼합하여, 열처리한 후의 모습을 나타내는 사진이다. 윗단이 DTT O mM의 처리시약을 사용한 결과로서, 왼쪽부터 [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]의 처리시약을 사용한 결과이다. 아랫단은 DTT 20 mM의 처리시약을 사용한 결과로서, 왼쪽부터 [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]의 처리시약을 사용한 결과이다.
발명을 실시하기
위한 최선의 형태
본 발명의 RNase 불활성화 방법 및 RNA 추출방법은 알칼리 환경 및 환원제의 존재하에서 실현된다. 본 발명의 RNA 검출방법은 시료 중의 RNase 불활성화 및 RNA 포함체 내부로부터의 RNA 추출을 행하는 공정과, RNA 증폭반응을 행하는 공정을 포함한다.
시료 중의 RNase 불활성화 및 RNA 포함체 내부로부터의 RNA 추출을 행하는 공정에 의해 얻어지는 시료 처리액은, RNA 증폭용 반응액과 직접 혼합되어 RNA 증폭반응에 공급된다. 이 때문에, RNA의 특별한 정제를 행하지 않고, 시료로부터 바로 RNA 증폭을 시킬 수 있다.
1. 시료
본 발명은 처리 대상이 되는 시료로서, RNase가 포함될 수 있는 것이면 어떠한 것에도 적용할 수 있다. 이와 같은 시료로서, 생체시료, 생체 유래 시료, 환경시료, 환경 유래 시료, 배설물시료, 배설물 유래 시료 등을 들 수 있다.
본 발명은 처리 대상이 되는 시료로서, RNase에 추가로 RNA 포함체가 포함되어 있는 것인 경우에, 특히 유용하게 적용할 수 있다. 이와 같은 시료로서, 생체시료, 생체 유래 시료, 환경시료, 환경 유래 시료, 배설물시료, 배설물 유래 시료 등을 들 수 있다. 이 경우, RNase의 불활성화와 RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출을 일공정으로 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 RNA 포함체란, 막 구조에 둘러싸이고 또한 내부에 RNA를 갖는 구조체이다. 구체적으로는, 세포, 진균, 세균, 바이러스 등을 말한다. 세포에는 혈액이나 수액(髓液) 등에 유래하는 백혈구, 구강점막세포 등이 포함된다. 또한, 세포에는 식품 유래 세포, 체내로부터의 박리세포 등도 포함된다. 본 발명에 있어서 이와 같은 세포를 RNA 포함체로 하는 경우, mRNA 등의 RNA에 대해서 추출 및 검출을 행할 수 있다. 바이러스로서는 RNA 바이러스를 들 수 있다. RNA 바이러스로서는 레트로바이러스(에이즈바이러스(HIV) 등), 노로바이러스(SRSV), 로타바이러스, C형 간염 바이러스(HCV) 등을 들 수 있다.
생체시료로서는 동식물 조직이나 체액 등을 들 수 있다. 체액에는 혈액시료, 수액, 타액, 젖 등이 포함된다. 여기에서, 혈액시료에는 전혈, 혈장, 혈청 등이 포함된다.
한편, 생체 유래 시료로서는 상기 생체시료에 대해 어떠한 처리를 한 것이 포함된다.
환경시료로서는 RNA 포함체를 포함하는 것이면, 대기, 토양, 물 등을 포함하는 모든 시료를 들 수 있다.
한편, 환경 유래 시료로서는 상기 환경시료에 대해 어떠한 처리를 한 것이 포함된다.
배설물에는 소변, 분변, 구토물 등이 포함된다.
배설물시료에는 생체로부터 배설된 배설물 그 자체, 또는 배설물 그 자체를 물, 생리식염수, pH 완충액 등에 현탁시킨 것이 포함된다. 상기 생체로서는 인간, 가축, 곤충, 기타 모든 동물을 들 수 있다.
한편, 배설물 유래 시료에는 상기 배설물시료에 대해 어떠한 처리를 한 시료가 포함된다.
상기 시료에 대해 행해져도 되는 어떠한 처리로서는 RNA 포함체의 회수처리를 들 수 있다. RNA 포함체의 회수방법으로서는, 상기 시료로부터 RNA 포함체를 분리할 수 있는 방법이면 어떠한 방법을 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면 원심·초원심 조작, 여과·한외여과 조작; 당해 조작에, 폴리에틸렌글리콜 등의 공침제(共沈劑)·항체 등의 흡착 담체 등을 병용하는 방법; 및 이 흡착 담체를 결합한 자기비즈나 막 등을 사용하여 분리하는 방법 등이 사용된다. 어느 방법이어도, RNase가 잔존할 가능성이 있는 RNA 포함체의 회수처리의 경우에, 본 발명은 유효하다.
또한, 본 발명에 있어서의 시료 중에는 RNA 증폭반응을 저해하는 물질이 포함되는 것이 허용된다. RNA 증폭반응을 저해하는 물질은 생체시료, 생체 유래 시료, 환경시료, 환경 유래 시료, 배설물시료, 배설물 유래 시료 등의 시료 중에 통상 포함되어 있다. RNA 증폭반응을 저해하는 물질로서는, 생체시료 중에 존재하는 색소, 단백질, 당류, 미지의 협잡물 등, 세포 내·외를 불문하고 존재하고 있는 물질을 들 수 있다.
2. 처리시약
2-1. 처리시약-시료 혼합물의 pH
시료 중의 RNase 불활성화, 더 나아가서는 시료 중의 RNA 포함체 내부로부터의 RNA 추출을 행하기 위해서는, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리 환경에 시료를 제공하면 된다. 적어도 환원제와 시료가 최종적으로 혼합된 알칼리성 혼합액이 조제된다면, 혼합하는 순서 등은 불문한다.
또한, 본 발명에 있어서, 당해 혼합액은 가열조건(후술 항목 3.)하에 제공되어야 하는 것이기 때문에, 당해 혼합액의 조제조작과 가열조작은 순서를 불문한다. 즉, 상기의 혼합액은 가열조건하에 제공될 때, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 용액 중에 시료가 혼재하고 있는 상태이면 된다.
예를 들면, 시료 및 처리시약의 한쪽 또는 양쪽을 가열해 둔 후, 양자를 혼합할 수 있다. 즉 당해 혼합액은 조제되는 동시에 가열조건에 제공되어도 된다.
또한 예를 들면, 시료와 처리시약의 혼합액을 실온에서 조제하고, 얻어진 혼합액을 가열조건하에 제공해도 된다. 이 경우, 처리시약은 통상 수용액으로서 사용된다.
또한 예를 들면, 적어도 환원제를 포함하는 용액과 시료를 실온에서 혼합하고, 얻어진 환원제-시료 혼합액의 pH를 조정(후술)하여, pH 조정된 환원제-시료 혼합액을 가열조건하에 제공해도 된다. 이 경우는, 하기 조성의 처리시약 그 자체가 사용되는 경우는 없지만, pH 조정된 환원제-시료 혼합액은 상기의 시료-처리시약 혼합물에 상당한다. 하기에 있어서, 시료-처리시약 혼합물이라고 기재하는 경우는 이 pH 조정된 환원제-시료 혼합액도 포함하는 것으로 한다.
처리시약과 시료의 혼합물(처리시약-시료 혼합물)의 pH는 25℃에 있어서 pH 8.1 이상, 예를 들면 pH 8.1~11.1로 할 수 있다. 시료에 따라서는 pH 9.0~11.1인 것이 바람직한 경우가 있다. 이와 같은 경우로서는 시료로서 배설물시료(특히 분변시료)나 그것에 유래하는 시료가 사용된 경우를 들 수 있다.
이와 같은 알칼리 환경으로 조정하기 위해서는 알칼리성 버퍼 및/또는 알칼리물질을 처리시약에 포함시키면 된다.
처리시약에 포함되어도 되는 알칼리성 버퍼로서는 특별히 한정되지 않지만, 트리스(Tris) 완충액, 굿(Good) 완충액, 붕산염 완충액, 탄산염 완충액을 들 수 있다. 굿(Good) 완충액을 구성하는 버퍼로서는 특별히 한정되지 않지만, Tricine, MOPS, HEPES, CHES 등을 들 수 있다.
처리시약에 포함되어도 되는 알칼리물질로서는 수산화물, 암모니아, 및 아민으로부터 선택하면 된다. 예를 들면 수산화물로서는 수산화나트륨이나 수산화칼륨 등을 들 수 있다. 아민으로서는 트리스히드록시메틸아미노메탄 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 또는 복수종을 조합하여 사용할 수 있다.
처리시약 중의 알칼리물질의 농도로서는 알칼리물질의 종류나, 시료의 종류나 농도, 시료와의 혼합비 등에 따라 상이하지만, 0.1 mM~포화농도(실온에 있어서의 포화농도), 바람직하게는 1 mM~포화농도(실온에 있어서의 포화농도)로 할 수 있다.
2-2. 환원제
처리시약에 포함되는 환원제로서는 티올형 환원제를 사용하면 된다. 티올형 환원제란, 티올기를 갖는 환원제의 총칭이다.
티올형 환원제로서는 디티오트레이톨(DTT), 메르캅토에탄올 등을 들 수 있다. 메르캅토에탄올은, 통상 2-메르캅토에탄올이다. 이들 환원제는 단독으로 또는 복수종을 조합하여 사용할 수 있다.
처리시약 중의 환원제의 농도로서는 환원제의 종류나, 시료의 종류나 농도, 시료의 혼합비 등에 따라 상이하지만, 0.1 mM~포화농도(실온에 있어서의 포화농도), 바람직하게는 1 mM~포화농도(실온에 있어서의 포화농도)로 할 수 있다.
처리시약과 시료의 혼합물 중의 환원제의 농도로서는, 예를 들면 0.1 mM~1 M, 바람직하게는 1 mM~100 mM로 할 수 있다. 시료가 혈액시료인 경우는 0.05 mM~20 mM로 하는 것이 더욱 바람직한 경우가 있다. 또한, 시료가 배설물시료 또는 배설물 유래 시료인 경우, 환원제의 종류, 시료의 종류·농도 등에 따라서는 2.5 mM~25 mM로 하는 것이 더욱 바람직한 경우가 있다.
2-3. 첨가물
처리시약은 킬레이트제를 추가로 포함해도 된다. RNA의 가수분해는 2가의 금속이온이 촉진하는 것이 알려져 있다. 따라서, 2가의 금속이온을 킬레이트하는 킬레이트제(EGTA나 EDTA 등)를 처리시약에 첨가하는 것이 유효하다.
또한, 처리시약은 황산화다당을 추가로 포함하고 있어도 된다.
3. 가열조건
가열처리에 있어서의 온도 및 시간의 조건에 대해서는, 시료 중의 RNase 존재량의 차이, RNA 포함체의 종류의 차이에 기인하는 막 구조의 파괴되기 쉬움의 차이, 알칼리물질 사용량의 차이에 기인하는 pH의 차이 등에 따라서 상이하기 때문에, 특별히 한정되는 것은 아니다. 처리시간은, 예를 들면 1초에서 60분 정도, 바람직하게는 30초에서 30분, 더욱 바람직하게는 30초에서 15분 정도로 할 수 있다.
처리온도는 30℃ 이상인 것이 바람직하다.
시료가 배설물시료 또는 배설물 유래 시료인 경우, 처리온도는, 예를 들면 30℃~100℃ 정도, 또는 45℃~100℃ 정도, 바람직하게는 가열시간에 따라서 상이하지만 55℃~80℃ 정도, 더욱 바람직하게는 가열시간에 따라서 상이하지만 60℃~75℃ 정도로 할 수 있다.
그 밖의 시료의 경우는, 처리온도는 60℃ 이상, 예를 들면 60℃ 이상 100℃ 이하 정도, 바람직하게는 70℃~90℃ 정도, 더욱 바람직하게는 80℃~85℃ 정도로 할 수 있다. 80℃~85℃에서 처리하는 경우는, 처리시간은 30초~5분으로 할 수 있다.
4. RNA 분해효소 불활성화 및 RNA 추출
상기의 처리시약을 사용하여 가열처리함으로써, 시료에 포함되는 RNase의 불활성화와, RNA 포함체 내부로부터의 RNA 추출 양쪽의 처리가 실현된다. RNA의 추출은 RNase의 불활성화와 동시에, 또는 RNase의 불활성화에 이어서 일어난다. 본 발명에서는 상기의 처리시약을 사용한 가열처리만의 간편한 조작에 의해서, 상기 양쪽의 처리를 행할 수 있기 때문에, RNA를 신속하고 안정하게 추출하는 것이 가능하다.
또한, RNase의 불활성화에 있어서는 RNase를 변성시켜, 효소활성 부위가 기능하지 않게 되는 상태로 한다. 가열조건하에 놓여졌다 하더라도 RNase는 통상 열에 안정하기 때문에 간단하게는 불활성화되지 않는다. 그러나, 본 발명의 처리시약을 사용한 가열조작에 의해 이와 같은 RNase의 불활성화를 가능하게 한다.
그리고, RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출이란, RNA 포함체의 막 구조가 파괴되어, 막 구조 중에 포함되어 있던 RNA가 막 외의 환경으로 노출되는 것을 말한다. RNA 포함체 막 외 환경에 있어서 존재하고 있던 RNase는 동일한 처리시약에 의해서 불활성화된다. 이 때문에, 노출된 RNA는 본래라면 분해를 받을 위험성이 매우 높은 RNA 포함체 막 외 환경에 처해짐에도 불구하고, 분해를 받을 위험성은 매우 낮아진다. 이 때문에, 본 발명에 있어서, RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출을 달성하기 위해서는 RNA 포함체의 막 외의 환경으로 RNA가 노출되면 되고, 노출된 RNA를 바로 정제하지 않아도 RNA는 안정하게 존재할 수 있다.
5. 시료 처리액
이와 같이 하여, RNase가 불활성화되고, RNA가 노출된 시료 처리액이 얻어진다. 또한, 시료 처리액은 다양한 공정에 제공할 수 있다. 예를 들면, RNA 해석을 행하기 위해 행해지는, RNA 증폭법, 하이브리다이제이션법 등의 공정에 제공할 수 있다. 본 발명의 방법으로 얻어지는 시료 처리액은 RNase가 불활성화되어 있다. 이 때문에, 안정하게 RNA를 포함하고 있어, 어떠한 처리를 행하지 않고 상기의 공정에 제공할 수 있다. 당연히, 본 발명의 방법으로 얻어지는 시료 처리액이, 추가로 어떠한 처리에 제공됨으로써 얻은 것이어도 상기 공정에 제공할 수 있다. 예를 들면, 중화 등의 pH를 조정하기 위한 처리나, 원심분리나 RNA 단리 등의 RNA의 정제처리를 들 수 있다.
6. 증폭 반응액
이미 기술한 방법으로 RNase가 불활성화되고, RNA가 노출된 시료 처리액이 얻어진다. 얻어진 시료 처리액은 증폭 반응액의 조제에 사용할 수 있다.
증폭 반응액에 사용하는 시료 처리액은 전술한 바와 같이, 상기의 가열처리 후 어떠한 처리도 행하지 않는 것으로서 얻어도 되고, 가열처리 후, 원심조작을 행함으로써 얻어진 상청액으로서, 또는 여과(filtration)를 행함으로써 얻어진 여액으로서 얻어도 된다.
또한, 시료 처리액은 RNA 증폭용 반응액과 혼합되어 최종 반응액이 되지만, 상기 시료 처리액은 알칼리성이기 때문에, 시료 처리액과 증폭용 반응액의 혼합물의 pH가 효소의 반응조건으로부터 벗어나는 경우에는, 상기의 가열처리 후부터 증폭반응 개시까지 사이의 적당한 단계에서, 혼합물의 pH가 적합한 조건 내가 되도록 조정할 필요가 있다. 적합한 pH나 pH의 조정법에 관해서는 당업자가 적절히 결정할 수 있다. pH의 적합한 조건으로서는 후술하는 바와 같이, 반응계 중에 RNA 증폭반응을 저해하는 물질이 존재하는 경우는, 당해 저해물질의 작용을 억제하기 위해 pH를 알칼리역으로 조정하는 것도 유효하다. 당해 적합한 pH에 대해서는 일본국 특허 제3494509호 공보나 일본국 특허 제3452717호 공보를 참고로 할 수 있다.
6-1. 증폭 반응액의 기본적 조성
RNA 증폭 반응법으로서는 RT-PCR법을 들 수 있지만, RNA 증폭을 행하는 방법이면 이것에 한정되지 않고, 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 증폭 반응액의 조성으로서는 특별히 한정되지 않고, 당업자가 적절히 결정할 수 있다.
RNA 증폭반응으로서 RT-PCR을 실행하는 경우, 그 형태로서는 튜브 내에 시료 처리액과 RT용 반응액의 혼합물을 준비하고, 상기 튜브 내에서 RT 반응을 행하여, RT 반응 산물의 일부를 다른 튜브 내에 준비한 PCR 반응액에 첨가하여 PCR 반응을 행함으로써 실행하는 반응형태(Two tube-Two step); 튜브 내에 시료 처리액과 RT 반응액의 혼합물을 준비하고, 상기 튜브 내에서 RT 반응을 행하여, 상기 튜브 내의 RT 반응 산물에 대해 PCR용 반응액을 첨가하여 PCR 반응을 행함으로써 실행하는 반응형태(One tube-Two step); 및, 튜브 내에 RT 반응액과 PCR 반응액 양쪽을 준비해 두고, 시료 처리액과 혼합함으로써, RT 반응과 PCR 반응을 연속적으로 행함으로써 실행하는 반응형태(One tube-One step)를 들 수 있다.
따라서, RT-PCR을 실행하는 경우, 시료 처리액과 혼합하는 RNA 증폭용 반응액은 상기 실행형태에 따라 RT 반응액인 경우나, RT 반응액과 PCR 반응액의 혼합 반응액인 경우가 있다.
RT 반응액에는 공지의 것을 한정하지 않고 사용할 수 있다. 통상은, pH 완충액, 염류, 프라이머, 데옥시리보뉴클레오티드류, 및 역전사효소가 포함된다. 상기의 염류는 MgCl2나 KCl 등이 사용되지만, 적절히 다른 염류로 변경해도 된다. 프라이머는 cDNA 합성시의 합성 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드를 말한다. RT 반응에 사용하는 역전사효소는 RNA를 cDNA로 역전사 할 수 있는 효소를 의미한다. 역전사효소로서는 라우스 관련 바이러스(Rous associated virus,RAV)나 조류 골수아구증 바이러스(Avian myeloblastosis virus,AMV) 등의 새의 레트로바이러스 유래의 역전사효소; 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus,MMLV) 등의 마우스의 레트로바이러스 유래의 역전사효소; 및 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 유래의 Tth DNA 폴리머라아제 등을 들 수 있지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다.
PCR 반응액에는 공지의 것을 한정하지 않고 사용할 수 있다. 통상은, pH 완충액, 염류, 프라이머, 데옥시리보뉴클레오티드류, 및 내열성 DNA 폴리머라아제가 포함된다. 상기의 염류는 MgCl2나 KCl 등이 사용되지만, 적절히 다른 염류로 변경해도 된다. 프라이머는 핵산증폭시의 합성 개시점으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드를 말한다. PCR에 사용하는 내열성 DNA 폴리머라아제는, 프라이머를 기점으로서 DNA를 합성하는 내열성이 우수한 폴리머라아제를 의미한다. 적절한 내열성 DNA 폴리머라아제로서는, 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) 유래의 Taq DNA 폴리머라아제; 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus) 유래의 Tth DNA 폴리머라아제; 파이로코커스(Pyrococcus) 유래의 KOD DNA 폴리머라아제, Pfu DNA 폴리머라아제, Pwo DNA 폴리머라아제; 및, 이들의 내열성 DNA 폴리머라아제의 혼합물 등을 들 수 있지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다.
또한, Tth DNA 폴리머라아제는 RT 활성과 PCR 활성 양쪽을 가지고 있기 때문에, RT-PCR을 One tube-One step으로 행할 때 1종류의 효소로 처리하는 것이 가능한 특징을 가지고 있다.
6-2. 증폭 반응액 중의 첨가물
RNA 포함체 및 RNase를 포함하는 시료로서 생체시료나 생체 유래 시료를 사용한 경우, 상기의 RNase 불활성화·RNA 포함체 내부로부터의 RNA 추출을 위한 처리 후에 얻어지는 시료 처리액에는, RNA 증폭반응을 저해하는 물질이 포함되어 있는 경우가 있다. 그리고, 이와 같은 시료 처리액을 증폭용 반응액과 혼합시키면, 반응계 중에 RNA 증폭반응을 저해하는 물질이 존재하게 되어, 이것이 원인으로서 증폭반응이 충분히 진행되지 않을 우려가 있다.
구체적으로는, RNA 증폭반응을 저해하는 물질에는, 예를 들면 생체시료 중의 색소, 어느 종의 단백질이나 당 등 세포 내외를 불문하고 존재하는 물질을 들 수 있다.
따라서, 이와 같은 저해물질의 작용을 억제하기 위해, 본 발명에서는 황산화다당 및 폴리아민으로부터 선택되는 첨가물을 사용할 수 있다.
황산화다당으로서는 헤파린, 덱스트란설페이트, 헤파란황산, 콘드로이틴황산, 데르마탄황산, 푸노란, 황산화아가로오스, 카라기난, 포피란, 후코이단, 황산화커드란, 및 그들의 염으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 이들 중에서도 헤파린 및 그의 염, 덱스트란설페이트 및 그의 염이 바람직하다. 황산화다당은 단독으로 또는 여러 종을 조합하여 사용할 수 있다.
황산화다당은 RNA 증폭반응시 반응계 중에 포함되어 있으면 된다. 따라서, 황산화다당은, 예를 들면 상기의 가열처리에 사용되는 처리시약, 가열처리 후의 시료 처리액, 증폭용 반응액, 및 시료 처리액과 증폭용 반응액의 혼합물 중 어느 하나에 첨가할 수 있다.
황산화다당의 사용량에 대해서는 황산화다당의 분자량, 증폭반응 저해물질의 존재량 등에 따라서 유효한 농도범위가 변동한다.
예를 들면, 황산화다당의 일례인 헤파린은 혈액의 항응혈제로서 빈번히 사용되지만, 그 자체가 PCR 저해물질로서 알려져 있기 때문에, PCR 반응액 중에 존재시키기에 바람직하지 않은 물질로 여기어지고 있다. 그러나 본 발명에서 헤파린 등의 황산화다당이 사용되는 경우, 그 사용량으로서는 황산화다당 자체가 RT 반응 및 PCR 반응의 저해물질이 되는 양을 제외하고, 상기의 RT 반응 및 PCR 반응의 저해물질의 작용을 억제하는 양이 특별히 한정되지 않고 허용된다. 황산화다당에 관한 구체적인 양으로서는, 황산화다당에 관한 상기 사항은 일본국 특허공개 제2000-93176호 공보에 기재되어 있다.
구체적으로 헤파린의 사용량으로서는, 시료 처리액과 RNA 증폭 반응액이 혼합된 최종 반응액 중에, 예를 들면 0.1 ㎍/㎖ 이상, 바람직하게는 0.3 ㎍/mL~50 ㎍/mL 첨가하는 것이 좋다.
폴리아민은 제1급 또는 제2급 아미노기를 2개 이상 갖는 탄화수소의 총칭이다. 어느 종의 폴리아민은 생체 내에 존재하고 있고, 단백질이나 핵산합성이 활발한 조직에 다수 포함되어 있어, 다양한 생리적 작용을 가지고 있다. 그러나, 본 발명에 있어서의 폴리아민에 이와 같은 작용이 반드시 요구되는 것은 아니고, 제1급 또는 제2급 아미노기를 2개 이상 1 분자 내에 갖는 탄화수소라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 폴리아민의 구체예로서는, 에틸렌디아민, 트리메틸렌디아민, 스페르민, 스페르미딘, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민, 테트라에틸렌펜타민 및 펜타에틸렌헥사민 등을 들 수 있다.
폴리아민은 RNA 증폭반응시에 반응계 중에 포함되어 있으면 된다. 따라서, 폴리아민은, 예를 들면 가열처리 후의 시료 처리액, 증폭용 반응액, 및 시료 처리액과 증폭용 반응액의 혼합물 중 어느 하나에 첨가할 수 있다. 폴리아민에 관한 전술한 사항은 일본국 특허공개 평6-277061호 공보에 상세하게 기술되어 있고, 폴리아민의 사용량에 대해서도 당해 공보를 참고로 할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 알부민(Bovine Serum Albumin; BSA) 및 비이온성 계면활성제로부터 선택되는 첨가물을, 시료 처리액과 RNA 증폭 반응액이 혼합된 최종 반응액 중에 추가로 포함시킬 수 있다. 이들 첨가물은 상기의 폴리아민과 함께 사용해도 된다.
알부민은 동·식물의 세포·체액 중에 포함되는 일군의 가용성 단백질의 총칭이다. 대표적인 것으로서, 난백알부민, 젖 중의 락트알부민, 혈청알부민, 소맥·대맥의 류코신, 피마자 종자 중의 리신 등을 들 수 있다. 이들 중, 특히 혈청알부민이 바람직하고, 더 나아가서는 소 혈청알부민이 바람직하다. 단, 이들 알부민에는 한정되지 않는다. 알부민은 RNA 증폭반응시 반응계 중에 포함되어 있으면 된다. 따라서, 알부민은, 예를 들면 가열처리 및 pH 조정 후의 시료 처리액, 증폭용 반응액, 및 가열처리 및 pH 조정 후의 시료 처리액과 증폭용 반응액의 혼합물 중 어느 하나에 첨가할 수 있다. 또한, 알부민은 최종 반응액에 균일하게 들어가 있지 않은 상태(예를 들면, 가열처리 및 pH 조정 후의 시료 처리액에 알부민을 첨가하여, 교반하지 않고 RNA 증폭 반응액을 혼합시킨 경우 등)에서도 동일한 효과가 있다. 알부민에 관한 전술한 사항은 일본국 특허공개 제2001-8685호 공보에 상세하게 기술되어 있고, 알부민의 사용량에 대해서도 당해 공보를 참고로 할 수 있다.
비이온성 계면활성제로서는, 예를 들면 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르로부터 선택된다. 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트로서는, 폴리옥시에틸렌소르비탄(20) 모노라우레이트(Tween 20)를 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르로서는, 폴리옥시에틸렌(9) 옥틸페닐에테르(노니데트 P-40(NP40)), 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐에테르(Triton×100)를 들 수 있다.
비이온성 계면활성제에 관한 상기 사항은 일본국 특허공개 평10-80279호 공보에 상세하게 기술되어 있고, 비이온 계면활성제의 사용량에 대해서도 당해 공보를 참고로 할 수 있다.
RNA 증폭법의 순서로서는, 시료를 상기 기재의 처리시약을 사용하여 가열처리하고, 얻어진 시료 처리액과 반응액을 혼합하여, 적절히 pH를 조정한 후, 공지의 방법을 토대로 증폭반응을 행할 수 있다.
RT 반응에 있어서는 선택한 프라이머와 역전사효소에 적합한 반응온도에서 30분~1시간 정도의 반응을 행한다. PCR에 있어서는, DNA를 열변성에 의해 단일 가닥 사슬의 DNA로 하는 변성(denaturation) 공정; 증폭시키고자 하는 영역을 사이에 둔 프라이머를 하이브리다이즈시키는 어닐링 공정; 및 데옥시리보뉴클레오티드류의 공존하에 DNA 폴리머라아제를 작용시켜, 프라이머의 신장반응을 행하는 중합(polymerization) 공정의 3공정을 반복함으로써, 프라이머에 끼인 영역을 증폭한다.
7. 효과
본 발명의 RNase 불활성화 방법 및 RNA 추출방법에 의하면, 생체시료 중의 RNase의 불활성화와 RNA 포함체 내부로부터의 RNA 추출을 행할 수 있기 때문에, 생체시료 중의 RNA 포함체의 정제를 행하지 않고 간편·안정적으로 RNA의 시료 처리액을 얻을 수 있다. 또한, 추출된 RNA에 대해 생체시료에 포함되는 단백 등의 협잡물에 의한 흡착·포매(embedment)라고 하는 영향을 억제할 수 있을 것으로 생각된다. 이 때문에, 본 발명의 RNA 추출방법은 이후의 RNA의 검출이나 해석 등에 유효하다. 즉, 시료 처리액에 대해서는 어떠한 처리를 행하지 않고, 또는 희석, pH의 조정, 첨가물을 첨가하는 등의 최저한의 처리를 행하는 것만으로, RNA 검출이나 해석 등의 이어지는 공정에 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 행함으로써, 종래부터 행해져 온 RNA의 추출, 정제시 등에 있어서 염려되었던 RNase에 의한 RNA의 분해에 의한 영향을 걱정하지 않고, 이와 같은 공정을 간편·신속하게 행하는 것이 가능해진다. 예를 들면, 본 발명은 RNA 정제를 위한 전단계로서 사용할 수 있다.
본 발명의 RNA 검출방법에 의하면, 생체시료 중의 RNase의 불활성화와 RNA 포함체 내부로부터의 RNA 추출을 행함으로써, 간편·안정적·효율적으로 시료 중에 존재하는 RNA를 증폭하는 것이 가능해진다. 그리고, 시료 처리액에 핵산합성의 저해물질이 포함되는 경우에도 희석, pH의 조정, 상응하는 첨가물을 증폭 반응액에 포함시키는 것 등에 의해, 핵산합성에 대한 저해물질의 작용을 완화 또는 억제하여, 간편·안정적·효율적으로 시료 중에 존재하는 RNA를 증폭하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명을 사용함으로써, 생체시료 중에 잠재하는 외래생물(예를 들면, RNA 바이러스로서 레트로바이러스(에이즈바이러스(HIV) 등), 노로바이러스(SRSV), 로타바이러스, C형 간염 바이러스(HCV) 등, 및 진균, 세균 등)이나 변이세포(예를 들면, 암세포 등)를 간편·신속하게 해석하는 것이 가능해진다. 또한 본 발명을 사용함으로써, 세포 중에서 전사되는 mRNA 등의 검출이나 염기서열 결정에 의한 발현 유전자의 해석, 더 나아가서는 cDNA의 클로닝에 의한 발현산물의 해석 및 생산 등을 간편·신속하게 행하는 것이 가능해진다. 또한, 대기·토양·물 등의 환경시료에 대해 본 발명을 사용하면, 환경시료 중의 미생물 검사 등으로의 전개도 가능할 것으로 생각된다.
또한, 본 발명의 처리시약에 의해서 추출된 RNA는 본 처리시약 중에서의 보존이나 중화처리 후의 보존 등이 가능하다.
이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 실시예에 있어서는 인간 혈청(RNase가 포함되어 있다)에 RNA 포함체를 첨가한 모델 검체를 시료로서 사용하고, 증류수(비교용), NaOH 수용액(비교용), DTT 수용액(비교용), 또는 본 발명의 처리시약으로서의 NaOH-DTT 수용액을 시료에 첨가하여 가열처리한 후, RNA 추출의 확인을 행하였다.
구체적으로는, RNA 포함체로서는 Ambion사 Armored RNA Hepatitis C Virus(Genotype 2b) Catalog #: 42011을 사용하였다. 인간 혈청과 Armored RNA Hepatitis C Virus액을 등량(v/v) 혼합한 모델 검체를 시료로서 준비하였다. 0.5 ㎖ 튜브에 검체 4 ㎕를 넣은 것을 4개 준비하고, 각각의 튜브 내에, (1) 증류수(비교용), (2) 10 mM NaOH 수용액(비교용), (3) 10 mM DTT 수용액(비교용), 또는 (4) 본 발명의 처리시약으로서의 10 mM NaOH 및 10 mM DTT를 포함하는 수용액 16 ㎕를 첨가하여, 85℃ 1분간 가열을 행하였다.
RNA 추출의 확인으로서, 가열처리 후의 각각의 시료 처리액을 주형으로서 HCV RNA에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하였다.
구체적으로는, 가열처리 후 바로 50 ㎕의 반응액당 상기 시료 처리액을 1 ㎕ 첨가하여 RT-PCR을 행하였다. RT 반응의 프라이머는 HCV RNA에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 계속해서 행하는 PCR에서는 RT 반응으로 합성된 cDNA에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 추가하여 행하였다. 본 실험의 RT-PCR에 있어서의 RNA 유래의 산물은 244 bp이다. 사용한 프라이머 서열은 다음과 같다.
(5'프라이머)5'-CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3'(서열번호: 1)
(3'프라이머)5'-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3'(서열번호: 2)
RT 반응액에는 10 mM Tris-HCl, 35 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 각각 200 μM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 2 mM DTT, 0.4 μM의 3'프라이머, 50 units/50 ㎕의 리보뉴클레아제 저해제(Ribonuclease Inhibitor)(Takara Bio, Shiga, Japan) 및 5 units/50 ㎕의 AMV XL 역전사효소(Takara Bio, Shiga, Japan)에 1 mM의 트리에틸렌테트라민과 0.5 ㎍/㎖의 헤파린나트륨을 첨가한 것을 사용하였다.
RT 반응은 55℃, 30분간 행하였다. 반응 후, 95℃, 5분간 처리하고, 역전사효소를 불활화하였다.
RT 반응 후, 상기 RT 반응액에 각각 20 p㏖의 5'프라이머, 및 1.25 units의 Taq DNA 폴리머라아제(Platinum Taq: Invitrogen, CA, USA)를 첨가하여 PCR을 행하였다.
PCR은 94℃ 2분간 행한 후, 94℃ 30초간, 60℃ 30초간, 72℃ 60초간의 조건으로 40 사이클, 마지막으로 72℃ 7분간의 중합을 행하였다.
PCR 종료 후, 반응액 5 ㎕를 사용하여 2.5% 아가로오스를 포함하는, 0.5 ㎍/㎖ 브롬화에티디움 첨가 TAE(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)액 중에서 전기영동을 행하여 검출하였다. 증폭산물의 전기영동 도면을 도 1에 나타낸다. 도 1 중, M은 사이즈마커(HincII로 절단한 250 ng의 ØX174-RF DNA) 1, 2, 3 및 4는 각각 증류수(비교용), 10 mM NaOH 수용액(비교용), 10 mM DTT 수용액(비교용), 및 10 mM NaOH-10 mM DTT 수용액(본 발명의 처리시약)을 사용한 결과이다.
도 1이 나타내는 바와 같이, 검체에 본 발명의 처리시약을 첨가한 경우(레인 4), HCV RNA에 특이적인 244 bp의 증폭산물(도면 중 화살표)이 얻어진 것을 알 수 있었다.
<실시예 2>
본 실시예에 있어서는, 실시예 1에서 얻은 4종의 시료 처리액을 냉장에서 1일간 보존한 후, 실시예 1과 동일하게 RT-PCR을 행하여, 추출 후의 RNA의 보존 안정성을 관찰한 것이다. RT 반응, PCR 반응, 및 전기영동 조건은 실시예 1과 동일하 다. 증폭산물의 전기영동 도면을 도 2에 나타낸다. 도 2 중, M은 사이즈마커(HincII로 절단한 250 ng의 ØX174-RF DNA), 1, 2, 3 및 4는 각각 증류수(비교용), 10 mM NaOH 수용액(비교용), 10 mM DTT 수용액(비교용), 및 10 mM NaOH-10 mM DTT 수용액(본 발명의 처리시약)을 사용한 결과이다.
도 2가 나타내는 바와 같이, 추출처리 후 하루가 경과해도 본 발명의 처리시약을 사용한 경우(레인 4), HCV RNA에 특이적인 244 bp의 증폭산물(도면 중 화살표)이 얻어진 것을 알 수 있었다. 이는, 본 발명의 처리시약에 의한 추출 후의 RNA가 안정적으로 존재하는 것을 나타내는 것이다.
이상의 실시예 1 및 2의 결과는, 본 발명의 처리시약에 의해 혈청 중 바이러스의 RNA를 해석할 수 있는 것을 나타내고 있다. 따라서, 본 발명의 처리시약을 사용함으로써, 생체시료 등에 포함되는 RNA 포함체로부터 간편한 조작으로 RNA를 추출하는 것이 가능해지는 것이 확인되었다.
<실시예 3: 가열처리의 온도 및 시간에 따른 영향(1)>
1.5 mL 자르스테드 튜브(SARSTEDT tube)에 HCV 양성(약 100 IU/㎖)의 혈장 검체 100 μL를 분주하고, 추가로 PEG 수용액(로슈 디아그노스틱스 주식회사 「앰플리코어(R) HBV 모니터용 검체 처리용 시약」에 동봉의 HBV SOL A. 이하, 실시예 4, 5, 6, 7에 있어서 동일.)을 50 μL 첨가하여 교반하였다. 이것을 벤치탑 미량 원심기로 15,000 rpm, 5분간 원심분리하여, 상청을 제거하였다. 남은 침전에 처리시약으로서 12 mM NaOH, 12 mM DTT, 및 6 ㎍/mL 헤파린나트륨을 포함하는 수용액 100 μL를 첨가하고, 볼텍스 믹스(Vortex mix)로 잘 교반하여, 하기 표에 나타내는 조건으로 인큐베이트하였다. 가온 후 바로 튜브 내의 시료 처리액 50 μL를, 별도의 튜브에 준비한 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트의 마스터 믹스 50 μL와 혼합하고, GeneAmp 9600(어플라이드 바이오시스템즈)으로 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트의 첨부문서에 나타내어지는 정성법(定性法)의 순서로 HCV 시그널(OD)을 측정하였다. 그 결과를 데이터 1 및 도 3에 나타낸다. 데이터 1은 HCV 시그널인 흡광도를 표기한 것이다. 또한, 데이터 1에 있어서는 추가 시험을 행하였기 때문에 합계 2회분의 측정결과를 나타내고 있다. 도 3은 데이터 1의 각 온도에서의 평균값을, 세로축을 흡광도, 가로축을 가열시간으로서 나타낸 그래프이다.
상기 데이터 1이 나타내는 바와 같이, 열처리가 본 법에 의한 HCV의 검출에 유효한 것을 알 수 있었다. 이 결과는, 본 발명의 방법에 의해서, RNase가 불활성화되고, 또한 HCV 바이러스 내부로부터 HCV RNA가 취출(取出)되어, RT-PCR의 주형으로 된 것을 나타내고 있다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 15초 정도의 가열로 RNA의 검출이 가능해지고, 가열시간에 대해서는 가열온도에 따라서 적절히 선택할 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4: 가열처리의 온도가 85℃에 있어서의 가열시간의 영향>
1.5 mL 자르스테드 튜브에 HCV 양성(약 1,000 IU/㎖)의 혈장 검체 100 μL를 분주하고, 추가로 PEG 수용액을 50 μL 첨가하여 교반하였다. 이것을 벤치탑 미량 원심기로 15,000 rpm, 5분간 원심분리하여, 상청을 제거하였다. 남은 침전에 처리시약으로서 12 mM NaOH, 12 mM DTT, 및 6 ㎍/mL 헤파린나트륨을 포함하는 수용액 100 μL를 첨가하고, 볼텍스 믹스로 잘 교반하여, 하기 표에 나타내는 시간, 85℃에서 가온하였다. 가온 후 바로 튜브 내의 시료 처리액 50 μL를, 별도의 튜브에 준비한 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트의 마스터 믹스 50 μL와 혼합하고, GeneAmp 9600(어플라이드 바이오시스템즈)으로 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트의 첨부문서에 나타내어지는 정량법의 순서로 HCV 시그널(토탈 OD)을 측정하였다. 결과를 데이터 2 및 도 4에 나타낸다.
상기 데이터 2가 나타내는 바와 같이, 80초~160초의 처리시간에 의해 최고 레벨의 검출감도가 얻어졌다.
<비교예 1>
본 발명의 검출방법의 유효성을 검증하기 위해, 상기 실시예 4와 동일한 검체로부터 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트의 첨부문서에 나타내어지는 정량법의 순서로 토탈 OD를 측정하였다. 비교예에서는 이 조작을 추가로 5회의 추가 시험을 행함으로써, 합계 6회의 측정을 행하였다. 각각의 측정결과는 HCV의 시그널인 토탈 OD(흡광도)로 나타내면, 0.75, 0.76, 1.14, 0.77, 1.30, 및 1.06이고, 이들 6회의 측정값의 평균은 0.96이다.
비교예 1에 있어서 행한 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트 첨부문서의 방법은 혈장 100 μL로부터 RNA 추출액 1,000 μL를 얻는다. 상기 실시예 4에서는 혈장 100 μL로부터 RNA 추출액을 100 μL 얻고 있다(즉, 실시예 4에서 얻어진 RNA 추출액이 10배 진하다). 따라서, 비교예 1에 있어서의 토탈 OD가 0.96이기 때문에, 실시예 4에 있어서의 토탈 OD가 가령 9.6이면, 종래법과 동등한 감도가 얻어졌다고 할 수 있다.
실제로, 실시예 4에서는 80~160초의 열처리시간으로 9~10 범위의 토탈 OD가 얻어지고 있다. 이 사실로부터, 실시예 4로 대표되는 본 발명의 방법은 비교예 1에 예시되는 종래법에 떨어지지 않는 감도가 얻어졌다고 생각된다.
<실시예 5: 가열처리의 온도 및 시간에 따른 영향(2)>
1.5 mL 자르스테드 튜브에 HCV 양성(약 1,000 IU/㎖)의 혈장 검체 100 μL를 분주하고, 추가로 PEG 수용액을 50 μL 첨가하여 교반하였다. 이것을 벤치탑 미량 원심기로 15,000 rpm, 5분간 원심분리하여, 상청을 제거하였다. 남은 침전에 처리시약으로서 12 mM NaOH, 12 mM DTT, 및 6 ㎍/mL 헤파린나트륨을 포함하는 수용액 100 μL를 첨가하고, 볼텍스 믹스로 잘 교반하여, 하기 표에 나타내는 조건으로 인큐베이트하였다. 가온 후 바로 튜브 내의 시료 처리액 50 μL를, 별도의 튜브에 준비한 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트의 마스터 믹스 50 μL와 혼합하고, GeneAmp 9600(어플라이드 바이오시스템즈)으로 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트의 첨부문서에 나타내어지는 정량법의 순서로 HCV 시그널(토탈 OD)을 측정하였다. HCV의 농도(IU/㎖)에 대한 토탈 OD값(흡광도의 적산값)을 이하의 데이터 3 및 도 5에 나타낸다. 도 5의 데이터 3을, 가로축을 가열시간, 세로축을 토탈 OD로서 나타낸 그래프이다. 또한, 근사선(近似線)은 실시예 4의 결과(도 4)를 토대로 기재하였다.
데이터 3에 의해 60℃의 가열시간에 의해서도 시그널이 얻어져, HCV의 RNA를 검출하는 것이 가능한 것을 알 수 있었다.
도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 60℃ 이하의 온도여도 긴 시간, 예를 들면 5분 이상의 가열을 행함으로써, HCV의 RNA 검출이 가능한 것은 용이하게 상도(想到)할 수 있다. 또한, 85℃보다 높은 가열온도여도 짧은 시간, 예를 들면 30초에서 3분의 가열을 행함으로써, HCV의 RNA 검출이 가능한 것은 용이하게 상도할 수 있다.
실시예 3~5에 있어서는 가열온도가 80℃~85℃일 때, 가열시간의 의존성이 낮은 안정된 시그널이 얻어지고, 또한 고감도인 것이 나타내어졌다. 이 때문에, 실시예 3~5에 나타내어진 조건하에서는 80℃~85℃는 특히 바람직한 온도조건이라고 할 수 있다. 온도조건이 80℃~85℃인 경우, 가열시간은 30초~10분, 더욱 바람직하게는 30초~5분, 더욱 바람직하게는 80초~160초로 할 수 있다.
<실시예 6>
실시예 6에서는 HCV 양성 기지의 혈장 검체 3종(약 100, 500, 5,000 IU/㎖) 및 HCV 음성 기지의 혈장 검체의 합계 4종의 혈장 검체에 PEG 수용액을 첨가하여 원심 조작을 실시한 후, 얻어진 침전물을 시료로서 사용하였다. 혈장으로부터의 PEG 수용액 침전물 중에는 바이러스 뿐 아니라 많은 혈장성분도 침전되어 있고, 그 중에는 RNase도 존재하고 있다. 각각의 시료에 대해서, 본 발명의 방법에 따라서 RNase의 불활성화 및 RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출을 행하고, HCV RNA에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하였다.
구체적으로는, 1.5 mL 자르스테드 튜브에 혈장 100 μL를 분주하고, 추가로 PEG 수용액을 50 μL 첨가하여 교반하였다. 이것을 벤치탑 미량 원심기로 15,000 rpm, 5분간 원심분리하여, 상청을 제거하였다. 남은 침전에 처리시약으로서 12 mM NaOH, 12 mM DTT, 및 6 ㎍/㎖ 헤파린나트륨을 포함하는 수용액 100 μL를 첨가하고, 볼텍스 믹스로 잘 교반하여, 85℃에서 2분간 인큐베이트하였다. 가열 후 바로 튜브 내의 시료 처리액 50 μL를, 별도의 튜브에 준비한 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트(로슈 디아그노스틱스)의 마스터 믹스 50 μL와 혼합하고, GeneAmp 9600(어플라이드 바이오시스템즈)으로 앰플리코어(R) HCV v2.0 키트의 첨부문서에 따라서 RT-PCR을 행하였다. RT-PCR 후에도 키트의 첨부문서에 따라서 소정의 순서로 HCV 시그널을 정량하였다. HCV의 농도(IU/㎖)에 대한 TOD값(흡광도의 적산값)을 이하의 데이터 4에 나타낸다.
상기 데이터 4가 나타내는 바와 같이, 양성 검체에 있어서 시그널이 얻어지져, HCV의 RNA를 검출하는 것이 가능하였다. 이 결과는, 본 발명의 방법에 의해서 RNase가 불활성화되고, 또한 HCV 바이러스 내부로부터 HCV RNA가 취출되어, RT-PCR의 주형으로 된 것을 나타내고 있다.
또한, HCV 농도에 의존한 HCV TOD값이 얻어지고 있음으로써, 정량적으로 HCV RNA가 검출되어 있는 것도 나타내고 있다.
<실시예 7>
본 실시예에서는, HIV 양성 기지의 혈장 검체(약 700 카피/㎖) 및 HIV 음성 기지의 혈장 검체의 2종의 검체를 사용하였다. 각각의 검체에 대해서, PEG 수용액에 의한 원심조작을 행하고, 얻어진 침전물을 시료로서 사용하였다. 각각의 시료에 대해서, 본 발명의 방법에 따라서 RNase의 불활성화 및 RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출을 행하고, HIV RNA에 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 행하였다.
1.5 mL 자르스테드 튜브에 혈장 50 μL를 분주하고, 추가로 PEG 수용액을 25 μL 첨가하여 교반하였다. 이것을 벤치탑 미량 원심기로 15,000 rpm, 5분간 원심분리하여, 상청을 제거하였다. 남은 침전에 처리시약으로서 12 mM NaOH, 12 mM DTT, 및 6 ㎍/mL 헤파린나트륨을 포함하는 수용액 100 μL를 첨가하고, 볼텍스 믹스로 잘 교반하여, 85℃에서 2분간 인큐베이트하였다. 그 후 바로 튜브 내의 시료 처리액 50 ㎕를, 별도의 튜브에 준비한 앰플리코어(R) HIV 모니터 v1.5 키트(로슈 디아그노스틱스)의 마스터 믹스 50 μL와 혼합하고, GeneAmp 9600(어플라이드 바이오시스템즈)으로 앰플리코어(R) HIV 모니터 v1.5 키트의 첨부문서에 따라서 RT-PCR을 행하였다. RT-PCR 후에도 키트의 첨부문서에 따라서 소정의 순서로 HIV-1 시그널을 정량하였다. HIV의 카피수/㎖에 대한 TOD값을 이하의 데이터 5에 나타낸다.
상기 데이터 5가 나타내는 바와 같이, 양성 검체에 있어서 시그널이 얻어지져, HIV의 RNA를 검출하는 것이 가능하였다.
하기 실시예 8 및 9에서는, 인간 혈청에 RNA 포함체를 첨가한 것을 모델 검체로 하였다(혈청에는 RNase가 포함되어 있다). 여기에서 RNA 포함체에는 Ambion Diagnostics사제 Armored RNA Hepatitis C Virus(Genotype 2b) in TSM III buffer Amplicor HCV Monitor Qualified Positive Control(Cat #: 42011)을 사용하였다. 본 실시예에 있어서의 모델 검체는, 상기 RNA 포함체-TSM III 버퍼액과 인간 혈청을 1:1의 체적비로 혼합하여 조제하였다. 상기 RNA 포함체-TSM III 버퍼액의 농도는 「혈장에 5(v/v)% 첨가한 경우 73,000 IU/mL」로 규정되어 있어, 혈청과 1:1(체적비)로 혼화(混和)하면 730 IU/μL라고 생각된다.
또한, RNA의 검출에 대해서, 먼저 유전자 증폭을 앰플리코어 HCV v2.0 증폭시약 세트(로슈 디아그노스틱스사제)를 사용하여 행하였다. RT-PCR의 온도 프로그램은 메이커의 추장법(推奬法)에 준하였는데, PCR 반응의 사이클수를 38로 하였다.
유전자 증폭 후, 아가로오스 전기영동을 사용하여 검출하였다. 전기영동 사진 중의 「M」은 DNA 사이즈마커를 나타낸다. 여기에서 사용하고 있는 DNA 사이즈마커는 ØX174 HincIIdigest이다.
<실시예 8>
본 실시예는, 알칼리물질과 환원제를 포함하는 처리시약으로 검체 중의 RNA를 추출할 수 있었던 것을 나타낸 예이다.
200 μL 용량의 플라스틱 튜브에 모델 검체 2 μL, 표 6에 나타내는 각 처리시약(15종)을 8 μL 취하여 혼화하고, 85℃ 3분 열처리하였다. 여기에 TE Buffer(pH 8.0)를 90 μL 첨가하고, 이 중 5 μL를 앰플리믹스(로슈 디아그노스틱스사제: 앰플리코어 HCV v2.0 증폭시약 세트에 포함되는 HCV 마스터 믹스 v2.0과 HCV 망간시액을 7:1의 비율로 혼합시킨 것) 5 μL와 혼화하여, RT-PCR을 행하였다. 또한, 각각의 처리시약(모델 검체 첨가 전)의 pH 및 모델 검체-처리시약 혼합물(모델 검체 첨가 후)의 pH(모두 25℃에서 측정)도 표 6에 나타낸다.
또한, 아가로오스 전기영동 사진을 도 6에 나타낸다. 또한, 도 17에 각 조건의 열처리 후의 모습을 나타내는 사진을 나타낸다. 도 17에 있어서 윗단이 DTT 0 mM의 처리시약을 사용한 결과로서, 왼쪽부터 [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]의 처리시약을 사용한 결과이다. 아랫단은 DTT 20 mM의 처리시약을 사용한 결과로서, 왼쪽부터 [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]의 처리시약을 사용한 결과이다.
도 6이 나타내는 바와 같이, 처리시약이 환원제와 알칼리의 양쪽을 포함하는 경우만, RNA가 검출되었다.
[15]에서 검출되지 않은 것은 RNA가 가수분해되었기 때문이라고 생각된다. RNA의 가수분해가 일어난 것은, 추출된 RNA가 가열온도(85℃)와 pH(10.1)의 양쪽이 높은 조건하에 처해졌기 때문이라고 생각된다. RNA를 효율적으로 추출하고 또한 노출된 RNA를 가수분해하지 않는 조건으로 하기 위해서는, 이하의 조건으로 조정하면 된다. 즉, NaOH 농도나 버퍼제의 종류나 농도를 조정함으로써 pH를 낮추는(바람직하게는 전술한 [10]~[14]의 조건) 것; 온도를 낮추는(예를 들면 가열을 행하지 않음으로써 RNA 검출이 가능해지는 것이 본 발명자 등에 의해서 확인되어 있는) 것; 또는, 온도 및 NaOH 농도를 변경하지 않고 EGTA 등의 2가 이온을 킬레이트하는 킬레이트제를 추가로 첨가하는 것(하기 실시예 9)을 행하면 된다.
DTT가 들어간 경우, 처리시약의 pH가 낮아져 있지만, 이는 알칼리역에서 DTT가 산으로서 작용하기 때문이라고 생각된다.
도 17에 있어서, [8], [9]라고 하는 중성역의 조건인 경우, 변성 단백질로 보이는 백침(白沈)이 현저하게 관찰되었지만, 사용한 처리시약의 pH가 높아짐에 따라서 투명도가 증가하고 있는 것을 알 수 있었다. 이 사실로부터, 중성역에 있어서 RNA를 검출할 수 없었던 원인으로서, 변성 단백질 등의 협잡 성분이 RNA에 흡착·포매되었을 가능성이 생각된다. 한편, [15]의 조건으로 RNA를 검출할 수 없었던 원인으로서는 전술한 바와 같이, 변성 단백질의 영향이 아니라 RNA의 가수분해에 의한 것이라고 추측된다.
<실시예 9>
본 실시예는, EGTA는 RNA의 열알칼리 조건에 의한 가수분해를 저감하는 것을 나타낸 예이다. RNA의 가수분해를 2가 금속이온이 촉진하는 것이 알려져 있다. 본 발명의 대상으로 하는 검체에 따라서는 2가 금속이온을 포함하기 때문에, 이것을 킬레이트하는 킬레이트제(EGTA 등)를 처리시약에 첨가하는 것은 유효하다.
처리시약으로서, 표 6에 나타내는 처리시약 [12]와, 여기에 EGTA 5 mM를 첨가한 처리시약의 2종을 준비하였다. 200 μL 용량의 플라스틱 튜브에 모델 검체 2 μL를 취하고, 여기에 8 μL의 각 처리시약을 첨가하여 혼화하였다. 이 때, 처리온도로서 25℃(비교용), 37℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 및 100℃, 처리시간으로서, 1분, 3분, 10분, 30분, 및 60분의 조건을 검토하였다. 처리 후, 여기에 TE Buffer(pH 8.0)를 90 μL 첨가하고, 이 중 5 μL를 앰플리믹스(Amplimix) 5 μL와 혼화하여, RT-PCR을 행하였다.
얻어진 전기영동 사진을 도 7(처리시약 중의 EGTA 농도는 0 mM) 및 도 8(처리시약 중의 EGTA 농도는 5 mM)에 나타낸다.
도 7 및 도 8이 나타내는 바와 같이, 처리시약이 EGTA를 포함하지 않는 경우, 30분 이상의 열처리에서는 거의 시그널이 확인되지 않게 되었다. 그러나, 처리시약에 EGTA를 첨가한 경우, 1시간의 열처리를 거쳐도 시그널이 검출되었다. EGTA의 첨가에 의해 RNA의 가수분해의 속도가 현저하게 작아지는 것이라고 생각된다.
본 실시예로부터, 처리시약에 2가의 금속이온을 킬레이트하는 킬레이트제를 첨가한 경우, 가열처리에 있어서의 온도는 65℃~100℃, 더욱 바람직하게는 70℃~100℃, 더욱 바람직하게는 70℃~95℃로 설정할 수 있는 것을 알 수 있었다.
<실시예 10>
노로바이러스 음성의 건강한 정상인의 분변을 생리식염수에 20%(w/v)의 농도로 현탁하고, 현탁액을 미량 원심기를 사용하여 5분간 원심분리하여 상청을 얻었다. 얻어진 상청 198 μL에 유사 노로바이러스 RNA 포함체(Armored RNA(R) Norwalk Virus(GenogroupII) in TSM III Buffer: Ambion Diagnostics) 2 μL를 첨가하고, 유사 노로바이러스 양성의 분변시료액을 조제하였다. 이 시료액 10 μL와, 처리시약 10 μL를 튜브 내에서 혼합하고, 최종액량을 20 μL로 한 후, 85℃에서 5분간 가열처리하였다. 이와 같이 하여, 시료 처리액을 얻었다.
RT-PCR의 RT 반응에 있어서는 Ampdirect(R) Plus(P/N: 241-08800-98: 시마즈세이사쿠쇼), 0.4 μM 유사 노로바이러스 RNA용 리버스 프라이머(5'-ACTGACAATTTCATCATCACC-3': 서열번호 3), 및 3.75 U AMV 역전사효소를 혼합한 RT-PCR 반응액 25 μL를 상기 시료 처리액 20 μL와 혼합하여, 42℃, 1시간의 조건으로 반응을 행하였다. 95℃, 2분의 조건으로 효소 불활성화 처리를 행한 후, RT 반응 후의 튜브에 0.2 μM 유사 노로바이러스 RNA용 포워드 프라이머(5'-TGGAATTCCATCGCCCACTGG-3': 서열번호 4), 및 1.25 U Nova Taq(TM) Hot Start DNA Polymerase(EMD Biosciences)를 혼화하고, 최종액량 50 μL로 하였다. PCR은 95℃, 5분의 예비가열에 이어서 92℃, 30초, 58℃, 30초, 및 72℃, 1분의 사이클을 40 사이클 행한 후, 72℃, 7분의 중합을 행하는 온도 프로그램으로 행하였다.
또한, 본 실시예 10에 있어서는 처리시약으로서, 하기 표 7에 기재된 조성을 갖는 8종의 처리시약 A-1~A-8을 조제하고, 8종 각각에 대해서 상기 조작을 행하였다. 이들 처리시약 중, A-2~A-8은 본 발명에 있어서의 처리시약이고, A-1은 비교용으로 조제한 처리시약이다.
PCR 산물의 검출은, 반응 종료 후의 반응액 5 μL를 사용하여, 2.5% 아가로오스 겔을 포함하는 0.5 ㎍/mL 브롬화에티디움 첨가 TAE(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)액 중에서의 전기영동에 의해 행하였다.
실시예 10에 의해서 얻어진 전기영동 도면을 도 9에 나타낸다. 도면 중, 레인 M은 분자량 마커(Ø×174 RF DNA의 HincII 소화물), 레인 1은 처리시약 A-1을 사용한 결과, 레인 2는 처리시약 A-2를 사용한 결과, 레인 3은 처리시약 A-3을 사용한 결과, 레인 4는 처리시약 A-4를 사용한 결과, 레인 5는 처리시약 A-5를 사용한 결과, 레인 6은 처리시약 A-6을 사용한 결과, 레인 7은 처리시약 A-7을 사용한 결과, 및 레인 8은 처리시약 A-8을 사용한 결과를 나타낸다.
<실시예 11>
처리시약으로서, 이하의 조성을 갖는 7종의 처리시약 B-1~B-7을 조제하여 각각 사용한 것을 제외하고는, 실시예 10과 동일한 조작을 행하였다. 이들 처리시약 중, B-2~B-7은 본 발명에 있어서의 처리시약이고, B-1은 비교용으로 조제한 처리시약이다.
B-1. 30 mM NaOH, 0 mM DTT(비교용)
B-2. 30 mM NaOH, 5 mM DTT
B-3. 30 mM NaOH, 10 mM DTT
B-4. 30 mM NaOH, 20 mM DTT
B-5. 30 mM NaOH, 30 mM DTT
B-6. 30 mM NaOH, 40 mM DTT
B-7. 30 mM NaOH, 50 mM DTT
실시예 11에 의해서 얻어진 전기영동 도면을 도 10에 나타낸다. 도면 중, 레인 M은 분자량 마커(Ø×174 RF DNA의 HincII 소화물), 레인 1은 처리시약 B-1을 사용한 결과, 레인 2는 처리시약 B-2를 사용한 결과, 레인 3은 처리시약 B-3을 사용한 결과, 레인 4는 처리시약 B-4를 사용한 결과, 레인 5는 처리시약 B-5를 사용한 결과, 레인 6은 처리시약 B-6을 사용한 결과, 및 레인 7은 처리시약 B-7을 사용한 결과를 나타낸다.
상기 실시예 10 및 11에서는 처리시약 중에 NaOH는 20 mM~60 mM, DTT는 5 mM~50 mM 포함되어 있는 것이 바람직한 것을 알 수 있다.
<실시예 12>
<1> RNA를 정제하지 않는 분변시료를 사용한 RNA 검출
노로바이러스 감염자의 분변을 생리식염수로 20%(w/v)의 농도로 현탁, 미량 원심기로 5분간 원심분리하여 상청을 얻었다.
한편, 노로바이러스 음성의 건강한 정상인의 분변을 생리식염수에 20%(w/v)의 농도로 현탁하고, 현탁액을 미량 원심기를 사용하여 5분간 원심분리하여 상청을 얻었다.
감염자 분변에 유래하는 상청에 대해, 건강한 정상인 분변에 유래하는 상청을 사용하여 10배 단계 희석을 행하고, 6종의 분변시료액 D-1~D-6을 조제하였다. 구체적으로는, D-1의 희석률은 1배, D-2의 희석률은 10배, D-3의 희석률은 102배, D-4의 희석률은 103배, D-5의 희석률은 104배, D-6의 희석률은 105배이다.
처리시약으로서는 30 mM NaOH, 20 mM DTT, 10 mM EGTA의 조성을 갖는 처리시약을 사용하였다.
단계 희석을 행한 상기 분변시료액 10 μL와 상기 처리시약 10 μL를 첨가하여 교반한 후, 85℃에서 5분간 가열하였다.
RT-PCR의 RT 반응에 있어서는 Ampdirect(R) Plus(P/N: 241-08800-98: 시마즈세이사쿠쇼), 0.4 μM 노로바이러스 RNA용 리버스 프라이머(5'-TGTCACGATCTCATCATCACC-3': 서열번호 5), 및 3.75 U AMV 역전사효소를 혼합한 RT-PCR 반응액 25 μL를 상기 시료 처리액 20 μL와 혼합하여, 42℃, 1시간의 조건으로 반응을 행하였다. 95℃, 2분의 조건으로 효소 불활성화 처리를 행한 후, RT 반응 후의 튜브에 0.2 μM 노로바이러스 RNA용 포워드 프라이머(5'-TGGAATTCCATCGCCCACTGG-3': 서열번호 4) 및 1.25 U Nova Taq(TM) Hot Start DNA Polymerase(EMD Biosciences)를 혼화하여, 최종액량 50 μL로 하였다. PCR은 95℃, 5분의 예비가열에 이어서 92℃, 30초, 58℃, 30초 및 72℃, 1분의 사이클을 40 사이클 행한 후, 72℃, 7분의 중합을 행하는 온도 프로그램으로 행하였다.
PCR 산물의 검출은 반응 종료 후의 반응액 5 μL를 사용하여, 2.5% 아가로오스 겔을 포함하는 0.5 ㎍/mL 브롬화에티디움 첨가 TAE(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)액 중에서의 전기영동에 의해 행하였다.
<1>에 의해서 얻어진 전기영동 도면을 도 11에 나타낸다. 도면 중, 레인 1은 분변시료액 D-1을 사용한 결과, 레인 2는 분변시료액 D-2를 사용한 결과, 레인 3은 분변시료액 D-3을 사용한 결과, 레인 4는 분변시료액 D-4를 사용한 결과, 레인 5는 분변시료액 D-5를 사용한 결과, 레인 6은 분변시료액 D-6을 사용한 결과를 나타낸다. 레인 7은 음성 대조(Negative Control), 즉 노로바이러스 감염자 분변 대신에 노로바이러스 비감염의 건강한 정상인 분변을 사용한 것을 제외하고 동일한 조작을 행한 결과를 나타낸다. 레인 M은 분자량 마커(Ø×174 RF DNA의 HincII 소화물)이다.
<2> 분변시료로부터 정제한 RNA를 사용한 RNA 검출
상기 <1>에서 얻어진 각 희석 감염자 분변에 유래하는 상청에 대해, QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN사)를 적용함으로써 RNA 정제를 행하고, 이들을 상기 <1>의 분변시료액 D-1~D-6에 대한 대조로서, 6종의 정제 RNA액 E-1~E-6으로 하였다. 구체적으로는, E-1은 D-1에 대응한 정제 RNA액(1배), E-2는 D-2에 대응한 정제 RNA액(10배), E-3은 D-3에 대응한 정제 RNA액(102배), E-4는 D-4에 대응한 정제 RNA액(103배), E-5는 D-5에 대응한 정제 RNA액(104배), E-6은 D-6에 대응한 정제 RNA액(105배)이다.
분변시료액 D-1~D-6 대신에, 각각 정제 RNA액 E-1~E-6을 사용한 것 이외에는, 상기 <1>과 동일한 조작을 행하였다.
<2>에 의해서 얻어진 전기영동 도면을 도 12에 나타낸다. 도면 중, 레인 1은 정제 RNA액 E-1을 사용한 결과, 레인 2는 정제 RNA액 E-2를 사용한 결과, 레인 3은 정제 RNA액 E-3을 사용한 결과, 레인 4는 정제 RNA액 E-4를 사용한 결과, 레인 5는 정제 RNA액 E-5를 사용한 결과, 레인 6은 정제 RNA액 E-6을 사용한 결과를 나타낸다. 레인 7은 음성 대조(Negative Control), 즉 노로바이러스 감염자 분변 대신에 노로바이러스 비감염의 건강한 정상인 분변을 사용한 것을 제외하고 동일한 조작을 행한 결과를 나타낸다. 레인 M은 분자량 마커(Ø×174 RF DNA의 HincII 소화물)이다.
도 11 및 도 12를 토대로, RNA를 정제하지 않는 분변시료를 사용한 경우와, 분변시료로부터 정제한 RNA를 사용한 경우에 대해서, RNA 검출의 감도·특이성을 비교하면, 검출한계는 양 시료 모두 희석률 104배였다.
분변 상청 중에는 바이러스 뿐 아니라 다수의 세균이나 생체 유래 물질도 부유(浮遊)하고 있고, 그 중에는 RNA 분해효소도 다량으로 존재하고 있다. 상기의 실시예가 나타내는 결과는, 본 발명의 실시에 의해 분변 중에 다량으로 존재하는 RNA 분해효소의 불활성화와 RNA 바이러스로부터의 RNA의 추출, 더 나아가서는 RT-PCR 저해물질의 제어가 유효하게 작용한 것에 의한 것이라고 해석할 수 있다.
<실시예 13>
노로바이러스에 감염되어 있는 18개의 상이한 검체(검체번호 1~18)에 각각 유래하는 18종의 노로바이러스 양성 분변에 대해서, 실시예 12의 <1>과 동일한 조작을 행하였다. 얻어진 전기영동 도면을 도 13에 나타낸다. 도 13 중, 레인의 숫자는 각각 검체번호에 상당한다. 레인 M은 분자량 마커(Ø×174 RF DNA의 HincII 소화물)이다.
한편, 노로바이러스에 감염되어 있지 않은 10개의 상이한 검체(검체번호 19~28)에 각각 유래하는 10종의 노로바이러스 음성 분변에 대해서, 실시예 12의 <1>과 동일한 조작을 행하였다. 얻어진 전기영동 도면을 도 14에 나타낸다. 도 14 중, 레인의 숫자는 각각 검체번호에 상당한다. 레인 M은 분자량 마커(Ø×174 RF DNA의 HincII 소화물)이다.
도 13 및 도 14가 나타내는 바와 같이, 노로바이러스 양성 분변시료로부터는 전체(18 검체 중 18 검체)에 있어서 특이산물이 검출되었다. 한편, 노로바이러스 음성 분변시료로부터는 전체(10 검체 중 10 검체)에 있어서 유사산물(mimic product)은 검출되지 않았다.
<실시예 14>
처리시약으로서, 30 mM NaOH, 20 mM DTT, 10 mM EGTA의 조성을 갖는 처리시약을 사용하여, 20℃에서 100℃까지의 다양한 온도 및 1분에서 60분까지의 다양한 시간의 조건하에서 가열처리를 행한 것 이외에는, 실시예 10과 동일한 조작을 행하였다.
실시예 14에 의해서 얻어진 전기영동 도면을 도 15에 나타낸다. 도 15에서는, 5개의 레인은 가열처리 시간이 1분, 5분, 15분, 30분 및 60분이었던 경우에 대응하고, 각각의 레인당 가열처리 온도가 25℃(비교용), 35℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 및 100℃였던 경우의 결과를 나타내고 있다.
증폭된 RNA를 실시간 PCR에 의해서 정량하였다. 구체적으로는, 얻어진 RT-PCR 반응액에 10×SYBR(TM) Green I(Molecular Probes)을 첨가하고, 온도 프로그램으로서 95℃, 5분의 예비가열에 이어서, 92℃, 30초, 58℃, 30초, 및 72℃, 1분의 사이클을 30사이클 행한 후, 72℃, 7분의 중합을 실행하였다. 30 사이클째의 형광강도를 도 16에 나타낸다. 도 16에 있어서는 가로축에 열처리온도(℃), 세로축에 형광강도(상대 형광강도: RFU)를 나타낸다.
본 실시예에 있어서도 EGTA의 첨가에 의해 RNA의 가수분해 속도가 현저하게 작아져, 광범위한 가열조건으로 안정하게 RNA의 검출이 가능해졌다고 생각된다.
상기 실시예에서는 본 발명의 범위에 있어서의 구체적인 형태에 대해서 나타내었지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니며 다른 다양한 형태로 실시할 수 있다. 이 때문에, 상기 실시예는 모든 점에서 단순한 예시에 불과하고, 한정적으로 해석해서는 안된다. 또한, 클레임의 균등범위에 속하는 변경은 모두 본 발명의 범위 내이다.
또한, 서열표 프리 텍스트(인공서열의 기재(Description of Artificial Sequence))에 있어서, 서열번호 1~5는 합성 프라이머이다.
본 발명에 의하면, 생체시료, 환경시료 등의 시료, 또는 그로부터 RNA 포함체의 분리 등을 행하여 얻은 생체 유래 시료 등의 시료 중에 보편적으로 존재하는 RNase를 불활성화시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 생체시료, 환경시료 등의 시료, 또는 그로부터 RNA 포함체의 분리 등을 행하여 얻은 생체 유래 시료 등의 시료 중에 존재하는 RNA 포함체로부터 RNA를 효율적으로 추출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 시료 중의 RNase의 불활성화와 RNA 포함체 내부로부터의 RNA의 추출을 일공정으로 행함으로써, 간편·안정적·효율적 또한 신속하게 시료 중에 존재하는 RNA를 증폭하는 것이 가능해진다. 그리고, 핵산합성에 대한 저해물질의 작용을 억제함으로써, 더욱 간편·안정적·효율적 또한 신속하게 시료 중에 존재하는 RNA를 증폭하는 것이 가능해진다. 이것에 의해, 간편·안정적·효율적 또한 신속하게 시료 중의 RNA를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 의하면, 이들의 방법에 사용할 수 있는 처리시약을 제공할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> SHIMADZU CORPORATION
<120> Method for Extracting RNA and Detecting RNA
<130> G106209 WO
<150> JP 2005-319332
<151> 2005-11-02
<150> JP 2005-319333
<151> 2005-11-02
<150> JP 2005-319334
<151> 2005-11-02
<150> JP 2006-116310
<151> 2006-04-20
<160> 5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic primer
<400> 1
cttcacgcag aaagcgtcta gccatggcgt 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic primer
<400> 2
ctcgcaagca ccctatcagg cagtaccaca 30
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic primer
<400> 3
actgacaatt tcatcatcac c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic primer
<400> 4
tggaattcca tcgcccactg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic primer
<400> 5
tgtcacgatc tcatcatcac c 21
Claims (22)
- RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료와, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약의 혼합물로서, pH가 8.1 이상인 혼합물을, 가열조건하에서 얻는 공정과,상기 혼합물을 상기 가열조건하에서 유지함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 RNA 포함체로부터의 RNA 추출을 행하는 공정을 포함하는, RNA의 추출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 처리시약은 트리스 완충액, 굿 완충액, 붕산염 완충액, 및 탄산염 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리 버퍼를 포함하는, RNA의 추출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 처리시약은 수산화물, 암모니아, 및 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리물질을 포함하는, RNA의 추출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 환원제가 티올형 환원제인, RNA의 추출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시료가 생체시료, 생체 유래 시료, 환경시료, 및 환경 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA의 추출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시료가 배설물시료 및 배설물 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA의 추출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA 포함체는 세포, 진균, 세균, 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA의 추출방법.
- 제7항에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 레트로바이러스, 노로바이러스, 로타바이러스, 및 C형 간염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA의 추출방법.
- 제8항에 있어서, 상기 RNA 바이러스가 레트로바이러스인 경우, 상기 레트로바이러스는 에이즈바이러스인, RNA의 추출방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RNA가 mRNA인, RNA의 추출방법.
- RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료를, 적어도 환원제를 포함하는 용액 중에 혼재시키는 공정과, 상기 시료와 상기 환원제의 혼합액을, 25℃에 있어서의 pH가 8.1 이상이 되도록 조정하는 공정과,pH 조정된 상기 혼합액을 가열조건하에 제공함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 상기 RNA 포함체로부터의 RNA의 추출을 행하는 공정을 포함하는, RNA 추출방법.
- RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료와, 적어도 환원제를 포함하는 알칼리성 처리시약의 혼합물로서, pH가 8.1 이상인 혼합물을, 가열조건하에서 얻는 공정과,상기 혼합물을 상기 가열조건하에서 유지함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 RNA 포함체로부터의 RNA 추출을 행하여, 추출된 RNA를 포함하는 시료 처리액을 얻는 공정과,상기 시료 처리액과 증폭용 반응액을 혼합하여 RNA 증폭반응을 행하는, RNA 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 처리시약은 트리스 완충액, 굿 완충액, 붕산염 완충액, 및 탄산염 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리 버퍼를 포함하는, RNA 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 처리시약은 수산화물, 암모니아, 및 아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리물질을 포함하는, RNA 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 환원제가 티올형 환원제인, RNA 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 시료가 생체시료, 생체 유래 시료, 환경시료, 및 환경 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 시료가 배설물시료 및 배설물 유래 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 RNA 포함체는 세포, 진균, 세균, 및 RNA 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA 검출방법.
- 제18항에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 레트로바이러스, 노로바이러스, 로타바이러스, 및 C형 간염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, RNA 검출방법.
- 제19항에 있어서, 상기 RNA 바이러스가 레트로바이러스인 경우, 상기 레트로바이러스는 에이즈바이러스인, RNA 검출방법.
- 제12항에 있어서, 상기 RNA가 mRNA인, RNA 검출방법.
- RNA 포함체 및 RNA 분해효소가 포함되는 시료를, 적어도 환원제를 포함하는 용액 중에 혼재시키는 공정과,상기 시료와 상기 환원제의 혼합액을, 25℃에 있어서의 pH가 8.1 이상이 되도록 조정하는 공정과,pH 조정된 상기 혼합액을 가열조건하에 제공함으로써, 상기 RNA 분해효소의 불활성화와 상기 RNA 포함체로부터의 RNA의 추출을 행하여, 추출된 RNA를 포함하는 시료 처리액을 얻는 공정과,상기 시료 처리액과 증폭용 반응액을 혼합하여 RNA 증폭반응을 행하는 공정을 포함하는, RNA 검출방법.
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