JPH089997A - 核酸合成法およびそれに用いる試薬キット - Google Patents
核酸合成法およびそれに用いる試薬キットInfo
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- JPH089997A JPH089997A JP6146500A JP14650094A JPH089997A JP H089997 A JPH089997 A JP H089997A JP 6146500 A JP6146500 A JP 6146500A JP 14650094 A JP14650094 A JP 14650094A JP H089997 A JPH089997 A JP H089997A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血液等の動物体液、植物由来の試料、環境試
料についての核酸合成法において、遺伝子増幅の感度を
向上させることを目的とする。 【構成】 血液等の動物体液、植物由来の試料、環境試
料から目的の遺伝子を増幅する核酸合成法において、反
応溶液内にポリアミンを１０〜０．０１ｍＭ程度、好ま
しくは、２〜０．５ｍＭ添加して行うことを特徴とす
る。
料についての核酸合成法において、遺伝子増幅の感度を
向上させることを目的とする。 【構成】 血液等の動物体液、植物由来の試料、環境試
料から目的の遺伝子を増幅する核酸合成法において、反
応溶液内にポリアミンを１０〜０．０１ｍＭ程度、好ま
しくは、２〜０．５ｍＭ添加して行うことを特徴とす
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸合成法、特にポリ
メラーゼ連鎖反応法による核酸合成法及びそれに用いる
試薬キットに関する。
メラーゼ連鎖反応法による核酸合成法及びそれに用いる
試薬キットに関する。
【０００２】
【従来技術】遺伝子を増幅する技術の一つにポリメラー
ゼ連鎖反応法（Polymerase Chain Reaction;以下、ＰＣ
Ｒと略す）が行われている。ＰＣＲ法は目的とするＤＮ
Ａ領域をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリ
メラーゼ反応でＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）断片を数十万倍にも増
幅できる方法である。ＰＣＲ法は、通常検体中のごく少
量の例えば１個のウィルス、細菌、細胞等のＤＮＡの解
析に使用される。また最近、ＰＣＲ後の生産物の量よ
り、検体中に存在していた鋳型ＤＮＡの量を推定する等
の定量的な解析も試みられている。
ゼ連鎖反応法（Polymerase Chain Reaction;以下、ＰＣ
Ｒと略す）が行われている。ＰＣＲ法は目的とするＤＮ
Ａ領域をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリ
メラーゼ反応でＤＮＡ合成反応を繰り返すことによっ
て、目的のＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）断片を数十万倍にも増
幅できる方法である。ＰＣＲ法は、通常検体中のごく少
量の例えば１個のウィルス、細菌、細胞等のＤＮＡの解
析に使用される。また最近、ＰＣＲ後の生産物の量よ
り、検体中に存在していた鋳型ＤＮＡの量を推定する等
の定量的な解析も試みられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、血液、
髄液、唾液等の動物体液または植物由来の根、茎、葉、
花、実等、環境試料（たとえば、土壌、水等）に含まれ
るウイルス、細菌または細胞等のＤＮＡの解析を行うた
めには、まず試料中の夾雑物を除去し、目的のＤＮＡの
みを分離、精製する必要がある。その方法として、現
在、一般的に酵素や界面活性剤による試料の処理後、フ
ェノール・クロロホルムによる抽出が行われている。
又、最近では、イオン交換樹脂、ガラスビーズ、蛋白凝
集剤等による蛋白等の除去法を用いるＤＮＡの精製も行
われている。
髄液、唾液等の動物体液または植物由来の根、茎、葉、
花、実等、環境試料（たとえば、土壌、水等）に含まれ
るウイルス、細菌または細胞等のＤＮＡの解析を行うた
めには、まず試料中の夾雑物を除去し、目的のＤＮＡの
みを分離、精製する必要がある。その方法として、現
在、一般的に酵素や界面活性剤による試料の処理後、フ
ェノール・クロロホルムによる抽出が行われている。
又、最近では、イオン交換樹脂、ガラスビーズ、蛋白凝
集剤等による蛋白等の除去法を用いるＤＮＡの精製も行
われている。
【０００４】しかし、いずれの方法を用いても、夾雑物
を充分に除去することは困難であり、このことが、しば
しばＰＣＲ法等による核酸合成法において遺伝子増幅の
抑制の原因となっている。
を充分に除去することは困難であり、このことが、しば
しばＰＣＲ法等による核酸合成法において遺伝子増幅の
抑制の原因となっている。
【０００５】そこで、本発明者らは先にＰＣＲ法等の核
酸合成法を用いた遺伝子増幅を行う際にポリアミンを添
加することにより、これらの夾雑物による核酸合成の抑
制が軽減されることを見出し、特許出願を行っており
（特願平５−９６７８５号）、本発明はさらに血液等の
動物体液、植物由来の試料、環境試料について検討を加
えたものである。
酸合成法を用いた遺伝子増幅を行う際にポリアミンを添
加することにより、これらの夾雑物による核酸合成の抑
制が軽減されることを見出し、特許出願を行っており
（特願平５−９６７８５号）、本発明はさらに血液等の
動物体液、植物由来の試料、環境試料について検討を加
えたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決する目的で、血液または植物由来の試料、環境試料
について核酸合成法におけるポリアミンの添加と夾雑物
による核酸合成の抑制との関係について検討を行い、血
液溶解後の白血球、又はタバコ葉、土壌等を試料として
陰イオン交換樹脂等により抽出した所望のＤＮＡを含む
サンプルに種々のポリアミンを種々の濃度で添加した
後、ＰＣＲ法で核酸合成を行った。
解決する目的で、血液または植物由来の試料、環境試料
について核酸合成法におけるポリアミンの添加と夾雑物
による核酸合成の抑制との関係について検討を行い、血
液溶解後の白血球、又はタバコ葉、土壌等を試料として
陰イオン交換樹脂等により抽出した所望のＤＮＡを含む
サンプルに種々のポリアミンを種々の濃度で添加した
後、ＰＣＲ法で核酸合成を行った。
【０００７】その結果、各種ポリアミンをある一定の範
囲で添加することにより、サンプル中に混入する夾雑物
による核酸合成の抑制が軽減されることを見いだし、本
発明を完成するに至った。
囲で添加することにより、サンプル中に混入する夾雑物
による核酸合成の抑制が軽減されることを見いだし、本
発明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明の要旨は血液等の動物体液ま
たは植物由来の試料、環境試料から目的の遺伝子を増幅
する核酸合成法において、反応溶液内にポリアミンを少
なくとも添加して行うことを特徴とする核酸合成法に関
する。
たは植物由来の試料、環境試料から目的の遺伝子を増幅
する核酸合成法において、反応溶液内にポリアミンを少
なくとも添加して行うことを特徴とする核酸合成法に関
する。
【０００９】本発明における動物体液としては、血液、
髄液、唾液、尿、乳等が、植物由来の試料としては、
根、茎、葉、花、実等が挙げられ、また、環境試料とし
てはたとえば、土壌、水等が挙げられる。
髄液、唾液、尿、乳等が、植物由来の試料としては、
根、茎、葉、花、実等が挙げられ、また、環境試料とし
てはたとえば、土壌、水等が挙げられる。
【００１０】本発明におけるポリアミンとは、第一級も
しくは第二級アミノ基を二つ以上もつ炭化水素の総称で
ある。ある種のポリアミンは、生体内に存在しており、
タンパク質や核酸合成の盛んな組織に多く含まれてお
り、多様な生理的作用を有しているが、本発明における
ポリアミンの作用にはかかる作用が必ずしも要求される
わけではなく、第一級もしくは第二級アミノ基を二つ以
上一分子内に有する炭化水素であれば特に限定される物
ではない。
しくは第二級アミノ基を二つ以上もつ炭化水素の総称で
ある。ある種のポリアミンは、生体内に存在しており、
タンパク質や核酸合成の盛んな組織に多く含まれてお
り、多様な生理的作用を有しているが、本発明における
ポリアミンの作用にはかかる作用が必ずしも要求される
わけではなく、第一級もしくは第二級アミノ基を二つ以
上一分子内に有する炭化水素であれば特に限定される物
ではない。
【００１１】具体的には、例えばエチレンジアミン、ト
リメチレンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエ
チレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエ
チレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、１，４
−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジン、１−（２
−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチ
ル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−
７，１６−ディアザサイクロオクタデカンおよびトリス
（２−アミノエチル）アミン等が挙げられる。
リメチレンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエ
チレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエ
チレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、１，４
−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジン、１−（２
−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチ
ル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−
７，１６−ディアザサイクロオクタデカンおよびトリス
（２−アミノエチル）アミン等が挙げられる。
【００１２】また、本発明における核酸合成法とは、通
常の核酸の合成方法を指すもので特に制限されるもので
はないが、例えばＰＣＲ法等が挙げられる。以下、ＰＣ
Ｒ法を例にして本発明の方法を説明する。
常の核酸の合成方法を指すもので特に制限されるもので
はないが、例えばＰＣＲ法等が挙げられる。以下、ＰＣ
Ｒ法を例にして本発明の方法を説明する。
【００１３】尚、本発明の記述において各種プライマ
ー、ｄＮＴＰ等を含有するＰＣＲを行うための反応液を
ＰＣＲ反応液と表現し、試料溶液、ＰＣＲ反応液および
ポリアミン等の混合液をＰＣＲ反応溶液と表現する。そ
して、本発明では、ＰＣＲ反応液およびポリアミンを少
なくとも含むものを試薬キットとして提供する。
ー、ｄＮＴＰ等を含有するＰＣＲを行うための反応液を
ＰＣＲ反応液と表現し、試料溶液、ＰＣＲ反応液および
ポリアミン等の混合液をＰＣＲ反応溶液と表現する。そ
して、本発明では、ＰＣＲ反応液およびポリアミンを少
なくとも含むものを試薬キットとして提供する。
【００１４】本発明においてポリアミンは、反応系内に
添加されるが、ここで反応系内への添加とは、ＰＣＲ反
応がポリアミンの存在下で行われるような態様であれば
特に限定されるものではなく、例えばＰＣＲの直前に試
料溶液とともにＰＣＲ反応液に添加してもよく、また試
料溶液またはＰＣＲ反応液の調製時にあらかじめ添加し
ておいてもよい。
添加されるが、ここで反応系内への添加とは、ＰＣＲ反
応がポリアミンの存在下で行われるような態様であれば
特に限定されるものではなく、例えばＰＣＲの直前に試
料溶液とともにＰＣＲ反応液に添加してもよく、また試
料溶液またはＰＣＲ反応液の調製時にあらかじめ添加し
ておいてもよい。
【００１５】また、ポリアミンの添加量（濃度）は、ポ
リアミンの種類や試料溶液の種類、濃度等により異なる
が、通常ＰＣＲ反応溶液中１０〜０．０１ｍＭ程度、好
ましくは２〜０．５ｍＭ程度の濃度が、夾雑物による核
酸合成の抑制を軽減するという観点から好ましい。
リアミンの種類や試料溶液の種類、濃度等により異なる
が、通常ＰＣＲ反応溶液中１０〜０．０１ｍＭ程度、好
ましくは２〜０．５ｍＭ程度の濃度が、夾雑物による核
酸合成の抑制を軽減するという観点から好ましい。
【００１６】本発明の核酸合成法の手順は、反応系内に
ポリアミンを添加する以外、通常の方法と何ら変わらな
い。
ポリアミンを添加する以外、通常の方法と何ら変わらな
い。
【００１７】即ち、まず、増幅しようとする目的の２本
鎖ＤＮＡ断片を熱変性により、１本鎖のＤＮＡにする
（ディナチュレーション工程）。次に増幅させたい領域
を挟む約２０塩基のプライマーをハイブリダイズさせる
（アニーリング工程）。次に４種類のデオキシリボヌク
レオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＰ）の共存下にＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プ
ライマーの伸長反応を行う（ポリメライゼーション工
程）。
鎖ＤＮＡ断片を熱変性により、１本鎖のＤＮＡにする
（ディナチュレーション工程）。次に増幅させたい領域
を挟む約２０塩基のプライマーをハイブリダイズさせる
（アニーリング工程）。次に４種類のデオキシリボヌク
レオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＰ）の共存下にＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プ
ライマーの伸長反応を行う（ポリメライゼーション工
程）。
【００１８】上記の一連の反応サイクルを繰り返すこと
によって、目的とするＤＮＡ領域が理論上２n （但し、
ｎはサイクル数）と指数関数的に増幅される。プライマ
ーの伸長反応は、通常、公知の耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼが用いられる。鎖長反応生成物の鋳型からの分離操作
は種々の公知の方法により行われるが、熱変性により行
うのが好ましい。
によって、目的とするＤＮＡ領域が理論上２n （但し、
ｎはサイクル数）と指数関数的に増幅される。プライマ
ーの伸長反応は、通常、公知の耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼが用いられる。鎖長反応生成物の鋳型からの分離操作
は種々の公知の方法により行われるが、熱変性により行
うのが好ましい。
【００１９】ＰＣＲに用いる検体中の標的ＤＮＡ量は、
ａｇオーダ〜最大限数μｇであり、プライマーの濃度は
それに応じて適宜決められる。ＰＣＲの条件はプライマ
ーの配列により異なるが、ディナチュレーション工程は
通常９０〜９５℃で０．５〜１分、アニーリング工程は
通常３７〜７２℃で０．５〜３分、ポリメライゼーショ
ン工程が通常６０〜７４℃で０．５〜３分の条件であ
る。これらの工程を１サイクルとしたＰＣＲの至適サイ
クル数は、サンプル中に存在する標的ＤＮＡの初期濃度
により異なるが、通常２５〜４５サイクル行う。
ａｇオーダ〜最大限数μｇであり、プライマーの濃度は
それに応じて適宜決められる。ＰＣＲの条件はプライマ
ーの配列により異なるが、ディナチュレーション工程は
通常９０〜９５℃で０．５〜１分、アニーリング工程は
通常３７〜７２℃で０．５〜３分、ポリメライゼーショ
ン工程が通常６０〜７４℃で０．５〜３分の条件であ
る。これらの工程を１サイクルとしたＰＣＲの至適サイ
クル数は、サンプル中に存在する標的ＤＮＡの初期濃度
により異なるが、通常２５〜４５サイクル行う。
【００２０】増幅されたＤＮＡ断片の検出法は、種々の
公知の方法が知られており、例えばアガロースゲル担体
中でＤＮＡ断片を泳動させ、その後臭化エチジウムでＤ
ＮＡを染色する方法や標識プローブを用いたハイブリダ
イゼーションにより検出する方法などが挙げられる。
公知の方法が知られており、例えばアガロースゲル担体
中でＤＮＡ断片を泳動させ、その後臭化エチジウムでＤ
ＮＡを染色する方法や標識プローブを用いたハイブリダ
イゼーションにより検出する方法などが挙げられる。
【００２１】
【作用】本発明では、ポリアミンの添加によりサンプル
中に混入する夾雑物による核酸合成の抑制が軽減され、
血液等の動物体液、植物由来の試料、環境由来の試料か
ら目的の遺伝子を効率よく合成することが可能となる。
中に混入する夾雑物による核酸合成の抑制が軽減され、
血液等の動物体液、植物由来の試料、環境由来の試料か
ら目的の遺伝子を効率よく合成することが可能となる。
【００２２】
［実験例１：ヒト血液］試料には、ヒト血液（白血球数
６０００個／μｌ）２３μｌにリン酸緩衝液で段階希釈
したマウス血液５μｌを添加したものを用いた。試料を
溶血処理後、遠心操作により白血球を沈殿させ、上澄を
除去した。洗浄後、白血球沈査にポリアミンおよびＰＣ
Ｒ反応液を添加し、ＰＣＲを行った。
６０００個／μｌ）２３μｌにリン酸緩衝液で段階希釈
したマウス血液５μｌを添加したものを用いた。試料を
溶血処理後、遠心操作により白血球を沈殿させ、上澄を
除去した。洗浄後、白血球沈査にポリアミンおよびＰＣ
Ｒ反応液を添加し、ＰＣＲを行った。
【００２３】ＰＣＲのプライマーは、マウスのβ−クロ
ビン遺伝子領域内に位置するプラス鎖の塩基配列を持つ
オリゴヌクレオチド（Ｐ1 、配列番号：１）およびマイ
ナス鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ2 、配
列番号：２）であり、その間に１７４ｂｐの塩基配列を
挟んでいる。
ビン遺伝子領域内に位置するプラス鎖の塩基配列を持つ
オリゴヌクレオチド（Ｐ1 、配列番号：１）およびマイ
ナス鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ2 、配
列番号：２）であり、その間に１７４ｂｐの塩基配列を
挟んでいる。
【００２４】 Ｐ1 ：５´ＧＣＡＣＡＧＣＴＧＴＧＴＴＴＡＣＴＡＧＣ ３´ Ｐ2 ：５´ＣＡＣＡＴＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧ ３´ ＰＣＲ反応液は、各プライマーを１μＭ、４種のｄＮＴ
Ｐを２００μＭ含む反応液（１０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，１，５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ2 、０．０１％（W/v)ゼラチン，０．０２５単位／
μｌの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ［Ampli Taq,Perkin E
lmer Cetus社製］）を用いた。
Ｐを２００μＭ含む反応液（１０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，１，５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ2 、０．０１％（W/v)ゼラチン，０．０２５単位／
μｌの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ［Ampli Taq,Perkin E
lmer Cetus社製］）を用いた。
【００２５】ＰＣＲ反応溶液の全体量は１００μｌと
し、ポリアミンは１０μｌ添加した。ＰＣＲは、９４℃
１分３０秒間の熱変性の後、９４℃１分間の熱変性、５
５℃１分間のアニーリング、７２℃１分間のＤＮＡ鎖伸
長反応を１サイクルとして４０サイクルの反応を行い、
最後に７２℃、７分間のＤＮＡ鎖長反応を行うことによ
り、２種類のプライマーの結合点の間に位置するＤＮＡ
断片の増幅を行った。ＰＣＲ終了後、反応溶液５μｌを
用いて３％アガロースを含むＴＡＥ（４０ｍＭのトリス
−酢酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）液中で電気
泳動を行い、臭化エチジウムによるＤＮＡの染色と検出
を行った。
し、ポリアミンは１０μｌ添加した。ＰＣＲは、９４℃
１分３０秒間の熱変性の後、９４℃１分間の熱変性、５
５℃１分間のアニーリング、７２℃１分間のＤＮＡ鎖伸
長反応を１サイクルとして４０サイクルの反応を行い、
最後に７２℃、７分間のＤＮＡ鎖長反応を行うことによ
り、２種類のプライマーの結合点の間に位置するＤＮＡ
断片の増幅を行った。ＰＣＲ終了後、反応溶液５μｌを
用いて３％アガロースを含むＴＡＥ（４０ｍＭのトリス
−酢酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）液中で電気
泳動を行い、臭化エチジウムによるＤＮＡの染色と検出
を行った。
【００２６】図１に本実施例の結果を示す。Ａはポリア
ミン・ＰＣＲ反応液添加群、ＢはＰＣＲ反応液のみの添
加群である。レーン１〜６は、ＰＣＲTube中にそれぞ
れ、１：１０4 、２：１０3 、３：１０2 、４：１０、
５：０個のマウス白血球を添加した結果である。なお、
レーンＭは分子量マーカーである。
ミン・ＰＣＲ反応液添加群、ＢはＰＣＲ反応液のみの添
加群である。レーン１〜６は、ＰＣＲTube中にそれぞ
れ、１：１０4 、２：１０3 、３：１０2 、４：１０、
５：０個のマウス白血球を添加した結果である。なお、
レーンＭは分子量マーカーである。
【００２７】図１の結果から明らかなように、ＢのＰＣ
Ｒ反応液のみの添加群では、増幅反応が高度に抑制さ
れ、マウス白血球が１０4 個存在する時に薄い増幅ＤＮ
Ａのバンドが認められるのみである。対してＡのポリア
ミンを併用した群では増幅反応の抑制が軽減され、マウ
ス白血球が１０個存在すれば、ＰＣＲ産物が検出される
ようになった事を示している。
Ｒ反応液のみの添加群では、増幅反応が高度に抑制さ
れ、マウス白血球が１０4 個存在する時に薄い増幅ＤＮ
Ａのバンドが認められるのみである。対してＡのポリア
ミンを併用した群では増幅反応の抑制が軽減され、マウ
ス白血球が１０個存在すれば、ＰＣＲ産物が検出される
ようになった事を示している。
【００２８】［実験例２：砂質水田土壌及びタバコ葉］
試料には１００ｍｇの砂質水田土壌又は１００ｍｇのタ
バコ葉をホモゲナイズしたものに０．６μｇのＡ４株Ｄ
ＮＡを混入したものを用いた。試料の溶解は、０．１Ｍ
のＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳで行い、試料の精製は弱
陰イオン交換樹脂［ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ｆ
ａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］により行
い、４００μｌの１ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ（ＰＨ７．０）で溶出した。得られた溶
出液にポリアミンおよびＰＣＲ反応液を添加した後、Ｐ
ＣＲを行った。
試料には１００ｍｇの砂質水田土壌又は１００ｍｇのタ
バコ葉をホモゲナイズしたものに０．６μｇのＡ４株Ｄ
ＮＡを混入したものを用いた。試料の溶解は、０．１Ｍ
のＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳで行い、試料の精製は弱
陰イオン交換樹脂［ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ｆ
ａｓｔ ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］により行
い、４００μｌの１ＭＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ（ＰＨ７．０）で溶出した。得られた溶
出液にポリアミンおよびＰＣＲ反応液を添加した後、Ｐ
ＣＲを行った。
【００２９】ＰＣＲ反応液は、実施例１で用いた反応液
よりＫＣｌを除いて用いた。ＰＣＲ反応溶液の全体量は
３０μｌとし、ＤＮＡ溶出液およびポリアミンは、それ
ぞれ３μｌずつ添加した。ＰＣＲおよび増幅ＤＮＡの検
出は実施例１と同様に行った。 図２に本実施例の結果
を示す。ＡはＤＮＡのみのpositive control群、Ｂは土
壌を混入した群、Ｃは葉を混入した群である。レーン１
は、０ｍＭ、レーン２は０．５ｍＭ，レーン３は１ｍ
Ｍ、レーン４は２ｍＭ、レーン５は４ｍＭ、レーン６は
８ｍＭの濃度に最終的になるようにポリアミンを添加し
た。なおレーンＭは分子量マーカーである。
よりＫＣｌを除いて用いた。ＰＣＲ反応溶液の全体量は
３０μｌとし、ＤＮＡ溶出液およびポリアミンは、それ
ぞれ３μｌずつ添加した。ＰＣＲおよび増幅ＤＮＡの検
出は実施例１と同様に行った。 図２に本実施例の結果
を示す。ＡはＤＮＡのみのpositive control群、Ｂは土
壌を混入した群、Ｃは葉を混入した群である。レーン１
は、０ｍＭ、レーン２は０．５ｍＭ，レーン３は１ｍ
Ｍ、レーン４は２ｍＭ、レーン５は４ｍＭ、レーン６は
８ｍＭの濃度に最終的になるようにポリアミンを添加し
た。なおレーンＭは分子量マーカーである。
【００３０】図２の結果から明らかなように、Ｂおよび
Ｃのレーン１、即ち土壌又は葉にＡ４株ＤＮＡを混入し
たものからの溶出液をＰＣＲ反応液に加えた場合、増幅
反応が抑制され、ＰＣＲ産物が検出されていない。しか
しＢおよびＣの２〜４レーンに見られるようにポリアミ
ンを０．５〜２ｍＭ加えると土壌や葉由来の不純物によ
る増幅反応の抑制が解除されＰＣＲ産物が検出されるよ
うになった事を示している。
Ｃのレーン１、即ち土壌又は葉にＡ４株ＤＮＡを混入し
たものからの溶出液をＰＣＲ反応液に加えた場合、増幅
反応が抑制され、ＰＣＲ産物が検出されていない。しか
しＢおよびＣの２〜４レーンに見られるようにポリアミ
ンを０．５〜２ｍＭ加えると土壌や葉由来の不純物によ
る増幅反応の抑制が解除されＰＣＲ産物が検出されるよ
うになった事を示している。
【００３１】
【発明の効果】本発明により、サンプル中に混入する夾
雑物による核酸合成の抑制が軽減され、血液等の動物体
液、植物由来の試料、環境由来の試料から目的の遺伝子
を効率よく合成することが可能となった。
雑物による核酸合成の抑制が軽減され、血液等の動物体
液、植物由来の試料、環境由来の試料から目的の遺伝子
を効率よく合成することが可能となった。
【００３２】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＧＣＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＧＴ ＴＴＡ ＣＴＡ ＧＣ
【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列： ＣＡＣ ＡＴＡ ＣＣＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＡＣＴ ＣＧ
【図１】ヒト血液に各希釈段階のマウス血液を添加した
ものを試料として用いてＰＣＲを行った場合の電気泳動
図である。
ものを試料として用いてＰＣＲを行った場合の電気泳動
図である。
【図２】ポリアミンを各種濃度で添加した後にＰＣＲを
行った場合の電気泳動図である。ＡはＤＮＡのみの添加
群、ＢはＤＮＡと土壌添加群、ＣはＤＮＡとタバコ葉添
加群より精製した溶出液を用いた時の結果を示してい
る。
行った場合の電気泳動図である。ＡはＤＮＡのみの添加
群、ＢはＤＮＡと土壌添加群、ＣはＤＮＡとタバコ葉添
加群より精製した溶出液を用いた時の結果を示してい
る。
Claims (2)
- 【請求項１】 動物体液、植物由来の試料、環境試料か
ら目的の遺伝子を増幅する核酸合成法において、反応溶
液中にポリアミンを添加して行うことを特徴とする核酸
合成法。 - 【請求項２】 増幅すべき塩基配列と相補鎖を形成する
プライマー、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン
酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ポリアミンを少
なくとも含んでなる核酸合成用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6146500A JPH089997A (ja) | 1994-06-28 | 1994-06-28 | 核酸合成法およびそれに用いる試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6146500A JPH089997A (ja) | 1994-06-28 | 1994-06-28 | 核酸合成法およびそれに用いる試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH089997A true JPH089997A (ja) | 1996-01-16 |
Family
ID=15409037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6146500A Pending JPH089997A (ja) | 1994-06-28 | 1994-06-28 | 核酸合成法およびそれに用いる試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH089997A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000037633A1 (fr) * | 1998-12-21 | 2000-06-29 | Riken | Promoteurs de la transcription d'arn polymerase et procede de determination de la sequence de bases |
| KR20020047693A (ko) * | 2000-12-13 | 2002-06-22 | 김성수 | 유전자 검사용 키트 |
| US8669061B2 (en) | 2008-06-26 | 2014-03-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method for the prevention of carryover contamination in nucleic acid amplification technologies |
| US9388159B2 (en) | 2006-03-27 | 2016-07-12 | The Regents Of The University Of California | Substituted diazaspiroalkanes as androgen receptor modulators |
| US10702508B2 (en) | 2017-10-16 | 2020-07-07 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castration-resistant prostate cancer |
| US10799489B2 (en) | 2012-09-26 | 2020-10-13 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castrate-resistant prostate cancer |
-
1994
- 1994-06-28 JP JP6146500A patent/JPH089997A/ja active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000037633A1 (fr) * | 1998-12-21 | 2000-06-29 | Riken | Promoteurs de la transcription d'arn polymerase et procede de determination de la sequence de bases |
| US6627399B1 (en) | 1998-12-21 | 2003-09-30 | Riken | RNA polymerase transcription promoters and nucleic acid sequencing method |
| KR20020047693A (ko) * | 2000-12-13 | 2002-06-22 | 김성수 | 유전자 검사용 키트 |
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| US9987261B2 (en) | 2006-03-27 | 2018-06-05 | The Regents Of The University Of California | Substituted diazaspiroalkanes as androgen receptor modulators |
| US11771687B2 (en) | 2006-03-27 | 2023-10-03 | The Regents Of The University Of California | Substituted diazaspiroalkanes as androgen receptor modulators |
| US10857139B2 (en) | 2006-03-27 | 2020-12-08 | The Regents Of The University Of California | Substituted diazaspiroalkanes as androgen receptor modulators |
| US8669061B2 (en) | 2008-06-26 | 2014-03-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Method for the prevention of carryover contamination in nucleic acid amplification technologies |
| US10849888B2 (en) | 2012-09-26 | 2020-12-01 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castrate-resistant prostate cancer |
| US10799488B2 (en) | 2012-09-26 | 2020-10-13 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castrate-resistant prostate cancer |
| US10799489B2 (en) | 2012-09-26 | 2020-10-13 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castrate-resistant prostate cancer |
| USRE49353E1 (en) | 2012-09-26 | 2023-01-03 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castrate-resistant prostate cancer |
| US11160796B2 (en) | 2017-10-16 | 2021-11-02 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castration-resistant prostate cancer |
| US11491149B2 (en) | 2017-10-16 | 2022-11-08 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castration-resistant prostate cancer |
| US10702508B2 (en) | 2017-10-16 | 2020-07-07 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Anti-androgens for the treatment of non-metastatic castration-resistant prostate cancer |
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