JP3416981B2 - 核酸合成法 - Google Patents
核酸合成法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸合成法、特にポリ
メラーゼ連鎖反応法による核酸合成法に関する。 【０００２】 【従来の技術・発明が解決しようとする課題】遺伝子を
増幅する技術の一つにポリメラーゼ連鎖反応法（Polyme
rase Chain Reaction;以下、ＰＣＲと略す）が行われて
いる。ＰＣＲ法は目的とするＤＮＡ領域をはさんで、プ
ライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラーゼ反応でＤＮＡ
合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ（鋳型
ＤＮＡ）断片を数十万倍にも増幅できる方法である。Ｐ
ＣＲ法は、通常検体中のごく少量の例えば１個のウィル
ス、細菌、細胞等のＤＮＡの解析に使用される。また最
近、ＰＣＲ後の生産物の量より、検体中に存在していた
鋳型ＤＮＡの量を推定する等の定量的な解析も試みられ
ている。 【０００３】しかしながら、生体由来の試料（たとえ
ば、動物由来の組織、血液、髄液、唾液、乳、尿、糞便
等または植物由来の根、茎、葉、花、実等）、環境試料
（たとえば、土壌、水等）または食品（例えば肉、牛
乳、卵等）等に含まれるウイルス、細菌または細胞等の
ＤＮＡの解析を行うためには、まず試料中の夾雑物を除
去し、目的のＤＮＡのみを分離、精製する必要がある。
その方法として、現在、一般的に酵素や界面活性剤によ
る試料の処理後、フェノール・クロロホルムによる抽出
が行われている。又、最近では、イオン交換樹脂、ガラ
スビーズ、蛋白凝集剤等による蛋白等の除去法を用いる
ＤＮＡの精製も行われている。しかし、いずれの方法を
用いても、夾雑物を充分に除去することは困難であり、
このことが、しばしばＰＣＲ法等による核酸合成法にお
いて遺伝子増幅の抑制の原因となっている。本発明者ら
は、ＰＣＲ法等の核酸合成法を用いた遺伝子増幅を行な
う際にポリアミンを添加することにより、これらの夾雑
物による核酸合成の抑制が軽減されるのではないかと想
定し、従来の文献などを検討したが、核酸合成法におけ
るポリアミンの添加と夾雑物による核酸合成の抑制との
関係について記述している文献は見当たらなかった。従
って、本発明の目的は核酸合成を抑制する可能性のある
物質を含むサンプル、即ち生体または環境等に由来する
試料より抽出したサンプルにおける核酸合成法を提供す
ることにある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決する目的で、核酸合成法におけるポリアミンの添加
と夾雑物による核酸合成の抑制との関係について検討を
行い、ヒトの糞便等を試料としてフェノール・クロロホ
ルムにより抽出した所望のＤＮＡを含むサンプルに種々
のポリアミンを種々の濃度で添加した後、ＰＣＲ法で核
酸合成を行なった。その結果、各種ポリアミンをある一
定の範囲で添加することにより、サンプル中に混入する
夾雑物による核酸合成の抑制が軽減されることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。 【０００５】即ち、本発明の要旨は試料から目的の遺伝
子を増幅する核酸合成法において、反応系内にポリアミ
ンを添加して行なうことを特徴とする核酸合成法に関す
る。 【０００６】本発明における試料とは、たとえば、生体
由来の試料としては動物由来の組織、血液、髄液、唾
液、乳、尿、糞便等または植物由来の根、茎、葉、花、
実等がが挙げられ、また、環境試料としてはたとえば、
土壌、水等が挙げられ、さらに食品としてはたとえば
肉、牛乳、卵等が挙げられるが特に制限されるものでは
ない。 【０００７】本発明におけるポリアミンとは、第一級も
しくは第二級アミノ基を二つ以上もつ炭化水素の総称で
ある。ある種のポリアミンは、生体内に存在しており、
タンパク質や核酸合成の盛んな組織に多く含まれてお
り、多様な生理的作用を有しているが、本発明における
ポリアミンの作用にはかかる作用が必ずしも要求される
わけではなく、第一級もしくは第二級アミノ基を二つ以
上一分子内に有する炭化水素であれば特に限定される物
ではない。具体的には、例えばエチレンジアミン、トリ
メチレンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエチ
レントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチ
レンペンタミンおよびペンタエチレンヘキサミン等が挙
げられる。 【０００８】また、本発明における核酸合成法とは、通
常の核酸の合成方法を指すもので特に制限されるもので
はないが、例えばＰＣＲ法等が挙げられる。以下、ＰＣ
Ｒ法を例にして本発明の方法を説明する。尚、本発明の
記述において各種プライマー、ｄＮＴＰ等を含有するＰ
ＣＲを行なうための反応液をＰＣＲ反応液と表現し、試
料溶液、ＰＣＲ反応液およびポリアミン等の混合液をＰ
ＣＲ反応溶液と表現する。本発明においてポリアミン
は、反応系内に添加されるが、ここで反応系内への添加
とは、ＰＣＲ反応がポリアミンの存在下で行なわれるよ
うな態様であれば特に限定されるものではなく、例えば
ＰＣＲの直前に試料溶液（例えば、糞便抽出液）ととも
にＰＣＲ反応液に添加してもよく、また試料溶液または
ＰＣＲ反応液の調製時にあらかじめ添加しておいてもよ
いが、試料溶液調製時に予め添加しておいた方が効果が
高くあらわれる。また、ポリアミンの添加量（濃度）
は、ポリアミンの種類や試料溶液の種類、濃度等により
異なるが、通常ＰＣＲ反応溶液中１０〜０．０１ｍＭ程
度、好ましくは４〜１ｍＭ程度の濃度が、夾雑物による
核酸合成の抑制を軽減するという観点から好ましい。 【０００９】本発明の核酸合成法の手順は、反応系内に
ポリアミンを添加する以外、通常の方法と何ら変わらな
い。即ち、まず、増幅しようとする目的の２本鎖ＤＮＡ
断片を熱変性により、１本鎖のＤＮＡにする（ディナチ
ュレーション工程）。次に増幅させたい領域を挟む約２
０塩基のプライマーをハイブリダイズさせる（アニーリ
ング工程）。次に４種類のデオキシリボヌクレオチド三
リン酸（ｄＮＴＰ）の共存下にＤＮＡポリメラーゼを作
用させ、プライマーの伸長反応を行う（ポリメライゼー
ション工程）。上記の一連の反応サイクルを繰り返すこ
とによって、目的とするＤＮＡ領域が理論上２n （但
し、ｎはサイクル数）と指数関数的に増幅される。プラ
イマーの伸長反応は通常、公知の耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼが用いられる。鎖長反応生成物の鋳型からの分離操
作は種々の公知の方法により行なわれるが、熱変性によ
り行なうのが好ましい。 【００１０】ＰＣＲに用いる検体中の標的ＤＮＡ量は、
ｎｇオーダ〜最大限１μｇであり、プライマーの濃度は
それに応じて適宜決められる。ＰＣＲの条件はプライマ
ーの配列により異なるが、ディナチュレーション工程は
通常９０〜９５℃で０．５〜１分、アニーリング工程は
通常３７〜７２℃で１〜３分、ポリメライゼーション工
程が通常６０〜７２℃で１〜３分の条件である。これら
の工程を１サイクルとしたＰＣＲの至適サイクル数は、
サンプル中に存在する標的ＤＮＡの初期濃度により異な
るが、通常２５〜４５サイクル行なう。 【００１１】増幅されたＤＮＡ断片の検出法は、種々の
公知の方法が知られており、例えばアガロースゲル担体
中でＤＮＡ断片を泳動させ、その後臭化エチジウムでＤ
ＮＡを染色する方法や標識プローブを用いたハイブリダ
イゼーションにより検出する方法などが挙げられる。 【００１２】 【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。 実施例１ 試料には１００ｍｇのヒト糞便を用いた。試料の溶解
は、０．１ＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳで行い、試
料の抽出には、フェノール・クロロホルムを用いた。フ
ェノール・クロロホルム処理後、エタノールによる沈
澱、７０％エタノールによる脱塩、乾燥した後、１ｍｌ
のＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）に溶解した。得られた糞便抽出液にア
グロバクテリウム リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）Ａ４株（以下、単にＡ
４株と省略する）のＤＮＡ（１００コピー）、各種のポ
リアミンおよびＰＣＲ反応液を添加した後、ＰＣＲを行
った。 【００１３】本実施例において増幅を行なうＤＮＡとし
ては、Ａ４株よりフェノール・クロロホルム法により抽
出した精製ＤＮＡを使用した。ＰＣＲのプライマーは、
Ａ４株の毛状根誘導遺伝子領域内に位置するプラス鎖の
塩基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ1 、配列番号：
１）、およびマイナス鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレ
オチド（Ｐ2 、配列番号：２）であり、その間に２０２
ｂｐの塩基配列を挟んでいるものを使用した。 Ｐ1 ：５’ＧＴＴＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡ
Ｇ ３’ Ｐ2 ：５’ＧＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＧＴＡＧＧＴＣ
３’ 【００１４】ＰＣＲ反応液は、各プライマーを１μＭ、
４種のｄＮＴＰを２００μＭ含む反応液（１０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５
ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、
０．７５単位の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ〔Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社
製〕）を用いた。ＰＣＲ反応液の全体量は２１μｌと
し、糞便抽出液、Ａ４株のＤＮＡおよびポリアミンは、
それぞれ３μｌずつ添加した。 【００１５】ＰＣＲは、９４℃１分３０秒間の熱変性の
後、９４℃１分間の熱変性、５５℃１分間のアニーリン
グ、そして７２℃１分間のＤＮＡ鎖伸長反応を１サイク
ルとして４０サイクルの反応を行い、最後に７２℃、７
分間のＤＮＡ鎖伸長反応を行うことにより、２種類のプ
ライマーの結合点の間に位置するＤＮＡ断片の増幅を行
った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて３％アガロ
ースを含むＴＡＥ（４０ｍＭのトリス−酢酸塩，１ｍＭ
のＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）液中で電気泳動を行い、臭化
エチジウムによるＤＮＡの染色と検出を行った。 【００１６】以下に、本実施例の結果を示す。図１およ
び図２は１００ｍｇのヒト糞便よりフェノール・クロロ
ホルム法により精製し、１ｍｌのＴＥに溶解して得られ
た糞便抽出液３μｌ、１００コピーのＡ４株精製ＤＮＡ
３μｌ、各種のポリアミン３μｌを混合した後、ＰＣＲ
反応液２１μｌを加え、ＰＣＲを行った場合の結果であ
る。各図中、レーン１〜５はポリアミンの添加量がそれ
ぞれ異なり、レーン１は１０ｍＭ、レーン２は３．２ｍ
Ｍ、レーン３は１ｍＭ、レーン４は０．３２ｍＭ、レー
ン５は０．１ｍＭ、レーン６は０．０３２ｍＭ、レーン
７は０．０１ｍＭの濃度に最終的になるようにポリアミ
ンを添加した。レーンＳＣは上記反応液中のポリアミン
のかわりに蒸留水（３μｌ）を加えたサンプルコントロ
ールであり、レーンＰＣは反応液中に糞便抽出液とポリ
アミンのかわりに、それぞれＴＥと蒸留水を加えた陽性
コントロールであり、レーンＮＣは反応液中に糞便抽出
液、Ａ４株精製ＤＮＡとポリアミンのかわりにＴＥと蒸
留水を加えた陰性コントロールである。なおレーンＭ
は、分子量マーカーであり、制限酵素ＨｉｃIIで切断し
た２５０ｎｇのφ×１７４−ＲＦ ＤＮＡを用いた。 【００１７】図中のＡ〜Ｅは、本実施例において添加し
た各種ポリアミンの種類を示している。 図１；Ａ エチレンジアミン、Ｂ トリメチレンジアミ
ン、Ｃ スペルミジン、Ｄ トリエチレンテトラミン、
Ｅ スペルミン 図２；Ａ スペルミジン、Ｂ ジエチレントリアミン、
Ｃ トリエチレンテトラミン、Ｄ テトラエチレンペン
タミン、Ｅ ペンタエチレンヘキサミン 図１および図２の結果から明らかなように、各図におい
てＳＣのレーン、すなわちＡ４株精製ＤＮＡに糞便抽出
液を加えた場合、ＰＣＲが抑制され、ＰＣＲ産物が検出
されていない。しかし、各図において上記各種ポリアミ
ンを加えると、いずれのポリアミンを加えた場合も糞便
由来の不純物によるＰＣＲ抑制が解除され、ＰＣＲ産物
が検出されるようになった事を示している。 【００１８】 【発明の効果】本発明により、サンプル中に混入する夾
雑物による核酸合成の抑制が軽減され、生体または環境
由来の試料から目的の遺伝子を効率よく合成することが
可能となった。 【００１９】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GTT AGG CGT GCA AAG GCC AAG 21 【００２０】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GCG TAT TAA TCC CGT AGG TC 20
メラーゼ連鎖反応法による核酸合成法に関する。 【０００２】 【従来の技術・発明が解決しようとする課題】遺伝子を
増幅する技術の一つにポリメラーゼ連鎖反応法（Polyme
rase Chain Reaction;以下、ＰＣＲと略す）が行われて
いる。ＰＣＲ法は目的とするＤＮＡ領域をはさんで、プ
ライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラーゼ反応でＤＮＡ
合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ（鋳型
ＤＮＡ）断片を数十万倍にも増幅できる方法である。Ｐ
ＣＲ法は、通常検体中のごく少量の例えば１個のウィル
ス、細菌、細胞等のＤＮＡの解析に使用される。また最
近、ＰＣＲ後の生産物の量より、検体中に存在していた
鋳型ＤＮＡの量を推定する等の定量的な解析も試みられ
ている。 【０００３】しかしながら、生体由来の試料（たとえ
ば、動物由来の組織、血液、髄液、唾液、乳、尿、糞便
等または植物由来の根、茎、葉、花、実等）、環境試料
（たとえば、土壌、水等）または食品（例えば肉、牛
乳、卵等）等に含まれるウイルス、細菌または細胞等の
ＤＮＡの解析を行うためには、まず試料中の夾雑物を除
去し、目的のＤＮＡのみを分離、精製する必要がある。
その方法として、現在、一般的に酵素や界面活性剤によ
る試料の処理後、フェノール・クロロホルムによる抽出
が行われている。又、最近では、イオン交換樹脂、ガラ
スビーズ、蛋白凝集剤等による蛋白等の除去法を用いる
ＤＮＡの精製も行われている。しかし、いずれの方法を
用いても、夾雑物を充分に除去することは困難であり、
このことが、しばしばＰＣＲ法等による核酸合成法にお
いて遺伝子増幅の抑制の原因となっている。本発明者ら
は、ＰＣＲ法等の核酸合成法を用いた遺伝子増幅を行な
う際にポリアミンを添加することにより、これらの夾雑
物による核酸合成の抑制が軽減されるのではないかと想
定し、従来の文献などを検討したが、核酸合成法におけ
るポリアミンの添加と夾雑物による核酸合成の抑制との
関係について記述している文献は見当たらなかった。従
って、本発明の目的は核酸合成を抑制する可能性のある
物質を含むサンプル、即ち生体または環境等に由来する
試料より抽出したサンプルにおける核酸合成法を提供す
ることにある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決する目的で、核酸合成法におけるポリアミンの添加
と夾雑物による核酸合成の抑制との関係について検討を
行い、ヒトの糞便等を試料としてフェノール・クロロホ
ルムにより抽出した所望のＤＮＡを含むサンプルに種々
のポリアミンを種々の濃度で添加した後、ＰＣＲ法で核
酸合成を行なった。その結果、各種ポリアミンをある一
定の範囲で添加することにより、サンプル中に混入する
夾雑物による核酸合成の抑制が軽減されることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。 【０００５】即ち、本発明の要旨は試料から目的の遺伝
子を増幅する核酸合成法において、反応系内にポリアミ
ンを添加して行なうことを特徴とする核酸合成法に関す
る。 【０００６】本発明における試料とは、たとえば、生体
由来の試料としては動物由来の組織、血液、髄液、唾
液、乳、尿、糞便等または植物由来の根、茎、葉、花、
実等がが挙げられ、また、環境試料としてはたとえば、
土壌、水等が挙げられ、さらに食品としてはたとえば
肉、牛乳、卵等が挙げられるが特に制限されるものでは
ない。 【０００７】本発明におけるポリアミンとは、第一級も
しくは第二級アミノ基を二つ以上もつ炭化水素の総称で
ある。ある種のポリアミンは、生体内に存在しており、
タンパク質や核酸合成の盛んな組織に多く含まれてお
り、多様な生理的作用を有しているが、本発明における
ポリアミンの作用にはかかる作用が必ずしも要求される
わけではなく、第一級もしくは第二級アミノ基を二つ以
上一分子内に有する炭化水素であれば特に限定される物
ではない。具体的には、例えばエチレンジアミン、トリ
メチレンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエチ
レントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチ
レンペンタミンおよびペンタエチレンヘキサミン等が挙
げられる。 【０００８】また、本発明における核酸合成法とは、通
常の核酸の合成方法を指すもので特に制限されるもので
はないが、例えばＰＣＲ法等が挙げられる。以下、ＰＣ
Ｒ法を例にして本発明の方法を説明する。尚、本発明の
記述において各種プライマー、ｄＮＴＰ等を含有するＰ
ＣＲを行なうための反応液をＰＣＲ反応液と表現し、試
料溶液、ＰＣＲ反応液およびポリアミン等の混合液をＰ
ＣＲ反応溶液と表現する。本発明においてポリアミン
は、反応系内に添加されるが、ここで反応系内への添加
とは、ＰＣＲ反応がポリアミンの存在下で行なわれるよ
うな態様であれば特に限定されるものではなく、例えば
ＰＣＲの直前に試料溶液（例えば、糞便抽出液）ととも
にＰＣＲ反応液に添加してもよく、また試料溶液または
ＰＣＲ反応液の調製時にあらかじめ添加しておいてもよ
いが、試料溶液調製時に予め添加しておいた方が効果が
高くあらわれる。また、ポリアミンの添加量（濃度）
は、ポリアミンの種類や試料溶液の種類、濃度等により
異なるが、通常ＰＣＲ反応溶液中１０〜０．０１ｍＭ程
度、好ましくは４〜１ｍＭ程度の濃度が、夾雑物による
核酸合成の抑制を軽減するという観点から好ましい。 【０００９】本発明の核酸合成法の手順は、反応系内に
ポリアミンを添加する以外、通常の方法と何ら変わらな
い。即ち、まず、増幅しようとする目的の２本鎖ＤＮＡ
断片を熱変性により、１本鎖のＤＮＡにする（ディナチ
ュレーション工程）。次に増幅させたい領域を挟む約２
０塩基のプライマーをハイブリダイズさせる（アニーリ
ング工程）。次に４種類のデオキシリボヌクレオチド三
リン酸（ｄＮＴＰ）の共存下にＤＮＡポリメラーゼを作
用させ、プライマーの伸長反応を行う（ポリメライゼー
ション工程）。上記の一連の反応サイクルを繰り返すこ
とによって、目的とするＤＮＡ領域が理論上２n （但
し、ｎはサイクル数）と指数関数的に増幅される。プラ
イマーの伸長反応は通常、公知の耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼが用いられる。鎖長反応生成物の鋳型からの分離操
作は種々の公知の方法により行なわれるが、熱変性によ
り行なうのが好ましい。 【００１０】ＰＣＲに用いる検体中の標的ＤＮＡ量は、
ｎｇオーダ〜最大限１μｇであり、プライマーの濃度は
それに応じて適宜決められる。ＰＣＲの条件はプライマ
ーの配列により異なるが、ディナチュレーション工程は
通常９０〜９５℃で０．５〜１分、アニーリング工程は
通常３７〜７２℃で１〜３分、ポリメライゼーション工
程が通常６０〜７２℃で１〜３分の条件である。これら
の工程を１サイクルとしたＰＣＲの至適サイクル数は、
サンプル中に存在する標的ＤＮＡの初期濃度により異な
るが、通常２５〜４５サイクル行なう。 【００１１】増幅されたＤＮＡ断片の検出法は、種々の
公知の方法が知られており、例えばアガロースゲル担体
中でＤＮＡ断片を泳動させ、その後臭化エチジウムでＤ
ＮＡを染色する方法や標識プローブを用いたハイブリダ
イゼーションにより検出する方法などが挙げられる。 【００１２】 【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。 実施例１ 試料には１００ｍｇのヒト糞便を用いた。試料の溶解
は、０．１ＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳで行い、試
料の抽出には、フェノール・クロロホルムを用いた。フ
ェノール・クロロホルム処理後、エタノールによる沈
澱、７０％エタノールによる脱塩、乾燥した後、１ｍｌ
のＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）に溶解した。得られた糞便抽出液にア
グロバクテリウム リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）Ａ４株（以下、単にＡ
４株と省略する）のＤＮＡ（１００コピー）、各種のポ
リアミンおよびＰＣＲ反応液を添加した後、ＰＣＲを行
った。 【００１３】本実施例において増幅を行なうＤＮＡとし
ては、Ａ４株よりフェノール・クロロホルム法により抽
出した精製ＤＮＡを使用した。ＰＣＲのプライマーは、
Ａ４株の毛状根誘導遺伝子領域内に位置するプラス鎖の
塩基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ1 、配列番号：
１）、およびマイナス鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレ
オチド（Ｐ2 、配列番号：２）であり、その間に２０２
ｂｐの塩基配列を挟んでいるものを使用した。 Ｐ1 ：５’ＧＴＴＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡ
Ｇ ３’ Ｐ2 ：５’ＧＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＧＴＡＧＧＴＣ
３’ 【００１４】ＰＣＲ反応液は、各プライマーを１μＭ、
４種のｄＮＴＰを２００μＭ含む反応液（１０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５
ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、
０．７５単位の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ〔Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社
製〕）を用いた。ＰＣＲ反応液の全体量は２１μｌと
し、糞便抽出液、Ａ４株のＤＮＡおよびポリアミンは、
それぞれ３μｌずつ添加した。 【００１５】ＰＣＲは、９４℃１分３０秒間の熱変性の
後、９４℃１分間の熱変性、５５℃１分間のアニーリン
グ、そして７２℃１分間のＤＮＡ鎖伸長反応を１サイク
ルとして４０サイクルの反応を行い、最後に７２℃、７
分間のＤＮＡ鎖伸長反応を行うことにより、２種類のプ
ライマーの結合点の間に位置するＤＮＡ断片の増幅を行
った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて３％アガロ
ースを含むＴＡＥ（４０ｍＭのトリス−酢酸塩，１ｍＭ
のＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）液中で電気泳動を行い、臭化
エチジウムによるＤＮＡの染色と検出を行った。 【００１６】以下に、本実施例の結果を示す。図１およ
び図２は１００ｍｇのヒト糞便よりフェノール・クロロ
ホルム法により精製し、１ｍｌのＴＥに溶解して得られ
た糞便抽出液３μｌ、１００コピーのＡ４株精製ＤＮＡ
３μｌ、各種のポリアミン３μｌを混合した後、ＰＣＲ
反応液２１μｌを加え、ＰＣＲを行った場合の結果であ
る。各図中、レーン１〜５はポリアミンの添加量がそれ
ぞれ異なり、レーン１は１０ｍＭ、レーン２は３．２ｍ
Ｍ、レーン３は１ｍＭ、レーン４は０．３２ｍＭ、レー
ン５は０．１ｍＭ、レーン６は０．０３２ｍＭ、レーン
７は０．０１ｍＭの濃度に最終的になるようにポリアミ
ンを添加した。レーンＳＣは上記反応液中のポリアミン
のかわりに蒸留水（３μｌ）を加えたサンプルコントロ
ールであり、レーンＰＣは反応液中に糞便抽出液とポリ
アミンのかわりに、それぞれＴＥと蒸留水を加えた陽性
コントロールであり、レーンＮＣは反応液中に糞便抽出
液、Ａ４株精製ＤＮＡとポリアミンのかわりにＴＥと蒸
留水を加えた陰性コントロールである。なおレーンＭ
は、分子量マーカーであり、制限酵素ＨｉｃIIで切断し
た２５０ｎｇのφ×１７４−ＲＦ ＤＮＡを用いた。 【００１７】図中のＡ〜Ｅは、本実施例において添加し
た各種ポリアミンの種類を示している。 図１；Ａ エチレンジアミン、Ｂ トリメチレンジアミ
ン、Ｃ スペルミジン、Ｄ トリエチレンテトラミン、
Ｅ スペルミン 図２；Ａ スペルミジン、Ｂ ジエチレントリアミン、
Ｃ トリエチレンテトラミン、Ｄ テトラエチレンペン
タミン、Ｅ ペンタエチレンヘキサミン 図１および図２の結果から明らかなように、各図におい
てＳＣのレーン、すなわちＡ４株精製ＤＮＡに糞便抽出
液を加えた場合、ＰＣＲが抑制され、ＰＣＲ産物が検出
されていない。しかし、各図において上記各種ポリアミ
ンを加えると、いずれのポリアミンを加えた場合も糞便
由来の不純物によるＰＣＲ抑制が解除され、ＰＣＲ産物
が検出されるようになった事を示している。 【００１８】 【発明の効果】本発明により、サンプル中に混入する夾
雑物による核酸合成の抑制が軽減され、生体または環境
由来の試料から目的の遺伝子を効率よく合成することが
可能となった。 【００１９】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GTT AGG CGT GCA AAG GCC AAG 21 【００２０】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 GCG TAT TAA TCC CGT AGG TC 20
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は各種ポリアミン（Ａ〜Ｅ）を各種濃度
（１０ｍＭ，３．２ｍＭ，１ｍＭ，０．３２ｍＭ，０．
１ｍＭ）で添加した後にＰＣＲ反応を行った場合の電気
泳動図である。なお、図中のＭレーンは分子量マーカー
を、ＳＣレーンはサンプルコントロールを、ＰＣレーン
は陽性コントロールを、ＮＣレーンは陰性コントロール
を示す。 【図２】図２は各種ポリアミン（Ａ〜Ｅ）を各種濃度
（１０ｍＭ，３．２ｍＭ，１ｍＭ，０．３２ｍＭ，０．
１ｍＭ，０．０３２ｍＭ，０．０１ｍＭ）で添加した後
にＰＣＲ反応を行った場合の電気泳動図である。なお、
図中のＭレーンは分子量マーカーを、ＳＣレーンはサン
プルコントロールを、ＰＣレーンは陽性コントロール
を、ＮＣレーンは陰性コントロールを示す。
（１０ｍＭ，３．２ｍＭ，１ｍＭ，０．３２ｍＭ，０．
１ｍＭ）で添加した後にＰＣＲ反応を行った場合の電気
泳動図である。なお、図中のＭレーンは分子量マーカー
を、ＳＣレーンはサンプルコントロールを、ＰＣレーン
は陽性コントロールを、ＮＣレーンは陰性コントロール
を示す。 【図２】図２は各種ポリアミン（Ａ〜Ｅ）を各種濃度
（１０ｍＭ，３．２ｍＭ，１ｍＭ，０．３２ｍＭ，０．
１ｍＭ，０．０３２ｍＭ，０．０１ｍＭ）で添加した後
にＰＣＲ反応を行った場合の電気泳動図である。なお、
図中のＭレーンは分子量マーカーを、ＳＣレーンはサン
プルコントロールを、ＰＣレーンは陽性コントロール
を、ＮＣレーンは陰性コントロールを示す。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 試料から目的の遺伝子を増幅する核酸合
成法において、反応系内にポリアミンを添加して行なう
ことを特徴とする核酸合成法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09678593A JP3416981B2 (ja) | 1993-03-30 | 1993-03-30 | 核酸合成法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09678593A JP3416981B2 (ja) | 1993-03-30 | 1993-03-30 | 核酸合成法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06277061A JPH06277061A (ja) | 1994-10-04 |
| JP3416981B2 true JP3416981B2 (ja) | 2003-06-16 |
Family
ID=14174296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09678593A Expired - Lifetime JP3416981B2 (ja) | 1993-03-30 | 1993-03-30 | 核酸合成法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3416981B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0791075A2 (en) * | 1994-10-21 | 1997-08-27 | Abbott Laboratories | Use of spermidine to relieve inhibition of ligase chain reaction in a clinical test sample |
| CA2232709C (en) * | 1995-09-22 | 2002-11-19 | Terragen Diversity Inc. | Method for isolating xylanase gene sequences from soil dna, compositions useful in such method and compositions obtained thereby |
| JPH1080280A (ja) * | 1996-09-09 | 1998-03-31 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
| AU4754300A (en) * | 1999-04-30 | 2000-12-12 | Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh | Mixture for neutralizing enzyme inhibitors |
| EP1343371A4 (en) * | 2000-09-08 | 2004-08-04 | Invitrogen Corp | COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF NUCLEIC ACID SYNTHESIS |
| WO2007052765A1 (ja) | 2005-11-02 | 2007-05-10 | Shimadzu Corporation | Rnaの抽出方法及びrnaの検出方法 |
| US8669061B2 (en) | 2008-06-26 | 2014-03-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method for the prevention of carryover contamination in nucleic acid amplification technologies |
-
1993
- 1993-03-30 JP JP09678593A patent/JP3416981B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06277061A (ja) | 1994-10-04 |
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