JPH07274999A - 核酸を用いた抄紙斑点の判別方法及びそれに用いるプライマー - Google Patents
核酸を用いた抄紙斑点の判別方法及びそれに用いるプライマーInfo
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- JPH07274999A JPH07274999A JP6073592A JP7359294A JPH07274999A JP H07274999 A JPH07274999 A JP H07274999A JP 6073592 A JP6073592 A JP 6073592A JP 7359294 A JP7359294 A JP 7359294A JP H07274999 A JPH07274999 A JP H07274999A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 （Ａ）抄紙の斑点部分からＤＮＡを抽出する
工程、（Ｂ）抽出されたＤＮＡを化学的に増幅する工
程、（Ｃ）増幅されたＤＮＡを単離精製後、標識付与処
理を施してプローブを調製する工程、（Ｄ）白水中に存
在する微生物を培養し、それから各微生物を単離し、こ
れらからＤＮＡを抽出し、必要に応じ化学的に増幅する
工程及び（Ｅ）（Ｃ）工程で得たプローブと（Ｄ）工程
で得た各微生物の電気泳動処理されたＤＮＡとをそれぞ
れハイブリダイズし、斑点中に含まれる微生物ＤＮＡと
同一の配列をもつ微生物を特定する工程を順次行うこと
により抄紙斑点を判別する。 【効果】 抄紙上の斑点の発生原因を、ＤＮＡの化学的
な増幅やハイブリダイゼーションを利用することにより
直接に検知することができる上に、従来全く不可能であ
った斑点中に存在する微生物種の特定も可能とすること
ができる。
工程、（Ｂ）抽出されたＤＮＡを化学的に増幅する工
程、（Ｃ）増幅されたＤＮＡを単離精製後、標識付与処
理を施してプローブを調製する工程、（Ｄ）白水中に存
在する微生物を培養し、それから各微生物を単離し、こ
れらからＤＮＡを抽出し、必要に応じ化学的に増幅する
工程及び（Ｅ）（Ｃ）工程で得たプローブと（Ｄ）工程
で得た各微生物の電気泳動処理されたＤＮＡとをそれぞ
れハイブリダイズし、斑点中に含まれる微生物ＤＮＡと
同一の配列をもつ微生物を特定する工程を順次行うこと
により抄紙斑点を判別する。 【効果】 抄紙上の斑点の発生原因を、ＤＮＡの化学的
な増幅やハイブリダイゼーションを利用することにより
直接に検知することができる上に、従来全く不可能であ
った斑点中に存在する微生物種の特定も可能とすること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、製紙の際に、抄紙上に
発生する斑点の原因を判別し、その適切な防止対策を見
出すための方法に関するものである。さらに詳しくいえ
ば、本発明は、ＤＮＡを利用して製紙工程中に発生する
抄紙上の斑点の原因となっている微生物の種類を迅速に
判別し、その微生物を除去するための適切な手段を見出
す方法及びそれに用いるプライマーに関するものであ
る。
発生する斑点の原因を判別し、その適切な防止対策を見
出すための方法に関するものである。さらに詳しくいえ
ば、本発明は、ＤＮＡを利用して製紙工程中に発生する
抄紙上の斑点の原因となっている微生物の種類を迅速に
判別し、その微生物を除去するための適切な手段を見出
す方法及びそれに用いるプライマーに関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】製紙工場における製品ロスの原因の１つ
に抄造工程で発生する抄紙上の斑点状スポットによる汚
染がある。この斑点の発生原因としては、大別して原料
中に含まれる填料のような無機成分の分散の不均一性
と、パルプ繊維に付着している微生物の異常増殖による
凝集体の形成が考えられる。
に抄造工程で発生する抄紙上の斑点状スポットによる汚
染がある。この斑点の発生原因としては、大別して原料
中に含まれる填料のような無機成分の分散の不均一性
と、パルプ繊維に付着している微生物の異常増殖による
凝集体の形成が考えられる。
【０００３】これまで、このような斑点状スポットの原
因を判別するには、スポットにα‐アミノ基の検出試薬
として知られているニンヒドリン溶液を滴下し、呈色し
た場合は微生物に起因するもの、呈色しない場合は無機
物に起因するものと判断し、それぞれに適合した対策を
講じていた。
因を判別するには、スポットにα‐アミノ基の検出試薬
として知られているニンヒドリン溶液を滴下し、呈色し
た場合は微生物に起因するもの、呈色しない場合は無機
物に起因するものと判断し、それぞれに適合した対策を
講じていた。
【０００４】しかしながら、このニンヒドリン反応を利
用した判断方法では、例えば微生物に起因することが知
られたとしても、その微生物がどのような種類のものか
は不明なため、通常、パルプに付着すると思われる、あ
らゆる種類の有害微生物を除去しうるように、多種の有
効成分を組み合わせて含有する工業用殺菌剤の使用が必
要になってくるが、このように、本来不必要な有効成分
を含む工業用殺菌剤を用いることは、製品の品質面にお
いても、またコスト面においても著しい不利をもたら
す。したがって、抄紙上の斑点の原因となっている微生
物を簡単かつ迅速に特定しうる方法の開発が、製紙工業
分野における重要な課題の１つとなっていた。
用した判断方法では、例えば微生物に起因することが知
られたとしても、その微生物がどのような種類のものか
は不明なため、通常、パルプに付着すると思われる、あ
らゆる種類の有害微生物を除去しうるように、多種の有
効成分を組み合わせて含有する工業用殺菌剤の使用が必
要になってくるが、このように、本来不必要な有効成分
を含む工業用殺菌剤を用いることは、製品の品質面にお
いても、またコスト面においても著しい不利をもたら
す。したがって、抄紙上の斑点の原因となっている微生
物を簡単かつ迅速に特定しうる方法の開発が、製紙工業
分野における重要な課題の１つとなっていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな事情に鑑み、抄紙上に生じる斑点の原因となる微生
物を簡単かつ迅速に判定し、それを除去する対策を講じ
やすくするために鋭意研究を重ねた結果、斑点部分から
抽出したＤＮＡを利用し、これを化学的に増幅して白水
中に存在する微生物のＤＮＡと対比することにより、斑
点の原因となる微生物を簡単に特定しうることを見出
し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
うな事情に鑑み、抄紙上に生じる斑点の原因となる微生
物を簡単かつ迅速に判定し、それを除去する対策を講じ
やすくするために鋭意研究を重ねた結果、斑点部分から
抽出したＤＮＡを利用し、これを化学的に増幅して白水
中に存在する微生物のＤＮＡと対比することにより、斑
点の原因となる微生物を簡単に特定しうることを見出
し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、（Ａ）抄紙の斑点部
分からＤＮＡを抽出する工程、（Ｂ）抽出されたＤＮＡ
を化学的に増幅する工程、（Ｃ）増幅されたＤＮＡを単
離精製し、標識付与処理を施してプローブを調製する工
程、（Ｄ）白水中に存在する各微生物を単離し、それぞ
れからＤＮＡを抽出し、必要に応じ化学的に増幅する工
程及び（Ｅ）（Ｃ）工程で得たプローブと（Ｄ）工程で
得た各微生物の電気泳動処理されたＤＮＡとをそれぞれ
サザンハイブリダイズし、パターンを対比して斑点に含
まれる微生物を特定する工程あるいは、（Ｆ）上記の
（Ｄ）工程における白水中の微生物の単離を行うことな
く、白水そのものを栄養培地上で培養したものから抽出
したＤＮＡと、（Ｃ）工程で得たプローブとをコロニー
ハイブリダイゼーションさせる工程及びこの反応生成物
のパターンを対比して標識プローブと同一配列を有する
微生物を特定することから成る抄紙斑点の判別方法を提
供するものである。
分からＤＮＡを抽出する工程、（Ｂ）抽出されたＤＮＡ
を化学的に増幅する工程、（Ｃ）増幅されたＤＮＡを単
離精製し、標識付与処理を施してプローブを調製する工
程、（Ｄ）白水中に存在する各微生物を単離し、それぞ
れからＤＮＡを抽出し、必要に応じ化学的に増幅する工
程及び（Ｅ）（Ｃ）工程で得たプローブと（Ｄ）工程で
得た各微生物の電気泳動処理されたＤＮＡとをそれぞれ
サザンハイブリダイズし、パターンを対比して斑点に含
まれる微生物を特定する工程あるいは、（Ｆ）上記の
（Ｄ）工程における白水中の微生物の単離を行うことな
く、白水そのものを栄養培地上で培養したものから抽出
したＤＮＡと、（Ｃ）工程で得たプローブとをコロニー
ハイブリダイゼーションさせる工程及びこの反応生成物
のパターンを対比して標識プローブと同一配列を有する
微生物を特定することから成る抄紙斑点の判別方法を提
供するものである。
【０００７】本発明方法の（Ａ）工程における抄紙斑点
部分からのＤＮＡ抽出は、例えば抽出溶媒として、ＴＥ
バッファーを用い、これを細断した抄紙斑点部分と混合
し、フェノール‐クロロホルム混合溶媒（容量比１：
１）により除タンパク及び精製し、次いで水層からエタ
ノール沈殿させることによって行われる。
部分からのＤＮＡ抽出は、例えば抽出溶媒として、ＴＥ
バッファーを用い、これを細断した抄紙斑点部分と混合
し、フェノール‐クロロホルム混合溶媒（容量比１：
１）により除タンパク及び精製し、次いで水層からエタ
ノール沈殿させることによって行われる。
【０００８】次に、（Ｂ）工程における抽出されたＤＮ
Ａの化学的な増幅は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う
のが有利である。
Ａの化学的な増幅は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う
のが有利である。
【０００９】この化学増幅法は、所定の塩基配列を有す
るＤＮＡについて、その５′側と３′側に相補的な約１
５〜２０個の塩基単位をもつプライマー用合成ＤＮＡを
調製して、この多量を前記のＤＮＡと混合し、このＤＮ
Ａの１本鎖ＤＮＡへの変性、プライマーの結合、ＤＮＡ
ポリメラーゼによる相補的ＤＮＡの合成という工程を多
数回繰り返すことにより、少量のＤＮＡから多量の同一
配列ＤＮＡを増幅合成する方法である。
るＤＮＡについて、その５′側と３′側に相補的な約１
５〜２０個の塩基単位をもつプライマー用合成ＤＮＡを
調製して、この多量を前記のＤＮＡと混合し、このＤＮ
Ａの１本鎖ＤＮＡへの変性、プライマーの結合、ＤＮＡ
ポリメラーゼによる相補的ＤＮＡの合成という工程を多
数回繰り返すことにより、少量のＤＮＡから多量の同一
配列ＤＮＡを増幅合成する方法である。
【００１０】通常の化学増幅法では、特定のＤＮＡと全
く同一の配列のものを形成させることが目的となってい
るため、プライマーとしては、そのＤＮＡを特定しうる
最小の塩基単位をもつものが要求されるが、本発明方法
においては、必ずしも塩基配列全体を同一に形成する必
要はなく、単に白水中に存在するいずれかの微生物との
同一性が確認されればよいのであるから、プライマーと
しては、塩基単位の比較的少ないものを用いることがで
きる。
く同一の配列のものを形成させることが目的となってい
るため、プライマーとしては、そのＤＮＡを特定しうる
最小の塩基単位をもつものが要求されるが、本発明方法
においては、必ずしも塩基配列全体を同一に形成する必
要はなく、単に白水中に存在するいずれかの微生物との
同一性が確認されればよいのであるから、プライマーと
しては、塩基単位の比較的少ないものを用いることがで
きる。
【００１１】本発明方法で用いられるＤＮＡ増幅用プラ
イマーとしては、例えば塩基配列ＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ
及びＡＴＡＣＧＡＡＣＡＧ（ただし、Ａはアデノシン、
Ｃはシチジン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジンの単位を
それぞれ意味する）を有するプライマーがある。これら
の１０個の塩基単位をもつプライマーは、文献未載の新
規物質であって、種々の微生物ＤＮＡの増幅用として好
適に用いることができる。
イマーとしては、例えば塩基配列ＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ
及びＡＴＡＣＧＡＡＣＡＧ（ただし、Ａはアデノシン、
Ｃはシチジン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジンの単位を
それぞれ意味する）を有するプライマーがある。これら
の１０個の塩基単位をもつプライマーは、文献未載の新
規物質であって、種々の微生物ＤＮＡの増幅用として好
適に用いることができる。
【００１２】本発明方法においては、（Ａ）工程で得た
ＤＮＡ抽出液に、上記の２種を加え、ポリメラーゼの存
在下、９０℃以上の温度で１〜５分、３０〜４０℃の温
度で１〜５分及び７０〜８０℃の温度で１〜５分という
温度サイクルを少なくとも１０回以上好ましくは２０回
以上繰り返すことによって増幅反応が行われる。
ＤＮＡ抽出液に、上記の２種を加え、ポリメラーゼの存
在下、９０℃以上の温度で１〜５分、３０〜４０℃の温
度で１〜５分及び７０〜８０℃の温度で１〜５分という
温度サイクルを少なくとも１０回以上好ましくは２０回
以上繰り返すことによって増幅反応が行われる。
【００１３】次に（Ｃ）工程は、必要に応じ（Ｂ）工程
で得た増幅反応生成物をゲル電気泳動により確認したの
ち、例えばスピン・バインドＤＮＡ回収システムを用い
て単離、精製し、最後にエタノールを注加して、水溶液
中から沈殿させ回収することによって行われる。そし
て、このようにして回収されたＤＮＡは、例えば32Ｐ−
ＡＴＰやジゴキシジエニン標識ｄＵＴＰ（ベーリンガー
・マンハイム社のキットとして市販）を使用して標識を
付与し、プローブとして用いる。
で得た増幅反応生成物をゲル電気泳動により確認したの
ち、例えばスピン・バインドＤＮＡ回収システムを用い
て単離、精製し、最後にエタノールを注加して、水溶液
中から沈殿させ回収することによって行われる。そし
て、このようにして回収されたＤＮＡは、例えば32Ｐ−
ＡＴＰやジゴキシジエニン標識ｄＵＴＰ（ベーリンガー
・マンハイム社のキットとして市販）を使用して標識を
付与し、プローブとして用いる。
【００１４】（Ｄ）工程においては、上記のプローブと
ハイブリダイズすべき、白水中の個々の微生物のＤＮＡ
を調製する。すなわち、抄紙機内から採取した白水を、
常法に従い、適当な栄養培地例えばワックスマン寒天培
地に加え、培養したのち、各コロニーから前記の（Ａ）
工程と同様にして抽出溶媒によりＤＮＡを抽出する。こ
のようにして得られたＤＮＡの量が少ない場合には、前
記の（Ｂ）工程と同様にしてＤＮＡ増幅を行うが、この
際大量に得られた場合には必ずしもＤＮＡ増幅を行う必
要はない。
ハイブリダイズすべき、白水中の個々の微生物のＤＮＡ
を調製する。すなわち、抄紙機内から採取した白水を、
常法に従い、適当な栄養培地例えばワックスマン寒天培
地に加え、培養したのち、各コロニーから前記の（Ａ）
工程と同様にして抽出溶媒によりＤＮＡを抽出する。こ
のようにして得られたＤＮＡの量が少ない場合には、前
記の（Ｂ）工程と同様にしてＤＮＡ増幅を行うが、この
際大量に得られた場合には必ずしもＤＮＡ増幅を行う必
要はない。
【００１５】そして、（Ｅ）工程において、このように
して得た各単離菌からのＤＮＡをゲル電気泳動し、それ
ぞれのパターンを得るが、微生物から抽出されたＤＮＡ
は抽出時の分解などにより分子量分布が広く高分子量か
ら低分子量に至る多数のバンドを生じ、そのままでプロ
ーブのそれと対比することができないので、（Ｃ）工程
で得たプローブとハイブリダイズし、そのパターンの類
似性から、斑点の原因となる有害菌を判定する。この場
合のゲル電気泳動は、アガロースゲル電気泳動及びポリ
アクリルアミドゲル電気泳動のいずれでもよい。
して得た各単離菌からのＤＮＡをゲル電気泳動し、それ
ぞれのパターンを得るが、微生物から抽出されたＤＮＡ
は抽出時の分解などにより分子量分布が広く高分子量か
ら低分子量に至る多数のバンドを生じ、そのままでプロ
ーブのそれと対比することができないので、（Ｃ）工程
で得たプローブとハイブリダイズし、そのパターンの類
似性から、斑点の原因となる有害菌を判定する。この場
合のゲル電気泳動は、アガロースゲル電気泳動及びポリ
アクリルアミドゲル電気泳動のいずれでもよい。
【００１６】他方、（Ｆ）工程では、（Ｄ）工程におけ
る白水中の各微生物の単離を行わずに白水を培養した栄
養培地そのものを支持体上に転写し、（Ｃ）工程で得た
プローブを加え、コロニーハイブリダイゼーションを行
わせることにより、有害菌を判定する。
る白水中の各微生物の単離を行わずに白水を培養した栄
養培地そのものを支持体上に転写し、（Ｃ）工程で得た
プローブを加え、コロニーハイブリダイゼーションを行
わせることにより、有害菌を判定する。
【００１７】このコロニーハイブリダイゼーションによ
る判定は、上記の支持体に標識を付したプローブを加え
ハイブリッドを形成させ、標識に対して特異的に作用す
る試薬を反応させ、そのシグナルの有無を観察すること
によって行われる。この際の支持体としては、ニトロセ
ルロースフィルターやナイロンフィルターなどが用いら
れ、またプローブの標識の例としては、32Ｐ−ＡＴＰや
ジゴキシジエニン標識ｄＵＴＰがある。
る判定は、上記の支持体に標識を付したプローブを加え
ハイブリッドを形成させ、標識に対して特異的に作用す
る試薬を反応させ、そのシグナルの有無を観察すること
によって行われる。この際の支持体としては、ニトロセ
ルロースフィルターやナイロンフィルターなどが用いら
れ、またプローブの標識の例としては、32Ｐ−ＡＴＰや
ジゴキシジエニン標識ｄＵＴＰがある。
【００１８】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
する。
する。
【００１９】実施例 （Ａ）斑点を有する抄紙の斑点を含む部分を、一辺５ｍ
ｍの正方形に切り取り、さらに細かく細断して試料とし
た。この試料を滅菌蒸留水で３回洗浄後、抽出溶媒（Ｂ
ｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、Ｉｎｓｔ
ａ Ｇｅｎｅ ＴＭ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭａｔ
ｒｉｘ）２００μｌを添加し、３０分間５６℃に保ち、
よくかきまぜたのち、１００℃において８分間加熱し
た。このように処理した溶液をかきまぜたのち、９５０
０ｒｐｍで５分間遠心分離し、不溶物を沈殿させ、上清
液を採取した。
ｍの正方形に切り取り、さらに細かく細断して試料とし
た。この試料を滅菌蒸留水で３回洗浄後、抽出溶媒（Ｂ
ｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、Ｉｎｓｔ
ａ Ｇｅｎｅ ＴＭ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭａｔ
ｒｉｘ）２００μｌを添加し、３０分間５６℃に保ち、
よくかきまぜたのち、１００℃において８分間加熱し
た。このように処理した溶液をかきまぜたのち、９５０
０ｒｐｍで５分間遠心分離し、不溶物を沈殿させ、上清
液を採取した。
【００２０】（Ｂ）次に、このようにして得た上清液
１．０μｌを表１に示す組成の反応液と混合して全量１
００μｌとし、これを９４℃で１分、３７℃で１分及び
７２℃で１分の加熱サイクルを２５回繰り返すことによ
って、ＤＮＡ増幅反応を行った。
１．０μｌを表１に示す組成の反応液と混合して全量１
００μｌとし、これを９４℃で１分、３７℃で１分及び
７２℃で１分の加熱サイクルを２５回繰り返すことによ
って、ＤＮＡ増幅反応を行った。
【００２１】
【表１】
【００２２】この場合のプライマー１としては、ＧＡＣ
ＣＧＴＧＧＴＣの塩基配列をもつ１０量体を、またプラ
イマー２としては、ＡＴＡＣＧＡＡＧＡＧの塩基配列を
もつ１０量体を用いた。
ＣＧＴＧＧＴＣの塩基配列をもつ１０量体を、またプラ
イマー２としては、ＡＴＡＣＧＡＡＧＡＧの塩基配列を
もつ１０量体を用いた。
【００２３】このようにして得た反応生成物を、０．８
％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動を行った結果を
図１に示す。この図１には比較のために、同じ抄紙の斑
点を有しない部分（正常部分）を一辺５ｍｍの正方形に
切り取り、上記と同様に処理したものについてゲル電気
泳動した結果も合わせて示した。
％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動を行った結果を
図１に示す。この図１には比較のために、同じ抄紙の斑
点を有しない部分（正常部分）を一辺５ｍｍの正方形に
切り取り、上記と同様に処理したものについてゲル電気
泳動した結果も合わせて示した。
【００２４】この結果、正常部分（ｂ、ｃ）からは、Ｄ
ＮＡバンドが全く観察されず、斑点部分（ｄ）からは、
明らかにＤＮＡと思われるバンドが認められた。またポ
ジティブコントロールとして斑点反応液に既知の糸状菌
であるアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ）のＤＮＡを大過剰に添加したもの
（ｅ）においてもＤＮＡ増幅が観察されており、反応自
体は順調に進行していることが確認された。なお、ａは
分子量標識用のλ‐ファージ・ヒンディーＩＩＩ分解物
のバンドである。
ＮＡバンドが全く観察されず、斑点部分（ｄ）からは、
明らかにＤＮＡと思われるバンドが認められた。またポ
ジティブコントロールとして斑点反応液に既知の糸状菌
であるアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒ）のＤＮＡを大過剰に添加したもの
（ｅ）においてもＤＮＡ増幅が観察されており、反応自
体は順調に進行していることが確認された。なお、ａは
分子量標識用のλ‐ファージ・ヒンディーＩＩＩ分解物
のバンドである。
【００２５】（Ｃ）図１におけるｄバンドの２本のうち
分子量の高い方をスピン・バインド・ＤＮＡ回収システ
ム（ＦＭＣ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて単離
・精製し、最終的にエタノールを加え沈殿させてＤＮＡ
を回収したのち、プローブとして調製した。
分子量の高い方をスピン・バインド・ＤＮＡ回収システ
ム（ＦＭＣ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて単離
・精製し、最終的にエタノールを加え沈殿させてＤＮＡ
を回収したのち、プローブとして調製した。
【００２６】（Ｄ）別に、抄紙機内から採取した白水を
滅菌蒸留水で希釈したもの約０．５ｍｌを、ワックスマ
ン寒天培地に注加し、コンラージ棒を用いて均一になら
したのち、３５℃で３日間培養した。この結果、黄色粘
塊状細菌、淡褐色粘塊状細菌及び淡褐色粘液状細菌の３
種のバクテリアコロニーが得られた。
滅菌蒸留水で希釈したもの約０．５ｍｌを、ワックスマ
ン寒天培地に注加し、コンラージ棒を用いて均一になら
したのち、３５℃で３日間培養した。この結果、黄色粘
塊状細菌、淡褐色粘塊状細菌及び淡褐色粘液状細菌の３
種のバクテリアコロニーが得られた。
【００２７】次に、各バクテリアコロニーからそれぞれ
少量を取り出し、前記（Ａ）工程と同様にしてＤＮＡを
抽出し、前記（Ｂ）工程と同様に処理してＤＮＡの増幅
を行った。このようにして増幅したＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動処理したところ３種のバクテリアはいずれ
も異なったパターンを示した（図２Ａ）。
少量を取り出し、前記（Ａ）工程と同様にしてＤＮＡを
抽出し、前記（Ｂ）工程と同様に処理してＤＮＡの増幅
を行った。このようにして増幅したＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動処理したところ３種のバクテリアはいずれ
も異なったパターンを示した（図２Ａ）。
【００２８】次いで（Ｃ）で得たＤＮＡにジゴキシジエ
ニン標識ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ製、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて標識を付すこ
とにより標識プローブを調製した。
ニン標識ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ製、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて標識を付すこ
とにより標識プローブを調製した。
【００２９】次に、上記で得たゲル内のＤＮＡ（図２
Ａ）をそのままナイロン膜上にキャピラリー転写し、上
記の標識プローブとサザンハイブリダイゼーションを行
ったのち、抗ジゴキシジエニン抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ製、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅ
ｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用
いて検出した。結果としてプローブは黄色粘塊状細菌Ｄ
ＮＡとハイブリダイズし、同一の配列を有することが分
った（図２Ｂ）。このことにより斑点に含まれる微生物
は黄色粘塊状細菌であることが確認された。
Ａ）をそのままナイロン膜上にキャピラリー転写し、上
記の標識プローブとサザンハイブリダイゼーションを行
ったのち、抗ジゴキシジエニン抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ製、ＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅ
ｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用
いて検出した。結果としてプローブは黄色粘塊状細菌Ｄ
ＮＡとハイブリダイズし、同一の配列を有することが分
った（図２Ｂ）。このことにより斑点に含まれる微生物
は黄色粘塊状細菌であることが確認された。
【００３０】この図２においてａ′は分子量マーカー、
ｂ′は正常部分を化学増幅したもの、ｃ′は斑点部分イ
から化学増幅したもの、ｄ′は黄色粘塊状細菌を化学増
幅したもの、ｅ′は淡褐色粘塊状細菌を化学増幅したも
の、ｆ′は淡褐色粘塊状（大）細菌を化学増幅したも
の、ｇ′は斑点部分ロから化学増幅したものである。
ｂ′は正常部分を化学増幅したもの、ｃ′は斑点部分イ
から化学増幅したもの、ｄ′は黄色粘塊状細菌を化学増
幅したもの、ｅ′は淡褐色粘塊状細菌を化学増幅したも
の、ｆ′は淡褐色粘塊状（大）細菌を化学増幅したも
の、ｇ′は斑点部分ロから化学増幅したものである。
【００３１】参考例 実施例の抄紙における抄造工程で採取したスライム状付
着物１ｇを滅菌蒸留水に懸濁し、ポリトロンホモジナイ
ザーを用い、１００００ｒｐｍで５分間粉砕した。次
に、この粉砕物を滅菌蒸留水で希釈し、その１μｌをワ
ックスマン寒天培地に加え、混合して滅菌シャーレに注
入したのち、３５℃で３日間培養した。この培養後、そ
の生菌数を測定した結果を表２に示す。
着物１ｇを滅菌蒸留水に懸濁し、ポリトロンホモジナイ
ザーを用い、１００００ｒｐｍで５分間粉砕した。次
に、この粉砕物を滅菌蒸留水で希釈し、その１μｌをワ
ックスマン寒天培地に加え、混合して滅菌シャーレに注
入したのち、３５℃で３日間培養した。この培養後、そ
の生菌数を測定した結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】このようにして、付着物からは、４種のバ
クテリアが検出されたが、その中のほとんどが、黄色粘
塊状細菌であることが分った。このことは、抄紙上に発
生した斑点の原因が黄色粘塊状細菌であることを示す実
施例の結果とよく一致している。
クテリアが検出されたが、その中のほとんどが、黄色粘
塊状細菌であることが分った。このことは、抄紙上に発
生した斑点の原因が黄色粘塊状細菌であることを示す実
施例の結果とよく一致している。
【００３４】
【発明の効果】本発明により、従来間接的な方法でしか
検出することができなかった抄紙上の斑点の発生原因
を、ＤＮＡの化学的な増幅やハイブリダイゼーションを
利用することにより直接に検知することができる上に、
従来全く不可能であった斑点中に存在する微生物種の特
定も可能とすることができた。
検出することができなかった抄紙上の斑点の発生原因
を、ＤＮＡの化学的な増幅やハイブリダイゼーションを
利用することにより直接に検知することができる上に、
従来全く不可能であった斑点中に存在する微生物種の特
定も可能とすることができた。
【図１】 実施例で得た増幅反応生成物のゲル電気泳動
パターン
パターン
【図２】 白水中の微生物から抽出したＤＮＡのゲル電
気泳動パターン（Ａ）及び標識プローブをサザンハイブ
リダイゼーションし、同一配列を検出したパターン
（Ｂ）。
気泳動パターン（Ａ）及び標識プローブをサザンハイブ
リダイゼーションし、同一配列を検出したパターン
（Ｂ）。
Claims (4)
- 【請求項１】 抄紙の斑点の原因となる微生物を判別す
るに当り、斑点部分から抽出したＤＮＡと白水中に存在
する個々の微生物から抽出したＤＮＡとの間で同定処理
を行うことにより微生物を特定することを特徴とする抄
紙斑点の判別方法。 - 【請求項２】 （Ａ）抄紙の斑点部分からＤＮＡを抽出
する工程、（Ｂ）抽出されたＤＮＡを化学的に増幅する
工程、（Ｃ）増幅されたＤＮＡを単離精製後、標識付与
処理を施してプローブを調製する工程、（Ｄ）白水中に
存在する微生物を培養し、それから各微生物を単離し、
これらからＤＮＡを抽出し、必要に応じ化学的に増幅す
る工程及び（Ｅ）（Ｃ）工程で得たプローブと（Ｄ）工
程で得た各微生物の電気泳動処理されたＤＮＡとをそれ
ぞれハイブリダイズし、斑点中に含まれる微生物ＤＮＡ
と同一の配列をもつ微生物を特定する工程から成る抄紙
斑点の判別方法。 - 【請求項３】 （Ｂ）工程におけるＤＮＡの増幅を２種
のプライマーを用いて行う請求項２記載の判別方法。 - 【請求項４】 ＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣ又はＡＴＡＣＧＡ
ＡＣＡＧ（ただし、Ａはアデノシン、Ｃはシチジン、Ｇ
はグアノシン、Ｔはチミジンの単位をそれぞれ意味す
る）で示される塩基配列をもつＤＮＡ増幅用プライマ
ー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07359294A JP3788999B2 (ja) | 1994-04-12 | 1994-04-12 | 抄紙斑点の原因となる微生物の検知方法及びそれに用いるプライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07359294A JP3788999B2 (ja) | 1994-04-12 | 1994-04-12 | 抄紙斑点の原因となる微生物の検知方法及びそれに用いるプライマー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07274999A true JPH07274999A (ja) | 1995-10-24 |
| JP3788999B2 JP3788999B2 (ja) | 2006-06-21 |
Family
ID=13522750
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07359294A Expired - Fee Related JP3788999B2 (ja) | 1994-04-12 | 1994-04-12 | 抄紙斑点の原因となる微生物の検知方法及びそれに用いるプライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3788999B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002054865A1 (fr) * | 2001-01-09 | 2002-07-18 | Kurita Water Industries Ltd. | Procede de selection d'un agent antimicrobien et procede d'utilisation de ce dernier |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9290802B2 (en) | 2012-01-24 | 2016-03-22 | Nalco Company | Detection and quantification of nucleic acid to assess microbial biomass in paper defects and machine felts |
| US8613837B2 (en) * | 2012-01-24 | 2013-12-24 | Nalco Company | Detection and quantification of nucleic acid to assess microbial biomass in paper defects and machine felts |
| US9908796B2 (en) | 2012-10-23 | 2018-03-06 | Ecolab Usa Inc. | Use of oxidizing and non-oxidizing biocides for control of bacteria tolerant to stabilized-oxidant treatment |
| WO2015100123A1 (en) * | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Nalco Company | Detection and quantification of nucleic acid to assess microbial biomass in paper defects and machine felts |
-
1994
- 1994-04-12 JP JP07359294A patent/JP3788999B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002054865A1 (fr) * | 2001-01-09 | 2002-07-18 | Kurita Water Industries Ltd. | Procede de selection d'un agent antimicrobien et procede d'utilisation de ce dernier |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3788999B2 (ja) | 2006-06-21 |
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